ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Meltem BERBER KABUKSUZ ÇEKİRDEK KABAKLARINDA (Cucurbita pepo L. var. styriaca) IŞINLANMIŞ POLENLE TOZLAMA YÖNTEMİYLE HAPLOİD ÜRETİMİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KABUKSUZ ÇEKİRDEK KABAKLARINDA (Cucurbita pepo L. var. styriaca) IŞINLANMIŞ POLEN İLE TOZLAMA YÖNTEMİYLE HAPLOİD ÜRETİMİ Meltem BERBER YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez.../.../2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza... İmza... İmza... Prof. Dr. Kazım ABAK Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof. Dr. Şebnem ELLİALTIOĞLU DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoteknoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu çalışma Ç.Ü. Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: ZF2008YL50 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ KABUKSUZ ÇEKİRDEK KABAKLARINDA (Cucurbita pepo L. var. styriaca) IŞINLANMIŞ POLENLE TOZLAMA YÖNTEMİ KULLANILARAK HAPLOİD ÜRETİMİ Meltem BERBER ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof.Dr. Kazım ABAK Yıl : 2009, Sayfa: 62 Jüri : Prof.Dr. Kazım ABAK Prof.Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof.Dr. Şebnem ELLİALTIOĞLU Bu çalışma esas olarak iki amaca yönelik yapılmıştır. Birincisi kabuksuz çekirdek kabaklarında (Cucurbita pepo var. styriaca) ışınlanmış polen uyartımıyla haploid bitki elde edilmesi; diğeri de bu amaca yönelik olarak en uygun ışın dozunun araştırılmasıdır. Araştırmada tanık olarak kabuklu tohumlu kabak genotipleri de kullanılmıştır. Toplam on beş genotipin kullanıldığı araştırmada 50, 100 ve 150 Gray ışın dozları denenmiştir. Çalışmada tüm genotiplerde toplam 2073 embriyo elde edilmiştir ve bu embriyoların 979 adedi bitkiye dönüşmüştür. Araştırmada kullanılan tüm genotiplerde haploid embriyo elde edilebilmiş, genotipler arasında önemli fark çıkmamıştır. Denemede test edilen her üç ışın dozu da iyi sonuç vermiştir. Ancak 150 Gray ışın dozundan daha çok haploid bitki elde edilmiştir. Dış koşullara alıştırılan 75 bitkide indirekt yöntemlerle (çiçek tozu varlığı, yaprak ve çiçek özellikleri, stoma yoğunluğu, stomaların bekçi hücrelerinde bulunan kloroplastların sayımı) yapılan gözlemler sonucunda bu bitkilerin %42.6 sının haploid, %57.3 ünün ise diploid olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimler: Kabak, Cucurbita pepo L., ışınlanmış polen, haploid. I

4 ABSTRACT MSc THESIS PRODUCTION OF HAPLOIDS IN NAKED SEED PUMKINS (Cucurbita pepo L. var. styriaca) BY POLLINATION WITH IRRADIATED POLLEN Meltem BERBER DEPARMENT OF BIOTECHNOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIEDSCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor : Prof.Dr. Kazım ABAK Year : 2009, Pages: 62 Jury : Prof.Dr. Kazım ABAK Prof.Dr. Saadet BUYUKALACA Prof.Dr. Sebnem ELLIALTIOGLU This study is realiesed for two basic purposes. First one is to produce haploid plants from naked seed pumpkins (Cucurbita pepo var. styriaca) with irradiated pollination technique and the second one is to research the most suitable doses of irradiation for this aim. In the research the shelled seed pumpkin genotypes are also used as control and a total of fifteen genotypes were used as plant matarial. Three irradition dosses of gamma rays (50, 100 and 150 Gray) were tested. During the study, a total of 2073 embryos are resqued from different genotypes and 979 of these embryos transformed into plants. Haploid embryos are obtained in all of the used material and any important difference has not been observed between genotypes. All three dosses of irradiation gave good results in the study. However; more haploid plants are acquired from the 150 Gray. 75 of plants were acclimatized and cultiveted in a plantichimes and ploidy levels of there plants were determined using indirect methods (existence of pollens, leaf and flower features, stoma density and chloroplast number in gard cells of stoma). 42.6% of these plants seen to be haploid and 57.3% of them diploid. Key Words: Pumpkin, Cucurbita pepo L., irradiated pollen, haploid. II

5 TEŞEKKÜR Bu elinizde tutmakta olduğunuz tezin yazımı aşamasında en çok zorlandığım, bir türlü hislerimi anlatabilecek kelimeleri bulamadığım ve ne yazarsam yazayım içimdekileri yansıtamayacağım bölümü bu bölümüdür. İlk gördüğüm andan itibaren çok sevdiğim, kendisinden öğrendiğim her kelimede, sorduğum her soruya aldığım yanıtta hayran kaldığım, parmağımı kaldıracak halim yok artık dediğim anlarda söylediği bir kelimeyle insana her şeyi yapabileceğini hissettiren, tanıdığım için onur duyduğum ve beni seçtiği için minnettar olduğum danışman hocam Prof. Dr. Kazım ABAK a; hayata bakış açımı değiştiren, hep annem gibi gördüğüm, her açıdan örnek aldığım, tarifi olmayan bir sevgi, bağlılık ve güven duyduğum, çalışmayı her zaman en keyifli hale getiren ve her konuda desteğini hiçbir zaman esirgemeyen saygıdeğer hocam Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA ya teşekkürlerimi sunarım. Kafamdaki döllenme biyolojisi karmaşasını çözen, tezime çok büyük katkıları olan, her karşılaştığımızda kendisinden bir şeyler öğrendiğim hocam Prof. Dr. Sinan Eti ye; güler yüzüyle, eleştirileriyle her konuda cesaret veren, bakış açısına hayran kaldığım ve fikirlerine çok önem verdiğim değerli hocam Prof. Dr. Sevgi Paydaş a teşekkür ederim. Tezimin her aşamasında çok büyük emeği olan, çalışma disiplininden, ne zaman ne yapmam gerektiğine kadar her konuda bana yardımcı olan, daha ben ne olacak diye düşünürken dile getirmeme fırsat bile kalmadan her sorunu çözebilen, elinden her iş gelen, kendisine magic finger demenin yerinde olacağı, gideceğini bilmenin hüznüyle içimi sıkan biricik ablam ve hocam Dr. Mehtap YILDIZ a, bana evini, gönlünü açan, embriyo kurtarma ekibinde kabaklarımla boğuşan, içinden git başımdan artık demek istediği anlarda bile bana katlanan ablam Ar.Gör.Songül ÇÖMLEKÇİOĞLU na, doku kültürünün erbabı, hiç bir soruyu yanıtsız bırakmayan, her fırsatta yardımlarını esirgemeyen ablam Ar.Gör.Hatıra TAŞKIN a teşekkürlerimi bir borç bilirim. Çalışmamın istatistik analiz kısmına yardımcı olan Yüksek Mühendis Bekir Bülent Arpacı ya, tezimin yapım aşamasında her zaman yardımcı olan yüksek lisans öğrencisi, arkadaşım Remziye EBRİŞİM e, her şeyi beraber öğrendiğimiz, birçok III

6 konuda bana yardımcı olan Yüksek Mühendis Gökhan BAKTEMUR a, sebzelerin dilinden anlayan, ustaların ustası Şükrü TÜRKMEN e, Çukurova Üniversite si Tıp Fakültesi Radyasyon Onkolojisi Anabilim dalı öğretim öğesi Prof. Dr. Candaş TUNALI ya teşekkür ederim. Beni benden çok düşünen babam Mehmet BERBER e, hayatını benim eğitimime adayan annem Nede BERBER e, tezimle yatıp kalkan kız kardeşim Nihal BERBER e, beni düşünen, destekleyen, stresli olduğum her anıma katlanan, tezimin İngilizce yazışmalarını yapan ve katkıları olan dostlarım Figen GÖKÇE, Dilan ÇELİK, Emrah ÇANKAYA ve Özge CUMAOĞULLARI na çok teşekkür ederim. Ve adını yazamadığım, tezimde emeği olan herkese, kendimi buraya ait hissettiren Bahçe Bitkileri Bölümü ne teşekkürler. IV

7 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ I ABSTRACT. II TEŞEKKÜR..... III İÇİNDEKİLER... V SİMGELER VE KISALTMALAR. VII ÇİZELGELER DİZİNİ IX ŞEKİLLER DİZİNİ. X 1.GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Yöntem Bitkilerin Yetiştirilmesi Çiçeklerin İzolasyonu Polenlerin Işınlanması Tozlama Embriyoların Çıkartılması ve Kültürü Dezenfeksiyon Embriyoların Çıkarılması Besin Ortamları ve Kültür Koşulları İn Vitro Bitki Gelişmeleri ve Dış Koşullara Alıştırma Ploidi Seviyesinin Belirlenmesi ve Morfolojik Gözlemler Birim Alandaki Stoma Sayısı (adet) Kloroplast Sayıları (adet) Morfolojik Gözlemler Yapılan Sayım, Ölçüm ve Gözlemler ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Araştırma Bulguları Meyve Tutma Oranları 28 V

8 Meyve Başına Düşen Ortalama Tohum Sayıları Meyve Başına Kurtarılan Ortalama Embriyo Sayıları Elde Edilen Embriyoların Gelişme Safhaları Embriyoların Bitkiye Dönüşüm Oranları Dış Ortama Alıştırma ve Bitkiye Dönüşüm Seçilen Bitkilerde Morfolojik gözlemler ve Ploidi Seviyesinin Belirlenmesi Tartışma 5. SONUÇ ve ÖNERİLER KAYNAKLAR... ÖZGEÇMİŞ VI

9 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ AFLP : Amplified Fragment Lenght Polymorphism BAP : Benzil Amino Pürin KN : Kinetin IBA : Indol Bütürik Asit IAA : Indol Asetik Asit NAA : Naftalin Asetik Asit 2,4-D : 2,4 dikloro fenoksi asetik asit Co 60 : Kobalt 60 Gy : Gray ÇÜZF : Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi G.Ölkürbis : Gloidosfer Ölkürbis GÖ : Gloidosfer Ölkürbis Y.Yeşil : Yabancı yeşil YY : Yabancı yeşil İsk 1 : İskenderun 1 İsk 2 : İskenderun 2 SK : Sakız Nev : Nevşehir Ed : Edirne No : Numara BDO : Bitkiye dönüşüm oranı OES : Ortalama embriyo sayısı OTS : Ortalama tohum sayısı MBDOES : Meyve başına düşen ortalama embriyo sayısı TTS : Toplam tohum sayısı TMS : Toplam meyve sayısı TS : Tohum sayısı TTMS : Toplam tutan meyve sayısı VII

10 TTÇS : Toplam tozlanan çiçek sayısı MTO : Meyve tutma oranı g : Gram mg : Miligram Kg : Kilogram ml : mililitre l : Litre mm : Milimetre cm : Santimetre µm : mikromolar V : Hacim TDZ : Thidiazuron WMV : Watermelon mosaic virus ZYMV : Zucchini yellow mosaic virus UV : Ultra viyole % : Yüzde B5 : Gamborg et all. VIII

11 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Tezde kullanılan bitkisel materyal ve özellikleri... Çizelge 3.2. E20A Besin Ortamının Bileşimi Çizelge 3.3. MS Besin Ortamının Bileşimi... Çizelge 4.1. Meyve tutma oranı. Çizelge 4.2. Meyve başına düşen ortalama tohum sayıları Çizelge 4.3. Meyve başına kurtarılan ortalama embriyo sayıları.. Çizelge 4.4. Embriyo aşamaları... Çizelge 4.5. Bitkiye dönüşüm oranları... Çizelge 4.6.Embriyoların bitkiye dönüşümleri sürecinde gelişmeyen, enfekte olan ve vitrifiye olan bitki sayıları ve kalan bitkilerin saksıya aktarılma oranları.. Çizelge 4.7. Seraya şaşırtılan bitkilerden diploid oldukları düşünülenlerde yaprak ve çiçek özellikleri. Çizelge 4.8. Seraya şaşırtılan bitkilerden haploid oldukları düşünülenlerde yaprak ve çiçek özellikleri. Çizelge 4.9. Diploid (solda) ve haploid (sağda) bitkilerin stoma ve kloroplast sayıları IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Tezde kullanılan kabak (Cucurbita pepo L.) bitkilerinin seradaki görünümü... Şekil 3.2. Antesisten bir gün önce izole edilen çiçek. Şekil 3.3. (A)Anthesisten bir gün önce toplanan erkek çiçekler; (B) Taç ve çanak yaprakları ayrılarak ışınlanmak üzere hazırlanmış anterler... Şekil 3.4. Işınlanmış polenle tozlama; (A)ışınlanmış erkek çiçekler (B)dişi çiçeğin ışınlanmış polenle tozlanması (C) tozlamadan sonra pensle kapatılarak izole edilmiş dişi çiçek.. Şekil 3.5. Tozlamadan sonra tutan bir meyvenin birkaç gün sonraki görünümü... Şekil 3.6. Hasat aşamasına gelmiş meyveler. Şekil 3.7. Embriyoların çıkarılması... Şekil 3.8. Tohumların içinde embriyoların görünümü... Şekil 3.9. İklim odasında bulunan MS ortamı içeren büyük kavanozlardaki in vitro kabak bitkicikleri Şekil İn vitro bitkiciklerin dış ortama transferi. (A) Besin ortamından ayırma; (B) Ortam kalıntılarından kurtarmak amacıyla su altında yıkama; (C) %0,2 lik Captan la hazırlanmış ilaçlı suya batırılan kökler; (D) Steril torf içeren plastik bardaklara dikim; (E) Dikilip, sulanan ve ilaçlanan bitkilerin nemli poşetle örtülmesi; (F) Lastiklerin gevşetildiği 4. günden sonraki dış koşullara alışmak üzere olan bitki... Şekil Dış koşullara alıştırılmak amacıyla plastik bardaklara alınan bitki (A). Dış koşullara alışmış saksıya alınacak olan bitki (B). Şekil 4.1. Işın dozlarına göre meyve tutma oranı.. Şekil 4.2. Genotiplere göre meyve tutma oranı. Şekil 4.3. Kabuklu ve kabuksuz tohumlu genotiplerde meyve tutma oranı X

13 Şekil Gray ışın dozuyla tozlanmış bir meyveden elde edilen tohumlar, içi boş tohum (a), içinde haploid olduğu tahmin edilen embriyo içeren tohum (b), diploid embriyo içeren tohum (c) Şekil 4.5. Kabuklu ve kabuksuz tohumlu genotiplerde ortalama tohum sayıları. Şekil 4.6. Işın dozlarına göre ortalama tohum sayıları.. Şekil 4.7. Genotiplere göre ortalama embriyo sayıları. Şekil 4.8. Işın dozlarına göre ortalama embriyo sayıları... Şekil 4.9. Kabuklu ve kabuksuz tohumlu genotiplerde ortalama embriyo sayıları... Şekil Globüler, çubuk, yürek(kalp) ve torpedo aşamalarındaki embriyoların ışın dozlarına göre oranı Şekil Genotiplerin globüler, çubuk, yürek ve torpedo aşamalarındaki embriyo oranları... Şekil Kabuklu ve kabuksuz tohumlu genotiplerde embriyoların bitkiye dönüşüm oranları Şekil Genotiplere göre embriyoların bitkiye dönüşüm oranları... Şekil Işın dozlarına göre embriyoların bitkiye dönüşüm oranları Şekil Saksılara aktarılan bina içindeki bitkiler. Şekil Bitkilerin saksılardan seraya dikilmesi Şekil Haploid ve diploid bitkilerin 4. yaprakları arasındaki boyut farkı Şekil Haploid ve diploid bitkilerin seraya aktarılmadan önce saksılardaki görüntüsü Şekil Diploid (a) ve haploid (b) bitkilerin stomalarındaki kloroplastlar XI

14 1.GİRİŞ Meltem BERBER 1.GİRİŞ Anavatanı Kuzey ve Güney Amerika olan kabaklar (Cucurbita spp.) kültüre alınan ilk bitkiler arasında gösterilmektedir (Heiser 1973). 16.yüzyılda Amerika dan diğer kıtalara okyanusları aşarak yayılmıştır. Tropik, subtropik, sıcak, kurak bölgeler ve çöl koşulları gibi çok farklı ekolojilere adapte olabilen bu bitkinin Meksika, Kuzey Amerika ve Doğu Asya da ilk çağlardan beri yetiştirildiği yapılan arkeolojik çalışmalar sonucunda anlaşılmıştır (Robinson ve Decker-Walters 1997). Dünya da 1,5 milyon hektarlık alanda 20 milyon ton, Türkiye de ise 21 bin hektarlık alanda, 350 bin ton yıllık üretime sahip Cucurbita cinsi içerisinde ekonomik açıdan en önemli türler; Cucurbita pepo L. (yazlık kabak), Cucurbita maxima Duch. (kışlık kestane kabakları) ve Cucurbita moschata (Duch ex. Lam.) (kışlık bal kabakları) dır (Anonim 2007). Cucurbita pepo L. (yazlık kabak), meyve özellikleri açısından çok farklı çeşitleri bulunan ve dünya çapında büyük ekonomik öneme sahip bir türdür. En az 10 bin yıl önce kültüre alınmış olmasına rağmen Avrupa ya girmesi sadece 500 yıl kadar önce gerçekleşmiştir. Tüm ılıman ve subtropik bölgelerde yetişen bu tür, yenebilir meyvelilerin yanı sıra çoğunlukla acı, küçük meyveli yenilemeyen kabak tip ve formlarını da içine alır (Paris, 2001). Yüksek polimorfiziminden ötürü C. pepo ssp. pepo, C. pepo ssp. fraterna ve C. pepo ssp. ovifera olmak üzere 3 alt türe ayrılmıştır. Bu alt türlerinde birçok varyeteleri bulunmaktadır. Acı, küçük meyveli çeşitleri içeren C. pepo ssp. ovifera, C. pepo ssp. pepo ya göre daha küçük generatif ve vejetatif organlara sahiptir (Anonim 2008). Cucurbita pepo ssp. pepo nun filogenetik açıdan en genç üyesi olan kabuksuz çekirdek kabaklarının (Cucurbita pepo subsp. pepo var. styriaca) ilk olarak 1881 yılında Avusturya nın güney doğusunda bulunan Styria şehrinde kabuklu çekirdek kabaklarında meydana gelen doğal bir mutasyon sonucunda ortaya çıktığı bildirilmektedir (Fruhwirth ve Hermetter, 2007). Kabak tohumlarının kabuksuzluk karakteri ve genetiği üzerindeki çalışmalar 1950 yılında başlamış olup halen devam etmektedir. İlk çalışmalarda kabuk tabakalarındaki odunlaşmanın majör dominant bir gen tarafından kontrol edildiği ileri sürülmüştür. Buna göre, lokustaki her iki allel 1

15 1.GİRİŞ Meltem BERBER gen homozigot dominant ya da heterozigot olduğu durumlarda tohumlar sert ve kalın bir kabuk taşımakta, homozigot resesif olduğunda ise sert kabuk taşımamaktadır. Fakat çok ince ve zar şeklinde bir kabuk görülebilmekte ve bunun kalınlığı bakımından da çeşitlilik gözlemlenmektedir (Zraidi ve ark. 2003). Bu olay kabuksuzluk özelliğinin kalıtsal yapısının çok basit olmadığının, yalnızca bir çift genle yönetilmediğinin bir göstergesidir. Kabak türlerinin tarımı esas olarak meyveleri için yapılmaktadır. Bazı ülkelerde ve Türkiye de kabak, tohumları için de yetiştirilmektedir. Kabak tohumları A ve E vitaminleri açısından zengindir. Doymamış yağ oranı da yüksek olduğundan, birçok ülkede yağ üretimi için yetiştirilmekte, ayrıca çerez olarak da tüketilmektedir (Follet 2002). Bunlara ek olarak ilaç sanayisinde değerlendirilmektedir (Robinson ve Decker-Walters, 1997). Kabuksuz tohumlu kabaklar, yağ üretiminde özellikle tercih edilmekte ve bu nedenle yağlık styrian kabakları (styrian oil-pumpkin) olarak ta isimlendirilmektedir yılı verilerine göre kabuksuz çekirdek kabaklarının yalnızca Avusturya da 13 bin hektar alanda yetiştirildiği, üretiminin 11 bin ton olduğu ve hektardan ortalama kg ürün alındığı, 1 lt yağ üretimi için de 2,5 kg tohum kullanıldığı bildirilmektedir (Fruhwirth ve Hermetter, 2007). Avusturya da 2006 yılında toplam 6 bin ton tohum üretilip sadece yağ üretimi için kullanılmıştır. Yağ üretimi amacıyla tohumları çıkarılan meyveler, meyve eti kalitesi bakımından Cucurbita moschata ile Cucurbita maxima arasında olduğundan hayvan yemi olarak kullanılabilmektedir. Ayrıca kabak tohumu yağı Amerika ve Çin de yemek yapımında; Fransa da margarin yapımında (Follet 2002); Macaristan, Slovenya ve Avusturya da salatalarda ve prostatın tedavisi amacıyla fitoterapide (Mandl ve ark. 1999) yaygın kullanımı yanında tohumları yağda kızartılarak ya da fırında kavrularak tüketilmektedir (Stephens 2003). Yetiştiriciliğinin hayli geniş alanlarda yapılmasına rağmen Türkiye de çekirdek kabaklarında ve özellikle de kabuksuz çekirdekli kabaklarda mevcut herhangi bir çeşit bulunmamaktadır. Üretimde az veya çok karışıklıklar içeren populasyonlar kullanılmaktadır. Kabak yabancı tozlanan bir bitki olduğu için seleksiyon çalışmaları da uzun sürmektedir. Bu konuda Türkiye de ilk olarak Abak 2

16 1.GİRİŞ Meltem BERBER ve ark. (1990) tarafından seleksiyon çalışmaları başlatılmış ve uzun bir süreçte çeşit adayı hatlar üretilebilmiştir. Haploid bitkiler embriyo kesesi veya polen çekirdeğindeki gamet hücrelerinden meydana gelen gametofitik kromozom sayısına sahip (n) bitkilerdir (Khush ve Virmani, 1996). Normal bir bitkide bulunan tüm özelliklere sahip olmasına karşın diploidlere göre yaprakları küçük ve dar, çiçekleri küçük ve bitki boyları kısadır. Kısır oldukları için meyve tutma yetenekleri yoktur ve tohum oluşturamazlar. Haploid bitkilerin ürün vermeleri ve yeni döller oluşturabilmeleri için kromozom sayılarının kolhisin, azot protoksit, kafein, kloral hidrat, asenaften, sulfinilamid, etil merkuriklorid, hekzaklorosiklohekzan gibi bazı kimyasallarla katlanıp iki katına çıkarılması gerekmektedir. Dihaploidizasyon denilen bu yöntemle %100 homozigot saf hatlar elde edilmektedir (Çağlar ve Abak 1999). Haploidler klasik ıslah çalışmalarında 8 10 generasyon kendileme ile mümkün olan saflaştırma işlemini 5 6 yıldan 1 yıla indirerek ıslah çalışmalarının daha kısa sürede tamamlanması olanağını sunmaktadır. Haploidlerin doğada spontan olarak ortaya çıkma sıklığı çok nadir olup türlere ve hatta genotiplere göre değişmektedir. Birçok türde de spontan haploidi oluşumuna hiç rastlanmamaktadır. Bu nedenle yeni kuşaklara aktarılamayan haploidlerin üretimini gerçekleştirebilmek için pek çok yöntem denenmiştir. Belling ve Blakeslee tarafından 1922 de tanımlanan ilk spontan haploid Datura stramonium bitkisinde partenogenetik yolla oluşmuştur. Bunun ardından pek çok bitki türünde spontan haploid oluşumu üzerine çalışmalar yoğunlaşmıştır (Khush ve Virmani 1996). In vitro veya in situ uyartılı partenogenesiste normal döllenme meydana gelmemektedir. Temel olarak haploid embriyolar, yumurta hücresi veya embriyo kesesinde bulunan hücrelerden birinin bölünmesiyle (apogami) dişi gametten ya da erkek gametlerden meydana gelmektedir. Otuz yılı aşkın süredir bitki biyoteknolojisinde yaygın olarak uygulanan bu yöntemler erkek ve dişi gametlerin in vitro kültürlerinden haploid bitki elde edilmesi temeline dayanmaktadır. Erkek ve dişi gametler stres (sıcak, soğuk, kimyasal faktörler) altında yapay olarak uyarılarak doğal gelişim ve farklılaşma sürecinde etkilenirler (Juhasz ve Jakse 2005). İn situ haploid embriyo uyartımını teşvik amacıyla uzak akrabalar arası melezlemeler, 3

17 1.GİRİŞ Meltem BERBER tozlamanın geciktirilmesi, eksik veya yetersiz (ışınlanmış) polenle tozlama, değişik kimyasalların uygulanması, sıcaklık şokları, X ve UV ışınlarının uygulanması gibi yöntemler kullanılmaktadır (Yılmaz, 2005). Şu anda genotip, donör bitkinin gelişme koşulları ve kültür koşullarına göre farklı cevaplar veren, haploid bitki üretme denemeleri sonucu belirlenen dört ana yöntem bulunmaktadır: 1. Androgenesis: anterlerin veya izole edilmiş mikrosporların, in vitro kültüre alınması yöntemiyle haploid üretimidir. 2. Ginogenesis: döllenmemiş yumurtalığın ya da yumurta hücrelerinin in vitro kültüre alınması ya da eksik veya yetersiz polenlerle tozlanması yöntemiyle haploid embriyo ve bitki üretimidir. 3. Kromozom eliminasyonu: türler arası melezlemeler sonucunda oluşan embriyoda, ebeveynlerden birine ait kromozomların kaybolmasına dayanan yöntemdir. 4. Parthenogenesis: erkek gamet olmadan yumurtadan embriyo üretilmesidir. Erkek ve dişi eşey hücrelerinin birleşerek embriyo oluşumuna katıldığı ancak çekirdeksel erimenin gerçekleşmeyip ana ve babaya ait kimeralı haploidlerin oluşması (semigami) ya da embriyo kesesinde bulunan sinerjit hücrelerinden birinin bölünmesiyle (apogami) de mümkün olan, ginogenesisle kromozom eliminasyonu arasında bir yöntemdir (Khush ve Virmani 1996; Ellialtığolu ve ark. 2001; Palmer ve Keller 2005, Forster ve ark. 2007). Cucurbitaceae familyasında da haploidizasyon çalışmaları önceleri hem anterler, hem de ovül ve ovaryumlar in vitro kültüre alınarak denenmeye başlanmıştır. Anter kültüründen olumlu bir sonuç alınamamış, ovül ve ovaryum kültürlerinden elde edilen bitki sayıları ise çok az olmuştur lı yıllara doğru gama ışını uygulanmış polenlerle tozlamalar yapılarak in situ haploid embriyo uyartımı ve bu embriyoların özel besin ortamları üzerinde in vitro kültüre alınarak bitkiye dönüştürülmesi araştırılmıştır. Bu yolla Cucurbitaceae familyasının ilk haploid embriyoları kavunda elde edilmiş ve bu embriyolar in vitro da bitkiye dönüştürülmüştür (Sauton ve Dumas de Vaulx 1987). Daha sonra aynı teknik hıyarda 4

18 1.GİRİŞ Meltem BERBER (Sauton 1989), karpuzda (Gürsöz ve ark.1991; Sarı ve ark. 1994) ve kabakta (Kurtar ve ark 2002) denenmiş ve tüm bu bitkilerde başarılı sonuçlar alınmıştır. Kabak türlerinde şimdiye kadar spontan haploidi oluşumuna ilişkin bilgiye rastlanmamıştır. Kabaklarda haploid bitki elde edilmesi ile ilgili çalışmalar da oldukça azdır. Ayrıca bu türde haploid bitki elde etmek amacıyla anter ve ovül kültürü kullanılarak yapılan birçok çalışmada yeterli düzeyde başarı da sağlanamamıştır (Chambonet ve Dumas de Vaulx, 1985; Shail ve Robinson, 1987; Kwack ve Fujieda 1988). Daha sonraki çalışmalarda ise haploid bitkiler elde edilebilmiştir (Gémésné ve Venczel, 1996; Metwally ve ark., 1998; Shalaby 2007). Türkiye de bu konuda yapılan bir çalışmada da (Kurtar ve ark. 2002) kabakta ışınlanmış polenle tozlama yöntemi kullanarak diğer Cucurbitaceae familyası türlerinde olduğu gibi kabakta da olumlu sonuçlar alınmıştır. Burada sonuçları sunulan çalışmada, ekonomik değeri her geçen gün artan bir ürün olan kabuksuz çekirdek kabaklarında ışınlanmış polenlerle uyartımla haploid embriyo elde edilmesi ve in vitro koşullarda bitkiye dönüştürülmesi amaçlanmıştır. Daha önce normal kabuklu tohumlu kabaklarda uygulanan bu yöntemin kabuksuzlarda da çalışıp çalışmayacağı araştırılmış; ayrıca uygulanan farklı ışın dozlarının, haploid embriyo uyartımı üzerine etkileri de incelenmiştir. 5

19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Kabakgil bitkilerinde ilk haploidi çalışması Dumas de Vaulx (1979) tarafından yapılmış ve bu çalışmada Cucumis melo L.(2n=24) nun Cucumis ficifolius (2n=48) ile tozlanması yoluyla kavunda ilk haploid bitkiler elde edilmiştir. Daha sonra yapılan çalışmalarda uzun süre doku kültürü yöntemleri üzerinde durulmuş; hem anterler, hem de ovul ve ovaryumlar in vitro kültüre alınarak denenmiş; anter kültüründe başarı sağlanamayınca sonraki çalışmalarda ovül kültürüne ağırlık verilmiştir. Chambonet ve Dumas de Vaulx (1985), Cucurbita pepo nun döllenmemiş ovüllerini in vitro kültüre alıp bu ovüllerden haploid embriyolara ve sonra da bitkilere ulaşmışlardır. Araştırıcılar, oluşan bitkilerin çoğunun diploid olduğunu, bazılarının anoploid, diploid-haploid kimeralı ve bazılarının da poliploid olduğunu görmüşlerdir. Benzer bir çalışmayı da Shail ve Robinson (1987) Cucurbita pepo türüne ait 3 kabak çeşidinde yapmışlardır. Denenen çeşitlerden yalnızca Blackjack çeşidinde kalluslar elde edilmiş fakat bunlarda bitkiye dönüşüm gerçekleşmemiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda, anter veya ovül kültürü yöntemiyle elde edilen haploidler genetik ve ıslah çalışmalarında kullanılacak düzeyde olmadığından ışınlanmış polenle uyartımla haploid embriyoların elde edilmesi ve bunların bitkiye dönüştürülmesine yönelik başlayan araştırmalar, Cucurbitaceae familyası türlerinde de denenmiştir. Bu yöntemle, Cucurbitaceae familyasının ilk haploid embriyoları Sauton ve Dumas de Vaulx (1987) tarafından kavunda elde edilmiştir. Anılan çalışmada tozlamada kullanılan erkek çiçek tomurcuğu sayısı, çeşit ve ışın dozunun, ışınlanmış polen yöntemiyle haploid bitki elde edilmesi üzerine etkisini araştırmışlardır. Çalışmanın sonucunda, bu faktörlerin embriyo verimine etki ettiği, dört çiçek tomurcuğu ile tozlanarak elde edilen haploid embriyoların oranı ve meyve başına düşen ortalama tohum sayısının iki çiçek tomurcuğu ile tozlanarak elde edilenlerden önemli ölçüde daha fazla olduğu bildirilmiştir. Daha sonra hıyarda çalışan Sauton (1989), bu türde de ışınlanmış polenlerle tozlama yöntemiyle haploid bitki elde etmiştir. Çalışmasında polenlere Co 60 ışın kaynağından Gray arasında değişen dozlarda gama ışını uygulayan 6

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER araştırıcı, tozlamadan 3 hafta sonra hasat ettiği meyvelerden bir tanesi hariç tümünün tohumlarının içlerinin boş olduğunu görmüş, bir meyveden çıkan tohum sayısı az olmuş ve haploid embriyo sayısı % 0.3 olarak bulunmuştur. Aynı zamanda normal polenlerle yapılan tozlama sonucunda ise tohumların %30-60 ının diploid olduğu gözlenmiştir. Türkiye de kabakgil türlerindeki ilk çalışmalar Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü nde kavun ve karpuzda aynı anda başlatılmıştır. Kavundaki çalışmada üç farklı çeşit grubunda (C. melo var. inodorus, C. melo var. reticulatus ve C. melo var. cantalupensis) ışınlanmış (300 Gy) polenle haploid embriyo uyartımı üzerinde durulmuş, bu yöntemin ve ışın dozunun kavunda genotiplere göre değişmekle birlikte tüm çeşitlerde etkin olduğu sonucuna varılmıştır (Sarı ve ark. 1992a). Kavundaki çalışmaların yanında karpuzda (Citrullus lanatus) da benzer çalışmalara yönelen araştırıcılar Crimson Sweet, Halep Karası, Sugar Baby ve Pannonia F1 çeşitlerinde ışınlanmış (200 veya 300 Gy) polen tozlamaları yaparak haploid embriyo üretimine genotipin ve ışın dozunun etkisini araştırmışlardır. Bu amaçla, tozlamadan 2 5 hafta sonra hasat ettikleri meyvelerden globüler ve yürek şekilli embriyolar elde etmişler ve 100 tohumdaki en yüksek embriyo sayısına Halep Karası çeşidinde ulaşmışlardır. Araştırıcılar elde ettikleri 17 haploid bitkiyi kolhisin uygulayarak diploid bitkiler elde etmişlerdir. (Sarı ve ark. 1994). Daha sonra kavundaki haploid üretimini ve dihaploidizasyon tekniğini ıslah çalışmalarında kullanmaya başlayan Abak ve ark. (1996), kavunun (Cucumis melo) üç farklı grubuna (var. inodorus, var. reticulatus ve var. cantalupensis) ait 18 kavun çeşidinde ışınlanmış polen tozlamaları yaparak haploid embriyo uyartımında genotip etkisini araştırmışlardır. Bu çalışmalarda kavunun üç botanik varyetesine yayılmış olan 14 genotipte embriyo elde edildiğini ve bunların in vitro embriyo kurtarma yoluyla bitkiye dönüştürüldüğünü bildiren araştırıcılar, iki saat süre ile %0.5 lik kolhisin uygulamasıyla diploid hatlar oluşturulduğunu açıklamışlardır. Elde ettikleri bu bitkilerin ploidi seviyelerini sitolojik, sitometrik ve morfolojik olmak üzere üç farklı yöntemle belirlemişlerdir. 7

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER Yanmaz ve ark. (1997), altı adet acur (Cucumis melo var. flexuosus) hattında haploid embriyo uyartımına gama ışınının farklı dozlarının etkilerini araştırmışlardır. 250, 300 ve 350 Gy ışın dozları uygulanmış polenlerin ışınlamadan 1, 2 ve 3 gün sonraki canlılıklarını da araştırmışlardır. 250 Gy ışın dozu uygulanan polenlerle tozlanan bitkilerde meyve tutumu gerçekleşmemekle beraber, 300 ve 350 Gy ışın dozları uygulanarak elde edilen meyvelerden kurtarılan embriyoların büyük bir oranı nekrotik olarak bulunmuştur. 300 Gy ışın dozu uygulanarak elde edilen embriyolardan %17.39 u globüler, %23.91 i yürek aşamasında olup 8 inde bitkiye dönüşüm gerçekleşmiş ancak yaşatılamamıştır. Polen canlılığının ise ışın dozu ve polen yaşı arttıkça azaldığı bildirilmiştir. Sandı (1998), kabuksuz çerezlik kabakta haploid bitki elde etme olanaklarını araştırmak amacıyla ışınlanmış polen tekniği ve anter kültürü yöntemini kullanmıştır. Araştırıcı Sezyum 137 gama ışın kaynağını kullanarak 300 ve 350 Gray ışın dozları uygulanan polenlerle, ışın uygulanmamış polenleri kıyasladığında önemli bir farklılık bulunmadığını ve elde ettiği tohumların diploid olduğunu bildirmiştir. Benzer şekilde anter kültürü çalışmalarından da uygun aşamadaki anterlerin 5 mg/l 2,4-D içeren ortamlarda olumlu tepkiler verdiğini, 2,4-D X BA hormon kombinasyonlarının en iyi performansı göstermesine karşın haploid kallus ve embriyo elde edilemediğini bildirmiştir. Çağlar ve Abak (1999a), hıyarda ışınlanmış polen yöntemini yıl boyunca yetiştirdikleri dört çeşit üzerinde denemişler ve haploid uyartımına genotipin, ışın dozlarının ve mevsimin etkisini araştırmışlardır yılları arasında yapılan çalışmada Qamar F1, Seraset F1, Dere ve Çengelköy çeşitlerinde 300, 450 ve 600 Gy ışın dozları uygulanmış polenlerle yıl boyu yapılan tozlamalar sonucunda tüm genotiplerde başarı elde etmişlerdir. Çalışmada en yüksek embriyo uyartımı 300 Gy ışın dozu ile elde edilmiş; mevsim olarak da en iyi sonuçlar ilkbahar ve yaz aylarında (Mayıs Haziran) alınmıştır. Yine Çağlar ve Abak (1999b), bir öncekinin devamı niteliğindeki çalışmalarında haploid embriyoların in vitro kültürde bitkiye dönüştürülmesi üzerinde elde ettikleri araştırma sonuçlarını vermişlerdir. Bu çalışmada, farklı gelişme dönemlerindeki embriyolardan yürek şekli gibi daha ileri gelişim 8

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER safhalarındaki haploid embriyoların, globüler safhadakilere göre daha kısa zamanda ve daha yüksek oranda bitkiye dönüştüğü rapor edilmiştir. Ayrıca meyve başına elde edilen haploid bitki sayısının genotip olarak en çok Çengelköy çeşidinde ve dönem olarak Haziran ayında gerçekleştiği; bununla birlikte iki yılın sonunda 4 genotipten de yeterli bitki alındığı ve elde edilen toplam haploid bitki sayısının 190 olduğu belirtilmiştir. Bu iki çalışma ile hıyarda haploid embriyo uyartımı ve bitki elde edilmesi, bu bitkilerden dihaploid hatlar oluşturulması ile ilgili protokoller ortaya çıkartılmış, Türkiye için uygun takvimler belirlenmiştir. Faris ve ark. (1999), hıyarda haploid embriyo üretiminde mümkün olabilen en düşük gama ışın dozunu belirlemek ve etkilerini gözlemlemek amacıyla çalışmışlar ve buna yönelik olarak iki deneme kurmuşlardır. İlk denemede 5 hıyar hattı (Gy 3, M, Gin, B, Og) ve bunların melezlemesiyle oluşan 3 hibrite (Gy 3 x M, B x Gin, B x Og) 200 ve 300 Gy ışın dozları uygulanmıştır. Çalışılan genotipler arasında embriyo sayılarının toplamı açısından önemli bir fark olmadığı ve embriyoların bitkiye dönüşüm oranının yaklaşık % 3.3 olduğu bildirilmiştir. İkinci denemede, ilk denemede en yüksek bitkiye dönüşüm oranına sahip Gy 3 ve M genotipleriyle Gy 3 x M melezi kullanılmıştır. 100, 200 ve 300 Gy ışın dozları uygulanarak elde edilen embriyoların bitkiye dönüşüm oranı %7.7 olarak bulunmuş; 50 Gy ışın dozu uygulamasından ise elde edilen tüm embriyoların diploid olduğu belirlenmiştir. Daha sonra yapılan başka denemelerle de 100 Gy ışın dozunun yüksek sayıda haploid embriyo veren en düşük doz olduğu ancak başarının bitkinin genotipine, fizyolojik koşullarına ve kültür koşullarına göre değiştiği belirtilmiştir. Kavun, karpuz ve hıyarda olumlu sonuçlar vermesinin ardından Çukurova Üniversitesi nde kabakta (Cucurbita pepo) da ışınlanmış polen tekniğini kullanarak haploid bitkiler uyartımı üzerinde çalışmışlar ve başarılı sonuçlar elde etmişlerdir (Kurtar ve ark., 2002). Anılan çalışmada farklı gama ışını dozları (25, 50, 75, 100, 200, 300 ve 400 Gray) ile farklı genotipler (Eskenderany F1, Acceste F1, Sakız ve Urfa Yerli) kullanılmıştır. Daha önce kavun, hıyar ve karpuzda izlenen yöntemlere benzer bir şekilde yürütülen çalışmalar sonunda ışınlamadan 4 5 hafta sonra hasat edilen meyvelerden çıkarılan embriyoların farklı şekil ve dönemlerde (nokta, 9

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER globüler, ok ucu, çubuk, torpedo ve kalp) oldukları belirlenmiştir. En iyi partenogenetik uyartının 25 ve 50 Gy ışın dozlarında gerçekleştiği ve in vitro kültür sonrasında 93 adet haploid bitki üretildiği belirtilmiştir. Genotipler içinde de en çok haploid bitki veren Eskenderany F1 ve Sakız genotipleri olmuştur. Ploidi seviyesi, kök ucu kromozom sayımı yapılarak belirlenmiş; bu bulgular stoma özellikleri incelenip morfolojik gözlemler yapılarak ta desteklenmiştir. Lotfi ve ark. (2003), kavunda birçok virüse dirençli (CMV, ZYMV, WMV ve külleme) hatların melezlenmesiyle elde edilen uygun iki hibrit materyal kullanılarak haploid ve dihaploid bitki üretme protokolü geliştirmişlerdir. Bu amaçla ışınlanmış polen ile yapılan tozlamadan (250 Gy) sonra elde edilen tohumları çimlenene kadar sıvı ortama alıp ardından katı ortama transfer ederek ya da direk katı ortama alarak iki ortamı kıyaslamışlardır. Araştırıcılar 175 bitkiden seçilerek oluşturulan üç hatta ait bitkilerin yaprak dokularından örnekler alarak flow sitometri yöntemiyle ploidi düzeylerine bakmışlardır. Sonuç olarak 2 hattın doğal dihaploid, 3. nün ise hem haploid hem de diploid hücreler içerdiğini (miksoploid) bildirmişlerdir. Kalan bitkilerin çiçeklenme aşamasında, steril olanlarına yapılan flow sitometri analizleri ile 20 bitkinin tamamının haploid bulunduğunu bildirmişlerdir. Kolhisin uygulamalarının başarısız olması üzerine haploid bitkilerdeki sürgünler in vitro ortamda çoğaltılarak elde edilen 167 bitkiye kolhisin uygulamışlardır. Bunlardan elde edilen 156 bitkinin %64 ünün miksoploid, %6 sının ise dihaploid olduğu bildirilmiştir. İstenilen özellikleri taşıyan dihaploid hatların oluşturulmasının kavun ıslahçıları için değerli bir araç olacağı bildirilmiştir. Lim ve Earle (2008); üç genotipte dihaploid bitkiler elde etmek amacıyla ışınlanmış polenle tozlama yöntemini kullanarak elde ettikleri 63 partenogenetik kavun bitkiciğini boğumlarından keserek in vitro ortamda çoğaltmışlardır. Genel olarak Lotfi ve ark.(2003) tarafından izlenen yöntemleri temel alıp laboratuar ve arazi koşullarında kolhisin uygulamalarının hayatta kalma, ploidi düzeyi, polen üretimi ve meyve oluşumu üzerindeki etkilerini test etmişlerdir. En etkili yöntem olarak belirledikleri arazi koşullarında kökün 3cm lik uç kısmı 500 mg/l lik kolhisine 3 saat daldırma işlemi sonucunda eksplantların %83 ünün canlı kalabildiğini; %26 oranında diploidiye dönüşüm gerçekleştiğini ve polen üreten bitkilerde de meyve 10

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER üretiminin %60 olduğunu bildirmişlerdir. Bir başka yöntem olarak ta genç bitkilerin tepe uçlarına 5000 mg/l kolhisini 2 4 saat uygulayarak meyve oluşumu sağlandığını ancak bu meyvelerin hayatta kalma oranının daha düşük olup morfolojik anormalliklere neden olduğunu belirtmişlerdir. Bu çalışmanın partenogenetik kavun bitkilerinden meyve ve tohum elde edilmesi üzerine yapılmış kapsamlı ilk çalışma olduğunu ve partenogenetik kavun bitkilerinden ürün elde edilmesi için stratejilerin geliştirilmesi gerektiğini ortaya koymuşlardır. Lotfi ve Salehi (2008); iki melez hıyar hattında 250 Gy ışın dozu uygulanan polenlerle yaptıkları tozlamalardan 3 hafta sonra elde ettikleri tohumların embriyolarını kurtarmak amacıyla tek tek açma yöntemine alternatif olarak tohumları 10 gün boyunca sıvı ortamda tuttuktan sonra embriyolarını almışlardır. Elde ettikleri embriyoların %51 inin bitkiye dönüştüğünü bildiren araştırıcılar, içinde embriyo olan tohumların 10 gün içinde çimlenmeye başladığından yeşile döndüğünü ve tek tek açmaya gerek kalmadan kolaylıkla ayırt edilebildiğinden hızlı embriyo elde ettiklerini ve bunun da embriyo verimliliğini arttırdığından haploid bitki sayısını arttırdığını belirtmişlerdir. Cucurbitaceae familyasında eski çalışmalara ek olarak özellikle hıyarda ve kabakta anter ve ovül- ovaryum kültürleri tekniklerinin geliştirilmesi üzerine de çalışmalar yapılmış ve olumlu sonuçlar alınmıştır: Kabakta anter kültürünü etkileyen etmenleri incelemek amacıyla Metwally ve ark. (1998a), kabağın (Cucurbita pepo ) Eskandarani çeşidinde sakkaroz ve 2,4-D (2,4-diklorofenoksi asetik asit) nin farklı konsantrasyonlarını deneyerek kültüre almışlardır. Sakkarozun 30, 60, 90, 120 ve 150 g/l ve 2,4-D nin 0.1, 1.0, 2.5 ve 5.0 mg/l konsantrasyonlarını kullanılarak sıvı MS anter kültürü ortamları hazırlamışlardır. Bu amaçla tek çekirdekli mikrosporları içeren anterler flamentleri ayrıldıktan sonra sterilize edilmiş ve 20 farklı modifiye MS ortamına her petride on anter olacak şekilde ekmiştir (iki ay). Bu ortamlarda gelişen kalluslar, 0.23µM kinetin ve 0.27µM NAA(2-α naftalin asetik asit) içeren MS ortamlarına (dört hafta) aktarılmıştır. Burada gelişen bitkicikler de büyüme hormanları olmayan MS ortamına kök gelişimi amacıyla transfer edilmiştir. Bitkiciklerin 150 g/l sakkaroz ve 5 mg/l 11

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER 2,4-D eklenmiş MS ortamında en iyi sonucu verdiği ve ışık mikroskobunda bakılarak yapılan sitolojik sonuçlara göre 20 bitkiden %50 sinin haploid olduğu bildirilmiştir. Metwally ve ark. (1998b), ikinci çalışmalarında in vitro ginogenesis aracılığıyla Cucurbita pepo L. dan haploid bitki üretmede ovül kültürü tekniğinin verimliliğini arttırmayı amaçlamışlardır. Bu amaçla antesisten bir gün önce topladıkları ovaryumları 4 C de 0, 2, 4 ve 8 günlük periyotlarla soğuk uygulamasına tabi tuttuktan sonra ovüllerini çıkarıp 2,4-D (2,4-diklorofenoksi asetik asit) nin farklı konsantrasyonlarının ( 0.1, 1.0, 5.0 ve 10 mg/l ) denendiği modifiye MS ortamlarına aktarmışlardır. Dört hafta boyunca 25 C (± 1) de 16 saatlik fotoperiyotta gelişmeleri beklenen ovülleri hormon içermeyen MS ortamına aktararak dört hafta daha bekletmişlerdir. Bu süre sonunda her bir petride bulunan kültüre alınmış 100 ovülden oluşan kallus, bitkicik ve ginogenetik ovül sayılarını belirlenmiş ve oluşan her bitkiciği kültür kaplarında bulunan MS ortamına transfer etmişlerdir. En iyi sonucu veren ortamın 1 ya da 5 mg/l 2,4-D içeren MS ortamı olduğu ve ön uygulamaların olumsuz etki gösterdiği, yapılan sitolojik gözlemler sonucunda da elde edilen bitkilerden her 3 bitkiden 1 inin haploid diğerlerinin ise diploid olduğunun belirlendiğini bildirmişlerdir. Kumar ve ark. (2003) hıyarın (Cucumis sativus L.) Calypso ve Green Long çeşitlerinde yaptıkları çalışmada anter kültürü tekniğiyle haploid bitki üretiminin hıyardaki etkinliğini arttırmada uygun ortam belirlemeyi amaçlamışlardır. Araştırıcılar çiçek tomurcuklarına uyguladıkları sıcak veya soğuk ( 4ºC de 0 10 gün ve 32ºC de bir gün) ön işlemlerinden sonra anterleri alarak farklı büyüme hormonlarının farklı konsantrasyonlarının denendiği B5 ortamlarına aktarmışlardır. 4ºC de 2 gün tutulan çiçek tomurcuklarından daha çok embriyo elde etmişlerdir. Büyüme hormanlarından da özellikle oksin konsantrasyonlarının türden türe değiştiğini ve hıyarda düşük konsantrasyonda sitokinin eklenmesinin androgenesisi teşvik ettiğini gören araştırıcılar IAA, IBA, BAP, KN ve TDZ hormonları eklemişlerdir. Hiç tepki vermeyen bu iki türde 2 µm 2,4-D ve 1µM BAP hormonları eklenerek modifiye edilen B5 ortamının en iyi sonucu verdiğini görmüşlerdir. Kültüre alınan anterleri iki hafta karanlık periyodun ardından 24 C (± 2) de 16 saatlik fotoperiyotta bekletmişlerdir. Ayrıca Green Long çeşitlerinde embriyogenik 12

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER kallus oluşumu gözlenirken Calypso çeşitlerinde direk embriyoların oluştuğunu bildirmişlerdir. Embriyo farklılaşmasında 0.09 M şeker, µm NAA ve 0,25 µm KN; embriyo olgunlaşmasında 5 µm ABA; embriyoların çimlenmesi ve bitkicik oluşumunda da 0,09 M şeker eklenerek oluşturulan B5 ortamları en başarılı ortamlar olarak bulunmuştur. Bitkicikler kontrollü çevre koşullarında dışarıya alıştırılmışlardır. Her türden 24 er bitkicik alınarak kök uçlarındaki ploidi düzeyleri incelendiğinde Calypso çeşidinden 21, Green Long dan 17 haploid bitki bulunduğu bildirilmiştir. YoungQiang ve ark. (2004), Cucurbita pepo nun tozlanmamış ovüllerden rejenere olan bitkilerin ploidi tanımlanmasında bekçi hücrelerindeki kromozom ve kloroplast sayımını kullanmışlardır. Bekçi hücrelerindeki kloroplast sayılarını haploid, diploid ve tetraploitte sırasıyla oranladıklarında yaklaşık 1:2:4 e denk geldiğini belirlemişlerdir. Bekçi hücrelerindeki kloroplast sayılarının ve bekçi hücrelerinin boyutlarının ploidi seviyesini belirlemede güvenilir ve pratik bir yöntem olduğunu ortaya koymuşlardır. Shalaby (2007), Cucurbita pepo da in vitro ovül kültürü yöntemini kullanarak haploid bitki üretimine; genotipin, bitki gövdesindeki dişi çiçeğin durumunun, sıcaklığın ve sakkaroz konsantrasyonlarının etkilerini araştırmıştır. Bu amaçla 4 ayrı deneme kurmuş; bu denemelerde dişi çiçekleri antesisten bir gün önce toplayıp ovüllerini sterilize etmiştir. İlk denemede 12 genotip kullanarak % 3 sakkaroz, 1 mg/l kinetin ve 1 mg/l 2,4-D eklenmiş MS ortamında kültüre almış ve bu genotiplerden en fazla haploid bitki Raad F1 genotipinde bulunmuştur. İkinci denemede aynı ortama iki hibritin (Giad ve Road) ve 3. dişi çiçeklerinden ovülleri ayırarak kültüre almış ve en iyi performansı 2. dişi çiçeklerin ovüllerinden elde etmiştir. Üçüncü denemede Queen F1 hibrit çeşidini 0, 4, 7 ve 12 gün süreyle 4 C ve 32 C ye maruz bırakmıştır. Bu çalışma sonucunda ovüllerin en iyi tepkiyi 4 veya 32 C ye 4 gün maruz bırakıldıklarında verdikleri gözlenmiştir. Son deneme de ise üç sakkaroz konsantrasyonu (30, 60 ve 90 g/l) Eskandarani çeşidinde test edildiğinde en iyi sonuç 30 g/l sakkaroz içeren MS ortamında alınırken, 90 g/l sakkaroz içeren ortamdan sonuç alınamamıştır. Bu dört uygulama sonucunda elde 13

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Meltem BERBER edilen bitkilerin % 65 inin haploid (2n=x=20); %35 inin ise diploid (2n=2x=40) olduğu sitolojik çalışmalarla bulunmuştur. Song ve ark. (2007); hıyarda farklı ekotiplere ve yetişme koşullarına sahip genotipler kullanılarak yaptıkları çalışmada özellikle anter kültüründe haploid bitki elde etmenin genotipler üzerindeki etkisi üzerinde durarak etkin bir anter kültürü protokolü hazırlamak için altı deneme (soğuk ve sıcak ön uygulama, embriyonik kallus, embriyo çimlendirme ortamı ve genotipik etki) kurmuşlardır. Sıcaklık genotiplere bağlı olarak değiştirilmiştir. Soğuk bölgelerdeki hıyarlar soğuk şokuna, sıcak bölgelerdeki hıyarlar sıcak şokuna iyi sonuç vermişlerdir. 16 genotipte kallus oluşumu sağlanırken, değerlendirilen 20 genotipten 3 ü bitki oluşturmuştur. Ningjia No.1 çeşidinde her anterden 3 haploid embriyo ve her 45 anterden 42 dihaploid elde edilmiştir (%93). Rejenere olan bitkilerin orijini sitolojik, morfolojik, AFLP analizleriyle belirlenmiştir. 14

28 3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER 3. MATERYAL VE YÖNTEM Araştırma, 2008 yılında Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümüne ait deneme arazileri ile Doku Kültürü Laboratuarı nda yürütülmüştür Materyal Çalışmada bitki materyali olarak toplam 15 farklı kabak genotipi kullanılmıştır. Bunlardan on tanesi kabuksuz çekirdekli kabak genotipi olup sekizi Çukurova Üniversitesi nde yapılmış seleksiyonlarla elde edilmiş, ikisi ise yurtdışından sağlanmıştır. Biri Yabancı Yeşil diğeri Geisdorfer Ölkürbis adlı olan yabancı çeşitlerin tohumları koyu yeşil renkli, yerli genotipler ise açık yeşil renklidir. Kabuksuz genotiplerin yanında, dördü populasyon biri de çeşit olan (Sakız 5801) beş de kabuklu tohumlara sahip genotip kullanılmıştır. Araştırmada kullanılan genotipler ve özellikleri Çizelge 3.1. de gösterilmiştir. Çizelge 3.1. Denemede kullanılan bitkisel materyal ve özellikleri Genotip Orijin Kabuk Özelliği ÇÜZF No.1 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.2 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.3 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.4 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.5 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.7 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.9 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz ÇÜZF No.10 Çukurova Üniversitesi Kabuksuz Yabancı Yeşil Avusturya Kabuksuz Geisdorfer Ölkürbis Avusturya Kabuksuz İskenderun 1 İskenderun Kabuklu İskenderun 2 İskenderun Kabuklu Edirne Edirne Kabuklu Nevşehir Nevşehir Kabuklu Sakız 5801 Bursa Kabuklu 15

29 3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER 3.2. Yöntem Bitkilerin Yetiştirilmesi Bitkilerin yetiştirilmesi amacıyla tohumlar tarihinde ekilmiştir. Bu amaçla, torf: perlit (2 v / 1 v) karışımı harç içeren 45 gözlü (9x5) viyoller kullanılmıştır. Gelişen fideler 2 3 gerçek yapraklı dönemde iken sıra arası 150 cm, sıra üzerleri 80 cm olacak şekilde plastik seraya tek sıralı olarak dikilmiştir. Dikim tarihinde yapılmıştır ve her genotipten 10 bitki olacak şekilde yapılmıştır (Şekil 3.1). Bitkilerin gelişimi için gerekli ilaçlama, sulama ve gübreleme yapılmıştır. Şekil 3.1. Tezde kullanılan kabak (Cucurbita pepo L.) bitkilerinin seradaki görünümü Çiçeklerin İzolasyonu Çiçeklerin izolasyonu Şekil 3.2.'de de görüldüğü gibi dişi çiçeğin taç yaprağının uç kısmında başlayan renk değişimi ile ertesi gün açacağını 16

30 3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER belirlediğimiz dişi çiçeklerin uç kısımlarının pens ile kapatılmasıyla yapılmıştır. Işınlanmış polenlerle tozlanacak çiçekler bir gün önceden kapatılarak ışınlanmamış polen bulaşması engellenmiştir. Şekil 3.2. Antesisten bir gün önce izole edilen çiçek Polenlerin Işınlanması Işınlama için anthesisten bir gün önceki aşamada olan, henüz açılmamış fakat iyi gelişmiş erkek çiçek tomurcukları seçilerek toplanmıştır (Şekil 3.3. (A)). Bu tomurcukların, taç ve çanak yapraklar ayrıldıktan sonra 9 cm çaplı cam petri kaplarına konulmuş ve γ ışını uygulamasına alınmıştır. Işınlama işlemi Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Radyoloji Onkolojisi Anabilim Dalı nda yapılmıştır. Işın kaynağı olarak Co 60 kullanılmış ve denemelerimizde olmak üzere üç farklı ışın dozu denenmiştir. Işınlanan polenler ertesi sabaha kadar (oda koşullarında) bekletilmiştir (Şekil 3.3. (B) ) Tozlama Işınlamadan sonraki gün sabahın erken saatlerinde, bir gün önce kapatılan dişi çiçekler açılmış ve her bir dişi çiçeğin stigmasına 1 2 erkek çiçek tomurcuğu (Şekil 3.4. (A)) sürtülerek tozlamalar gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.4. (B)). A Tozlamalarda bütün genotiplere ait erkek çiçekler karıştırılarak kullanılmıştır. Tozlamadan sonra yabancı polen girişini engellemek amacıyla tozlanmış dişi 17

31 3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER çiçekler penslerle yeniden kapatılmıştır (Şekil 3.4. (C)). İlerleyen günlerde çiçeklerdeki yumurtalığın gelişme durumu kontrol edilerek, dişi çiçeğin şişkinleşmeye başladığı ve stigmanın kuruduğu dönemde (Şekil 3.5.) pensler çıkarılmıştır. (A) (B) Şekil 3.3. (A)Anthesisten bir gün önce toplanan erkek çiçekler; (B) Taç ve çanak yaprakları ayrılarak ışınlanmak üzere hazırlanmış anterler (A) (B) (C) Şekil 3.4. Işınlanmış polenle tozlama; (A) ışınlanmış erkek çiçekler (B) dişi çiçeğin ışınlanmış polenle tozlanması (C) tozlamadan sonra pensle kapatılarak izole edilmiş dişi çiçek Embriyoların Çıkartılması ve Kültürü Dezenfeksiyon Tozlamalardan gün sonra hasat edilen meyveler laboratuara getirilmiştir (Şekil 3.6). Laboratuvara gelen meyveler önce çeşme suyuyla yıkanıp 18

32 3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER kurulanmış; daha sonra steril kabin içerisinde, % 96 lık saf etil alkol kullanılarak kuru yakma yöntemi ile dezenfekte edilmiştir. Şekil 3.5. Tozlamadan sonra tutan bir meyvenin birkaç gün sonraki görünümü. Şekil 3.6. Hasat aşamasına gelmiş meyveler Embriyoların Çıkarılması Steril kabin içinde kuru yakma sonrası meyveler steril bir bıçak yardımıyla ve içerisindeki tohumlara zarar verilmemesine özen gösterilerek kesilmiştir (Şekil 3.7). Her meyvenin içinden çıkan tohumlar sayılarak steril bir pens ve bisturi yardımıyla tek tek açılmış ve incelenmiştir. Boş (embriyo içermeyen) veya içi tam dolu (çok iri ve diploid olduğu kesin embriyo içeren) (Şekil 3.8.) olan tohumlar atılmış, olgunlaşmamış embriyolar kurtarılarak E20A ortamına aktarılmıştır. Bu embriyolar embriyogenesis aşamalarına göre aşağıdaki gibi gruplandırılmıştır: Globüler aşama; zigotun şekilsiz bir hücre yığını şeklinde olduğu proembriyo aşamasından sonra küre şeklinde ki gelişmekte olan embriyolar Globüler embriyonun çubuk aşaması; bazı genotiplerde küre şeklindeki 3 5 hücreden oluşan suspensoru çubuk görünümünde olan embriyolar Yürek aşaması; yanlara doğru yayvanlaşarak kalp şeklini alan embriyolar Torpedo aşaması; kotiledonların belirerek iki kanat halinde uzadığı görülen embriyolar ( Eti, 2009). 19

33 3. MATERYAL VE YÖNTEM Meltem BERBER Şekil 3.7. Embriyoların çıkarılması Şekil 3.8. Tohumların içinde embriyoların görünümü Besin Ortamları ve Kültür Koşulları Embriyo kurtarma çalışmalarında iki farklı besin ortamından yararlanılmıştır. Kurtarılan embriyolar önce 4 cm çapında ve 5 cm yüksekliğindeki küçük kavanozlarda kültüre alınmış ve besin ortamı olarak E20A kullanılmıştır (Çizelge 3.2). Embriyoların bitkiye dönüşmesi, köklenip mikroçoğaltım aşamasına gelmesinden sonra ise 5 cm çaplı ve 9 cm yükseklikteki kavanozlara aktarılmıştır. Bu aşamada ise besin ortamı olarak daha zengin içerikli olan MS besin ortamı kullanılmıştır (Çizelge 3.3). Tüm kültürler sıcaklığı 25±1 C olan ve fotoperiyodu 16 saat aydınlık 8 saat karanlık olacak şekilde hazırlanmış iklim odasında inkübe edilmiştir (Şekil 3.9.). Şekil 3.9. İklim odasında bulunan MS ortamı içeren büyük kavanozlardaki in vitro kabak bitkicikleri 20