T.C. SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ KONYA, KARAMAN VE AKSARAY ĠLLERĠ KABAKGĠL EKĠM ALANLARINDA GÖRÜLEN VĠRÜS HASTALIKLARININ SEROLOJĠK VE MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE TESPĠTĠ VE ENFEKSĠYON KAYNAKLARININ BELĠRLENMESĠ SERKAN YEġĠL DOKTORA TEZĠ Bitki Koruma Anabilim Dalı Ağustos-2013 KONYA Her Hakkı Saklıdır

2

3

4 ÖZET DOKTORA TEZĠ KONYA, KARAMAN VE AKSARAY ĠLLERĠ KABAKGĠL EKĠM ALANLARINDA GÖRÜLEN VĠRÜS HASTALIKLARININ SEROLOJĠK VE MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE TESPĠTĠ VE ENFEKSĠYON KAYNAKLARININ BELĠRLENMESĠ SERKAN YEġĠL Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı DanıĢman: Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ 2013, 127 Sayfa Jüri Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ Prof. Dr. Nuh BOYRAZ Prof. Dr. Önder TÜRKMEN Yrd. Doç. Dr. Kubilay K. BAġTAġ Yrd. Doç. Dr. Hasibe CĠNGĠLLĠ VURAL Bu çalışma, Konya, Karaman ve Aksaray illeri kabakgil ekim alanlarındaki virüs enfeksiyonlarını ve bunların enfeksiyon kaynaklarını belirlemek amacıyla gerçekleştirilmiştir ve 2010 yıllarında, toplam olarak virüs hastalığı belirtileri gösteren 652 kabakgil bitki örneği, 92 tohum örneği ve 85 yabancı ot örneği toplanmıştır. Virüsler DAS-ELISA ve RT-PCR ile tanımlanmıştır. Sonuçlar, bitki örneklerinin %83,4 ünün, yabancı ot örneklerinin %50,6 sının ve tohum örneklerinin ise %8,7 sinin Zucchini yellow mosaic Potyvirus (ZYMV), Watermelon mosaic Potyvirus-2 (WMV-2), Cucumber mosaic Cucumovirus (CMV), Papaya ringspot Potyvirus-watermelon strain (PRSV-W) veya Squash mosaic Comovirus (SqMV) ile enfekteli olduğunu göstermiştir. Test sonuçlarına gore, bitki örnekleri için ZYMV (%51,7), WMV-2 (%45,2) ve CMV (%21,3), tohum örnekleri için ZYMV (%4,3), WMV-2 (%3,3) ve CMV (%1,1) ve yabancı ot örnekleri için CMV (% 36,5), WMV-2 (%22,3) ve ZYMV (%15,3) hâkim virüslerdir. Bunun yanında, özellikle bitki örneklerinde karışık enfeksiyonların, oldukça yaygın olduğu belirlenmiştir. Testi yapılan hiçbir örnekte ise Cucumber green mottle mosaic Tobamovirus (CGMMV) enfeksiyonu saptanmamıştır. Aynı zamanda, bu çalışmada, kabakgil bitkilerinden toplanan 17 afid örneği RT-PCR testine tabi tutulmuştur. Bu örneklerde ise CMV, ZYMV (%17,6) ve WMV-2 (%11,7) enfeksiyonları tespit edilmiştir. Çalışmanın sonraki aşamasında ise 5 ZYMV, 3 WMV-2 ve 2 CMV izolatının dizileri belirlenerek, WMV-2 (KF021298, KF ve KF021300) ve CMV (KC ve KC989615) izolatlarının dizileri GenBank a kaydettirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Aksaray, CMV, Cucurbitaceae, Enfeksiyon kaynakları, Karaman, Konya, WMV-2, ZYMV. iv

5 ABSTRACT Ph.D THESIS DETECTION OF VIRUS DISEASES OF CUCURBITS IN KONYA, KARAMAN AND AKSARAY PROVINCES BY SEROLOGIC AND MOLECULAR METHODS AND DETERMINATION OF INFECTION SOURCES Serkan YEġĠL THE GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE OF SELÇUK UNIVERSITY THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY IN DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION Advisor: Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ 2013, 127 Pages Jury Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ Prof. Dr. Nuh BOYRAZ Prof. Dr. Önder TÜRKMEN Asst. Prof. Dr. Kubilay K. BAġTAġ Asst. Prof. Dr. Hasibe CĠNGĠLLĠ VURAL This study was conducted in order to determine the virus infections and their infection sources in major cucurbit growing areas in Konya, Karaman and Aksaray provinces. In total, 652 cucurbit plant samples with common symptoms of virus infections, 92 seed samples and 85 weed samples were collected during 2009 and The viruses were identified by DAS-ELISA and RT-PCR. The results showed that 83,4% of plant samples, 50,6% of weed samples and 8,7% of seed samples were infected with Zucchini yellow mosaic Potyvirus (ZYMV), Watermelon mosaic Potyvirus-2 (WMV-2), Cucumber mosaic Cucumovirus (CMV), Papaya ringspot Potyvirus-watermelon strain (PRSV-W) or Squash mosaic Comovirus (SqMV). According to the test results, predominant viruses were ZYMV (51,7%), WMV-2 (45,2%) and CMV (21,3%) for plant samples, ZYMV (4,3%), WMV-2 (3,3%) and CMV (1,1%) for seed samples and CMV (36,5%), WMV-2 (22,3%) and ZYMV (15,3%) for weed samples. Also mixed infections were determined commonly especially in plant samples. Cucumber green mottle mosaic Tobamovirus (CGMMV) was not determined in any of the tested samples. In this study, also, 17 aphid samples were collected on cucurbit plants and RT-PCR test was performed. CMV, ZYMV (17,6%) and WMV-2 (11,7%) infections were detected from aphid samples. In the further stage of the study, isolates of ZYMV (5), WMV-2 (3) and CMV (2) were sequenced and CMV (KC KC989615) and WMV-2 (KF KF KF021300) sequences were submitted to GenBank database. Keywords: Aksaray, CMV, Cucurbitaceae, Infection sources, Karaman, Konya, WMV-2, ZYMV. v

6 ÖNSÖZ Tez çalışmasının her aşamasında yardımcı olan danışman hocam sayın Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ a, ikinci danışmanım Prof. Dr. Nuh BOYRAZ ve tez izleme komitesi üyesi Yrd. Doç. Dr. Kubilay K. BAŞTAŞ a, arazi ve laboratuar çalışmalarında yardımcı olan bölüm stajyer öğrencilerine ve çalışanlarına, maddi destek sağlayan S.Ü. BAP yönetimine teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca eşime ve ailemin tüm bireylerine, verdikleri destek ve gösterdikleri hoşgörüden dolayı sonsuz teşekkür ederim. Serkan YEŞİL KONYA-2013 vi

7 ĠÇĠNDEKĠLER ÖZET... iv ABSTRACT... v ÖNSÖZ... vi ĠÇĠNDEKĠLER... vii SĠMGELER VE KISALTMALAR... ix 1. GĠRĠġ KAYNAK ARAġTIRMASI Kabakgil Bitkilerinde Virüslerin Tanılanması ve Yaygınlıkları Ülkemizde Kabakgil Virüsleri Üzerinde Yapılan Çalışmalar Enfeksiyon Kaynakları ve Mücadele Yolları Genetik Çalışmalar MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Virüs ile enfekteli kabakgil bitki materyalinin temini Serolojik testlerde kullanılan materyal Moleküler çalışmalarda kullanılan materyal Total nükleik asit (TNA) ekstraksiyonunda kullanılan materyal RT-PCR ve PCR testlerinde kullanılan materyal Agaroz jel elektroforez çalışmalarında kullanılan materyal Araştırmada kullanılan diğer materyal Yöntem Arazi çalışmaları ve örnekleme Serolojik test yöntemi (DAS-ELISA) Moleküler çalışmalar Total nükleik asit (TNA) ekstraksiyonu Komplementer DNA (cdna) sentezi PCR çalışmaları Multiplex-RT-PCR Çalışmaları Agaroz-Jel Elektroforez Çalışmaları Dizi Belirleme ve BLAST Analizi Çalışmaları ARAġTIRMA BULGULARI VE TARTIġMA Kabakgil Üretim Alanlarından Toplanan Örnekler Kabakgil Üretim Alanlarındaki Enfekteli Bitkilerde Görülen Virutik Belirtiler DAS-ELISA Çalışmaları Moleküler Çalışmalar TNA (Total Nükleik Asit) ekstraksiyon çalışmaları RT-PCR çalışmaları Dizi Belirleme ve BLAST Analizi Çalışmaları Hıyar mozayik virüsü (CMV) dizi analizi çalışmaları Karpuz mozayik virüsü-2 (WMV-2) dizi analizi çalışmaları Kabak sarı mozayik virüsü (ZYMV) dizi analizi çalışmaları SONUÇLAR VE ÖNERĠLER vii

8 5.1. Sonuçlar DAS-ELISA çalışmalarına ilişkin sonuçlar RT-PCR çalışmalarına ilişkin sonuçlar Dizi belirleme çalışmalarına ilişkin sonuçlar Öneriler KAYNAKLAR EKLER ÖZGEÇMĠġ viii

9 SĠMGELER VE KISALTMALAR Simgeler % : Yüzde o C : Santigrat derece da : Dekar dk : Dakika g : Gram µg : Mikrogram µl : Mikrolitre µm : Mikromolar M : Molar mg : Miligram ml : Mililitre mm : Milimolar ph : Hidrojen İyon Konsantrasyonunun Negatif Logaritması pmol : Pikomol sn : Saniye U : Unite V : Volt Kısaltmalar AMV : Alfalfa mosaic alfamovirus BPYV : Beet pseudo yellows closterovirus CABYV : Cucurbit aphid-borne yellows polerovirus cdna : Komplementer deoksiribonükleikasit CGMMV : Cucumber green mottle mosaic tobamovirus CMV : Cucumber mosaic cucumovirus CuNV : Cucumber necrosis tombusvirus CVYV : Cucumber vein yellowing ipomovirus CYSDV : Cucumber yellow stunting disorder crinivirus DAS-ELISA : Double Antibody Sandwich ELISA ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay LIYV : Lettuce infectious yellows crinivirus MNSV : Melon necrotic spot carmovirus PAS-ELISA : Protein A Sandwich-ELISA PCR : Polymerase Chain Reaction PRSV-W : Papaya ringspot potyvirus PTA-ELISA : Plate Trapped Antigen - ELISA PYMV : Potato yellow mosaic begomovirus PYVMV : Pumpkin yellow vein mosaic begomovirus RNA : Ribonükleikasit RNAse : Ribonükleaz enzim rpm : Dakikadaki devir sayısı RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SDS : Sodium dodecyl sulphate SLCV : Squash leaf curl begomovirus SqMV : Squash mosaic comovirus TBRV : Tomato black ring nepovirus TBSV : Tomato bushy stunt tombusvirus ix

10 TMV TNA ToMV ToRSV TLCV TRV TSWV WMV-2 ZLCV ZYFV ZYMV : Tobacco mosaic tobamovirus : Total Nükleik Asit : Tomato mosaic tobamovirus : Tomato ringspot nepovirus : Tobacco leaf curl begomovirus : Tobacco rattle tobravirus : Tomato spotted wilt tospovirus : Watermelon mosaic potyvirus-2 : Zucchini lethal chlorosis tospovirus : Zucchini yellow fleck potyvirus : Zucchini yellow mosaic potyvirus x

11 1 1. GĠRĠġ Kabakgil bitkileri Cucurbitaceaea familyası içerisinde yer almaktadır. Bu familya içerisinde yaklaşık 119 cins ve 825 tür bulunmaktadır. Öncelikle tropikal ve subtropikal bölgeler olmak üzere, dünyanın her yerinde bu türlerin bazılarının tarımı yapılmaktadır (Andres, 2004). Kavun (Cucumis melo L.), hıyar (Cucumis sativus L.), kabak (Cucurbita pepo L.), karpuz (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai), bal kabağı (Cucurbita moschata L.), kestane kabağı (Cucurbita maxima L.) ve acur (Cucumis anguria) bu familyada başlıca tarımı yapılan türlerdir (Günay, 1993). Cucurbitaceae familyasındaki sebzelerin yetiştiriciliği çok eski yıllara dayanmaktadır. Theben (Mısır) de KAHUN un mezarında bulunan belgelerde hıyar ve diğer Cucurbitaceae familyası bitkilerinin M.Ö yıllarında yetiştirildiği anlaşılmaktadır. Hıyarın ana vatanı konusunda araştırıcılar Çin, Hindistan, İran ve Anadolu yu içine alan bir bölgeden dünyaya yayıldığı konusunda fikir birliği içindedirler. Kabakların ana vatanının Amerika olduğu ve özellikle C. pepo ve C. moschata nın dünyaya buradan yayıldığı, C. maxima nın ise Asya kökenli olduğu bilinmektedir. Kavunun kökeni geniş bir bölge içinde tanımlanmaktadır. Anadolu, Afganistan, İran, Orta Asya ve Güney batı Asya kavunun gen merkezleri arasındadır. Karpuzun ana vatanı Orta Afrika dır. Bazı araştırıcılar farklı bölgeleri vurgulasalar da Afrika da birçok yabani karpuza bol miktarda rastlanması, karpuzun gen merkezinin Orta Afrika olduğunu kesin bir şekilde kanıtlamıştır (Günay, 1993). Kabak dünyanın pek çok yerinde olduğu gibi meyvesi için üretilmesinin yanı sıra tohumları ve çiçekleri için de üretilmektedir. Çerezlik kabak yetiştiriciliğinin yemeklik kabak tarımına göre bazı avantajları vardır. Bunlar, sulamanın sık yapılmasına gerek olmaması veya tamamen kıraç koşullarda da çerezlik kabak tarımının yapılabilmesi, ekim nöbeti için uygun bir tür olabilmesi, hasat kolaylığı, kültürel işlemlerin büyük oranda makine ile yapılabilmesi, hastalık ve zararlılar açısından fazla sıkıntıya yol açmaması gibi nedenler sayılabilir. Ülkemizde çerezlik kabak tarımı genelde C. pepo ile yapılmaktadır. Nadiren C. moschata türü de çekirdeklik kabak tarımı için kullanılmaktadır (Yanmaz ve Düzeltir, 2003). Kavun insan beslenmesi ve sağlığı açısından önemli bir sebze türüdür. Küçük meyveleri turşu sanayinde önemli bir yer alır. Karpuz su içeriği nedeniyle ülkemizde serinletici olarak bilinen bir yaz sebzesidir. Karpuz meyvesinde oldukça yüksek oranda şeker, A, B, C vitaminleri ve birçok mineral madde vardır. Karpuzun taze tüketiminin

12 2 yanı sıra kabuklarından ve küçük meyvelerinden turşu ve reçel yapılmaktadır (Vural ve ark., 2000). Türkiye, dünyada en fazla sebze üreten ülkelerden bir tanesi durumundadır. Çizelge 1.1 de görüldüğü gibi, ülkemiz, FAO 2010 yılı üretim değerleri verilerine göre dünyada kavun ve karpuz üretiminde ikinci, hıyar üretiminde üçüncü ve kabak üretiminde ise onuncu sırada yer almaktadır. Çin, İran, ABD ve Hindistan ülkemiz ile birlikte dünyada kabakgil üretiminde söz sahibi ülkeler arasında yer almaktadırlar. Çizelge yılı verilerine göre Dünya da kabakgiller üretiminde önde gelen ülkeler ve üretim miktarları (ton) (Anonymous, 2013) Bitkiler Sıra Hıyar Kavun Karpuz Kabak 1 Çin Çin Çin Çin İran Türkiye Türkiye Hindistan Türkiye İran İran Rusya Rusya Mısır Brezilya ABD ABD ABD ABD İran Ukrayna İspanya Mısır Mısır İspanya Hindistan Özbekistan Meksika Mısır Fas Rusya Ukrayna Japonya Meksika Meksika İtalya Endonezya Guatemala Cezayir Türkiye Kabakgiller familyası içerisindeki sebzeler, ülkemiz yıllık toplam sebze üretiminin yaklaşık olarak % 30 unu oluşturmaktadırlar. Çizelge 1.2. de bu ürünlerin yıllık üretim miktarları görülmektedir. Çizelge 1.2. Türkiye de 2010 yılı kabakgil bitkileri üretim miktarları (Anonim, 2012) Bitki türü Üretim miktarı (ton) Karpuz Hıyar Kavun Sakız kabağı Bal kabağı Çerezlik kabak (kabak çekirdeği) Acur

13 3 Arazi çalışmalarının gerçekleştirildiği, Konya, Karaman ve Aksaray illeri ve ilçelerinde 2008 yılı verilerine göre sırasıyla; da. lık tarım alanında ton, da. lık tarım alanında ton ve da. lık tarım alanında ton kabakgil bitkisi üretilmiştir. Bu üç il ve ilçelerinde ise toplam olarak da. lık tarım alanında ton kabakgil bitkisi üretilmiştir. Bunların içinde en fazla ekim alanı ve üretim miktarına sahip olanlar ise sırasıyla, çerezlik kabak ( da, 6783,5 ton), karpuz ( da, ton) kavun ( da, ton) ve sofralık hıyar ( da, ton) dır (Anonim, 2009a,b,c). Konya ili ve ilçelerinde kabakgil bitkilerinden en fazla ekim alanı ve üretim miktarına sahip bitkiler sırasıyla; çerezlik kabak ( da, ton), kavun ( da, ton) ve karpuz ( da, ton) dur. En fazla ekim alanına sahip olan ilçeleri ise Çumra, Ereğli, Altınekin, Yunak, Meram ve Karatay dır (Anonim, 2009a). Örnekleme çalışmaları bu ilçelerdeki ekim alanlarında gerçekleştirilmiştir. Özellikle Çumra ilçesi, hoş lezzet ve aromaya sahip olan kavunu ile tanınmaktadır. Ve bu bölgedeki üreticiler uzun yıllardan beri kavun ve karpuz yetiştiriciliği yapmaktadırlar. Karaman ili ve ilçelerinde kabakgil bitkilerinden en fazla ekim alanı ve üretim miktarına sahip bitkiler sırasıyla; karpuz ( da, ton), sofralık hıyar (9780 da, ton) ve çerezlik kabak (8.950 da, 1.052,5 ton) tır. En fazla ekim alanına sahip olan ilçeleri ise merkez, Ayrancı ve Kazımkarabekir dir (Anonim, 2009b). Aksaray ili ve ilçelerinde kabakgil bitkilerinden en fazla ekim alanı ve üretim miktarına sahip bitkiler sırasıyla; çerezlik kabak ( da, 3638 ton), sofralık hıyar (2.604 da, ton) ve kavun (1.883 da, ton) dur. En fazla ekim alanına sahip olan ilçeleri ise merkez, Gülağaç ve Ortaköy dür (Anonim, 2009c). Çalışmanın gerçekleştirildiği üretim alanlarında yerel standart ve hibrid kabakgil çeşitlerinin üretimi yapılmaktadır. Ticari amaçlı üretim yapılan alanlarda daha çok hibrid çeşitler kullanılmaktadır. Fakat bölgede en fazla üretimi yapılan kabakgil bitkisi olan çerezlik kabakta hibrid bir çeşit mevcut değildir. Üreticiler daha çok Nevşehir sivrisi ve Çerçeveli isimli yerli populasyonları kullanmaktadır. Sakızkabağı üretiminde ise koyu yeşil (kara kabak) ve beyaz renkli yerli populasyonlarla birlikte, Profit F1, Akça F1, Zümrüt F1 ve Meram F1 gibi hibrid çeşitler de ekilmektedir. Daha çok Konya nın Çumra ilçesinde yoğun bir üretim alanına sahip olan kavun için ise Kırkağaç kavunu (637), Ankara (Hıdır) kavunu, Sürmeli F1, Sinem F1 ve Edalı F1 gibi çeşitler kullanılmaktadır. Karpuz üretiminde Crimson sweet ile Karacan F1, hıyar

14 4 üretiminde Tuana F1, Toros F1 ve Altay F1 gibi hibrid çeşitler kullanılırken, acur üretiminde ise yerli populasyonlar tercih edilmektedir. Kabakgiller pek çok virüs hastalığına konukçuluk etmekte ve bu ürünlerde önemli düzeylerde ürün kayıpları meydana gelmektedir. Dünya da kabakgiller familyası içindeki bitki türlerinde zarar yapan ve ekonomik kayıplara neden olan çok sayıda virüs hastalığı bulunmaktadır (Zitter ve ark, 1996). Kabak Sarı Mozayik Virüsü (Zucchini Yellow Mosaic Virus, ZYMV), Hıyar Mozayik Virüsü (Cucumber Mosaic Virus, CMV), Kabak Mozayik Virüsü (Squash Mosaic Virus, SqMV), Karpuz Mozayik Virüsü-2 (Watermelon Mosaic Virus-2, WMV-2) ve Papaya Halka Leke Virüsü (Papaya Ring Spot Virus, PRSV) kabakgillere zarar veren virüslerden bazılarıdır (Lisa ve Lecoq, 1984; Purcifull ve ark, 1984). Bu virüs hastalıkları bitkilerde gelişme geriliğine, şiddetli infeksiyonlar sonucu anormal meyve ve yeşil aksam oluşumuna neden olmakta, hatta meyve oluşumunu tamamen engelleyebilmektedir. Planlanan bu çalışma ile, Konya, Karaman ve Aksaray illeri kabakgil bitkileri ekim alanlarında sorun olan virüs hastalıkları ve bu hastalıkların enfeksiyon kaynakları serolojik ve moleküler yöntemlerle tespit edilmiştir. Ayrıca, çalışma yapılan üretim alanlarında yoğun olarak izole edilen ZYMV, WMV-2 ve CMV izolatlarının bir kısmının kılıf proteinleri genlerinin nükleotid dizileri kısmi olarak belirlenerek izolatlar arasındaki genetik yakınlıklar ve ayrıca daha önce yapılan çalışmalardan elde edilen sonuçlarla karşılaştarılarak tespit edilen izolatların dünyadaki izolatlarla genetik yakınlıkları belirlenmiştir.

15 5 2. KAYNAK ARAġTIRMASI 2.1. Kabakgil Bitkilerinde Virüslerin Tanılanması ve Yaygınlıkları Kabakgil bitkilerinin üretimi sırasında karşılaşılan sorunların başında hastalıklar ve zararlılar gelmektedir. Zitter (1996), kabakgil sebze türlerinde önemli düzeyde verim ve kalite kaybına yol açan 200 den fazla hastalık olduğunu bildirmiştir. Kabakgil bitkilerinde hastalıklara neden olan etmenler arasında virüslerin sebep olduğu zararların daha fazla olduğu bildirilmektedir (Yılmaz ve Çığşar, 2006). Viral hastalıklar dünya çapında önemli ekonomik kayıplara yol açmaktadır. Kabakgil bitkilerinde 50 den fazla virüs ve 4 viroid enfeksiyon meydana getirebilmektedir. Kabakgil virüslerinin bir kısmı henüz tam olarak karakterize edilememiş olup aynı virüs farklı adlarla isimlendirilmektedir (Lovisolo, 1980). Kabakgillerden bugüne kadar 35 den fazla virüs izole edilmiştir (Provvidenti, 1996). Lisa ve Lecoq (1984), kabakgillerde 32 adet virüs ve virüs benzeri hastalık etmeni tespit edildiğini ve bu virüslerin 26 adedinin mekanik olarak özsu ile 9 adedinin ise tohum ile taşındığını rapor etmektedirler. Bunlar içerisinde ise; ZYMV, CMV, SqMV, WMV-2 ve PRSV nün kabakgillere zarar veren önemli virüsler olduğunu bildirmektedirler. Meng ve ark. (2007), Gu ve ark. (2002) na atfen, kabakgillerde 46 virüs türünün hastalık yaptığını ve bunlardan en önemlilerinin ise ZYMV, WMV, CMV, PRSV-W ve SqMV olduğunu bildirmektedirler. Dünya da ve ülkemizde, kabakgil ekim alanlarında saptanan virüs hastalıkları Çizelge 2.1 de gösterilmektedir yılında Florida da gerçekleştirilen bir çalışmada, yapraklarında mozayik belirtisi gösteren 39 adet kabak örnekleri toplanmış ve SDS-immunodiffusion testi ile WMV-1, WMV 2, WMV-M, SqMV ve CMV ne karşı testlenmişlerdir. Bu örneklerin 7 tanesinin WMV-1, 21 tanesinin WMV-2, 8 tanesinin WMV-1+WMV-2, 3 tanesinin de serolojik olarak WMV-2 ye benzeyen farklı bir virüsle bulaşık olduğu belirlenmiştir. Örneklerin hiçbirinde WMV-M, SqMV ve CMV saptanmamıştır. WMV-2 ye benzeyen izolatlardan bir tanesi (1119) sera koşullarında sakız kabağına mekanik olarak bulaştırıldığında yapraklarda; sistemik mozayik, damar bantlaşması, kıvrılma ve kabarcık tipinde simptom gösterdiği bildirilmiştir. Bu izolat, aynı zamanda, lif kabağı, karpuz ve hıyarda sistemik infeksiyon, C. amaranthicolor, C. quinoa, Phaseolus

16 6 vulgaris ve Pisum sativum Alaska da lokal infeksiyonlara neden olmuştur. Virüsün Myzus persicae ile taşındığı tespit edilerek uzun ipliksi partiküllerin yaklaşık 760nm olduğu kaydedilmiştir nolu bu izolatın 1982 yılında Florida nın farklı bölgelerinde izole edilen ZYMV ne serolojik ve simptomatolojik açılardan oldukça benzer olduğu bildirilmektedir (Purcifull ve ark., 1984). Çizelge 2.1. Dünya da kabakgil üretim alanlarında tespit edilen virüsler Virüs adı Konukçu bitki türü Ülke Kaynak WMV-1, WMV-2, CMV Kabak ABD Webb, 1971 WMV-1 (PRSV-W), WMV-2 Bal ve sakız kabağı Avustralya Greber, 1978 CMV, WMV-2 Kabakgiller İran Rahimian ve Izadpanah, 1978 WMV-2 Bal kabağı Irak Shawkat ve Fegla, 1979 CMV, WMV-2, CGMMV Kavun Japonya Yoshida ve ark., 1980 ZYMV Kabak İtalya Lisa ve ark., 1981 WMV-2 Kavun, kabak Ürdün Al-Musa ve ark., 1982 WMV-2, SqMV Kavun ABD Dodds ve ark., 1984 ZYMV Kabakgiller ABD Nameth ve ark., 1985 WMV-1, WMV-2, ZYMV, CMV, SqMV, SLCV ve LIYV Kabakgiller ABD Nameth ve ark., 1986 ZYMV, WMV-1, CMV Kavun, karpuz Tayland Chang ve ark., 1987 CMV, WMV-2 Kabak ABD Davis ve Mizuki, 1987 WMV-2, PRSV-W, WMV-Morocco Kabakgiller Güney Afrika Meer ve Garnett, 1987 ZYMV, WMV-2 Kabak ABD Crosslin ve ark., 1988 ZYMV Kabak, kavun İran Ghorbani, 1988 ZYMV, CMV, WMV-2 Hıyar Japonya Iwasaki ve Inaba, 1988 CMV, PRSV-W, WMV-2, TRSV Kabak ABD Sammons ve ark., 1989 CMV, PRSV-W, WMV-2, ZYMV Kabakgiller Meksika Delgadillo-Sanches ve ark., 1989 ZYMV Kabak Çekoslavakya Chod ve Jokes, 1991 CMV, WMV-2, ZYMV Kabak, hıyar Yunanistan Kyriakopoulou ve Varveri, 1991 WMV-2, CMV, PYMV, PYVMV Bal kabağı Hindistan Singh ve ark., 1991 CMV, CVYV, ZYMV Hıyar Ürdün Mansour, 1994 ZYMV Kavun Meksika Orozco ve ark., 1994 WMV-2, SqMV Kabak ABD Celeste ve ark., 1996 ZYMV Kabak Martinik Desbiez ve ark., 1996 CMV, CABYV, PRSV-W, ZYMV Kabakgiller Nepal Dahal ve ark., 1997 WMV-2, PRSV, WMV-2, ZYMV Karpuz, kabak ABD Murphy ve ark., 2000 ZYMV, CABYV, WMV-2, PRSV-W, CMV Kabakgiller Lübnan Abou-Jawdah ve ark., 2000 WMV-2, PRSV-W, ZYMV Kavun, karpuz Brezilya Oliveira ve ark., 2000 TLCV Hıyar Tayland Samretwanich ve ark., 2000 MNSV Kavun İtalya Tomassoli ve Barba, 2000 ZLCV, CMV, PRSV-W, WMV-2, ZYMV Kabakgiller Brezilya Yuki ve ark., 2000 WMV-2, WMV-M, ZYMV Kabakgiller Güney Afrika Cradock ve ark., 2001 WMV-2, PRSV, ZYMV Kabakgiller Yeni Gine Davis ve ark., 2002 CMV, WMV-2 Kavun İspanya Alonso ve ark., 2003 CMV, PRSV-W, SqMV, ZYMV Kabakgiller ABD Walters ve ark., 2003 WMV, ZYMV, CMV Kabakgiller Türkiye Sevik ve Arli-Sokmen, 2003 CGMMV, WMV-2, PRSV-W Kabakgiller Pakistan Ali ve ark., 2004 CMV, CABYV, BPYV, CVYV, CYSDV, MNSV, PRSV, WMV, ZYMV Kabakgiller İspanya Juarez ve ark., 2005 ZYMV, PRSV-W, CABYV, WMV, CYSDV, BPYV, CVYV Kabakgiller Güney Kıbrıs Papayiannis ve ark., 2005 ZYMV, WMV-2, CMV, PRSV-W, SqMV, MNSV Karpuz, kavun Türkiye Köklü ve Yilmaz, 2006 CMV, ZYMV,. WMV-2, TSWV Kabakgiller İran Massumi ve ark., 2007 BPYV, CABYV, CMV, CYSDV, WMV, MNSV, ZYMV, CVYV, PRSV Kabakgiller İspanya Kassem ve ark., 2007 ZYV, WMV, CMV, TSWV Kabaklar Sırbistan Vucurovic ve ark., 2012

17 7 Davis ve Mizuki (1987), ABD nin New Jersey eyaletinde yaptıkları üç yıllık bir survey çalışmasında; 1983 yılında kabakta CMV ve WMV-2 yoğun olarak görülürken, 1984 yılında PRSV-W nin tahripkâr tür olduğunu, kabak ve diğer kabakgillerde şiddetli kayıplara sebep olan ZYMV nün ise ilk kez 1985 yılında tespit edildiğini bildirmektedirler. Araştırıcılar, araziden topladıkları hastalıklı bitki örneklerinde ZYMV, WMV-2 ve PRSV-W nin karışık enfeksiyonlarına da rastlamışlar. Bu karışık enfeksiyonlu örneklerden, hassas test bitkilerine yapılan yapay inokulasyonlardan sonra, test bitkilerinin ELISA ile test edildiğinde genellikle ZYMV nün diğer türleri baskı altına aldığı görülmüştür. Böylece ZYMV nün oldukça agresif olduğu ve karışık enfeksiyonlarda PRSV-W ve WMV-2 ne göre rekabette daha avantajlı olduğunun görüldüğü bildirilmektedir yılında Hawai adalarında yapılan bir çalışmada ise kabakgillerde ZYMV, PRSV-W ve CMV tespit edilmiştir (Ullman ve ark., 1991). Lecoq ve ark. (1992) Fransa da kabakgillerin çok sayıda virüs hastalığından etkilendiğini, bunların başında da afitlerle taşınan CMV, WMV-2 ve ZYMV nin geldiğini, CABYV virüsünün de üretim alanlarında önemli ölçüde bulunduğunu bildirmektedirler. Doğu Kaliforniya (ABD) da, kabakgil ekim alanlarında yapılan survey çalışmalarında WMV-2 ve ZYMV adlı virüslerin ekonomik manada zararlı olduğu bildirilmektedir (Perring ve ark., 1992). Dogimont ve ark. (1996) Fransa da gerçekleştirdikleri bir çalışmada Cucurbitaceae familyasındaki bitkilerin afit kaynaklı birçok virüsten etkilendiğini bildirmişlerdir. Araştırıcılar çalışmalarında CMV, WMV-2 ve ZYMV adlı virüslerin yaygın olduğunu, bununla birlikte son yıllarda tanımlanan ve Kabakgil Afit Kaynaklı Sarılık Virüsü (CABYV) adı verilen virüsün de kabakgil üretim alanlarında saptandığını bildirmektedirler. Çalışmada CABYV virüsünün Akdeniz bölgesinde yaygın olarak bulunduğu ve kavun, hıyar, kabak ve karpuz bitkilerinde zararlı olduğu bildirilmektedir. Dahal ve ark. (1997) tarafından Nepal in 68 farklı lokasyonunda, papaya ve kabakgil sebzelerinin yetiştirildiği ekim alanlarında gerçekleştirilen survey çalışmasında, ürünlerin yoğun biçimde farklı virüs benzeri belirtiler gösterdiği gözlenmiştir. Bu hastalık belirtilerinin ortalama yaygınlıklarının; papayada %75-100, sakız kabağında %85-100, hıyarda %4-100, balkabağında %4-100 ve su kabağı, choyote kavunu ve karpuzda % arasında olduğu bildirilmektedir. Yapılan DAS-ELISA ve SDS-immunodiffusion testleri sonucunda, papaya ve sakız kabağından izole edilen

18 8 virüsün PRSV-W olduğu tespit edilmiştir. Aynı virüs diğer kabakgillerde de saptanmıştır. Bazı hıyar, choyote kavunu, bal kabağı, sakız kabağı ve acur yaprak örneklerinde CMV ve ZYMV tespit edilmiştir. Kış kavunu, hıyar ve balkabağı örneklerinin bir kısmında ise CABYV saptanmıştır. Çalışmada ELISA testine tabi tutulan hiçbir örnekte WMV-2 ve SqMV ne rastlanmamıştır. İspanya kavun ekim alanlarında yıllarında yapılan survey çalışmalarında CMV ve WMV-2 en çok saptanan virüsler olurken, PRSV-W ve ZYMV ne daha az alanda ve daha düşük şiddetlerde rastlanmıştır (Luis-Artega ve ark., 1998). Rezende ve ark. (1998), Brezilya da kabakgillerde 8 farklı virüsün saptandığını PRSV-W, WMV-2, ZYMV, CMV ve SqMV isimli virüslerin yaygın olduğu belirlenirken, PRSV-W adlı virüsün ise kabakgillerin en yıkıcı patojenlerinden birisi olduğunu ve PRSV-W ye karşı kabakgiller içerisinde en hassas türün zucchini kabağı olduğunu bildirmektedirler. Yuki ve ark. (2000) tarafından, Brezilya nın Sao Paula eyaletinde kabakgil yetiştiriciliği yapılan bölgelerinde yıllarında gerçekleştirilen surveylerde 621 bitki örneği toplanarak PTA-ELISA yöntemiyle virüs enfeksiyonları tespit edilmiştir. PTA-ELISA testleri sonucunda PRSV-W (% 49,1) ve ZYMV (% 24,8) en yaygın virüsler olarak belirlenmiştir. Ayrıca, ZLCV (% 7,8), CMV (% 6,0) ve WMV-2 (% 4,5) tespit edilmiştir. Abou-Jawdah ve ark. (2000) tarafından yılında Lübnan da gerçekleştirilen bir survey çalışmasında, 67 bahçeden toplam 382 bitki örneği toplanmış ve DAS-ELISA ile CMV, CABYV, MNSV, PRSV-W, SqMV, WMV ve ZYMV ne karşı test edilmiştir. Çalışma sonucunda, ZYMV ve CABYV en yaygın virüsler olarak ortaya konulmuştur. Bu virüslerin yaygınlıkları sırasıyla, kabakta %64 ve %65 ve kavunda ise %44 ve %30 olarak tespit edilmiştir. Bu iki virüsü WMV, PRSV-W ve CMV takip etmiştir. MNSV ve SqMV bulaşık örneklerin sırasıyla %1 ve %2 sinden daha azında tespit edilmiştir. İkili ve üçlü enfeksiyonlar ise örneklerin %37 sinde görülmüştür. Ayrıca kabakta yapılan çapraz-koruma çalışmalarında, zayıf strain olan ZYMV-WK inokule edilen bitkilerde, kontrole kıyasla şiddetli virüs hastalık belirtilerine karşı önemli ölçüde koruma sağlanmış ve verim artışı görülmüştür. Bununla birlikte, en iyi koruma ve en yüksek verim floating row covers (vektör zararını önleyen özel bir örtü) uygulaması ile sağlanmıştır. Çapraz koruma ile birlikte gümüş malç

19 9 uygulaması veya floating row covers uygulamasının korumayı daha da artırdığı bildirilmektedir. Güney Afrika nın KwaZulu-Natal bölgesinde yıllarında kabakgil ekim alanlarında gerçekleştirilen bir survey çalışmasında; toplanan kabakgil bitki örneklerinde DAS-ELISA testiyle 1997 yılında 4 adet virüsün (ZYMV, WMV-2 WMV- M, CMV), 1998 yılında ise bu dört virüse ilaveten PRSV ve SqMV varlığına bakılmıştır. DAS-ELISA çalışmaları sonucunda en yaygın virüs olarak ZYMV (% 50.67) saptanmıştır. Bu virüsten başka WMV-M (% 24), WMV-2 (% 22.67) ve CMV nü (% 6.67) saptamışlardır. Ayrıca örneklerin % 32 si birden fazla virüs ile enfekteli bulunmuştur (Cradock ve ark., 2001). Davis ve ark. (2002), Papua, Endonezya, Papua Yeni Gine ve Avusturalya nın Torres Strait Adaları, Gove ve Cape York Yarımadasında yıllarında gerçekleştirdikleri survey çalışmasında, DAS-ELISA ve RT-PCR yöntemi ile kabakgil bitkilerinde CMV, PRSV, WMV-2 ve ZYMV ne bakmışlar. Araştırıcılar, bal kabağı (Cucurbita maxima) ve Trichosanthes cucumerina da ZYMV; PRSV ve WMV; Cucurbita moschata da ZYMV nün tespit edildiğini bildirmektedirler. Pakistan da 2002 yılında gerçekleştirilen bir survey çalışmasında, 28 kabakgil üretim alanından toplanan örneklerde yoğun olarak CGMMV (%46,9), bu virüsü takiben ZYMV (%14,8), WMV (%12,5) ve PRSV (%7,8) tespit edilmiştir. Örneklerde yoğun miktarda ikili (%42) ve üçlü (%8) enfeksiyonlar da saptanmıştır (Ali ve ark., 2004). Finetti-Sialer ve ark. (2005) tarafından yıllarında Arnavutluk ta, sebze üretim alanlarındaki viral hastalıkları ortaya koymak için gerçekleştirilen çalışmada, viral hastalık belirtileri gösteren 16 adet sakız kabağı, 13 adet karpuz ve 13 adet hıyar bitkisi örneklerini enfekte eden virüsler Dot-blot hibridizasyon yöntemiyle ortaya konulmuştur. Testlemeler sonucunda sakız kabağının 3 tanesinin CMV, 1 tanesinin domates lekeli solgunluk virüsü (TSWV) ve 2 tanesinin WMV 2 ile 3 hıyar örneğinin ise 1 tanesinin CMV ve 1 tanesinin de WMV 2 ile enfekteli olduğu bulunmuştur. Karpuz örnekleri ise hiçbir virüsle bulaşık bulunmamıştır. Davis ve ark. (2005) tarafından yıllarında, Cook adalarındaki sebzelerde görülen virüs hastalıklarını ortaya koymak için gerçekleştirilen survey çalışmalarında, karpuz, hıyar, bal kabağı, kavun bitkilerinde CMV nün, PRSV-W nin ise bu kabakgillere ilaveten sakız kabağında da tespit edildiğini bildirmektedirler. Aynı araştırıcılar, çalışma kapsamında DAS-ELISA ve RT-PCR testlerine tabi tutulan

20 10 kabakgil bitkileri örneklerinde WMV, ZYMV ve SqMV lerinin saptanmadığını bildirmektedirler. Papayiannis ve ark. (2005), Güney Kıbrıs kabakgil üretim alanlarında sorun olan virüs hastalıklarını ortaya koymak için yılları arasında gerçekleştirdikleri surveyde 2993 adet hıyar, kavun, kabak ve karpuz örneği toplamışlardır. ZYMV, PRSV-W, WMV, CABYV, CMV ve SqMV DAS-ELISA ile Hıyar sarı bodurlaşma virüsü (CYSDV), Pancar yalancı sarılık virüsü (BPYV) ve Hıyar sarı damar virüsü (CVYV) ise RT-PCR ile saptanmıştır. Çalışma sonucunda, ZYMV %45 bulaşıklık oranı ile kabakgillerdeki en yaygın virüs olarak belirlenmiştir. Örneklerde ZYMV nü takiben PRSV-W (%20,8), CABYV (%20,8) ve WMV (%7,8) virüsleri de saptanmıştır. CYSDV çoğunlukla seralarda yetiştirilen ve solgunluk belirtisi gösteren hıyar bitkilerinde saptanırken (%88,1), BPYV ve CVYV sırasıyla, örneklerin sadece %2,4 ve %9,5 inde bulunmuştur. Bu çalışmada toplanan hiçbir bitki örneğinde CMV ve SqMV tespit edilmemiştir. Boubourakas ve ark. (2006) tarafından yıllarında, Yunanistan da, sera ve açık alanda yetiştirilen hıyar ve kavun bitkilerinde solgunluğa sebep olan virüslerin yaygınlığını ortaya koymak amacıyla gerçekleştirilen survey çalışmalarında toplanan 73 hıyar, 6 kavun ve 38 yabancı ot örneğinde, CABYV, BPYV ve CYSDV enfeksiyonunu ortaya koymak için DAS-ELISA ve Simplex RT-PCR yöntemleriyle testlenmişlerdir. Testlemeler sonucunda; BPYV hıyar (%67) ve kavun (%66) bitkilerinde baskın virüs olarak saptanmış, bu çalışma ile Yunanistan da ilk kez rapor edilen CYSDV (%15) ise sadece 3 bölgede izole edilebilmiş, CABYV ise sadece üç hıyar serasında tespit edilmiştir. Amaranthus retroflexus, Selosia cristata, Sonchus oleraceus ve Sonchus sp. yabancı ot türlerinin de BPYV için potansiyel bir konukçu olduğu bildirilmektedir. Kassem ve ark. (2007) tarafından, İspanya nın Murcia şehri kavun ve kabak bahçelerinde, yıllarında yapılan survey çalışmasında 48 bahçeden (36 kavun, 12 kabak) toplam 924 bitki örneği (700 kavun, 224 kabak) toplanmıştır. Araştırıcılar topladıkları bitki örneklerinde, dot blot hyridization yöntemiyle BPYV, CABYV, CMV, CVYV, CYSDV, PRSV, WMV, ZYMV ve MNSV enfeksiyonlarını tespit etmeye çalışmışlardır. Çalışma sonucunda örneklerin %90 ının en az bir virüsle bulaşık olduğunu ve kavun örneklerinin %83 ünün, kabak örneklerinin ise %66 sının CABYV ile bulaşık olduğunu saptamışlardır. CABYV yi kavun örneklerinde CYSDV, BPYV ve WMV %20-30, kabak örneklerinde ise CVYV ve BPYV %21-28 arasında bulaşıklık

21 11 oranları ile takip etmişlerdir. Araştırıcılar ayrıca çoklu enfeksiyon miktarının kavun ve kabak bitkilerinde sırasıyla %66 ve 56 ile oldukça yüksek olduğunu bildirmektedirler. Çoklu enfeksiyonların tamamında CABYV saptanmıştır. Araştırıcılar bu çalışma kapsamında tespit ettikleri CABYV izolatlarını yaptıkları RFLP analizleri ile genetik olarak iki gruba ayırmışlardır. Massumi ve ark. (2007), İran ın farklı bölgelerinde, kabakgil üretimi yapılan seralardaki virüs hastalıklarını ortaya koymak amacıyla yılları arasında gerçekleştirdikleri survey çalışmalarında rasgele 1304 ve hastalık belirtisi gösteren 1085 bitki ve meyve örneği toplamışlar. Toplanan bu örnekler CMV, SqMV, PRSV-W, WMV-2, ZYMV, CuNV ve TSWV enfeksiyonlarını saptamak için DAS-ELISA testine tabi tutulmuşlar. Test edilen örneklerde CMV (%21,2) ve ZYMV (%18) en yaygın virüsler olarak saptanmışlardır. WMV-2 %4,3 yaygınlık oranıyla 15 bölgede tespit edilirken, TSWV %1,25 yaygınlık oranıyla sadece 2 bölgede tespit edilmiştir. Ayrıca araştırıcılar Hıyar nekroz virüsü (CuNV), SqMV ve PRSV-W nin hiçbir örnekte tespit edilmeğini bildirmektedirler. Meng ve ark. (2007), Dot-blot hibridizasyon yöntemiyle, digoxigenin-etiketli cdna probları kullanarak kabakgillerde sorun olan ZYMV, WMV, CMV, PRSV-W ve SqMV nü enfekteli bitki yaprakları ekstraksiyonundan tanılamışlardır. Jossey ve Babadoost (2008) tarafından yıllarında Illinois (ABD) de yapılan survey çalışmalarında toplanan kabak örnekleri DAS-ELISA ile CMV, PRSV, SqMV, TRSV, ToRSV, WMV ve ZYMV ne karşı testlenmişler ve testleme sonucunda CMV, PRSV, SqMV, TRSV, ToRSV, WMV, ZYMV ve türü teşhis edilememiş bir potyvirüs tespit edilmiştir. Araştırıcılar serolojik olarak teşhis ettikleri TRSV nü, RT- PCR çalışmasıyla da tespit etmişler. Surveyin yapıldığı eyalette, WMV nün en yaygın virüs olduğu ve bunu SqMV nün takip ettiği bildirilmektedir ve 2005 yıllarında İran da gerçekleştirilen bir survey çalışmasında hastalık belirtisi gösteren toplam 757 kabakgil bitki örneği ve 31 yabancı ot örneği taplanarak WMV varlığı açısından DAS-ELISA ve RT-PCR yöntemleriyle testlenmişlerdir. Spesifik poliklonal antibadi kullanılarak gerçekleştirilen DAS-ELISA testleri sonucu 788 yaprak örneğinden 190 adedinin WMV ile bulaşık olduğu ortaya konmuştur. DAS- ELISA testine tabii tutulan, farklı genuslara ait yabancı ot örneklerinden sadece acı karpuz (Citrullus colocynthis L.) pozitif sonuç vermiştir. Pozitif örneklerden 18 adet izolat seçilerek RT-PCR ile kılıf protein geninin 804 bp lik kısmı ile Nlb geninin 18 bp lik kısmı WMV-F ve WMV-R primer çifti ile çoğaltılmıştır. RT-PCR çalışması

22 12 sonucu elde edilen 18 izolata ait ürünler klonlanıp, dna dizilimleri belirlenmiştir. Dizi analizi sonucunda, 18 izolattan 12 adedinin %96,2-%99,9 oranlarında benzer nükleotidleri taşıdıkları görülmüştür (Sharifi ve ark., 2008). Vucurovic ve ark. (2012) tarafından, Sırbistan da yürütülen bir survey çalışmasında toplanan 700 adet kabak ve balkabağı bitkilerinin, gerçekleştirdikleri DAS-ELISA ve RT-PCR testleri sonucunda ZYMV (%79,2), WMV (%32,2) ve CMV (%12,8) ile bulaşık olduğu belirlenmiştir Ülkemizde Kabakgil Virüsleri Üzerinde Yapılan ÇalıĢmalar Ülkemizde, kabakgil bitkilerinin yetiştirildiği alanlarda üretimi sınırlayan çok sayıda viral etmen saptanmıştır. Bu etmenlerin ve yaygınlıklarının belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmalar aşağıda özetlenmeye çalışılmıştır. Erdiller ve Özyanar (1983) ın Ankara nın Kalaba semti civarında hıyar ekim alanlarından topladıkları örneklerde; mekanik inokulasyon, serolojik testler ve elektron mikroskobu çalışmalarında CMV nün bulunduğunu saptamışlardır. Araştırmada aynı zamanda CMV nün hıyar bitkilerinin fizyolojik ve biyokimyasal faaliyetleri üzerindeki etkisi, kontrollü koşullarda yetişen sağlam ve hasta bitkilerin primer yaprakları, inokulasyon ile çiçeklenme başlangıcı arasındaki dönemde periyodik olarak solunum, nişasta, protein, indirgenebilir şeker ve klorofil miktarındaki değişimleri araştırmışlardır. İnokulasyondan sonraki ilk hafta içinde nişasta ve indirgenebilir şeker miktarındaki düşüş, solunumdaki artış ile birlikte bitkilerde bu dönemde hızlı bir glukoz parçalanması olayının gerçekleştiğini ve bol miktarda serbest enerjinin açığa çıktığını göstermektedir. Buna karşılık ise sağlam salatalık primer yapraklarında sürekli bir şekilde nişasta birikimi meydana geldiğini görmüşlerdir. Bu olayın ise yaprağın giderek yaşlanması nedenine bağlamışlardır. Sonuç olarak solunum, nişasta ve indirgenebilir şeker miktarları arasında bir ilişkinin olduğunu saptamışlardır. Nogay (1983), Marmara bölgesinde 9 ilde Cucurbitaceae familyası bitkilerinde görülen virüsleri tanılamış, etmenlerin tohumla taşınıp taşınmadıklarını ve familya içindeki konukçularını saptamıştır yılında yapılan surveylerde bölgede hastalık oranları tespit edilmiştir. Alınan örneklerde biyolojik ve serolojik yöntemler, fiziksel özellikler ve elektron mikroskop incelemeleri ile CMV ve WMV-2 belirlenmiştir. CMV nin % oranında kayıplara neden olduğu tespit edilmiştir. CMV ve WMV-2 izolatlarının Cucurbitaceae familyası bitkilerinde tohumla taşınmadıkları saptanmıştır.

23 13 Familya içindeki konukçuları belirlemek için 14 çeşit kullanılmıştır. CMV izolatları hıyar, kabak ve kavun çeşitlerini lokal ve sistemik hastalandırmıştır. Karpuz çeşitlerinden biri hariç diğerlerinde sistemik enfeksiyon görülmemiştir. WMV-2 izolatları denenen bütün çeşitleri hastalandırmıştır. Nogay ve Yorgancı (1984), Marmara bölgesinde kabakgillerde görülen virüs hastalıkları üzerinde çalışmalar yapmışlardır. Kabakgillerde zararlı virüsleri bitkilerde oluşturdukları reaksiyonlar, fiziksel özellikler, serolojik testler ve elektron mikroskobu yöntemiyle tanımlamışlardır. Yapılan çalışmalar, Anadolu yakasında CMV nün, Trakya da ise WMV-2 nün hâkim olduğunu göstermiştir. Akdeniz sahil şeridinde yetiştirilen bazı sebzelerde zararlı virüslerin tanımı serolojik ve biyolojik yöntemler ve elektron mikroskobu yardımı ile yapılmıştır. Domates (Lycopersicon esculentum), biber (Capsicum annum) ve fasulyelerde (Phaseolus vulgaris) TMV; biber, domates ve karpuzda (Citrullus vulgaris) CMV; marulda (Lactuca sativa) Marul Mozayik Virüsü, biberde PVY, karpuz ve kabakta (Cucurbita pepo) ZYMV saptanmıştır (Yılmaz ve Davis, 1985). Erdiller ve Ertunç (1987), PRSV-W nin Yuva kavun çeşidinde oluşturduğu fizyolojik ve biyokimyasal değişimleri araştırmışlardır. PRSV-W ile enfekteli bitkilerde protein miktarının arttığı buna karşılık diğer fizyolojik ve biyokimyasal faaliyetlerin azaldığını tespit etmişlerdir. Özyanar ve Sako (1987), CMV nün sarı (CMV-Y) ve Zinnia (CMV-Z) ırkları DAS-ELISA, ön kaplama yapılmadan uygulanan I-ELISA (Indirect-ELISA) ve DIBA (Dot Imminobinding Assay) yöntemleri kullanarak teşhis etmişlerdir. DAS-ELISA yönteminde gözlenen reaksiyonlar iki ırkın ayırt edilmesinde yeterli olsa da absorbans değerleri her zaman I-ELISA yöntemine göre düşük olmuştur. CMV-Y değerleri hem DAS-ELISA hem de I-ELISA yöntemlerinde CMV-Z değerlerinden yüksek bulunmuştur. Erdiller ve Ertunç (1988), Ankara ili çevresindeki kavun ekim alanlarında yılları arasında virüs hastalıklarını tespit etmek için survey çalışması gerçekleştirmişlerdir. Toplanan örneklerdeki virüsler biyolojik ve fiziksel özellikleri, serolojik reaksiyonları ve elektron mikroskop incelemeleri ile teşhis edilmişlerdir. Yapılan çalışmalar sonucunda araştırma bölgesinden Hıyar Mozayik Virüsünün (CMV) iki farklı ırkı, Karpuz Mozayik Virüsü-1 (WMV-1) ve Karpuz Mozayik Virüsü-2 (WMV-2) nin mevcut olduğu ve bunlar içinde de en yaygın enfeksiyonun WMV-1 e ait olduğu saptanmıştır.

24 14 Ertunç (1988), CMV nün Zinnia (CMV-Z) ve sarı (CMV-Y) ırklarını Dot- ELISA tekniği kullanarak teşhis etmiştir. Araştırıcı Dot-ELISA tekniğinin, I-ELISA ve DAS-ELISA tekniklerine göre daha iyi sonuç verdiğini bildirmektedir. Ertunç (1989), hıyar mozayik virüsünün sarı (CMV-Y) ve Zinnia (CMV-Z) ırkları, latex ile kaplı CMV-Y antiserumunun kullanıldığı latex çöktürme (LF testi ) ve antikorlarla hassaslaştırılmadan önce latex partiküllerinin protein A ile kaplandığı antiserumun kullandığı protein A kaplı latexe bağlı antiserum testi (PALLAS testi) ile serolojik olarak tespit etmiştir. Yapılan çalışma sonucunda her iki testin de, CMV ırklarına kolaylıkla uygulanabildiği ve kısa sürede tespit ettiği görülmüştür. Çukurova bölgesinde gerçekleştirilen bir çalışmada, kabakgil familyası bitkilerine zarar veren virüs hastalıklarından farklı olarak kavun, karpuz ve hıyar bitkilerinde damar açılması, damar sararması, cüceleşme, sarı mozayik ve üründe önemli miktarda azalmaların nedeni araştırılmıştır. Mekanik inokulasyon çalışmaları, doğal taşınma, vektör taşıma deneyleri, elektron mikroskop incelemeleri sonucu etmenin CVYV olduğu tespit edilmiştir (Yılmaz ve ark., 1991). Ertunç (1992a) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada, Ankara ilinde yapraklarında sistemik mozayik, meyvelerinde kabarcıklar ve deformasyon belirtileri gösteren kabak bitkilerinde sorun olan viral etmen belirlenmiştir. Araştırıcı, konukçu dizisinin tespiti, serolojik testler, özsu içindeki virüsün fiziksel özelliklerinin tespiti ve elektron mikroskop çalışmaları sonucunda etmenin ZYMV olduğunu bildirmektedir. Cucurbitaceae familyası kültür bitkisi tohum örneklerinin, CMV nü taşıma durumlarını ortaya koymak amacıyla gerçekleştirilen çalışmada tohum örnekleri DAS- ELISA yöntemiyle testlenmişlerdir. Yapılan çalışmalar sonucu 1 karpuz, 1 kavun, 3 hıyar, 2 kabak ve 2 bal kabağı tohumu olmak üzere 9 örneğin etmenle bulaşık olduğu tespit edilmiştir (Ertunç 1992b). Yılmaz ve ark. (1992), 1991 yılında Akdeniz bölgesinde Adana ve İçel, Ege Bölgesinde İzmir, Manisa ve Afyon, İç Anadolu Bölgesinde Konya illerinden; hıyar, yazlık kabak, kışlık kabaklar, karpuz, kavun, lif kabağı, su kabağı ve acurdan oluşmak üzere toplam 76 örneği DAS-ELISA testine tabi tutmuşlardır. Test sonucunda bu örneklerde ZYMV, WMV 2, CMV, CABYV, PRSV-W virüslerine rastlanmasına rağmen SqMV, ZYFV, WMV-M ve WMV-A virüsleri saptanamamıştır. Bunun yanında söz konusu çalışma bölgelerinde en yaygın virüsün ZYMV olduğu ortaya çıkarılmıştır. Bu çalışma ile CABYV ülkemizde ilk kez rapor edilmiştir.

25 15 Fidan (1993), Muğla ilinde seralarda yetiştirilen hıyar bitkilerinde sorun olan viral etmenlerin, gerçekleştirdiği ELISA testi sonucunda ToRSV ve TBRV olduğunu bildirmektedir. Bu hastalıklar, aynı zamanda Türkiye için ilk kayıt olarak belirtilmiştir. Yılmaz ve ark. (1994), Çukurova bölgesi koşullarında ZYMV nün şiddetli ırkının ZYMV nün zayıf ırkı (ZYMV-WK) ile kontrolünü amaçlamışlardır. Bitkilere ZYMV nün şiddetli ırkı, zayıf ırk, ZYMV+ZYMV-WK birlikte ve kontrol olmak üzere 4 uygulama yapılmıştır. Uygulamalarda verim değerleri yönünden istatistikî olarak fark bulunmamıştır. Ancak meyve sayısı ve meyvenin ticari değeri yönünden farklar gözlenmiştir. Kabak bitkilerinde ticari değeri olan meyve çapraz-koruma yapılan parsellerde % 69-80, korumasız parsellerde % 32; hıyar bitkilerinde çapraz-koruma yapılan parsellerde % 83-87, korumasız parsellerde % olarak belirlenmiştir. Fidan (1995), İzmir ve Muğla illerinde seralarda yetiştirilen bazı sebzelerde yıllarında survey çalışmaları gerçekleştirmiş ve virüs hastalıkları biyolojik ve serolojik (ELISA) yöntemler kullanarak tespit etmiştir. İzmir ilinde hıyarlarda CMV, Muğla ilinde ToRSV ve TBRV saptanmıştır. Vargün ve Ertunç (1995), kabak bitkisinde CMV ve ZYMV nün birlikte ve ayrı ayrı enfeksiyonlarının bitki gelişim komponentlerine (Bitki boyu, çiçek ve yaprak sayısı, genç, orta ve yaşlı yaprak alanı) etkisini incelemişlerdir. Araştırıcılar gerçekleştirdikleri çalışmalar sonucunda, bitki boyunda en fazla düşüşe ZYMV+CMV uygulaması, çiçek sayısında en fazla düşüşe CMV, yaprak sayısında en fazla düşüşe CMV ve ZYMV karışımının sebep olduğunu bildirmektedirler. Amasya, Çorum, Samsun ve Tokat illerinde balkabağı, sakız kabağı, karpuz ve kavun bitkilerinde verim ve kaliteyi düşüren virüs hastalıklarını belirlemek için 1995 yılında bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Tarla ve sera koşullarında söz konusu kültür bitkilerindeki simptomlara ve enfekteli bitki yapraklarının özsularının indikatör test bitkilerine mekanik inokulasyonları sonucu bu bitkilerde sergiledikleri belirtilere göre üç ayrı virüs saptanmıştır. Araştırıcılar bal kabağında ve karpuzda CMV, sakız kabağı ve kavunda ZYMV nü tespit ettiklerini bildirmektedirler (Çıtır ve ark., 1998). Antalya ilinde örtü altında kabak yetiştiriciliğinde sorun olan ZYMV nün taşınması ve yayılmasında etkili olan yabancı ot ve vektör türlerini belirlemek ve etmenin tohumla taşınma durumunu ortaya koymak amacıyla bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Toplanan kabak bitkisi, yabancı ot, tohum ve afit örneklerindeki viral bulaşıklık I-ELISA testi ile teşhis edilmiş. Araştırma sonucunda ZYMV Aphis gossypii, Myzus persicae yaprakbiti türlerinde, Chenopodium sp., Trifolium sp,

26 16 Amaranthus sp., Medicago sp. Vicia sp., Ranunculus sp. Veronica sp. Onobrichus sp., Erysymum sp., Euphorbia sp., Anthemis sp. Cynorus sp. yabancı ot cinslerinde saptanmıştır. Ayrıca çiftçi tarafından kullanılan tohumların da etmen ile bulaşık oldukları bildirilmektedir (Uçar ve Ertunç, 1998). Yardımcı ve ark. (2000) Isparta ilinde Cucurbitaceae familyası bitkilerinde hastalığa sebep olan viral etmenleri simptomatolojik ve serolojik yöntemlerle belirlemişlerdir. Çalışma sonucunda enfeksiyona ZYMV, CABYV ve WMV-2 adlı virüslerin sebep olduğu saptanmıştır. Yılmaz ve Sherwood (2000), kabakgil bitkilerinde sorun olan önemli virüslerden CMV, PRSV-W, SqMV, WMV ve ZYMV nün teşhisinde Protein-A ELISA (PAS- ELISA), antijen kaplı ELISA tabağı ve ticari olarak mevcut olan Indirekt ELISA yöntemleri ve bazı kimyasalları karşılaştırarak en uygun metodu belirlemişlerdir. Araştırıcılar, indirekt ELISA metodunu, rutin virüs teşhisi ve arazi survey çalışmaları için en uygun yöntem olarak tespit ederken, izolatlar ve ırklar arası serolojik farklılıklar ve virüs antijen yoğunluklarının belirlenmesi için ise PAS-ELISA yöntemini en uygun metod olarak belirlemişlerdir. Gümüş ve ark. (2001) nın ticari kabakgil tohumlarında gerçekleştirdikleri araştırmada hıyar tohumlarının %36,8, kavun ve kabak tohumlarının %18,5 oranında CMV ile enfekteli olduğunu saptarken hıyar tohumlarının %36,8 oranında CGMMV ile enfekteli olduğunu belirtmişlerdir. Bostan ve ark. (2002a), tarafından Erzurum ve Artvin illerinde kabakgil ekim alanlarında sorun olan viral etmenleri belirlemek amacıyla survey çalışması gerçekleştirilmiştir. Araştırıcılar, topladıkları örneklerin tamamında serolojik ve biyolojik testler sonucu ZYMV varlığını belirlemişlerdir. Yine Erzurum ve Artvin illerinde, Bostan ve ark. (2002b) tarafından, seralarda yürütülen bir sürvey çalışmasında mozayik, bronzlaşma, kloroz, deformasyon, yapraklarda kıvrılma ve gelişme geriliği gibi virüs benzeri simptom gösteren domates ve hıyar bitkilerinden yaprak örnekleri alınmış ve DAS-ELISA yöntemi ile testlenmiştir. Araştırıcılar, hıyarlarda % 4,3 oranında CMV tespit ettiklerini bildirmektedirler. Çağlar ve Yılmaz (2002) tarafından, Çukurova bölgesinde kabakgillerde görülen SqMV nü farklı firmaların ithal ettiği kavun tohumlarında serolojik, biyolojik, SDS- PAGE, elektron mikroskop ve ds-rna analiz yöntemi kullanarak belirlemişlerdir.

27 17 Dursunoğlu ve Ertunç (2003), Ankara ili ve çevresinde yetiştirilen kabakgillerde görülen ve kabakgillerin en önemli viral hastalıklarından biri olan CMV izolatlarının serolojik yöntemlerle belirlenmesini amaçladıkları çalışmalarında kabakgil ekim alanlarına 2002 yılında sürveyler düzenlemişlerdir. Sürveylerde topladıkları bitki örneklerinden elde ettikleri izolatları test bitkilerine inokulasyon ve DAS-ELISA yöntemi ile tanılamışlardır. Sevik ve Arli-Sökmen (2003), Samsun ili kabakgil ekim alanlarında sorun olan virüsleri ve bunların yayılışını belirlemek amacıyla yıllarında 18 köydeki 45 bahçede surveyler gerçekleştirmişlerdir. Alınan örneklerin biyolojik ve serolojik yöntemler ile testlenmesi sonucu % 53,9 WMV, % 38,8 ZYMV ve % 20,6 CMV tespit edilmiştir. ZYMV ve WMV enfeksiyonları tüm kabakgil bitkilerinde tespit edilirken, CMV karpuz ve balkabakları örneklerinin hiçbirisinde tespit edilememiştir. Aynı araştırıcılar ayrıca, CMV kapsid protein genine spesifik primerler kullanarak, enfekteli bitkilerde CMV enfeksiyonunu RT-PCR yöntemi ile belirlemişlerdir. Hatay ilinde yetiştirilen kabakgil ekim alanlarındaki ZYMV nün yaygınlığını ve taşınma durumunu ortaya koymak için gerçekleştirilen bir çalışmada, Hatay ilinin farklı yörelerinden, 2003 yılında yazlık kabak (C. pepo), kışlık kabaklar (C. maxima ve C. moschata), kavun (Cucumis melo) ve hıyar (Cucumis sativus) bitkilerinden simptom gösteren yaprak ve meyve örnekleri toplanmıştır. Simptomlu bitkiler ELlSA ile testlenmiştir. Şiddetli simptom gösteren meyvelerden çıkarılan tohumlar çimlendirilerek her bir çeşitten 100'er fide ELlSA ile testlenmiş, 200'er bitkide simptom gözlemleri yapılmıştır. Tohumlardan %86-94 oranında bitki elde edilmiştir. Özellikle C. pepo ve C. maxima fidelerinde %2-3 oranında genel kloroz, bodurlaşma ve yaprak deformasyonu gözlenmiş, ELlSA sonucunda tohumlarından elde edilen fidelerin hiç birinde ZYMV belirlenmemiştir. Şiddetli simptom sergileyen C. sativus örneklerinin hiç birinde ZYMV belirlenememiştir. Şiddetli simptom gösteren C. pepo yapraklarından elde edilen özsu ile biyolojik testleme çalışmaları yapılmıştır. Mekanik inokulasyondan iki hafta sonra değişik test bitkilerinde ZYMV'ne özgü simptomlar gözlenmiştir. ELISA sonucunda ZYMV ile enfekteli olduğu belirlenen C. pepo bitkileri üzerinde 7 gün süre ile beslenen Myzus persicae bireyleri l0'arlı gruplar halinde sağlıklı C. pepo fideleri üzerine aktarılarak 3 gün süre ile tutulmuştur. Afitle taşıma çalışmalarında kullanılan test bitkilerinde üç hafta içerisinde yapraklarda klorotik ve mozayik lekelenmeler, şekil bozukluğu, bodurlaşma ve fide ölümleri gibi belirtiler ortaya çıkmıştır (Sertkaya ve ark, 2004).

28 18 Dağ (2005) tarafından, Gaziantep ili kabakgil ekim alanlarında sorun olan viral etmenleri ortaya koymak için 2004 yılında gerçekleştirilen survey çalışmasında toplanan örnekler DAS-ELISA yöntemiyle CMV, CABYV, ZYMV, ToMV, PVX, PVY, PMMV ye karşı testlenmiştir. Yapılan testler sonucunda 56 örnekten 10 tanesinin bir veya daha fazla virüsle bulaşık olduğu ortaya konulmuştur. Bununla birlikte mevcut örneklerden 20 tanesinin CMV, 24 ünün ZYMV ve 3 örneğin ise PVY ile bulaşık olduğu bildirilmektedir. Adana, Mersin, Hatay ve Şanlıurfa illerinde üretimi yapılan kavun, domates ve biberlerde zararlı CMV izolatlarının tanımlanmaları, sınıflandırılmaları, çoğalttıkları satellit-rna lerin büyüklerini ve satellit-rna ların virüs üzerindeki etkisini araştırmak amacıyla bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Çalışma kapsamında yapılan surveylerle toplanan örnekler ELISA ile testlenmiş ve CMV ile enfekteli oldukları belirlenen kavun, domates ve biber bitkilerinden alınan örnekler mekanik inokulasyon yöntemi ile test bitkileri dahil olmak üzere kavun, domates, biber bitkilerine de aşılanmıştır. CMV izolatları enfekteli bitkilerden arılaştırılarak virionların elektrik ortamındaki hareket hızları kontrol edilmiştir. İzolatların RNA-1, RNA-2, kılıf proteini ve 2a proteinini kodlayan genleri üzerinde bazı bölgeler RT-PCR ile çoğaltılmıştır. PCR ürünleri RFLP çalışmasında MluI, Eco RI, Hind III, Bam HI ve Msp I endonükleaz restriksiyon enzimleri ile kesilmiş ve agaroz jelde görüntülenmiştir. Sonuçlar CMV-K, CMV-D ve CMV-B izolatlarının alt grup IA ya ait olduğunu, üç izolatında 700 bp satellit-rna ni çoğalttıkları, CMV-K nın zayıf ırk olduğunu ve bu ırkta simptomun satellit-rna den kaynaklanabileceğini, CMV-K nın çapraz koruma (cross-protection) da kontrol ajanı olarak kullanılabileceğini ortaya koymuştur (Çağlar, 2006). Köklü ve Yılmaz (2006), Tekirdağ, Edirne ve Kırklareli çevresinde, 2005 yılında, 17 kavun ve 19 karpuz bahçesinde yürüttükleri survey çalışmasında topladıkları 502 bitki örneğinde; CMV, PRSV-W, SqMV, MNSV, CGMMV, ZYMV ve WMV-2 virüslerinin bulaşıklıklarını DAS-ELISA testi ile ortaya koymaya çalışmışlardır. DAS- ELISA çalışmaları sonucunda; Tekirdağ ilinden toplanan 235 örneğin 167 sinin, Edirne den toplanan 187 örneğin 103 ünün ve Kırklareli den toplanan 80 örneğin 63 ünün, toplam 502 örneğin 333 adedinin ise çalışılan virüslerle bulaşık olduğunu belirlemişlerdir. Serolojik testler, örneklerin çalışılan 7 virüsten 6 sı ile bulaşık olduğunu göstermiştir. Karpuz örneklerinde, bulaşıklık oranları; ZYMV için %45,5, WMV-2 için %34,2, CMV için %19,9, PRSV-W için %2,1, SqMV için %1,8 ve MNSV için %0,4 iken kavun örneklerinde ise; ZYMV için %40,3, WMV-2 için 31,2, CMV için

29 19 %7,2, PRSV-W için %2,3, SqMV için %0,5 ve MNSV için %1,8 olarak saptanmıştır. WMV-2+ZYMV ikili enfeksiyonu oldukça yoğun olup, kavun örneklerinde %16,7, karpuz örneklerinde ise %11,4 oranında bulunmuştur. Adana ve İçel illeri ile çevresinde, yılları arasında, örtü altı ve açık alanda yetiştirilen kabakgillerde saptanan ZYMV izolatının (ZYMV-FM) biyolojik, serolojik ve moleküler yöntemler kullanılarak tanısının yapılması ve bitki aktivatörlerinin ZYMV mücadelesinde kullanım olanaklarının araştırılması amacıyla bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Araziden toplanan ve virüslü olduğundan şüphelenilen bitkiler, öncelikle ELISA yöntemi ile testlenmiş ve hastalık oranı % 51,2 olarak hesaplanmıştır. ZYMV ile infekteli olan örnekler içerisinde biri kodlanarak, mekanik inokulasyon ve vektör ile taşıma denemesi çalışmalarında kullanılmıştır. Araştırıcı, ZYMV ile infekteli örnekleri aynı zamanda RT-PCR ve IC-RT-PCR yöntemleri ile de teyit etmiştir. Kabakgillerde ZYMV ne karşı dayanıklılığın uyarılması çalışmalarında ise, ACTIGARD, MESSENGER ve ISR-2000 bitki aktivatörleri kullanılarak saksı ve arazi denemeleri ile bu hastalığa karşı etkinlikleri belirlenmiştir. ACTIGARD uygulandıktan 48 saat, MESSENGER ve ISR 2000 uygulandıktan 72 saat sonra ZYMV uygulanan bitkilerde kontrol bitkilerine göre simptom çıkış süresinde farklılıklar gözlenmiştir. Yapılan histokimyasal boyamalar ile de; bitki aktivatörleri uygulanan bitkilerde teşvik edilmiş dayanıklılıktan dolayı meydana gelen Lignin sentezi ile H 2 O 2 birikiminin varlığı saptanmıştır (Çalışkan, 2007). Karamanlı (2007) tarafından, yılları arasında, Kuzey Kıbrıs Türk Cumhuriyeti nde yetiştirilen kabakgillerde zararlı CMV ve ZYMV nün biyolojik, serolojik ve moleküler tanısının yapılması amacıyla bir çalışma yürütülmüştür. Çalışmada, araziden toplanan virüslü olduğundan şüphelenilen bitkiler, öncelikle ELISA yöntemi ile testlenmiş ve hastalık oranı CMV için % 8,07 ve ZYMV için % 34,5 olarak saptanmıştır. Ayrıca her iki virüsün karışık hastalık oranı da % 7,4 olarak saptanmıştır. Ayrıca, CMV ve ZYMV ile infekteli indikatör bitkilerinden total RNA ekstraksiyonu yapılmış ve bunlar RT- PCR yönteminde kullanılmıştır. Agaroz jel elektroforezde CMV ve ZYMV için sırasıyla 250 ve 650 bp lik band büyüklükleri gözlenmiştir. Kaya ve Erkan (2007) tarafından İzmir, Aydın, Manisa ve Balıkesir illerinde gerçekleştirilen bir çalışmada; kabakgil alanlarında sorun olan viral etmenler belirlenmiştir yılında toplanan örneklerdeki en yaygın viral etmenler kavun bitkilerinde %43,88 ve sakız kabağı bitkilerinde %30,32 oranı ile WMV-2, karpuz

30 20 bitkilerinde %24,16 oranında PRSV-W ve hıyar bitkilerinde %13,15 oranı ile CMV olarak belirlenmiştir. WMV-2 tüm kabakgillerde ve PRSV-W yalnızca karpuzlarda tespit edilirken, ZYMV hıyar ve karpuz örneklerinde, SqMV ve CGMMV ise hiçbir kabakgil örneğinde saptanmamıştır yılında toplanan örneklerde ise WMV-2, kavun bitkilerinde %65, sakız kabağı bitkilerinde %50, bal kabağı bitkilerinde %88,8 ve hıyar bitkilerinde CMV %65 oranlarıyla belirlenmiştir. Ayrıca karışık enfeksiyonlar da tespit edilmiştir. Paylan (2011) tarafından, ülkemizde taze tüketim ve tohumluk üretimi için öneme sahip olan bazı sebze türlerinin tohumlarındaki viral hastalık etmenlerinin bulunma durumlarını belirlemek, enfekteli olan tohumlardaki virüsleri elimine etmek ve bu etmenler için bir savaşım programı geliştirmek amacıyla bir çalışma yapılmıştır. Araştırma kapsamında, toplam 325 adet tohum örneğindeki viral etmenlerin tanılanmasında biyolojik, serolojik ve moleküler yöntemler kullanılmıştır. Araştırıcı, değişik virüslere karşı testlenen 30 karpuz örneğinin %17 sinde CMV, 32 kavun örneğinin %38 inde CMV ve %6 sında SqMV, 30 hıyar örneğinin %13 ünde CMV, 15 kabak örneğinin %27 sinde CMV ve %20 sinde ZYMV tespit edildiğini ve araştırmada kullanılan farklı sebze türlerine ait tohum örneklerindeki viral etmenlerin bulunuşlarının genel olarak %0-69 arasında değiştiğini bildirmektedir. Araştırıcı ayrıca, enfekteli 8 sebze tohum örneğine 10 farklı inaktifleştirme uygulaması gerçekleştirmiş ve bu uygulamaların sebze tohumlarındaki çimlenme değerleri üzerine olan etkilerini araştırmıştır. Bu çalışmalar sonucunda, viral etmenlerin konsantrasyonlarının azaltması açısından en etkili yöntemlerin HCL (%51), sıcak su (%42) ve ozon (%32) uygulamaları olduğu görülmüştür. HCL ve ozon uygulamalarınınn tohumların çimlenme değerleri üzerinde olumsuz etkileri olmazken, sıcak su uygulamaları çimlenme değerlerini önemli derecede olumsuz etkilemiş ve tohumların çimlenme güçlerini ortalama olarak %94 ten %31 e düşürdüğü tespit edilmiştir. Topkaya ve Ertunç (2012) tarafından Ankara ve Antalya kabakgil üretim alanlarında gerçekleştirilen survey çalışmalarında; Ankara dan toplanan 118 bitki örneğinin ZYMV (%50,8), WMV-2 (%65,2), CMV (%21,1), PRSV-W (%20,3), SqMV (%2,5) ve CGMMV (%11,6); Antalya dan toplanan 79 balkabağı örneklerinin ZYMV (%21,5) ve WMV-2 (%59,4) ile bulaşık olduğu yapılan DAS-ELISA testleri sonucu ortaya konmuştur.

31 Enfeksiyon Kaynakları ve Mücadele Yolları Kabakgil virüslerinin başlıca enfeksiyon kaynakları tohum, enfekteli bitkiler ve böcek vektörlerdir. Kabakgil sebzelerinde virüslerin ilk enfeksiyonları tesadüfidir ve çoğunlukla tarlada enfeksiyon noktalarında lokalize olmaktadır. Mevsim sonuna doğru yaprak biti türlerinin kolonizasyonu ile bitkiden bitkiye sıralar boyunca yayılma olmaktadır. Kabakgil bitkileri sıra aralarında genişledikçe, virüs yayılımı daha karmaşık bir hal almaya başlamaktadır (Raccah, 1999). CMV, birçok bitkide 60 dan fazla yaprak biti türü ile non-persistent olarak taşınabilmektedir. Ayrıca, bu virüsün mekanik inokulasyonla da Chenopodium amaranticolor da klorotik lokal lezyon, Cucumis sativus da sistemik mozayik, Lycopersicon esculentum da mozayik ve yaprak deformasyonları ve N. tabaccum da da lokal lezyon oluşturduğu bildirilmektedir. CMV nün belirtileri türe, gelişim dönemine, sıcaklığa ve virüs ırkına göre büyük değişiklik göstermektedir. Bu belirtiler gelişen genç yapraklardaki hafif sararmalar (kloroz), büyüme noktalarının şiddetli biçimde yanması ve bitki ölümlerini içerir. Enfekteli bitkilerin genç yapraklarında çoğunlukla klorotik lekeler ve yapraklarda daralma, şiddetli kıvrılma ve şekil bozuklukları görülebilmektedir. Hastalığın ilerleyen döneminde bitkide çoğunlukla bodurluk gözlenmekte, taç yapraklar tamamen yanabilmekte ve büyüme noktası ölebilmektedir (Francki, 1980; Kaper ve Waterworth, 1981; Yang ve ark., 1993). Sharma ve ark. (1984) tarafından yapılan çalışmalarda CMV nün kavun ırkının %10-28 oranında kavun tohumlarıyla taşınabildiğini belirlemişlerdir. Gera (1999) tarafından yapılan bir çalışma sonucunda CGMMV nün hıyar tohumlarıyla %8 gibi bir oranla taşınabildiği belirlenmiştir. Powell ve Schlege (1970) SqMV ile bulaşık kavun bitkilerinden elde ettikleri kavun tohumlarının %12 sinin embriyosunda ve bu tohumlardan elde ettikleri fidelerin de % 22 sinde SqMV nü saptamışlardır. Tohumlar çimlendikten sonra fidelerde görülebilir bir virüs artışı olmasına rağmen 30 günlük bir gözlem sonucunda hastalıklı tohumların çimlendirilmesi ile oluşan infekteli fakat simptomsuz bitkilerden alınan tohumlarda %13 oranında virüs saptanmıştır. SqMV infeksiyonu ile kavun meyve ağırlığı, büyüklüğü, tohum sayısı, tohum ağırlığı ve tohumların çimlenme yüzdesinde bir azalma ortaya çıkmıştır. İki yıl boyunca depolanan tohumlarda infeksiyon oranında % 23 ten, % 5 e doğru bir azalma saptanmıştır. Provvidenti ve Robinson (1974)

32 22 Cucumis metuliformis in SqMV ne dayanıklı olduğunu saptamışlardır. Bulaşık bitkilerde SqMV klorotik lokal lezyon biçiminde simptom oluşturmuştur. SqMV mekanik inokülasyonla, vektörle (Acalymma trivittata; Diabrotica undecimpunctata: Diabrotica bivittula; Epilachna chrysomelina; Epilachna paenulata), tohumla ve polenle taşınmaktadır. Tohumla taşınma oranı kavun da %10, kabak ta % 35 e kadar ulaşmaktadır. Virüs; kavun, hıyar, kabak, balkabağı, kestane kabağı gibi konukçu bitkilerde halkalı lekeler ve yaprak deformasyonları, Echbalium elatarium da hafif sarı mozayik simptomlarını oluşturmaktadır. Karpuz ve sirken virüsün konukçuları arasında yer almaktadır (Alvarez ve Campbell; 1978, Nolan ve Campbell, 1984). Yapılan araştırmalar SqMV ün kabak tohumlarında %12-15, kavun tohumlarında %43 lere varan oranlarda taşınabildiğini göstermiştir (Richardson, 1990). Kabakgil tohumlarının kabuğu ve embriyosundan elde edilen ekstraktlar ile yapılan ELISA çalışmalarında virüs hem tohum kabuğunda hem de embriyoda bulunmuş ve teste tabi tutulan 400 tohumun % 90 oranında SqMV ile bulaşık olduğu görülmüştür (Nolan ve Campbell, 1984). SqMV, Chenopodium murale ve C. quinoa tohumlarıyla taşınmaktadır. Çimlenmiş fidelerin ELISA ile testlenmesi sonucunda SqMV nün tohumla taşınma oranı C. quinoa da % 25, C. murale de % 23 tür. Atripleks glauca SqMV nün sistemik konukçusu ve önemli bir inokulum kaynağıdır (Lockhart ve ark., 1985). Maghoub ve ark. (1997), Sudan da, 1993 yılında kabak (C. pepo cv. Eskandrani) tan izole ettikleri ZYMV-Su izolatının etkili bir şekilde M. persicae ve A. gossypii ile non-persistent olarak taşındığını bildirmektedirler. Diğer potyvirüsler gibi ZYMV de afidlerle non-persistent olarak etkili biçimde taşınmaktadır. Tek bir M. persicae bireyi ile taşınma oranı %30 olarak hesaplanmıştır (Lisa ve ark., 1981). Desbiez ve ark. (2003) hassas kabak çeşidi olan C. pepo cv. Diamant da şiddetli belirtiler oluşturan ZYMV izolatlarının, tolerant çeşit olan Afrodit te seri mekanik inokulasyonlarının ardından elde ettikleri mutant ZYMV izolatlarının P3 proteininde meydana gelen tek bir nokta mutasyonun (917. pozisyonda Arjinin yerine triptofan) çeşit toleransını kırmaya yettiğini bildirmektedirler. Kabakgillerde önemli verim kaybına neden olan ve 2002 yılına kadar epidemiyolojisinde tohum ile taşınmanın önemli role sahip olmadığı düşünülen ZYMV ile yapılan çalışmalarda, sadece tohumla taşınabileceği durumlarda ortaya çıktığına dair izler bulunmuştur. Çalışmalarda kullanlan C. pepo var. styriaca tohumlarnda %5

33 23 oranına kadar bulunduğunda tohum ile taşınabildiği rapor edilmiştir (Riedle-Bauer ve ark., 2002). Pinto ve ark. (2008) A. gossypii ve M. persicae nin CMV nü tek başına ve PRSV-W veya ZYMV ile karışık enfeksiyonlarını taşıma kapasitelerini ortaya koymak için bir çalışma gerçekleştirmişler. Araştırıcılar, PRSV-W ve ZYMV nün CMV ne kıyasla her iki afid tarafından da daha etkili taşınabildiğini (%92), ayrıca bu üç virüsün ayrı ayrı taşınma kapasitelerinin, karışım halinde taşınma kapasitelerinden daha yüksek olduğunu bildirmektedirler. Nishiguchi (2007) Japonya da, seralarda yetiştirilen kavunlarda sorun olan CGMMV virüsü ile mücadelede, aynı virüsün ılımlı ırkı (strain SH33b) ile yaptığı çapraz dayanıklılık çalışmaları sonucunda hastalık şiddetinin ve verim kaybının azaldığını bildirmektedir Genetik ÇalıĢmalar Potyviruslerde, izolatların genetik farklılıklarını ortaya koyabilmek için, genomlarında en fazla varyasyon görülen bölge olan kılıf proteini (CP) geninin N-uç kısmı kullanılmaktadır (Rybicki ve Shukla, 1992; Desbiez ve ark., 2002). Desbiez ve ark. (1996) Martinik adasında, kabakgil ekim alanlarından yıllarında topladıkları bitkilerden izole ettikleri 14 adet ZYMV moleküler ve biyolojik çeşitliliğini belirlemek için bir çalışma yapmışlardır. Biyolojik özelliklerini belirlemek için çeşitli test bitkilerine inokulasyon, antijenik özelliklerini belirlemek için ise bir dizi monoklonal antibadiler kullanmışlar. Araştırıcılar, izolatların, biyolojik ve antijenik özellikleri açısından farklılıklar gösterdiklerini bildirmektedir. Ayrıca kılıf proteini ve polimeraz (Nlb) kodlayan bölgenin (432 baz) kısmi dizi analizinin gerçekleştirilmesi sonucu, izolatlar arasında az da olsa moleküler değişkenlik olduğunu tespit etmişlerdir. Mahgoub ve ark. (1998) Sudan kabakgil ekim alanlarından elde ettikleri 22 adet ZYMV izolatlarının biyolojik ve serolojik çeşitliliklerini ortaya koymak için gerçekleştirdikleri çalışmada; simptomatoloji, konukçu dizisi ve Zym dayanıklılık genine sahip kavun çeşidindeki virülensleri açısından izolatlar arasında değişkenlik bulunduğunu bildirmektedirler. Çalışmada, ayrıca, yedi farklı monoklonal antibadi (mabs) den oluşan bir set kullanılarak 6 adet serotip ortaya konulmuş. Fakat izolatların büyük bir kısmının (%88) referans strainler (İtalya ve Fransa) gibi mabs in hepsiyle reaksiyona girdiklerini bildirmektedirler. İzolatların tamamının; kabak (C. moschata

34 24 (Duchesne) Duchesne ex Poir. cvs. Menina ve Nigeria) ve hıyar (Cucumis sativus L. cv. TMG) çeşitlerinin sahip olduğu dayanıklılık genleri veya ZYMV-WK straini ile çapraz koruma çalışmaları ile kontrol edilebildiği rapor edilmektedir. Yine tüm izolatların, A. gossypii Glover ve M. persicae Sulzer ile non-persistent olarak taşındığını bildirmektedirler. Desbiez ve ark. (2002), yıllarında, Martinik ve Guadolop adalarından sağladıkları 110 ZYMV izolatının, polimeraz geninin C ucu (Nlb C-ter) ve kılıf proteini geninin N ucu (CP N-ter) nu kapsayacak biçimde 250 baz uzunluğundaki kısmın dizi analizini gerçekleştirmişlerdir. Filogenetik analiz çalışmalarında 110 izolat ile birlikte, gen bankasından sağladıkları ve daha önce dizi analizi yapılmış 32 izolatı da kullanmışlardır. Filogenetik analiz sonucunda elde ettikleri ağaçta izolatlar iki gruba dağılmışlar, Reunion ve komşu adalardan sağlanan 5 izolat diğerlerinden yüksek oranda farklılık göstererek ayrı bir grupta yer almışlar (grup B). İzolatların büyük bir kısmı ise (Martinik ve Guadolop izolatları) aynı grupta (grup A) toplanırken, bu grup altında 3 altgrubun oluştuğu gözlenmiştir. Zhao ve ark (2003) Çin in Hangzhou şehrinden farklı kabakgil bitkilerinden elde ettikleri ZYMV izolatlarından 4 adedinin tam genom ve yine 4 adedinin kılıf proteinini kodlayan bölgeyi de kapsayacak şekilde genomun 3ʹ ucunun dizi analizini yaparak dünyada mevcut dizilerle karşılaştırmışlardır. Araştırıcılar, filogenetik analizler sonucunda, izolatların birbirinden farklı 3 gruba dağıldıklarını ve Çin izolatlarının ise III nolu grup içine düştüklerini bildirmektedirler. Ali ve ark. (2004), Pakistan kabakgil ekim alanlarından izole ettikleri CGMMV, ZYMV, WMV ve PRSV izolatlarının kılıf proteini (CP) genlerinin dna dizilerini ve amino asit bileşimlerini ortaya koymuşlardır. ZYMV-Pak izolatının amino asit bileşiminin daha önce dünyada rapor edilen ZYMV izolatlarının amino asit bileşimlerine %88,3-99 oranında benzer olduğunu rapor etmektedirler. Finetti-Sialer ve ark. (2005) sakız kabağı, hıyar, domates, patlıcan, biber ve yabancı otlardan izole ettikleri CMV izolatlarının gerçekleştirdikleri RT-PCR-RFLP çalışmalarıyla IA altgrubuna bağlı olduğunu saptamışlardır. Boubourakas ve ark. (2006) tarafından yıllarında, Yunanistan da, sera ve açık alanda yetiştirilen hıyar ve kavun bitkilerinden izole edilen CYSDV ve BPYV izolatlarından birer tanesinin sekans analizleri yapılmıştır. Araştırıcılar bu amaçla, BPYVI/BPYVII ve CYSDV1/CYSDV2 oligonukleotid primerleri ile elde ettikleri PCR ürünlerini (251 ve 364 bp) direkt olarak kullanmışlardır. WU-BLAST2

35 25 programı ile gerçekleştirdikleri sekans analizi sonucu, BPYV Rh izolatının daha önce Yunanistan da sekans analizi yapılmış olan BPYV izolatı ile nükleotid ve amino asit dizilerinin, sırasıyla %98,7 ve %99 benzerlik gösterdiğini bildirmektedirler. Yine, CYSDV Rh izolatının da İspanya ve İsrail izolatlarına %99 nükleotid ve %100 amino asit dizisi benzerliği gösterdiği rapor edilmektedir. Glasa ve Pittnerova (2006) Slovakya da 2002 yılında kabak bitkisinden izole ettikleri ZYMV-Kuchyna izolatının tüm genomunun dizi analizini gerçekleştirmişlerdir nükleotid içeren viral genomun 3080 adet amino asit kodladığı ve gen bankasından sağlanan diğer ZYMV izolatlarıyla nükleotid bakımından %90,4-98,8, amino asit dizisi bakımından ise %78-98,8 oranında benzer olduğunu bildirmektedirler. Glasa ve ark. (2007) Slovakya ve Çek Cumhuriyetinin çeşitli bölgelerinde, hıyar, kabak ve sakız kabağından sağladıkları 11 ZYMV izolatlarının biyolojik ve moleküler çeşitliliğini ortaya koymak için bir çalışma gerçekleştirmişlerdir. ZYMV genomunun üç ayrı genomik bölgesi (P1, P3 ve (Cter)Nlb-(Nter)CP) hedeflenerek gerçekleştirilen moleküler farklılık analizi, zamansal ve mekansal farklılıklarına karşın, izolatlar arasında önemli ölçüde, düşük düzeyde nükleotid farklılığı olduğunu ortaya koymuştur. CP geninin 5ʹ ucuna göre yapılan filogenetik analiz, Slovak, Çek ve diğer orta Avrupa ZYMV izolatlarının yakın akraba olduğunu göstermiştir. Asya gibi diğer coğrafi bölgelerden sağlanan izolatlarda gözlenen genetik farklılığın aksine, orta Avrupa izolatlarında düşük düzeyde genetik farklılık saptanmıştır. ZYMV genomunda bir rekombinasyona rastlanmamıştır. Saldırgan ve ılımlı ZYMV izolatları arasında yapılan sekans karşılaştırması, P3 proteinin N-ucunda tek bir amino asit farklılığı (tolerans kırıcı) olduğunu ortaya koymuştur. Bananej ve ark. (2008), İran kabakgil ekim alanlarından, yıllarında topladıkları bitki örneklerinden izole ettikleri 12 adet ZYMV izolatlarının genetik ve biyolojik farklılıklarını ortaya koymak için bir çalışma gerçekleştirmişler. İzolatların biyolojik özelliklerini karşılaştırmak için yapılan deneysel konukçu dizisi çalışmaları sonucunda, biyolojik özelliklerinde bazı farklılıklar gözlenmiş. Araştırıcılar, Nlb geninin C ucu ve kılıf protein geninin (CP) N ucunu (489 baz) dizi analizine tabii tutmuşlar ve GenBank a yüklemişler. İran izolatlarının kendi aralarındaki amino asit dizilerinin %95,6-100 benzerlik gösterdiğini saptamışlar. Yakoubi ve ark. (2008a), Tunus kabakgil ekim alanlarındaki ZYMV nün populasyon yapısını ortaya koyabilmek için gerçekleştirdikleri çalışma kapsamında elde ettikleri 83 ZYMV izolatının polimeraz (Nlb) ve kılıf proteini (CP) nin kısmi dizi

36 26 analizini yapmışlar. Filogenetik analizler sonucunda izolatların moleküler grup A içerisinde birbirinden ayrı iki altgrup içerisine yerleştiklerini gözlemlemişlerdir. Araştırıcılar P3 proteininde bulunan, ZYMV-tolerant kabak çeşitlerinde tolerans kırma ile ilişkili olan MREK motifinde önemli bir değişkenlik saptamışlardır. Altgrup 1 de MREK motifi yaygınken, altgrup 2 de MKEK motifinin yaygın olduğunu bildirmektedirler. Yakoubi ve ark. (2008b), 1986 yılında Cezayir de kabak bitkisinden izole ettikleri, H4 adını verdikleri bir potyvirüsün, biyolojik ve serolojik özelliklerinin diğer kabakgil-enfekte eden potyvirüslere, özellikle Moroccan watermelon mosaic potyvirus (MWMV) ve PRSV ne benzerlik gösterdiğini tespit etmişlerdir. Araştırıcılar bu virüsü kesin olarak teşhis edebilmek için, tüm genom sekans analizini yapmışlar. Analiz sonucu, amino asit dizileri MWMV (%70) ve PRSV (%65) ne benzerlik gösterdiğinden bu virüsün PRSV grubundan olduğunu ve bu yeni potyvirüse Algerian watermelon mosaic potyvirus (AWMV) adını verdiklerini bildirmektedirler. Chikh Ali ve ark. (2009) 2006 yılında sakız kabağından izole ettikleri ZYMV izolatlarını (SYZY-1 ve SYZY-3) moleküler ve biyolojik olarak, Suriye de ilk kez karakterize etmişlerdir. Araştırıcılar, SYZY-1 in kabakgillerde saldırganken, baklagil bitkilerinde hiçbir belirti oluşturmadığını gözlemlemişler. Diğer taraftan, SYZY-3 hıyar ve kavunu enfekte etmezken, sakız kabağı ve karpuzda hafif belirtiler oluşturmuş fakat test edilen baklagil bitkilerinde lokal ve sistemik belirtilerin ortaya çıkmasına sebep olmuştur. Bununla birlikte, yapılan moleküler karakterizasyon çalışmaları her iki izolatın yakın akraba olduğunu ortaya koymuştur. Kılıf proteini (CP) nükleotid ve amino asid dizilerinin, sırasıyla %99,5 ve %100 benzer olduğu bildirilmektedir. Ayrıca çalışmada ortaya konan Suriye izolatları CP nükleotid dizilerinin, Almanya izolatıyla yüksek oranda benzerlik göstermesi sebebiyle orjinlerinin de benzer olduğu rapor edilmektedir. Vucurovic ve ark. (2012), Sırbistan dan yıllarında sağladıkları 12 ZYMV izolatlarının, kendi aralarında ve dünya izolatılarıyla olan genetik akrabalıklarını ortaya koyabilmek için kılıf protein geninin tamamını (837 baz) dizi analizine tabi tutmuşlardır. Araştırıcılar daha sonra gerçekleştirdikleri filogenetik analiz sonucunda, Sırbistan izolatlarının orta Avrupa izolatlarının da içerisinde yer aldığı grup A içerisinde bulunduğunu bildirmektedirler.

37 27 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal Virüs ile enfekteli kabakgil bitki materyalinin temini Araştırma materyali 2009 ve 2010 yılları Temmuz-Ağustos aylarında bulaşık olduğu düşünülen genç kabakgil (çerezlik kabak (Cucurbita pepo L.), hıyar (Cucumis sativus L.), kavun (C. melo L.), acur (C melo var. flexuosus (L.) Naudin.), karpuz (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai), sakız kabağı (yazlık kabak) (Cucurbita pepo L.) ve bal kabağı (kışlık kabak) (Cucurbita moschata Duch.)) bitkilerinden sağlanmıştır. Kabakgil yetiştiriciliği yapılan Konya, Karaman ve Aksaray illerine bağlı ilçelerdeki kabakgil bitkilerinin üretildiği alanlarda yaprak deformasyonu, yapraklarda kıvırcıklaşma, çalılaşma, yaprak şekil bozukluğu, yeşilimsi sarı renkli mozayik, uç sürgünlerinde kıvrılmalar ve sivilceli, deforme meyve oluşumu tipinde simptom gösteren kabakgil bitkilerinin ve bu bitkilerin civarında bulunan yabancı otların yaprakları ve bunların üzerinde bulunan yaprak bitleri ile o seneye ait, üreticiden sağlanan kabakgil tohumları çalışmanın materyalini oluşturmuştur Serolojik testlerde kullanılan materyal Araştırma kapsamında gerçekleştirilen DAS-ELISA testi çalışmaları; Selçuk Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Bölümü Moleküler Bitki Patolojisi Laboratuarında yürütülmüştür. Yapılan arazi çıkışlarında, virüs hastalık belirtileri gösteren kabakgil bitkilerinin ve bu bitkilerin civarından alınan yabancı otların genç yaprak ve sürgünleri ile üreticilerden sağlanan kabakgil bitkilerinin tohumları DAS-ELISA yöntemi ile testlenmişlerdir. DAS-ELISA çalışmalarında; ticari firmalardan temin edilen CGMMV (ADGEN), CMV, PRSV-W, SqMV, WMV-2 ve ZYMV (BIOREBA) ne spesifik reagent setler (antiserum, pozitif ve negatif kontroller) ile laboratuarda hazırlanan ekstraksiyon, kaplama, conjugate, substrat ve yıkama tamponları (Ek.1) ile 96 çukurlu microplateler (Nunc F96 Maxisorp), otomatik pipetler (eppendorf), pipet uçları ve saf su kullanılmıştır. ELISA testleri sonucunda örneklerin absorbans değerleri, Anthos 2010 markalı ELISA okuyucusunda belirlenmiştir.

38 Moleküler çalıģmalarda kullanılan materyal Total nükleik asit (TNA) ekstraksiyonunda kullanılan materyal DAS-ELISA testleri sonucunda, çalışmaya konu olan virüslerle bulaşık olduğu belirlenen kabakgil bitkileri, tohumlar ve yabancı otlardan ve arazi çalışmalarında toplanan yaprak biti örneklerinden TNA ekstraksiyonu yapılmıştır. Bu çalışmalar sırasında; steril havan ve havan eli, çeşitli kimyasallar ve tampon çözeltiler (Ek.2), 0,5 ve 0,2 ml lik RNase free eppendorf tüpleri, ayarlanabilir mikropipetler, pipet uçları, Precisa marka hassas terazi, Daihan marka masaüstü santrifüj, Nüve RF 800 marka soğutmalı santrifüj, Techne marka kuru blok ısıtıcı, Daihan marka vorteks cihazı ve -25 o C ye kadar soğutma kapasitesine sahip derin dondurucu kullanılmıştır RT-PCR ve PCR testlerinde kullanılan materyal Daha önceden TNA ekstraksiyonu yapılmış olan örneklerden komplementer DNA (cdna) sentezi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla Fermentas firmasından temin edilen cdna sentez kiti, Daihan marka masaüstü santrifüj ve vorteks, Techne marka kuru blok ısıtıcı, Eppendorf marka thermocycler, mikropipetler ve pipet uçları ve 0,2 ml lik RNase free eppendorf tüpleri kullanılmıştır. PCR testlerinde; bir önceki aşamada elde edilen her bir örneğe ait cdna ler, yüksek ısıya dayanıklı (termostabil) DNA polimeraz enzimi (Taq polymerase, 5u/µl), MgCl 2 (25 mm), PCR buffer (10X) ve virüs RNA nin hedef bölgesine spesifik forward ve reverse oligonükleotid primerler (Alpha DNA), Daihan marka masaüstü santrifüj ve vorteks, Eppendorf ve Techne marka thermocycler cihazları, mikropipetler ve pipet uçları ve 0,2 ml lik RNase free eppendorf PCR tüpleri kullanılmıştır Agaroz jel elektroforez çalıģmalarında kullanılan materyal Agaroz jel elektroforez çalışmaları ile kontrol edilecek olan materyal olarak TNA ekstraksiyonu sonucunda elde edilen ilgili virüslere ait TNA ler, RT-PCR çalışmaları sonucunda çoğaltılan DNA materyali kullanılmıştır. Çalışmada, Owl A2 ve Owl Easy Cast B1 (Thermo) model jel elektroforez düzeneği, Thermo marka güç kaynağı, örneklerin ve jellerin hazırlanmasında ve boyanmasında kullanılan kimyasallar

39 29 ve Gene Ruler 100 bp DNA Ladder (Fermentas) materyal olarak kullanılmıştır. Tüm jellerin fotoğrafları Vilber Lourmat marka jel görüntüleme cihazında çekilmiştir AraĢtırmada kullanılan diğer materyal Araştırma kapsamında; Hirayama 80L otoklav, mikrodalga fırın, Daihan mikrosantrifuj, Precisa hassas terazi, Scotsman buz makinası, Nüve saf su makinası, Elga ultra saf su makinası, Heidolph Unimax 2010 çalkalayıcı, Nüve ES 120 soğutmalı inkübatör, Nüve EN 400 inkübatör, Nüve FN 400 pastör fırını, ısıtıcılı-manyetik karıştırıcı, WTW PH3110 ph metre ve Nüve RF800 santrifüj tez çalışmasının çeşitli aşamalarında kullanılmıştır Yöntem Arazi çalıģmaları ve örnekleme Araştırma kapsamında örneklemenin yapıldığı alanı, Konya, Karaman ve Aksaray illeri merkez ve ilçelerinde açıkta ve serada kabakgil yetiştiriciliği yapılan üretim alanları oluşturmaktadır. Arazi çalışmaları, Konya, Karaman ve Aksaray Tarım il ve İlçe Müdürlüklerinden alınan bilgilere göre, yoğun olarak kabakgil yetiştiriciliği yapılan Konya da, Çumra, Ereğli, Altınekin, Yunak, Karatay ve Meram, Karaman da, merkez, Ayrancı ve Kazımkarabekir, Aksaray da ise, merkez, Ortaköy ve Gülağaç ilçeleri ve köylerinde 2009 ve 2010 yıllarında temmuz-ağustos aylarında gerçekleştirilmiştir. Örnekleme çalışmaları, bu üç ilin toplam üretim alanının % 1 inden daha fazla olan yaklaşık 3500 da (Konya 1450 da, Karaman 1100 da ve Aksaray 950 da) alana sahip 139 adet üretim alanı dolaşılarak gerçekleştirilmiştir. Örneklerin alındığı il ve ilçeler Şekil 3.1 de gösterilmiştir. Arazi çalışmalarında, tarla ve seralar tesadüfî olarak bölgeyi temsil edecek şekilde seçilmiş ve gezilen her sera veya araziden, tipik virüs hastalıkları belirtileri gösteren en az 5 farklı bitkiden ve bu bitkilerin yakınında bulunan yabancı otlardan genç sürgün ve yaprak örnekleri alınmıştır. Alınan bitki örnekleri, üzerinde; örneğin alındığı yer, bitki çeşidi ve tarih yazılarak numaralandırılmış plastik torbalar içerisine ayrı ayrı konularak laboratuara getirilmiştir. Örnekler serolojik ve moleküler

40 30 çalışmalarda kullanılıncaya kadar -20 o C de çalışan derin dondurucuda muhafaza edilmiştir. ġekil 3.1. Araştırmanın gerçekleştirildiği iller ve ilçeler. Çalışma kapsamında, gezilen arazilere ekilen kabakgil bitkisi tohumunun, bu çalışmaya konu olan virüslerle bulaşık olup olmadığını belirlemek amacıyla, üreticisine ulaşılan arazilerden tohum örnekleri de alınmıştır. Bunlar, plastik torbalarda laboratuara getirilip, + 4 o C de muhafaza edilmiştir. Yine, virüs hastalıkları belirtileri gösteren kabakgil bitkileri üzerinde görülen yaprak bitleri de, içerisinde %70 lik etil alkol bulunan küçük şişelere yumuşak uçlu fırça yardımıyla alınarak laboratuara getirilmiştir. Laboratuara getirilen yabancı otların tür teşhisleri Prof. Dr. Ahmet GÜNCAN, yaprak bitlerinin tür teşhisleri ise Prof. Dr. Meryem UYSAL tarafından yapılmıştır. Arazi çalışmaları sırasında toplanan ve laboratuara getirilen kabakgil bitkisi örnekleri, tohum örnekleri ve yabancı ot örnekleri DAS-ELISA ile testlenmiş, bulaşık

41 31 olan örnekler ve araziden toplanan yaprak biti örnekleri RT-PCR çalışmalarında kullanılmıştır Serolojik test yöntemi (DAS-ELISA) Arazi çalışmaları sonucu toplanan kabakgil bitkileri ve yabancı ot yaprakları ile üreticilerden temin edilen kabakgil bitki tohumlarındaki viral etmenlerin belirlenmesi amacıyla bu örneklere serolojik yöntemlerden DAS-ELISA testi uygulanmıştır. Bu çalışmalarda, örneklerde CGMMV, CMV, PRSV-W, SqMV, WMV-2 ve ZYMV bulaşıklığına bakılmıştır. DAS-ELISA testinde kullanılan tohum örnekleri, 4 er gram tartılmış ve iç kısımlarında filtre kağıdı bulunan, steril petri kaplarında 1-3 hafta süreyle inkübatörde tutularak çimlendirilmiştir (Anonymous, 1999) (Şekil 3.2). Çimlenen tohumlar, ilk kotiledon yapraklarını oluşturduğu zaman, steril havan ve havan eli yardımıyla üzerine 1:5-7 (ağırlık: hacim) oranında ekstraksiyon tamponu (PBS-TP, ph 7,4) ilave edilerek ezilmiştir. Daha sonra, steril tülbent yardımıyla, küçük hacimli cam tüplere tohum ekstraktları aktarılmıştır (Hampton ve De Boer, 1990). Bu şekilde hazırlanan tohum örnekleri ile 1:10 oranında PBS-TP ile ekstrakte edilen bitki ve yabancı ot yaprak örnekleri aşağıda belirtilen aşamaların gerçekleştirilmesiyle DAS-ELISA testine tabi tutulmuşlardır (Clark ve Adams, 1977). Bu çalışmada kullanılan tampon çözeltiler ve hazırlanışları Ek-1 de verilmiştir. 1. Önce ELISA tabaklarının her bir kuyucuğuna, kaplama tamponunda 1:1000 (Bioreba firması antiserumları) oranında seyreltilmiş olan IgG den 100 µl eklenerek inkübatörde 37 o C de 4 saat inkübe edilmiştir, 2. ELISA tabakları, her bir kuyucuğu tamamen yıkama tamponu (PBST) ile doldurulup bu şekilde 3 dakika bekletilmesi suretiyle yıkanmıştır ve bu işlem 3 kez tekrarlanmıştır, 3. Ekstraksiyon (PBS-TP) tamponu varlığında elde edilen bitki ve tohum ekstraktları ile buffer, pozitif ve negatif kontroller, her bir kuyucuğa 100 µl hacimde konulmuştur ve + 4 o C de en az 16 saat (bir gece) inkübe edilmiştir, 4. ELISA tabakları daha önce tarif edildiği gibi tekrar yıkanmıştır, 5. Alkalin fosfotaz ile etiketli olan (Conjugated IgG) IgG, konjugat tamponu içerisinde 1:1000 (Bioreba firması antiserumları için) oranında seyreltilip her bir kuyucuğa 100 µl hacimde eklenerek 37 o C de 4 saat inkübe edilmiştir,

42 32 6. ELISA tabakları daha önce tarif edildiği gibi bir kez daha yıkınmıştır, 7. Son olarak tabakların herbir kuyusuna substrat tampon çözeltisinde 1mg/ml olacak şekilde hazırlanan substrattan 100 er μl ilave edilmiştir ve tabaklar dakika oda sıcaklığında ışıksız ortamda inkübe edilmiştir, 8. ELISA testleri sonunda, ELISA okuyucusunda negatif kontrol için 405 nm de okunan absorbans değerinin en az iki katı ve daha fazla absorbans değeri veren örnekler pozitif (virüsle enfekteli) olarak kabul edilmiştir (Barba ve Riccioni, 1993; Ertunç, 1992b; Helguera ve ark., 2002). Yapılan ELISA testlerinde, her bir örnek için ikişer kuyu kullanılmış ve her bir ELISA pleytinde birer adet pozitif (enfekteli), negatif (sağlıklı) ve buffer kontrol bulunmasına dikkat edilmiştir. a b c d ġekil 3.2. a, b, c) DAS-ELISA çalışmalarının aşamaları, d) DAS-ELISA ve TNA ekstraksiyon çalışmalarında kullanılan çimlendirilmiş tohum örnekleri

43 Moleküler çalıģmalar Total nükleik asit (TNA) ekstraksiyonu Arazi çalışmaları sırasında, kabakgil bitkileri üzerinde görülüp toplanan yaprak bitleri örnekleri ile yapılan DAS-ELISA testleri sonucunda virüs(ler) ile bulaşık olduğu saptanan kabakgil bitki örnekleri, yabancı ot örnekleri ve kabakgil bitkisi tohum örneklerinde bulunan virüs bulaşıklığını belirlemek için gerçekleştirilen RT-PCR çalışmalarında materyal olarak kullanılmak üzere TNA ekstraksiyonları gerçekleştirilmiştir. Kabakgil bitki örneği sayısının çok fazla olması sebebiyle RT-PCR çalışmalarında, ELISA testlerinde yüksek absorbans değeri veren örnekler seçilerek moleküler çalışmalarda kullanılmıştır. Tohum örnekleri, yine ekstraksiyondan önce steril koşullarda çimlendirilmiştir. Bitki ve tohum örneklerinden gerçekleştirilen TNA ekstraksiyonlarında iki farklı yöntem kullanılmıştır. Birinci yöntem Astruc ve ark. (1996) ndan alınmış ve aşağıdaki gibi gerçekleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan tampon çözeltiler Ek-2 de verilmiştir. 1. Bitki örnekleri ekstraksiyon tamponu (100mM Tris-HCI ph.8,0, 50mM EDTA b-ph. 7,0, 500 mm NaCI, 10mM 2.mercapto-ethanol (1/1000)) içerisinde 1:2 (w/v) oranında sulandırılarak ekstrakte edilmiş ve bitki özsuyu steril tülbentten süzülmüştür. 2. Bitki özsuyundan 1ml alınarak eppendorf tüpleri içerisine yerleştirilmiş ve örnekler 3 dk rpm de santrifüj edilmiştir. 3. Pelet üzerine % 20 lik sodium dodecyl sulfat (SDS) den 50 μl ilave edilerek vortekste karıştırılmış ve sonra tüpler 65 ºC de 30 dk kuru blok ısıtıcıda inkübe edilmiştir. 4. Tüplere 250 μl potasyum asetat (5M) ilave edilerek 20 dakika buz içerisinde bekletilmiş ve daha sonra 15 dk rpm de santrifüj yapılmıştır. 5. Elde edilen süpernatant iki kısma ayrılmıştır ve 500 μl si yeni hazırlanmış eppendorf tüplerine konularak -70 C de saklanmıştır. Geriye kalan 500 μl süpernatant ise yeni hazırlanan eppendorf tüplerine konulup, üzerine % 100 lük ethanolden 500 μl ilave edilerek 1ml ye tamamlanmış ve vortekste karıştırılmıştır. 6. Daha sonra tüplere 50 μl sodyum asetat (3 M) ilave edilip, örnekler tekrar karıştırılarak -70 ºC de bir gece bekletilmiştir.

44 34 7. Ertesi gün, örnekler 15 dk rpm de santrifüj edilerek süpernatant kısmı ortamdan uzaklaştırılmıştır. 8. Eppendorf tüpleri filtre kağıdı üzerinde ters çevrilerek 5 dk kurutulmuş ve pellet üzerine % 70 lik ethanolden 1ml ilave edilmiştir. 9. Örnekler RNA leri çöktürmek amacıyla 5 dk rpm de santrifüj edilmiş ve tüp içerisindeki ethanol atılarak eppendorf tüpleri kurutma kağıtları ile dikkatlice kurutulmuştur. 10. Elde edilen total RNA lar 50 μl RNAse free saf su ile sulandırılarak, -70 ºC de muhafaza edilmiştir. Total nükleik asit izolasyonunda kullanılan diğer bir yöntem ise Foissac ve ark. (2000) ndan alınmış ve aşağıdaki gibi gerçekleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan tampon çözeltiler Ek-3 de verilmiştir. Daha önceden hazırlanan örnek tamponu (grinding buffer) içerisine virüslerin okside olmasının engellenmesi amacıyla 1/1000 oranında 2-mercaptoethanol ilave edilmiştir. Bitki ve tohum örneklerinden 100 er mg tartılarak, steril havanda 1ml örnek tamponu varlığında ezilmiştir. Elde edilen her bir örnek ekstraktından 500 er µl alınıp tüplere konulmuş ve her bir tüpe, karıştırıcı (vorteks) da iyice karıştırılan %10 luk sarkosyl (sodium lauroyl sarcosinate) den, 100 er µl konulmuştur. Tüpler karıştırıldıktan sonra, 70 C de çalışan blok ısıtıcıda, 10 dakika inkübe edilmiş ve ardından 5 dakika buzda tutulmuştur. İnkübasyonun ardından tüplere, devirde 10 dakika santrifüj uygulanmıştır. Bu arada, çalışılan örnek sayısı kadar yeni tüp hazırlanıp, numaralandırılmıştır. Yeni tüplerin içine eski tüplerden 300µl örnek, 50µl silica, 300 µl 6M NaI ve 150 µl etanol (%99) konulup tüpler karıştırıcı (vorteks) da karıştırılmıştır. Daha sonra tüpler çalkalayıcıya alınmış ve oda sıcaklığında 10 dakika tutulmuştur. Çalkalayıcıdan alınan tüplere 6000 devirde 1 dakika santrifüj uygulanmıştır. Santrifüjün ardından tüplerin üstünde kalan sıvı kısımlar dökülmüş ve tüplerde sadece silicalı kısım bırakılmıştır. Ardından, her tüpün içine 500µl yıkama tamponu konulup, katı kısım tamamen çözülene kadar karıştırıcıda karıştırılmış ve tüpler yıkama tamponları ile doluyken 6000 devirde 1 dakika santrifüj yapılmıştır. Aynı şekilde sıvı kısım boşaltılıp tekrar yıkama tamponu konulmuş ve aynı işlem bir daha yapılmıştır. Tüpleri santrifüjden çıkardıktan sonra sıvı kısım atılmış ve kurutma kâğıdına ters şekilde konularak birkaç dakika kurumaya bırakılmıştır. Daha sonra, 150 şer µl RNAse-free su eklenmiş ve karıştırıcıda karıştırılarak silicanın çözünmesi sağlanmıştır. Ardından örnekler, blok ısıtıcıda 4 dakika boyunca 70 C de inkube

45 35 edilmiş ve inkübasyonu takiben tüpler santrifüje alınarak, devirde 3 dakika santrifüj uygulanmıştır. Bu arada, çalışılan örnek sayısı kadar yeni tüpler hazırlanmış ve numaralandırılmıştır. Santrifüj işleminin ardından, tüplerdeki sıvı kısımlardan 145 er µl yeni hazırlanan tüplere aktarılmıştır. 145 µl hacmindeki total nükleik asit (TNA) ler, RT-PCR çalışmaları yapılıncaya kadar, hızlı bir şekilde -20 C de çalışan derin dondurucuya kaldırılmıştır. Ayrıca örnekleme çalışmaları esnasında viral hastalık belirtisi gösteren bitkilerden toplanan afidlerden de TNA izolasyonu yapılmıştır. Bu amaçla Singh ve ark. (1995) nın belirtmiş olduğu protokol modifiye edilerek kullanılmıştır. Öncelikle içerisinde 10 ar adet afid bulunan mikrosantrifüj tüpleri içerisindeki etil alkol uzaklaştırılmış ve sıvı azot bulunan kaplara daldırılarak plastik çubuk yardımıyla afitler toz haline gelinceye kadar ezilmiştir. Tüp içerisine 200 µl RNA izolasyon tamponu (200 mm Tris-HCL, ph:8,5, %1,5 lithium dodecyl sulfat, 300 mm lithium chloride, 10 mm EDTA, %1 sodium deoxycholate, %1 NP-40, %1 2-mercaptoethanol) eklenmiş ve daha sonra karıştırılmıştır. Karışıma 1,6 hacim (320 µl) 5 M potassium acetate (ph:6,5) eklendikten sonra, vorteks ile iyice karışması sağlanmıştır. Ardından tüpler rpm hızda 45 dk santrifüj edilerek, üstte kalan sıvı kısımdan 400 µl yeni tüplere aktarılmıştır. Bu tüplere aynı hacimde isopropanol konularak karıştırıldıktan sonra tüpler rpm hızda 30 dk santirifüj edilerek RNA nın çökmesi sağlanmıştır. Çökelti, 0,5 ml soğuk %70 lik etil alkol ile yıkanmış ve en son aşama olarak 50 µl steril RNase-free saf su ile sulandırılmıştır. Örnekler PCR reaksiyonlarında kullanılıncaya kadar -20 C de saklanmıştır. TNA ekstraksiyon çalışmaları sonucunda elde edilen ekstraktlardaki total RNA varlığı ve kalitesi agaroz jel elektroforez çalışmasıyla ve ayrıca nanodropta kontrol edilmiştir. Total RNA miktarı ve kalitesi yüksek olan örnekler RT-PCR na tabi tutulmuştur. RT-PCR işlemi iki aşamada gerçekleştirilmiştir. Birinci aşamada Ters transkripsiyon ile RNA ler cdna (komplementer DNA) e dönüştürülmüş ve ikinci aşamada ise virüse spesifik primerlerle çoğaltılmışlardır Komplementer DNA (cdna) sentezi Total RNA ekstraksiyonu yapılmış olan örneklerden komplementer DNA (cdna) sentezi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla Fermentas firmasından temin edilen

46 36 cdna sentez kitleri kullanılmış ve firmanın belirttiği prosedür doğrultusunda cdna sentezleri gerçekleştirilmiştir. Bu yönteme göre ilk olarak eppendorf tüplerin içerisine 0,1-5 µg (2-4 µl) total RNA, 1 µl random hexamer primer konulmuş ve DEPC ile muamele edilmiş saf su ile 12 µl ye tamamlanmıştır. 70 C de 5 dakika inkübasyon uygulandıktan sonra tüpler buz üzerine konulmuş ve içlerine sırasıyla 4 µl 5X reaction buffer, 1 µl Ribolock Ribonuclease inhibitor, 2 µl 10mM dntp mix eklenmiştir. Kısa süreli santrifüj (35 saniye) uygulandıktan sonra 25 C de 5 dakika inkübasyon uygulanmış ve tüplerin içine 1 M-MuLV reverse transcriptase eklenerek toplam 20 µl hacme ulaşılmıştır. Karışım daha sonra, thermocycler cihazında 25 C de 10 dakika, 42 C de 60 dakika ve 70 C de 10 dakika inkubasyon uygulanarak cdna sentez aşaması tamamlanmıştır PCR çalıģmaları Çalışmanın bu aşamasında, her bir virüs için literatür taramaları sonucunda belirlenen spesifik primerler, PCR karışımları ve thermocycler programları kullanılmıştır. PCR çalışmaları sırasında özellikle, kullanılan primerlerin optimum bağlanma (annealing) sıcaklıklarının ve PCR karışımlarının modifiye edilmesi gerekmiştir. Aşağıda çalışılan her bir virüs için belirlenen optimum PCR koşulları verilmektedir. Araştırmanın bu aşamasında gerçekleştirilen moleküler çalışmaların amacı, çalışılan örneklerdeki virüs varlığının saptanması olduğu için TRNA veya cdna konsantrasyonlarının örnekler arasında eşitlenmesine gerek duyulmamıştır. Bu çalışmalarda kullanılan konsantrasyonların 500ng/µl den az olmamasını sağlayacak hacimlerde TRNA veya cdna materyali kullanılmıştır. Ayrıca, tüm işlemler boyunca eldiven kullanılmış ve herhangi bir kontaminasyon ihtimalini ortaya koymak için de içerisinde PCR karışımı bulunan bir tüpe nükleik asit yerine aynı hacimde, çalışmada kullanılan su eklenmiş (su kontrol), thermocycler da PCR işlemine tabi tutulmuştur. CGMMV için gerçekleştirilen PCR işleminde Moreno ve ark. (2004) nın bildirdiği yöntem kullanılmıştır. Kullanılan primerler CGMMV genomu üzerinde, nükleotidler arasındaki 359 bp lik bir bölgeyi çoğaltmaktadır. Bu yönteme göre; örneğe ait total RNA dan elde edilen komplementer DNA dan (cdna) 2,5 µl alınarak, 2 µl dntp (ATP, GTP, CTP, TTP), 5 µl 10X PCR buffer (100mM Tris HCl, ph 8,8, 15 mm MgCl 2, 500mM KCl, %1 Triton X-100), 0,5 µl Taq polimeraz enzimi (5U/ µl), 1 µl forward primer (CGMMV-2) 5'- TCTAAATATGACAAGTCGC -3' (25

47 37 pmol/µl), 1 µl reverse primer (CGMMV-1) 5'- GTTTCGCCTCAAAATTCC -3' (25 pmol/ µl) ve RNase free ddh 2 O ile son hacim 25 µl ye tamamlanmıştır. PCR tüpleri daha önceden programlanmış olan thermocycler aletine yerleştirilmiştir. Örneklere uygulanan PCR programı; 94 ºC de 4 dakika 1 döngü 95 ºC de 30 saniye 52 ºC de 30 saniye 35 döngü 72 ºC de 1 dakika 72 ºC de 10 dakika 1 döngü CMV için gerçekleştirilen PCR işleminde iki farklı yöntem kullanılmıştır. CMV ile bulaşık bitkilerdeki bulaşıklığı teyit etmek için gerçekleştirilen PCR çalışmalarında Finetti-Sialer ve ark. (1999) nın önerdiği yöntemde kullanılmıştır. Araştırıcıların kullandığı primerler (RW8 ve RV11), RNA-2 üzerinde nükleotidler arasındaki 650 bp lik kısmı çoğaltmaktadır. Yönteme göre; örneğe ait total RNA den elde edilen komplementer DNA dan (cdna) 3 µl alınarak, 2 µl dntp (ATP, GTP, CTP, TTP), 5 µl PCR buffer (10X), 3 µl MgCl 2 (25 mm), 0,5 µl Taq polimeraz enzimi (5U/ µl), 1 µl primer (RW8) 5'- GGTTCGAA(AG)(AG)(AT) ATAACCG GG -3' (25 pmol/µl), 2 µl primer (RV11) 5'- GTTTATTTACAAGA GCGTACGG -3' (50 pmol/ µl) ve 33,5 µl ddh 2 O ile karıştırılacak ve 50 µl lik son hacimde PCR tüpüne konulmuştur. PCR tüpleri daha önceden programlanmış olan thermocycler aletine yerleştirilmiştir. Örneklere uygulanan PCR programı; 94 ºC de 4 dakika 1 döngü 94 ºC de 30 saniye 64 ºC de 1 dakika 35 döngü 72 ºC de 2 dakika 72 ºC de 10 dakika 1 döngü CMV izolatlarının filogenetik analiz çalışmalarında cp geni kullanıldığı için filogenetik analiz çalışmalarında kullanmak amacıyla bu bölgenin çoğaltılması uygun görülmüştür. Singh ve ark. (1995) nın önerdiği yöntemde kullanılan primerler (CPF 5'- TATGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3' ve CPR 5'-GCCGTAAGCTGGATGGACAA-3') RNA-3 üzerinde nükleotidler arasındaki, kılıf proteinini kodlayan bölgedeki 488 bp lik kısmı çoğaltmaktadır. Yönteme göre; örneğe ait total RNA den elde edilen komplementer DNA dan (cdna) 3 µl alınarak, 2 µl dntp (ATP, GTP, CTP, TTP), 5 µl PCR buffer (10X), 3 µl MgCl 2 (25 mm), 0,5 µl Taq polimeraz enzimi (5U/ µl), 1 µl

48 38 primer (CPF, 25 pmol/µl), 1 µl primer (CPR, 25 pmol/µl) ve 34,5 µl ddh 2 O ile karıştırılacak ve 50 µl lik son hacimde PCR tüpüne konulmuştur. PCR tüpleri daha önceden programlanmış olan thermocycler aletine yerleştirilmiştir. Örneklere uygulanan PCR programı; 92 ºC de 3 dakika 1 döngü 95 ºC de 1 dakika 60 ºC de 1 dakika 35 döngü 72 ºC de 1 dakika 72 ºC de 7 dakika 1 döngü PRSV-W için gerçekleştirilen PCR işlemi Fermentas firmasının önerdiği prosedüre göre 50 µl hacimde yapılmıştır. Çalışmada kullanılan primerler, virüs genomu üzerindeki, CP genini kodlayan bölgede, nükleotidler arasındaki 820 bp lik kısmı çoğaltmaktadır. Steril PCR tüplerine 25 µl 2x PCR master mix(0,05 u/µl Taq DNA polymerase, reaction buffer, 4 mm MgCl 2, her bir dntp(datp, dctp, dgtp, dttp) den 0,4 mm), 1 µl forward primer (PRSV-W-Upstream) (5'- TCTAAAAATG AAGCTGTGGA-3'), 1 µl reverse primer (PRSV-W-Downstream) (5'- GTGCATGTCTCTGT TGACAT-3'), 2 µl cdna ve 21 µl nuclease free su eklenmiştir. Tüpler PCR cihazına yerleştirilerek, thermocycler cihazı aşağıdaki sıcaklık döngülerine göre ayarlanarak PCR işlemi gerçekleştirilmiştir (Wang ve Yeh, 1998). 95 ºC de 5 dakika 1 döngü 94 ºC de 1 dakika 55 ºC de 2 dakika 35 döngü 72 ºC de 90 saniye 72 ºC de 7 dakika 1 döngü SqMV için gerçekleştirilen PCR işlemi Fermentas firmasının önerdiği prosedüre göre 50 µl hacimde yapılmıştır. Çalışmada kullanılan primerler, RNA-2 üzerindeki, CP genini kodlayan bölgede, nükleotidler arasındaki 500 bp lik kısmı çoğaltmaktadır. Steril PCR tüplerine 25 µl 2x PCR master mix(0,05 u/µl Taq DNA polymerase, reaction buffer, 4 mm MgCl 2, her bir dntp(datp, dctp, dgtp, dttp) den 0,4 mm), 1 µl primer1 SqMV-F (5'-ATGGCTTCCATCGTCTCATCCGCC- 3'), 1 µl primer 2 SqMV-R (5'-CATGGTACAGCAGCTTGGAACTTATATTCCA-3'), 2 µl cdna ve 21 µl nuclease free su eklenmiştir. Tüpler PCR cihazına yerleştirilerek, thermocycler cihazı aşağıdaki sıcaklık döngülerine göre ayarlanarak PCR işlemi gerçekleştirilmiştir (Yoo ve ark., 2004).

49 39 95 ºC de 5 dakika 1 döngü 94 ºC de 30 saniye 60 ºC de 30 saniye 35 döngü 72 ºC de 90 saniye 72 ºC de 7 dakika 1 döngü WMV-2 için gerçekleştirilen PCR işlemi Sharifi ve ark. (2008) nın önerdiği yöntem modifiye edilerek gerçekleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan primerler, genom üzerinde nükleotidler arasındaki, CP genini kodlayan bölgede 804 bp ve Nlb geninin 3' ucunda 18 bp lik kısmı çoğaltmaktadır. PCR işlemi, 50 µl lik reaksiyon karışımı (5 µl 10X PCR buffer, 1.5 mm MgCl 2, 1 µl dntp (her birinden 10 mm), 0.1 µm antisense primer WMV-R (5' -ATT CAC GTC CCT TGC AGT GTG-3'), 170 ng (0.1 µm) sense primer WMV-F(5'-GAA TCA GTG TCT CTG CAA TCA GG-3'), Taq DNA polymerase (5 U/µl) (Fermentas) ve deiyonize H 2 O) içerisine 2.5 µl cdna preparasyonu ilave edilerek, thermocycler da aşağıdaki programa göre gerçekleştirilmiştir. 94 ºC de 3 dakika 1 döngü 94 ºC de 1 dakika 60 ºC de 1 dakika 30 döngü 72 ºC de 1 dakika 72 ºC de 10 dakika 1 döngü ZYMV için gerçekleştirilen PCR işleminde, Hsu ve ark (2005) nın bildirdiği yöntem modifiye edilerek kullanılmıştır. Kullanılan primerler, ZYMV genomu üzerinde nükleotidler arasındaki, Nlb ve CP genini kodlayan bölgede 193 bp lik kısmı çoğaltmaktadır. Bu yönteme göre; örneğe ait total RNA dan elde edilen komplementer DNA dan (cdna) 3 µl alınarak 2 µl dntp (ATP, GTP, CTP, TTP), 5 µl PCR buffer (10X), 3µl MgCl 2 (25 mm), 0.5 µl Taq polimeraz enzimi (5U/µl), 1µl primer (ZYMV- F1) 5'- ACT GGC ACGATACCTACAAGC- 3', 2 µl primer (ZYMV- R1) 5'- CTT GGC AGC TAC TAC TGT TTTC -3' (50 pmol/ µl) ve 33.5 µl ddh 2 O ile karıştırılmış ve 50 µl lik son hacimde PCR tüpüne konulmuştur. PCR tüpleri daha önceden programlanmış olan thermocycler aletine yerleştirilmiştir.

50 40 Örneklere uygulanan PCR programı; 94 ºC de 4 dakika 1 döngü 94 ºC de 30 saniye 59 ºC de 1 dakika 35 döngü 72 ºC de 2 dakika 72 ºC de 10 dakika 1 döngü Multiplex-RT-PCR ÇalıĢmaları DAS-ELISA testi sonucunda karışık enfeksiyonların belirlendiği örneklerin bir kısmındaki viral bulaşıklığın moleküler olarak ortaya konulması için multipleks PCR yöntemiyle testlenmişlerdir. Bu yöntem, aynı reaksiyon içerisinde birden fazla oligonükleotid primer çifti kullanılarak DNA zinciri üzerindeki birden fazla hedef bölgenin aynı anda çoğaltılması işlemidir. Bu PCR uygulaması; emek, zaman, maliyetten tasarruf sağlarken kontaminasyon riskini de en düşük düzeye indirmektedir. Ancak yöntemin başarılı olabilmesi için primer seçiminden, tüm PCR reaksiyonlarının aynı tampon-ısı koşullarında optimize edilebilmesi, jelde görüntülenebilmesi gibi koşulların birlikteliğinin sağlanması gerekmektedir (Kuroda ve ark., 2002). Bu çalışmada CMV, WMV-2 ve ZYMV ile bulaşık bitkiler (ikili veya üçlü bulaşık) testlenmiştir. Bu amaçla bağlanma sıcaklıkları en yakın olan primer çiftleri (CPF-CPR 58 ºC, WMV-F-WMV-R 60 ºC ve ZYMVF1-ZYMVR1 59 ºC) kullanılmıştır. Steril PCR tüplerine 25 µl 2x PCR master mix(0,05 u/µl Taq DNA polymerase, reaction buffer, 4 mm MgCl 2, her bir dntp(datp, dctp, dgtp, dttp) den 0,4 mm), 3 µl primer1 (her birinden 1 µl olmak üzere), 3 µl primer 2(her birinden 1 µl olmak üzere), 6 µl cdna (her birinden 2 µl) ve 13 µl nuclease free su eklenmiştir. Tüpler PCR cihazına yerleştirilerek, thermocycler cihazı aşağıdaki sıcaklık döngülerine göre ayarlanarak PCR işlemi gerçekleştirilmiştir Örneklere uygulanan PCR programı; 94 ºC de 4 dakika 1 döngü 94 ºC de 1 dakika 59 ºC de 1 dakika 35 döngü 72 ºC de 1 dakika 72 ºC de 10 dakika 1 döngü

51 Agaroz-Jel Elektroforez ÇalıĢmaları Agaroz jel elektroforez çalışması Gallitelli ve Minafra (1994) nın önerdiği yöntem kullanılmıştır. Yönteme göre, %1 lik konsantrasyonda agaroz-jel kullanılmıştır. Bu amaçla 100 ml 1x TBE ya da 1x TAE içerisine 1 g agaroz konulmuştur. Agaroz- TBE karışımı eriyinceye kadar mikrodalga fırın içerisinde ısıtılmış ve agarozun tampon içerisinde erimesi sağlanmıştır. Agaroz TBE içerisinde eridikten sonra, karışım 60 C ye kadar soğumaya bırakılmış ve ardından tank içerisine boşaltılarak tarak geçirilmiştir. Jel donduktan sonra tarak dikkatli bir şekilde çıkartılmış ve jelin üzerini 1-2 mm kadar kaplayıncaya kadar tank içerisine TBE ilave edilmiştir. 10 µl örnek 2 µl yükleme tamponu ile karıştırıldıktan sonra, toplam 12 µl karışım jeldeki çukurlara dikkatli bir şekilde pipetlenmiştir. İlk çukura ticari marker konulmuş ve elektroforez koşumu, 80 V da, yatay düzenekte dakika süreyle gerçekleştirilmiştir. Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra jel, oda sıcaklığında 10 dakika 10mg/ml etidyum bromür karışımı içerisinde boyanmıştır. Jeldeki fazla etidyum bromür uzaklaştırıncaya kadar 5 dakika saf su içerisinde tutulmuş ve sonuçlar UV transilluminatörde kontrol edilmiştir. Çalışmada kullanılan solüsyonlar Ek-4 te verilmiştir Dizi Belirleme ve BLAST Analizi ÇalıĢmaları ELISA ve RT-PCR çalışmaları sonucunda çalışma alanında en fazla izole edilen ZYMV, WMV-2 ve CMV ait izolatlar (Çizelge 3.4) DNA dizi belirleme çalışmalarında kullanılmıştır. Bu amaçla; ELISA da yüksek absorbans değeri veren, PCR da net bir bant oluşturan ve farklı ilçe ve konukçu bitki türünden sağlanan ZYMV nden 5, WMV- 2 den 3 ve CMV nden 2 adet izolat seçilerek, DNA dizi belirleme işlemi Refgen Biyoteknoloji (Ankara) firmasına hizmet alımı şeklinde yaptırılmıştır. Elde edilen ham dna dizileri CLC Sequence Viewer 6 programına aktarılarak her iki uçlarında bulunan ve kramotogramda düşük kaliteli okuma verdiği belirlenen bazlar silinmiştir. Dizi analizi sonrasında elde edilen nükleotid dizileri GenBank dan elde edilen referans diziler kullanılarak CLC Sequence Viewer 6 programında hizalanmış, okuma hatası nedeniyle oluşabilecek insersiyon ve delesyonlar kontrol edilmiştir. Diziler hizalandıktan sonra ZYMV izolatları dışındakiler GenBank veri tabanına kayıt ettirilmiştir. MEGA 5 programında, Pairwise genetik uzaklık matrisi oluşturulmuş ve izolatlar arasındaki genetik uzaklık diziler arasındaki baz substitüsyonları göz önünde

52 42 bulundurularak CMV için Kimura-2, WMV-2 için Tamura-Nei, ve ZYMV için Jukes- Cantor parameter modeline uygun olarak hesaplanmıştır (Tamura ve ark., 2011). Çizelge 3.4. DNA dizi analizleri yapılan virüs izolatları Virüs Ġzolat Accession no Konukçu Bitki Survey Alanı CMV C-5 (ER.3/3) KC Hıyar Konya/Ereğli C-14 (Ka.12/1) KC Kavun Karaman/Bucakkışla WMV-2 W-2 (ER.3/2) KF Hıyar Konya/Ereğli W-26 (KAR.1/7) KF Çerezlik Kabak Karaman/Kılbasan W-59 (SelHB.5) KF Sakız Kabak Konya/Selçuklu ZYMV Z-13 (KAR.10/2) Çerezlik Kabak Karaman/Kazımkarabekir Z-16 (Ç.6/6) Karpuz Konya/Çumra Z-28 (KAR.6/3) Kavun Karaman/Ortaoba Z-39 (Y.2/12) Çerezlik Kabak Konya/Yunak Z-41 (Ak.6/2) Çerezlik Kabak Aksaray/Ortaköy

53 43 4. ARAġTIRMA BULGULARI VE TARTIġMA 4.1. Kabakgil Üretim Alanlarından Toplanan Örnekler Konya (Çumra, Ereğli, Altınekin, Yunak, Meram ve Karatay), Karaman (Merkez, Ayrancı ve Kazımkarabekir) ve Aksaray (Merkez, Ortaköy ve Gülağaç) illerindeki kabakgil ekim alanlarında, 2009 ve 2010 yıllarında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında sırasıyla 307 ve 430 adet viral hastalık belirtileri gösteren kabakgil bitki örnekleri (Çizelge 4.1 ve 4.2), 11 ve 74 adet yabancı ot örnekleri (Çizelge 4.3) ve 41 ve 51 adet kabakgil bitkilerine ait tohum örnekleri (Çizelge 4.4) ile 2010 yılında 17 adet afid örneği (Çizelge 4.5) toplanmıştır. Çizelge yılında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında toplanan bitki örnekleri ve gözlenen simptomlar Örneğin alındığı il Aksaray Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Gözlenen simptom** Örneğin alındığı tarih AK.1/10 Ç.K. M., K AK.1/1 ÇK M., K., Ş.B.,B AK.1/2 ÇK M.,K AK.1/8 Ç.K. M., K.,B Merkez AK.1/11 Ç.K. M., K., Ş.B AK.2/1 Ç.K. M., K., Ş.B AK.2/5 ÇK M.,K., ŞB AK.2/6 Ç.K. M., K AK.2/3 Ç.K. M., K AK.2/4 Ç.K. M AK.4/8 Ç.K. M., K AK.3/3 Ç.K. M.,K., ŞB., B AK.3/8 ÇK M.,K., ŞB.,B AK.3/11 ÇK M.,K., ŞB AK.3/12 ÇK M., K., Ş.B AK.3/13 Ç.K. M.,K., ŞB.,İY AK.4/4 Ç.K. M., K., ŞB AK.4/7 ÇK M., K AK.4/10 ÇK M.,K., ŞB. İY AK.6/3 ÇK M., K., ŞB AK.6/4 ÇK M.,K.,ŞB.,İY.,B Ortaköy AK.4/11 Ç.K. M., K AK.6/6 Ç.K. M., K AK.5/7 Ç.K. M., K., ŞB AK.5/8 ÇK M., K.,ŞB.,İY,B AK.5/9 ÇK M.,K.,ŞB.,B AK.5/10 Ç.K. M., K., Ş.B.,İY,B AK.5/11 Ç.K. M., K.,ŞB.,B AK.6/2 ÇK M., K AK.6/5 ÇK M., K., ŞB.,B AK.6/7 ÇK M., K., Ş.B AK.7/1 Ç.K. M., K AK.7/2 Ç.K. M., K., ŞB., B AK.7/6 ÇK M., K., Ş.B.,İY,B * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı ** B: Beneklenme, BY: Belirti yok, İY: İplik yapraklılık, K: Kabarcıklaşma, M: Mozayik, ŞB: Şekil bozukluğu

54 44 Çizelge yılında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında toplanan bitki örnekleri ve gözlenen simptomlar (Devam ) Örneğin alındığı il Aksaray Karaman Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Gözlenen simptom** Örneğin alındığı tarih AK.8/1 ÇK M AK.8/2 Ç.K. M., K AK.8/3 ÇK M., K AK.8/7 ÇK M., K AK.8/9 ÇK M., K AK.9/3 Ç.K. M., K AK.9/4 Ç.K. M., K Gülağaç AK.9/5 ÇK M., K AK.9/6 KR M AK.9/7 KR M AK.9/8 KR M AK.9/14 KV M., K AK.9/15 KV M., K., ŞB AK.9/16 KV M., K AK.9/17 KV M., K KA.1/1 H M KA.1/2 H M KA.1/3 H M KA.1/4 H M KA.2/1 H M KA.2/2 H M KA.2/3 H M KA.2/4 SK KA.3/6 KV M., K KA.3/7 KV M., K KA.3/8 KV M., K KA.3/9 KV M., K KA.3/10 KV M., K KA.4/8 KV M., K KA.4/9 KV M KA.4/10 KV M., K KA.4/11 KV M., K KA.4/12 KR M KA.4/13 KR M KA.5/1 KV M., K KA.5/2 KV M., K Merkez KA.5/3 KV M KA.5/4 KV M., K KA.6/1 KV M.,K KA.6/5 KV M., K KA.6/7 KV M., K KA.6/8 KV M., K., ŞB KA.6/9 KV M, K KA.6/10 KV M., K KA.6/11 KV M., K KA.7/1 Ç.K. M KA.7/2 Ç.K. M KA.7/4 H M KA.7/5 H M., K KA.7/6 H M., K KA.7/3 Ç.K. M KA.8/1 H M KA.8/2 KV M., K KA.9/5 H M KA.9/6 H M KA.9/7 H M KA.9/10 H M KA.9/11 H M * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı ** B: Beneklenme, BY: Belirti yok, İY: İplik yapraklılık, K: Kabarcıklaşma, M: Mozayik, ŞB: Şekil bozukluğu

55 45 Çizelge yılında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında toplanan bitki örnekleri ve gözlenen simptomlar (Devam) Örneğin alındığı il Karaman Konya Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Gözlenen simptom** Örneğin alındığı tarih KA.10/1 H M KA.11/1 Ç.K. BY KA.11/2 H M KA.12/1 KV M Ayrancı KA.12/2 H. M KA.12/3 H M KA.12/4 H M KA.12/5 H M KA.13/1 H M KA.13/2 H M KA.14/1 Ç.K. M., K KA.14/2 KR M.K KA.14/3 KV M.K KA.14/4 KV M KA.14/5 KR M Kazımkarabekir KA.16/1 Ç.K. M KA.16/2 Ç.K. M., K KA.16/3 Ç.K. M. K KA.16/16 Ç.K. M KA.16/19 Ç.K. M., K KA/MK ÇK M., K KKDT.2 Ç.K. M., K KKDT.11 Ç.K. M., K KKDT.12 ÇK M., K., ŞB KKDT.13 Ç.K. M.,K.,ŞB.,B KKDT.14 Ç.K. M.,K.,ŞB.,B Merkez KKDT.15 ÇK M.,K.,ŞB.,B KKDT.16 Ç.K. M., K KKDT.17 Ç.K. M., K KKDT.8 Ç.K. M., K SHB.1/6 H M SHB.3/7 Ç.K. M., K., ŞB., İY SHB.3/8 AC M., K A.1/10 Ç.K. M., K.,ŞB A.1/12 Ç.K. K., ŞB., B A.1/13 Ç.K. M., K A.1/14 Ç.K. M., K., ŞB A.1/15 Ç.K. M., K A.1/17 ÇK M., K., ŞB., İY A.1/18 Ç.K. M., K., ŞB A.2/2 Ç.K. M., K., ŞB.,B A.2/3 Ç.K. M.,K., ŞB A.2/4 Ç.K. M.K., ŞB A.2/5 Ç.K. M., K.,ŞB., B A.2/7 Ç.K. M.,K., ŞB.,B Altınekin A.3/1 ÇK M A.4/1 ÇK M.K A.4/4 ÇK M.K A.4/5 Ç.K. M.,K.,ŞB., B A.4/8 Ç.K. M., K A.4/10 Ç.K. M., K.,ŞB A.5/1 KV M A.5/2 KV M., K A.5/4 KV M., K A.5/7 KV M., K A.6/1 Ç.K. M., K A.6/2 Ç.K. M., K.,ŞB A.6/5 Ç.K. M., K A.6/6 Ç.K. M., K.,ŞB., B * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı ** B: Beneklenme, BY: Belirti yok, İY: İplik yapraklılık, K: Kabarcıklaşma, M: Mozayik, ŞB: Şekil bozukluğu

56 46 Çizelge yılında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında toplanan bitki örnekleri ve gözlenen simptomlar (Devam ) Örneğin alındığı il Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Gözlenen simptom** Örneğin alındığı tarih Ç. 1/1 Ç.K. M., K., ŞB Ç. ½ Ç.K. M., K Ç. 1/3 Ç.K. M., K., ŞB., B Ç. ¼ Ç.K. M., K Ç. 1/5 ÇK K Ç. 1/6 ÇK M., K.,S Ç.1/7 Ç.K. M., K., ŞB Ç.1/8 Ç.K. M., K., ŞB Ç.1/19 Ç.K. M., ŞB., B Ç.1/11 ÇK M., ŞB., B Ç.1/12 ÇK K., İY Ç.1/20 ÇK M., K Ç.1/9 ÇK M., K., ŞB., B Ç.1/10 ÇK M., K., ŞB., S Ç.1/13 ÇK M., K., ŞB Ç.1/14 Ç.K. M., K., ŞB Ç.1/15 Ç.K. M., K., S Ç.1/18 Ç.K. M., K., ŞB.,İY,S Ç.1/21 Ç.K. M., K., ŞB.,B.,İY HALK. Ç.K. M., ŞB Ç.2/4 ÇK M., K., ŞB.,B.,İY Ç.2/5 ÇK M.,K., ŞB Ç.2/6 ÇK M., K., ŞB.,B.,İY Ç.2/7 ÇK M. K Ç.2/16 ÇK M Ç.4/1 ÇK M.,K., ŞB Ç.4/2 ÇK M, ŞB Ç.4/3 Ç.K. M., ŞB Ç.4/4 ÇK M.,K., ŞB Konya Çumra Ç.4/5 ÇK M.,K.,ŞB Ç.4/6 Ç.K. M., ŞB Ç.4/7 ÇK M, ŞB Ç.4/8 Ç.K. M.,K., ŞB Ç.4/9 Ç.K. M., K Ç.4/10 Ç.K. M., ŞB Ç.4/11 ÇK M., K Ç.4/12 Ç.K. M., K., ŞB Ç.4/13 Ç.K. M., ŞB Ç.4/14 ÇK M., ŞB Ç.4/15 ÇK M., K., ŞB Ç.4/16 ÇK M.,ŞB Ç.4/17 Ç.K. M., K Ç.4/18 Ç.K. M., ŞB Ç.4/19 ÇK M., ŞB Ç.4/20 ÇK M.,K Ç.4/21 ÇK M.,ŞB Ç.4/22 ÇK M.,K.,ŞB Ç.4/23 ÇK M.,K., ŞB Ç.4/24 KR M.,K., ŞB Ç.7/1 KV M, K Ç.7/2 ÇK M., K., ŞB Ç.7/5 Ç.K. M., ŞB Ç.7/6 Ç.K. M.,ŞB Ç.7/7 ÇK M., ŞB Ç.1/16 ÇK M Ç.1/17 ÇK M., K Ç.1/23 Ç.K. M Ç.1/24 Ç.K. M., K Ç.1/25 Ç.K. M., K.,ŞB., B.,İY * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı ** B: Beneklenme, BY: Belirti yok, İY: İplik yapraklılık, K: Kabarcıklaşma, M: Mozayik, ŞB: Şekil bozukluğu

57 47 Çizelge yılında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında toplanan bitki örnekleri ve gözlenen simptomlar (Devam) Örneğin alındığı il Konya Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Gözlenen simptom** Örneğin alındığı tarih Ç.2/14 ÇK M., K., Ç.3/3 Ç.K. M., K Ç.3/4 ÇK M Ç.3/5 ÇK M Ç.3/7 ÇK M., K Ç.3/9 ÇK M Ç.5/1 KV M Ç.5/2 ÇK M., K Ç.5/3 KV M., K Ç.5/4 Ç.K. M., K Ç.5/5 Ç.K. M., K Ç.5/6 KV M., K Ç.6/1 KV M., K Çumra Ç.6/2 KV M., K Ç.6/7 KV M., K Ç.6/6 KR M Ç.6/11 KV M., K Ç.6/14 KR M Ç.6/17 KV M., K Ç.6/23 KV M., K Ç.6/32 KR M Ç.6/33 KR M Ç.6/36 KV M., K Ç.7/8 KV M., K Ç.7/9 KV M.,K Ç.7/10 KV M., K Ç.7/11 KR M Ç.7/12 KR M Er.1/5 SK. M.K Er.1/6 S.K. M Er.1/7 SK MK Er.1/8 KV MK Er.1/9 KV MK Er.2/1 BK MK Er.2/3 H M Er.2/8 H M Er.2/9 H M Er.2/10 H M Er.2/11 KV MK Er.2/12 KV MK Er.3/4 BK MKŞB Er.3/5 SK MK Er.3/7 SK MKŞBİY Ereğli Er.3/8 BK MK Er.3/9 KR M., K Er.3/10 KV MK Er.4/2 B.K. M Er.4/4 SK M Er.4/5 BK MK Er.4/6 BK MK Er.4/7 KV M., K Er.5/1 SK MK Er.5/4 SK M., K Er.5/5 SK M., K Er.5/6 H M Er.5/7 H M Er.6/4 ÇK M Er.6/5 ÇK MKŞB Er.6/6 ÇK MKŞB * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı ** B: Beneklenme, BY: Belirti yok, İY: İplik yapraklılık, K: Kabarcıklaşma, M: Mozayik, ŞB: Şekil bozukluğu

58 48 Çizelge yılında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında toplanan bitki örnekleri ve gözlenen simptomlar (Devam) Örneğin alındığı il Konya Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Gözlenen simptom** Örneğin alındığı tarih Ereğli Er.6/7 ÇK M., K Er.6/8 ÇK MKŞB Y.2/3 ÇK MK Y.2/4 ÇK MK Y.2/12 ÇK MKŞB Y.3/7 ÇK M Y.3/8 ÇK M., K., ŞB.,B Y.3/10 ÇK M., K Y.3/11 ÇK M Y.3/12 Ç.K M., K Y.3/14 ÇK M Y.5/1 KV BY Y.5/2 KV M.,K Y.5/3 KV M., K Yunak Y.6/1 ÇK M., K Y.6/2 ÇK M Y.6/4 ÇK M., K., ŞB Y.6/5 Ç.K M., K Y.3/3 ÇK M., K.,ŞB., B Y.4/1 ÇK M., K Y.4/2 ÇK M., K.,ŞB Y.4/3 ÇK M., K Y.4/4 ÇK M., K., ŞB Y.4/5 ÇK M., K., ŞB Y.6/8 ÇK M.,K.,ŞB Y.6/9 ÇK M.,K.,ŞB.,B Y.7/18 ÇK MKŞBİY * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı ** B: Beneklenme, BY: Belirti yok, İY: İplik yapraklılık, K: Kabarcıklaşma, M: Mozayik, ŞB: Şekil bozukluğu

59 49 Çizelge yılında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında toplanan bitki örnekleri ve gözlenen simptomlar Örneğin alındığı il Aksaray Karaman Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Gözlenen simptom** Örneğin alındığı tarih AKS-1/1 Ç.K. M., K AKS-1/2 Ç.K. M., K AKS-1/3 Ç.K. M., K., Ş.B AKS-1/4 Ç.K. M., K AKS-2/1 Ç.K. M., K AKS-2/2 Ç.K. M Merkez AKS-2/3 Ç.K. M., K AKS-2/4 B.K. M., K AKS-2/5 B.K. M., K AKS-3/1 Ç.K. M., K., Ş.B AKS-3/2 Ç.K. M., K AKS-3/3 B.K. M., K AKS-3/4 B.K. M., K., Ş.B AKS-4/2 B.K. M., K., Ş.B AKS-4/3 Ç.K. M., K AKS-5/1 Ç.K. M., K., ŞB., İY.,B AKS-5/3 B.K. M., K., Ş.B AKS-5/5 H. M AKS-6/1 Ç.K. M., K., Ş.B AKS-6/5 B.K. M., K Ortaköy AKS-6/7 KV. M., K AKS-6/8 H. M., K AKS-7/2 Ç.K. M., K AKS-7/3 Ç.K. M., K AKS-7/4 B.K M., K AKS.7/5 ÇK M., K AKS.7/8 ÇK M., K., ŞB., İY.,B AKS-6/6 KV. M., K AKS-8/5 B.K. M., K AKS-8/7 H. M AKS-9/3 Ç.K. M AKS-9/5 B.K. M., K., Ş.B AKS-10/6 KV. M., K., Ş.B AKS-8/1 Ç.K. M., K AKS-8/2 Ç.K. M., K., Ş.B AKS-8/3 Ç.K. M., K., Ş.B Gülağaç AKS-10/1 Ç.K. M., K AKS-10/2 Ç.K. M., K AKS-10/3 B.K. M., K AKS-10/4 B.K. M., K AKS-10/5 B.K. M., K., Ş.B AKS-11/1 Ç.K. M., K AKS-11/2 Ç.K. M., Ş.B AKS-11/3 Ç.K. M AKS-11/4 B.K. M., K KAR.1/1 Ç.K. M KAR.1/2 Ç.K. M., K KAR.1/5 Ç.K. M., K KAR.1/7 Ç.K. M., Ş.B KAR.1/12 H M Ayrancı KAR.2/1 Ç.K. M KAR.2/2 Ç.K. M., K., Ş.B., B KAR.2/3 Ç.K. M., K KAR.2/4 Ç.K. M., K., Ş.B., B KAR.2/5 Ç.K. M., K., Ş.B., B KAR.2/6 Ç.K. M KAR.2/13 H M Merkez KAR.3/1 Ç.K. M., K., ŞB., İY KAR.3/2 Ç.K. M * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı ** B: Beneklenme, BY: Belirti yok, İY: İplik yapraklılık, K: Kabarcıklaşma, M: Mozayik, ŞB: Şekil bozukluğu

60 50 Çizelge yılında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında toplanan bitki örnekleri ve gözlenen simptomlar (Devam) Örneğin alındığı il Karaman Konya Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Gözlenen simptom** Örneğin alındığı tarih KAR.3/4 Ç.K. M., K., ŞB.,B.,İY KAR.3/6 Ç.K. M., K., ŞB., İY KAR.4/1 Ç.K. M., K., Ş.B., İ.Y KAR.4/2 Ç.K. M., K KAR.4/3 Ç.K. M., K KAR.4/4 Ç.K. M., K KAR.4/6 Ç.K. M KAR.5/1 Ç.K. M., K KAR.5/2 Ç.K. M., K KAR.5/3 Ç.K. M KAR.5/4 Ç.K. M KAR.6/3 KV. M., K., ŞB KAR.6/6 KV. M., K Merkez KAR.6/7 KV. M., K., ŞB KAR.6/8 KV. M., K KAR.6/11 KR. M KAR.6/12 KR. M., K KAR.7/1 Ç.K. M., K., Ş.B., İ.Y KAR.7/2 Ç.K. M., K KAR.7/3 Ç.K. M., K KAR.7/4 Ç.K. M KAR.7/14 H M KAR.8/1 Ç.K. M KAR.8/2 Ç.K. M., K KAR.8/4 Ç.K. M., K., Ş.B KAR.8/5 Ç.K. M., K., Ş.B KAR.8/7 Ç.K. M., K., Ş.B., B KAR.9/1 Ç.K. M., K KAR.9/2 Ç.K. M., K KAR.9/3 Ç.K. M., K KAR.9/4 Ç.K. M., K., Ş.B., İ.Y KAR.10/1 Ç.K. M., K., ŞB., B KAR.10/2 Ç.K. M., K KAR.10/3 Ç.K. M., K., ŞB., B KAR.10/4 Ç.K. M KAR.10/5 Ç.K. M., K KAR.13/1 Ç.K. M., K., ŞB KAR.13/2 Ç.K. M., K KAR.13/3 Ç.K. M., K., ŞB KAR.14/1 Ç.K. M KAR.14/2 Ç.K. M Kazımkarabekir KAR.15/1 B.K. M KAR.11/1 KR. M., K KAR.11/3 KR. M., K KAR.11/5 KR. M., K KAR.11/6 KR. M., K KAR.12/1 Ç.K. M., ŞB., B KAR.12/4 Ç.K. M., K., ŞB KAR.12/5 Ç.K. M., K., ŞB KAR.12/6 Ç.K. M., K., ŞB., İY KAR.12/7 Ç.K. M., K., ŞB., İY KAR.16/1 KV. M., K., ŞB KAR.16/3 KV. M., K., ŞB KAR.16/4 KV. M., K KAR.16/5 KV. M., K KAR.16/6 KV. M., K., ŞB KAR.12/14 H M Merkez İSM.1/6 Ç.K. M., K İSM.1/7 Ç.K. M., K., ŞB., B * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı ** B: Beneklenme, BY: Belirti yok, İY: İplik yapraklılık, K: Kabarcıklaşma, M: Mozayik, ŞB: Şekil bozukluğu

61 51 Çizelge yılında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında toplanan bitki örnekleri ve gözlenen simptomlar (Devam) Örneğin alındığı il Konya Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Gözlenen simptom** Örneğin alındığı tarih İSM.2/1 Ç.K. M., K., ŞB., B İSM.2/3 Ç.K. M., K İSM.2/4 Ç.K. M., K İSM.2/6 ÇK M.,K.,ŞB.,İY.,B İSM.2/7 Ç.K. M., K İSM.2/8 Ç.K. M., K İSM.3/5 Ç.K. M., K., ŞB., B İSM.3/6 Ç.K. M., K İSM.3/7 Ç.K. M., K K.K. Ç.K. M., K., ŞB., B KKK.1 KR. M., K KKK.2 KR. M., K KKK.3 KR. M., K KKB B.K. M., K KKKV.1 KV. M., K., ŞB KKKV.2 KV M., K SHB.27/1-18/1 AC. M., K., ŞB SHB.27/1-18/2 S.K. M., K., SHB.27/1-18/3 S.K. M., K., ŞB SHB.28/16-18/1 B.K. M., K SHB.28/16-18/2 S.K. M., K., ŞB Merkez SHB.28/6-1 B.K. M., K SHB.28/6-2 S.K. M., K., ŞB., İY SHB.28/6-3 S.K. M., K SHB.14P-1 S.K. M., K., ŞB SHB.32/14-1 AC. M., K SHB. 32/14-2 S.K. M., K., ŞB SHB. 32/14-3 B.K. M., K SHB. 32/14-4 S.K. M., K., ŞB SHB.33/1 B.K. M., K., ŞB SHB. 33/2 B.K. M., K SHB. 33/3 AC. M., K SHB. 33/4 AC. M., K SHB. 35/1 S.K. M., K., ŞB SHB. 35/3 AC. M., K KSEL.1 KV. M., K., ŞB SHB.14/3 S.K. M., K SHB.32/1 B.K. M., K SHB.32/2 H. M., K SHB.32/3 AC. M., K SHB.34/1 B.K. M., K SHB.34/2 S.K. M., K SHB.34/3 H M., K ALT.1/3 Ç.K. M., K ALT.1/7 Ç.K. M., K ALT.1/8 Ç.K. M., K ALT.1/9 Ç.K. M., K., ŞB ALT.1/10 Ç.K. M., K ALT.2/2 Ç.K. M., K., ŞB., B ALT.2/3 Ç.K. M., K Altınekin ALT.2/4 Ç.K. M., K ALT.4/2 Ç.K. M., K ALT.4/3 Ç.K. M ALT.4/4 Ç.K. M., K ALT.4/6 Ç.K. M., K ALT.6/1 Ç.K. M., K ALT.6/2 Ç.K. M., K ALT.6/3 Ç.K. M.,K ALT.6/4 Ç.K. M., K * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı ** B: Beneklenme, BY: Belirti yok, İY: İplik yapraklılık, K: Kabarcıklaşma, M: Mozayik, ŞB: Şekil bozukluğu

62 52 Çizelge yılında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında toplanan bitki örnekleri ve gözlenen simptomlar (Devam) Örneğin alındığı il Konya Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Gözlenen simptom** Örneğin alındığı tarih ALT.6/6 Ç.K. M., K ALT.2/6 Ç.K. M., K ALT.2/7 Ç.K. M., K ALT.2/8 Ç.K. M., K ALT.2/9 Ç.K. M., K ALT.2/11 Ç.K. M., K ALT.2/12 Ç.K. M., K., ŞB., İY., B ALT.4/1 Ç.K. M ALT.4/5 Ç.K. M., K ALT.5/2 KV. M., K., ŞB ALT.5/3 KV. K ALT.5/1 KV. M., K., ŞB ALT.7/2 Ç.K. M., K., ŞB., İY., B ALT.7/3 Ç.K. M., K ALT.7/4 Ç.K. M., K ALT.8/2 Ç.K. M., K Altınekin ALT.8/3 Ç.K. M., K ALT.8/4 Ç.K. M., K., ŞB ALT.8/5 Ç.K. M., K ALT.9/2 Ç.K. M., K., ŞB ALT.9/5 Ç.K. M., K ALT.9/7 Ç.K. M., K ALT.10/1 B.K. M ALT.10/2 B.K. M., K ALT.10/3 B.K. M., K ALT.11/1 Ç.K. M., K ALT.11/3 Ç.K. M., K ALT.11/4 Ç.K. M., K ALT.11/5 Ç.K. M., K ALT.12/1 Ç.K. M., K ALT.12/2 Ç.K. M., K., ŞB ALT.12/3 Ç.K. M., K ALT. 12/5 Ç.K. M., K Ç.1/1 Ç.K. M., K., ŞB., B Ç.1/3 Ç.K. M., K., ŞB., B Ç.1/4 Ç.K. M., K., ŞB Ç.2/1 Ç.K. M Ç.2/3 Ç.K. M., K Ç.2/10 Ç.K. M Ç.5/3 Ç.K. M., K., İY Ç.5/5 Ç.K. M Ç.5/8 Ç.K. M., K., ŞB Ç.6/6 Ç.K. M., K., ŞB Ç.6/7 Ç.K. M.,K., ŞB., İY., B Ç.8/3 Ç.K. M., K Çumra Ç.8/8 Ç.K. M., K., ŞB Ç.10/1 Ç.K. M Ç.10/2 Ç.K. M., K Ç.10/5 Ç.K. M.,K Ç.11/2 Ç.K. M Ç.11/4 Ç.K. M.,K Ç.11/5 Ç.K. M Ç.13/1 Ç.K. M., K., ŞB., B Ç.13/4 Ç.K. M., K Ç.14/1 Ç.K. M Ç.14/3 Ç.K. M Ç.14/4 Ç.K. M Ç.15/1 Ç.K. M., K Ç.4/2 Ç.K. M * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı ** B: Beneklenme, BY: Belirti yok, İY: İplik yapraklılık, K: Kabarcıklaşma, M: Mozayik, ŞB: Şekil bozukluğu

63 53 Çizelge yılında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında toplanan bitki örnekleri ve gözlenen simptomlar (Devam) Örneğin alındığı il Konya Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Gözlenen simptom** Örneğin alındığı tarih Ç.4/3 Ç.K. M., K Ç.4/5 Ç.K. M Ç.5/7 Ç.K. M., K Ç.6/1 Ç.K. M., K., ŞB., B Ç.12/1 Ç.K. M., K., ŞB Ç.12/5 Ç.K. M., K., ŞB., İY Ç.12/6 Ç.K. M., K., ŞB., B Ç.15/5 Ç.K. M., K., ŞB Ç.15/6 Ç.K. M., K Ç.3/1 Ç.K. M Ç.3/5 Ç.K. M., K., ŞB Ç.7/1 Ç.K. M Ç.7/2 Ç.K. M., K., ŞB Ç.7/3 Ç.K. M., K Ç.9/1 H M Ç.9/2 H M Çumra Ç.9/3 H M Ç.9/4 H M Ç.9/6 Ç.K. M., K., ŞB., B Ç.17/1 KV M., K Ç.17/2 KV M., K Ç.17/4 KV M., K Ç.17/5 KV M., K Ç.18/6 KR M., K Ç.18/7 KR M., K Ç.18/1 KV M., K., ŞB Ç.18/3 KV M., K., ŞB Ç.18/4 KV M., K., ŞB Ç.18/5 KV M., K Ç.16/2 KV M., K., ŞB Ç.16/3 KV M., K., ŞB Ç.19/3 KV. M., K Ç.19/4 KV M., K., ŞB., B Ç.19/5 AC M., K ER.2/1 B.K. M ER.2/2 B.K. M., K., ŞB., B ER.2/3 S.K. M ER.3/1 B.K M., ŞB ER.3/2 H M ER.3/3 H M ER.6/1 H M ER.6/2 H M ER.6/3 H M ER.6/4 H M ER.6/5 H M ER.6/7 H M Ereğli ER.6/8 KV M., K ER.7/1 B.K M ER.7/2 B.K. M ER.7/3 B.K. M., K ER.7/4 S.K. M ER.7/5 KV M ER.7/6 KV M., K ER.7/7 KV M., K ER.7/8 KV M., K ER.8/1 H M ER.8/2 H M ER.8/3 H M ER.8/4 H M ER.8/5 KV M * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı ** B: Beneklenme, BY: Belirti yok, İY: İplik yapraklılık, K: Kabarcıklaşma, M: Mozayik, ŞB: Şekil bozukluğu

64 54 Çizelge yılında gerçekleştirilen örnekleme çalışmalarında toplanan bitki örnekleri ve gözlenen simptomlar (Devam) Örneğin alındığı il Konya Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Gözlenen simptom** Örneğin alındığı tarih ER.8/6 KV M., K ER.8/7 KV M ER.8/8 KV M ER.8/10 S.K. M ER.9/1 B.K. M ER.9/2 B.K. M., K ER.10/1 KV M., K ER.10/2 KV M., K ER.10/4 KV M ER.10/5 KV M., K ER.1/1 B.K. M., K Ereğli ER.1/2 B.K. M., K ER.1/3 S.K. M., K ER.4/1 B.K. M ER.4/2 SK M., K ER.4/3 SK M., K., ŞB ER.4/5 SK M., K ER.5/1 BK M., K ER.5/2 BK M., K ER.5/3 BK M., K ER.5/4 BK M., K ER.5/5 BK M., K ER.11/1 ÇK M., K., ŞB., İY.,B YUN.1/1 ÇK M YUN.1/2 ÇK M YUN.1/3 ÇK M., K., ŞB YUN.1/4 ÇK M., K YUN.1/5 ÇK M., K., ŞB., İY YUN.2/1 Ç.K M YUN.2/2 ÇK M., K YUN.2/3 ÇK M., ŞB., B YUN.2/4 Ç.K M YUN.2/5 ÇK M., K YUN.3/1 KV M., K YUN.3/2 KV M., K YUN.3/3 KR M YUN.3/4 KR M YUN.4/1 Ç.K M YUN.4/2 ÇK M., K YUN.4/3 ÇK M., K YUN.4/4 ÇK M Yunak YUN.5/1 ÇK M., K YUN.5/2 ÇK M., K., ŞB YUN.5/3 ÇK M., K., ŞB YUN.5/4 ÇK K, ŞB, İY YUN.7/1 KV M., K YUN.7/2 KV M YUN.7/3 KV M., K YUN.7/4 KV M., K YUN.8/1 ÇK M., K., ŞB., B YUN.8/3 ÇK M., K., ŞB., İY.,B YUN.8/4 ÇK M., K., ŞB., İY YUN.8/6 ÇK M., K., ŞB YUN.8/7 ÇK M., K., ŞB YUN.6/3 ÇK M., K., ŞB., B YUN.6/4 ÇK M., K., ŞB YUN.6/5 ÇK M., K YUN.6/6 ÇK M., K YUN.6/7 ÇK M., K YUN.6/8 ÇK M., K * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı ** B: Beneklenme, BY: Belirti yok, İY: İplik yapraklılık, K: Kabarcıklaşma, M: Mozayik, ŞB: Şekil bozukluğu

65 55 Çizelge 4.3. Arazi çalışmalarında toplanan yabancı ot örnekleri Yıl Örneğin Örneğin alındığı Gözlenen Örneğin alındığı Örnek adı Bitki türü alındığı il ilçe simptom tarih Aksaray Ortaköy AK.4 Horozibiği Ç.1 Tarla sarmaşığı Çumra Ç.6/35 Horozibiği Ç.2A Horozibiği Ç.2B Topalak Konya Y.1 Sirken Y.4 Sirken Yunak Y.3 Sirken Y.5 Horozibiği Y.7 Sirken Y.6 Sirken Aksaray Gülağaç AKS-9/6 Sirken AKS-8/6 Sirken Ayrancı KAR.2/7 Horozibiği KAR.3/7 Küsküt KAR.3/8 Horozibiği KAR. 5/7 Yabani hardal Merkez KAR.5/8 Sirken Karaman KAR.6/13. Domuz pıtrağı KAR.6/14 Sirken KAR.7/8 Domuz pıtrağı KAR.10/6 Horozibiği Kazımkarabekir KAR.16/7 Horozibiği Konya Merkez Çumra KAR.16/8 Sirken SHB. 35/2 Sirken SHB.14/5 Horozibiği ALT.1/11 Horozibiği ALT.2/14 Horozibiği ALT.8/6 Horozibiği ALT.9/8 Sığır dili Ç.1/13 Sirken Ç.1/14 Horozibiği Belirti yok Ç.1/15 Tarla sarmaşığı Ç.2/13 Domuz pıtrağı Ç.2/14 Horozibiği Ç.2/16 Domuz pıtrağı Ç.2/17 Tarla sarmaşığı Ç.2/18 Horozibiği Ç.4/9 Şeytan elması Ç.6/8 Horozibiği Ç.6/9 Sirken Ç.8/5 Domuz pıtrağı Ç.8/6 Domuz pıtrağı Ç.8/9 Tarla sarmaşığı Ç.10/7 Sirken Ç.11/6 Köpek üzümü Ç.11/7 Domuz pıtrağı Ç.13/6 Köpek üzümü Ç.13/7 Yabani bamya Ç.13/8 Tarla sarmaşığı Ç.13/9 Horozibiği Ç.13/10 Köpek üzümü Ç.14/2 Şeytan elması Ç.14/6 Horozibiği Ç.15/3 Şeytan elması Ç.15/4 Horozibiği Ç.4/6 Tarla sarmaşığı Ç.4/7 Horozibiği Ç.4/8 Horozibiği Ç.5/9 Horozibiği Ç.5/10 Domuz pıtrağı Ç.5/11 Sirken Ç.5/12 Sirken Ç.5/13 Horozibiği Ç.12/11 Horozibiği

66 56 Çizelge 4.3. Arazi çalışmalarında toplanan yabancı ot örnekleri (Devam) Yıl Örneğin alındığı il 2010 Konya Örneğin alındığı ilçe Çumra Yunak Örnek adı Bitki türü Gözlenen Örneğin simptom alındığı tarih Ç.12/12 Yabani bamya Ç.12/13 Kuzukulağı Ç.19/6 Domuz pıtrağı Ç.19/7 Kekre otu Ç.3/6 Domuz pıtrağı Ç.3/7 Horozibiği Ç.3/9 Horozibiği Ç.7/4 Domuz pıtrağı Ç.7/5 Horozibiği Ç.3/8 Domuz pıtrağı Belirti yok Ç,17/6 Horozibiği Ç.18/8 Sirken Ç.18/9 Horozibiği ER.9/3 Sirken ER.11/6 Yatık gökbaş YUN.6/9 Tarla sarmaşığı YUN.7/5 Tarhana otu YUN.7/6 Boz ot YUN. 8/4 Domuz pıtrağı YUN.8/8 Domuz pıtrağı

67 57 Çizelge 4.3. Arazi çalışmalarında toplanan kabakgil tohum örnekleri Yıl Örneğin alındığı il Aksaray Karaman Konya Aksaray Karaman Konya Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Merkez AK-1 CK Gözlenen simptom Örneğin alındığı tarih AK-3 ÇK AK-4 ÇK Ortaköy AK-5 ÇK AK-7 ÇK Gülağaç AK-8 ÇK Merkez KA-2 H KA-14 ÇK KA-15 ÇK KA-16 ÇK Kazımkarabekir Merkez Altınekin Çumra Ereğli Yunak Merkez Ortaköy Gülağaç MER-1 BK MER-2 KV MER-3 KR KKDT-1 ÇK KKDT-2 ÇK KKDT-3 ÇK KKDT-4 ÇK A-1 ÇK A-2 ÇK A-3 ÇK A-4 ÇK A-5 KV Ç-1 ÇK Ç-2 ÇK Ç-3 ÇK Ç-6 KV Ç-7 H Ç-8/1 KR Ç-8/2 KR Ç-9 KV İÇ-1 ÇK İÇ-2 KR İÇ-KV/1 KV Belirti yok Er-1 KV Er-3 SK Er-6 ÇK Y-1 ÇK Y-2 ÇK Y-4 ÇK Y-5 ÇK Y-7 ÇK AKS-1 ÇK AKS-2 ÇK AKS-3 ÇK AKS-4 ÇK AKS-5 ÇK AKS-6 ÇK AKS-7 ÇK AKS-8 ÇK AKS-9 ÇK AKS-10 ÇK Ayrancı KAR-1 ÇK KAR-3 ÇK KAR-4 ÇK KAR-5 ÇK Merkez KAR-6 KV KAR-6/2 ÇK KAR-7 ÇK KAR-8 ÇK Kazımkarabekir Merkez KAR-9 ÇK KAR-10 ÇK KAR-14 ÇK KKDT-2/5 ÇK MRK-2 ÇK MRK-4 ÇK MRK-5 ÇK

68 58 Çizelge 4.3. Arazi çalışmalarında toplanan kabakgil tohum örnekleri (Devam) Yıl Örneğin alındığı il 2010 Konya Örneğin alındığı ilçe Örnek adı Bitki türü* Merkez MRK-7 ÇK Altınekin Çumra Ereğli Yunak Gözlenen simptom Örneğin alındığı tarih ALT-2 ÇK ALT-4 ÇK ALT-8 ÇK ALT-9 ÇK Ç-1 ÇK Ç-2/1 ÇK Ç-2/2 ÇK Ç-3 ÇK Ç-4 ÇK Ç5/1 ÇK Ç-5/2 ÇK Ç-7 ÇK Belirti yok Ç-8 ÇK Ç-10/1 ÇK Ç-12/1 KR İÇ.KV/1 KV İÇ.KV/2 KV İÇ.KR KR ER-2 KV ER-11 ÇK ERKÇT ÇK YUN-4 ÇK YUN-5 ÇK YUN-6 ÇK YUN-7 ÇK *BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı Çizelge 4.4. Arazi çalışmalarında kabakgil bitkilerinden toplanan afid örnekleri Yılı Alındığı il ve Örneğin Örnek adı Türü Toplandığı bitki* ilçe alındığı tarih ER.af.1 Myzus persicae SK ER.af.2 M. persicae BK ER.af.5 Aphis gossypii BK Konya-Ereğli ER.af.6 M. persicae H ER.af.7/1 A. gossypii KV ER.af.7/2 M. persicae BK ER.af.8 A. gossypii SK ER.af.9 M. persicae BK Mer.af.1 M. persicae BK Mer. af.3 A. gossypi SK Konya - Mer.af. 6 M. persicae BK Merkez Mer. af. 8 M. persicae BK Mer. af. 9 M. persicae BK Aks.af.2 A. gossypii ÇK Aksaray Aks. af.4/1 A. gossypii ÇK Aks.af. 4/2 A.gossypii BK Aks. af.9 M. persicae BK * BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı

69 Kabakgil Üretim Alanlarındaki Enfekteli Bitkilerde Görülen Virutik Belirtiler Konya, Karaman ve Aksaray illerinde yetiştirilen kabakgil bitkilerinde (çerezlik kabak, sakız kabağı, kavun, karpuz, hıyar, acur ve bal kabağı) tür, çeşit ve çevresel koşullara göre değişmekle birlikte virüs hastalıklarının en belirgin simptomları gözlenmiştir. Sakız kabağı bitkilerinde, genel bir gelişme geriliği, yapraklarda mozayik, iplik yapraklılık, simetrinin bozulması, meyvelerde kabarıklıklar, şekil bozuklukları ve lekelenmeler gözlenmiştir (Şekil 4.1). a b c d ġekil 4.1. Sakız kabağında; a) Gelişme geriliği, iplik yapraklılık (CMV+WMV-2), b) Yapraklarda mozayik (WMV-2), c) Yapraklarda şiddetli biçimde şekil bozukluğu ve iplik yapraklılık (WMV-2+ZYMV), d) Meyvede kabarıklıklar ve şekil bozuklukları (CMV+WMV-2).

70 60 a b c d e f ġekil 4.2. Çerezlik kabakta; a) Gelişme geriliği, yapraklarda sararma ve mozayik (ZYMV), b) Yaprakta mozayik(wmv-2+zymv), c) Yaprakta şekil bozukluğu ve damar açılmaları (WMV- 2+ZYMV), d) Yapraklarda damar bantlaşması (SqMV+ZYMV), e, f) Meyvede lekelenmeler, kabarıklıklar ve şekil bozuklukları (PRSV-W+ZYMV, ZYMV). Arazi çalışmaları sırasında çerezlik kabak bitkilerinde gelişme geriliği, yapraklarında; mozayik, iplik yapraklılık, sararma, şekil bozuklukları, meyvede ise şekil bozuklukları ve halkalı lekeler gözlenmiştir (Şekil 4.2).

71 61 Kavun bitkilerinde hastalık belirtileri sadece yapraklarda görülmüştür. Özellikle genç yapraklarda kabarcıklı mozayik, yaprak ayasında daralma, şekil bozuklukları ve gelişme geriliği gözlenmiştir (Şekil 4.3). Karpuz bitkileri yapraklarında mozayik, kabarcıklaşma şeklinde şekil bozuklukları ile yaprakların normalden küçük olması sebebiyle bitkide çalılaşma belirtileri ile meyvelerde lekelenmeler gözlenmiştir (Şekil 4.4). Arazi çalışmaları kapsamında gezilen hıyar tarlalarında dikkati çeken belirtiler Şekil 4.5 de görüldüğü gibi yapraklarda mozayik şeklinde renk açılmaları, sararma ve kabarcıklaşma şeklinde şekil bozuklukları ile meyvelerde ise hafif şekil bozuklukları ile lekelenmeler gözlenmiştir. Acur bitkileri yapraklarında, mozayik, sararma, kabarcıklaşma şeklinde şekil bozuklukları gözlenirken meyvelerinde yine şekil bozukluklarına rastlanmıştır (Şekil 4.6). a b c d ġekil 4.3. Kavunda; a) Yaprakta kabarcıklı mozayik (WMV-2), b) Yapraklarda mozayik ve gelişme geriliği (CMV), c) Yapraklarda şekil bozukluğu ve mozayik (CMV+WMV-2), d) Yapraklarda büzüşme şeklinde şekil bozuklukları (WMV-2+ZYMV).

72 62 a b c d ġekil 4.4. Karpuzda; a) Yaprakta kabarcıklı mozayik (CMV), b) Yapraklarda mozayik ve şekil bozukluğu (WMV-2), c) Yapraklarda küçülme, şekil bozukluğu ve mozayik (WMV-2+ZYMV), d) Meyvede lekelenmeler (WMV-2). a b c d ġekil 4.5. Hıyarda; a) Yapraklarda kabarcıklı mozayik (WMV-2), b) Yapraklarda mozayik ve renk açılmaları (CMV), c) Yaprakta kabarcıklaşma, şekil bozukluğu ve mozayik (CMV+WMV- 2), d) Meyvede lekelenmeler (CMV).

73 63 a b c d ġekil 4.6. Acurda; a,b) Yapraklarda kabarcıklı mozayik ve renk açılmaları (CMV+WMV-2), c) Yapraklarda kabarcıklı mozayik ve şekil bozuklukları (WMV-2), d) Meyvede şekil bozuklukları (WMV-2). a b c d ġekil 4.7. Balkabağında; a,b) Yapraklarda mozayik ve renk açılmaları (WMV-2), c, d) Yapraklarda mozayik, renk açılmaları ve şekil bozuklukları (WMV-2+ZYMV).

74 64 Balkabağı bitkilerinde ise genellikle yapraklarda mozayik şeklinde renk açılmaları ile sararmalar gözlenmiştir (Şekil 4.7). Bitki örneklerinde belirlenen virüsler genellikle benzer belirtiler oluşturmuşlar, bazı örneklerde farklı belirtiler gözlenmiştir. Bu belirtiler Türkiye ve Dünya da daha önce yapılan çalışmalarda diğer araştırıcıların bu konudaki gözlemleri ile benzerlik göstermektedir (Abou-Jawdah ve ark., 2000; Alonso-Prados ve ark., 1997; Çıtır ve ark., 1998: Davis ve ark., 2002; Dodds ve ark., 1984; Erdiller ve Ertunç, 1988; Lecoq ve ark., 1981; Luis-Arteaga ve ark. 1998; Makkouk ve Lesemann 1980; Massumi ve ark., 2007; Nogay ve Yorgancı, 1984; Provvidenti, 1996; Sammons ve ark. 1989; Sertkaya ve ark., 2004; Sevik ve Arli-Sokmen, 2003; Yılmaz ve ark., 1992; Yılmaz ve ark., 1994; Yuki ve ark., 2000) DAS-ELISA ÇalıĢmaları Konya, Karaman ve Aksaray illerindeki kabakgil ekim alanlarından, 2009 ve 2010 yıllarında toplanan sırasıyla 296 ve 356 adet viral hastalık belirtileri gösteren kabakgil bitki örnekleri, 41 ve 51 adet kabakgil bitkilerine ait tohum örnekleri ve 11 ve 74 adet yabancı ot örneklerinde virüs bulaşıklığının serolojik olarak belirlenmesi için DAS-ELISA testine tabi tutulmuşlardır ve sonuçlar Çizelge 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 ve 4.6 da gösterilmiştir. Test sonuçlarına göre; 2009 yılında toplam 348 örneğin 237 sinin (%68,1), 2010 yılında ise toplam 481 örneğin 358 inin (%74,4) virüslerle bulaşık oldukları saptanmıştır. Çalışma kapsamında toplanan hiçbir örnekte CGMMV bulaşıklığı tespit edilememiştir. Çizelge 4.1. de görüldüğü gibi, 2009 yılında WMV-2; balkabağı yaprak örneklerinde %83, çerezlik kabak örneklerinde %52,8 ve kavun örneklerinde %50,1 oranlarıyla en yaygın virüs olarak belirlenmiştir. ZYMV ise çerezlik kabak yaprak örneklerinde %53,4, balkabağında %50 ve karpuzda %33,3 oranlarıyla WMV-2 yi takip etmiştir. Kabakgil bitkileri içerisinde virüslerle en fazla bulaşma çerezlik kabak bitkilerinde görülmüştür. Aynı yıla ait kabakgil tohum örneklerinin %14,6 oranında virüslerle bulaşık olduğu, bunların sırasıyla; %7,3, %4,9 ve %2,4 oranlarında WMV-2, ZYMV ve CMV ile bulaşık oldukları belirlenmiştir. Çizelge 4.1. de de görüldüğü üzere tohum örneklerinde karışık enfeksiyonlara rastlanmamıştır.

75 CMV CGMMV PRSV-W SqMV WMV-2 ZYMV Ġkili enfeksiyonlar Çoklu enfeksiyonlar 65 Çizelge yılında toplanan bitki, tohum ve yabancı ot örneklerinde DAS-ELISA testleri ile saptanan virüsler Saptanan Virüsler Konukçu Bitki Türü Test Edilen Sağlıklı Balkabağı 6(1)* 1(1) Çerezlik kabak 178(22) 27(20) (2) 50 9 Sakız kabağı 10(1) 4(1) Hıyar 31(2) 17(1) 2(1) Karpuz 15(5) 5(4) (1) Kavun 55(10) 14(8) (2) Acur Horoz ibiği Sirken Tarla sarmaģığı Topalak TOPLAM 307(41) 76(35) 5(1) (3) 56(2) * Parantez içerisindeki sayılar, bitkiye ait tohum örnekleri miktarlarını ifade etmektedir. Yine aynı yıl kabakgil üretim alanlarından toplanan 4 farklı türden 11 yabancı ot örneğinin %36,4 ünün virüslerle bulaşık olduğu belirlenmiştir. Horoz ibiği (Amaranthus retroflexus L.), yabancı ot örnekleri arasında %50 bulaşıklık oranıyla virüslerle en fazla bulaşık olan yabancı ot türü olarak belirlenmiştir. Ayrıca, virüslerle bulaşık olduğu tespit edilen yabancı ot örneklerinin %75 inde WMV-2+ZYMV ikili enfeksiyonu tespit edilmiştir (Çizelge 4.4., 4.6.). Çizelge 4.2 de görüldüğü gibi 2010 yılında ZYMV; çerezlik kabak bitki örneklerinde %70,4, karpuzda %61,5, balkabağında %46,3 ve kavunda %42,9 oranlarıyla en yaygın virüs olarak belirlenmiştir. WMV-2 ise acur yaprak örneklerinde %85,7, sakızkabağında %72,2, kavunda %44,9, çerezlik kabakta %44,3 ve balkabağında %43,9 bulunma oranlarıyla ZYMV nden sonra en fazla yaygın olan virüs olarak belirlenmiştir. CMV nün en fazla enfekte ettiği örnekler ise hıyar (%68), acur (%57,1), kavun (%32,6) ve çerezlik kabak (%31,5) olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.2. de de görülebeliceği gibi, 2010 yılında toplanan karpuz örneklerinin tamamının virüslerle bulaşık olduğu belirlenmiştir. Aynı yıla ait kabakgil tohum örneklerinin %3,9 oranında ZYMV ile bulaşık olduğu ve bu tohumların da çerezlik kabak (%2,2) ve kavun (%25) bitkilerine ait

76 CMV CGMMV PRSV-W SqMV WMV-2 ZYMV Ġkili enfeksiyonlar Çoklu enfeksiyonlar 66 oldukları belirlenmiştir. Çizelge 4.2. de de görüldüğü üzere tohum örneklerinde karışık enfeksiyonlara rastlanmamıştır. Çizelge yılında toplanan bitki, tohum ve yabancı ot örneklerinde DAS-ELISA testleri ile saptanan virüsler Saptanan Virüsler Konukçu Bitki Türü Test Edilen Sağlıklı Balkabağı Çerezlik kabak 203(45)* 15(44) (1) Sakız kabağı Hıyar Karpuz 13(2) ---(2) Kavun 49(4) 8(3) (1) 17 4 Acur Horoz ibiği Sirken Tarla sarmaģığı Domuz pıtrağı ġeytan elması Kekre otu Kuzukulağı Yabani bamya Köpek üzümü Sığır dili Tarhana otu Boz ot Yatık gökbaģ Yabani hardal Küsküt TOPLAM 430(51) 74(49) (2) * Parantez içerisindeki sayılar, bitkiye ait tohum örnekleri miktarlarını ifade etmektedir. Yine aynı yıl kabakgil üretim alanlarından toplanan 15 farklı türden 74 yabancı ot örneğinin %52,7 sinin virüslerle bulaşık olduğu belirlenmiştir. Köpek üzümü (Solanum nigrum L.), boz ot (Heliotropium europaeum L.), sığırdili (Anchusa azurea P.Mill.) kuzukulağı (Rumex crispus L.), kekre otu (Acroptilon repens (L.) DC.) örneklerinin tamamının virüslerle bulaşık olduğu saptanırken; tarla sarmaşığı (Convolvulus arvensis L.) (%66,7), şeytan elması (Datura stramonium L.) (%66,7), sirken (Chenopodium album L.) (%61,5) ve horozibiği (Amaranthus retroflexus L.) (%44) örneklerinin büyük bir kısmının virüs hastalıklarıyla bulaşık olduğu saptanmıştır. Ayrıca, virüslerle bulaşık olduğu tespit edilen yabancı ot örneklerinin %29,3 ünde

77 67 CMV, %14,6 sında WMV-2 ve %9,3 ünde ZYMV bulaşıklığı tespit edilmiştir. SqMV ise sadece tek bir sığırdili örneğinde ZYMV ile birlikte bulunmuştur. Çizelge 4.4. ve 4.6. da yabancı ot örneklerinde belirlenen karışık enfeksiyonlar verilmiştir. Çalışma kapsamında Konya ilinden sağlanan toplam 423 kabakgil bitki örneğine DAS-ELISA testi uygulanmış olup, bölgede hâkim virüslerin ZYMV ve WMV-2 olduğu belirlenmiştir. Bu virüslerin bulaşıklık oranlarının sırasıyla, kabakta %70,5 ve %44,6 ve karpuzda %40 ve %46,7 olduğu testler sonucunda ortaya konulmuştur. CMV (%25,3), PRSV-W (%6,4) ve SqMV (%5,9) bu iki virüsü izlemektedir. Testlemeler sonucunda ikili enfeksiyonlar tespit edilen 112 adet kabakgil bitki örneğinin %47,3 ünün ZYMV+WMV-2, %14,3 ünün CMV+WMV-2, %13,4 ünün ise CMV+ZYMV ile enfekte edildiği belirlenmiştir. 11 örnekte üçlü enfeksiyon saptanırken, 3 çerezlik kabak örneğinde de dörtlü enfeksiyon tespit edilmiştir (Çizelge 4.3, 4.4). Konya ilinden toplanan ve DAS-ELISA testi uygulanan 14 farklı türdeki toplam 71 yabancı ot örneğinin %54,9 unun virüslerle bulaşık olduğu ve bu virüslerin de CMV (%38), WMV-2 (%26,7), ZYMV (%15,5), PRSV-W (%2,8) ve SqMV (%2,8) olduğu belirlenmiştir. Yabancı otlarda en fazla saptanan virüs olan CMV ile şeytan elması (%66,7), sirken (%46,1), tarla sarmaşığı (%42,8), domuz pıtrağı, köpek üzümü ve horozibiği (%33,3) nin bulaşık olduğu belirlenmiştir. WMV-2 ise; köpek üzümü (%66,7), sirken (%38,4), domuz pıtrağı (%33,3), tarla sarmaşığı (%28,6) ve horozibiği (%25) nde tespit edilmiştir. Aynı ilden toplanan 46 çerezlik kabak tohumu, 8 kavun tohumu, 4 karpuz tohumu ve 3 hıyar tohumundan oluşan toplam 61 adet tohum örneğinin %8,2 sinin virüslerle enfekteli olduğu yapılan DAS-ELISA testleri ile belirlenmiştir. İki kavun ve bir karpuz örneğinin WMV-2, bir hıyar örneğinin CMV ve bir çerezlik kabak tohum örneğinin ise ZYMV taşıdığı ortaya konulmuştur. Karaman iline ait toplam 135 kabakgil bitki örneğine DAS-ELISA testi uygulanmış olup, bölgede hâkim virüslerin ZYMV ve WMV-2 olduğu tespit edilmiştir. Bu virüslerin bulaşıklık oranlarının sırasıyla; kabakta %69 ve %50, kavunda ise %36,2 ve %43 olduğu gerçekleştirilen testler ile ortaya konulmuştur. Bitki örneklerinde bu iki virüsten başka CMV (%18,5), PRSV-W (%14,8) ve SqMV (%12,6) de belirlenmiştir. 49 örnekte ikili enfeksiyon tespit edilmiştir. Bunların arasında ZYMV+WMV-2 enfeksiyonları %44,9 ile en çok görülen çoklu enfeksiyon olmuştur. Kabakgil bitki örneklerinde CMV+WMV-2 (%16,3) ve ZYMV+SqMV (%10,2) ikili enfeksiyonları da

78 68 tespit edilmiştir. Farklı kombinasyonlardaki üçlü enfeksiyonlara ise sadece 5 bitki örneğinde rastlanmıştır (Çizelge 4.3, 4.5). Karaman ilinden toplanan ve DAS-ELISA testi uygulanan 5 farklı türdeki toplam 11 yabancı ot örneğinin %18,2 sinin CMV ile bulaşık olduğu ve bu örneklerin, bir adet horozibiği (%25) ve bir adet domuz pıtrağı (%50) örneği olduğu belirlenmiştir. Aynı ilden toplanan 13 çerezlik kabak tohumu, 1 kavun tohumu ve 1 hıyar tohumundan oluşan toplam 15 adet tohum örneğinin %13,3 ünün ZYMV ile enfekteli olduğu yapılan DAS-ELISA testleri ile belirlenmiştir. Gerçekleştirilen testlemeler ile aynı tarlada yetiştirilen, bir kavun ve bir çerezlik kabak tohum örneğinin ZYMV taşıdığı ortaya konulmuştur. Aksaray iline ait toplam 94 kabakgil bitki örneğine DAS-ELISA testi uygulanmış olup, bölgede hâkim virüslerin ZYMV ve WMV-2 olduğu tespit edilmiştir. Bu virüslerin bulaşıklık oranlarının sırasıyla; çerezlik kabakta %48,5 ve %47,1, balkabağında ise %30,8 ve %46,2 olduğu gerçekleştirilen testler ile ortaya konulmuştur. Bitki örneklerinde bu iki virüsten başka SqMV (%12,8), CMV (%9,6) ve PRSV-W (%1,1) de belirlenmiştir. 21 örnekte ikili enfeksiyon tespit edilmiştir. Bunların arasında ZYMV+WMV-2 enfeksiyonları %71,4 ile en çok görülen çoklu enfeksiyon olmuştur. Kabakgil bitki örneklerinde CMV+SqMV (%9,6), CMV+WMV-2 (%4,8), PRSV- W+ZYMV (%4,8), SqMV+WMV-2 (%4,8) ve ZYMV+SqMV (%4,8) ikili enfeksiyonları da tespit edilmiştir. Farklı kombinasyonlardaki üçlü enfeksiyonlara ise sadece 6 bitki örneğinde rastlanmıştır (Çizelge 4.3, 4.6). Arazi çalışmalarında, Aksaray ilinden toplanan 1 adet horozibiği ve 2 adet sirken örneklerinin %66,7 oranında virüslerle bulaşık olduğu belirlenmiştir. Sirken örneklerinin bir tanesinde ZYMV enfeksiyonu saptanırken, horozibiği örneğinde WMV-2+ZYMV ikili enfeksiyonu tespit edilmiştir. Aksaray ilinden, 2009 yılında 6 adet ve 2010 yılında 10 adet olmak üzere toplam 16 adet çerezlik kabak tohum örneği toplanarak DAS-ELISA ile testlenmişlerdir. Testlemeler sonucunda, hiçbir örnekte virüs bulaşıklığına rastlanmamıştır. Çalışma kapsamında saptanan tekli virüs enfeksiyonlarının ilçelere göre dağılımı ve DAS-ELISA testi sonucunda elde edilen maksimum-minimum absorbans değerleri Çizelge 4.3 te gösterilmiştir. Karışık virüs enfeksiyonlarının ilçelere ve bitkilere göre dağılımı ise Çizelge 4.4, 4.5 ve 4.6 da verilmiştir. İlçeler düzeyinde oransal olarak en fazla virüslü bitki miktarı Yunak (Konya) ilçesinden toplanan çerezlik kabak bitkilerinde (%100) tespit edilmiştir. En az virüslü bitki miktarı (%33,3) ise Gülağaç

79 69 (Aksaray) ilçesinden alınan karpuz bitkilerinde tespit edilmiştir. İl bazında bulaşık bitki oranları ortalamaları ise; Konya %83,9, Karaman %74,9 ve Aksaray %73,2 olarak hesaplanmıştır. Genel bir değerlendirilme yapıldığında 2009 ve 2010 yıllarında toplanan 829 örnekten 595 inin virüslerle enfekteli olduğu belirlenmiştir. Bunlardan 140 örneğin ZYMV, 121 örneğin WMV-2, 51 örneğin CMV, 10 örneğin SqMV ve 2 örneğin de PRSV-W ile enfekteli olduğu, 195 örnekte ikili ve 76 örnekte çoklu enfeksiyon bulunduğu saptanmıştır. İkili enfeksiyonların ise yarısına yakını (%46,7) WMV- 2+ZYMV enfeksiyonları şeklindedir. Gerçekleştirilen bu tez çalışması ile Konya, Karaman ve Aksaray illeri kabakgil ekim alanlarında sorun olan çok sayıda viral etmenin bulunduğu belirlenmiştir. Arazi çalışmaları sonunda virüsle bulaşık olduğundan şüphelenilen kabakgil bitki örnekleri, tohum örnekleri ve yabancı ot örneklerinin serolojik testlenmeleri sonucunda CMV, PRSV-W, SqMV, WMV-2 ve ZYMV tespit edilmiştir. Daha önce Türkiye nin farklı bölgelerinde gerçekleştirilen çalışmalarda da bu virüslerin varlığı ortaya konulmuştur (Çağlar ve Yılmaz, 2002; Davis ve Yilmaz, 1984; Erdiller ve Ertunç, 1988; Fidan, 1995; Kaya ve Erkan, 2007; Köklü ve Yılmaz, 2006; Kurcman, 1977; Nogay ve Yorgancı, 1984; Özaslan ve ark., 2006; Topkaya ve Ertunç, 2012; Yılmaz ve Davis, 1985; Yılmaz ve ark., 1991; Yılmaz ve ark., 1992). DAS-ELISA testleri sonucunda, çalışmanın gerçekleştirildiği illerde WMV-2 ve ZYMV nün en yaygın virüsler olduğu ve test edilen hiçbir örnekte CGMMV enfeksiyonu bulunmadığı belirlenmiştir. Benzer olarak, Köklü ve Yılmaz (2006) Tekirdağ, Edirne ve Kırklareli illerinden topladıkları kavun ve karpuz bitki örneklerinde ZYMV, WMV-2, CMV, PRSV-W, SqMV ve MNSV enfeksiyonlarını tespit ederken, bu örneklerin hiç birisinde CGMMV enfeksiyonu tespit etmemişlerdir. Buna karşın, Topkaya ve Ertunç (2012) Ankara dan toplanan 118 bitki örneğinde ZYMV (%50,8), WMV-2 (%65,2), CMV (%21,1), PRSV-W (%20,3) ve SqMV (%2,5) nün yanında CGMMV (%11,6) nün de bulunduğunu bildirmektedirler. Yılmaz ve ark. (1992), Türkiye nin farklı bölgelerinden sağladıkları kabakgil bitkilerinde en sık olarak CMV, WMV-2, ZYMV, PRSV-W ve CABYV nü tespit etmişlerdir. Samsun ili çevresinde gerçekleştirilen bir survey çalışmasında ise, DAS- ELISA ile testlenen 165 kabakgil bitkisinde %53,9 WMV-2, %38,8 ZYMV ve %20,6 CMV saptanmıştır (Sevik ve Arli-Sokmen, 2003). Gaziantep yöresinde 33 farklı arazide yürütülen bir survey çalışmasında ZYMV en yaygın virüs olarak belirlenirken, kabakgil bitkilerinde CMV ve PVY enfeksiyonları da tespit edilmiştir (Özaslan ve ark., 2006).

80 70 Testlenen örneklerde genelde bu virüslerden bir tanesi tespit edilmiş, bazı örneklerde ise karışık enfeksiyonlar tespit edilmiştir. Özellikle kabakgil bitki örneklerinde WMV-2+ZYMV, CMV+WMV-2 ve CMV+ZYMV ikili enfeksiyonları oldukça sık olarak tespit edilmiştir. Aynı bitkiyi birden fazla virüsün enfekte etmesi sonucunda hastalık belirtilerinin daha şiddetli olarak ortaya çıktığı gözlenmiştir. Karışık enfeksiyonların saptandığı çerezlik kabak bitki örnekleri yapraklarında şiddetli şekil bozuklukları, iplik yapraklılık gelişimi ve bodurluk görülmüştür. Bu durum, kabakgil virüsleri arasında sinerjistik bir etkinin olabileceğini düşündürmektedir. Lecoq ve ark. (1981), ZYMV nün diğer virüslerle özellikle CMV ile birlikte karışık enfeksiyonlarda bulunduğunda hastalık belirtilerinin daha şiddetli ortaya çıkabileceğini bildirmektedir. Benzer olarak, Lecoq ve Desbiez (2009), WMV-2 ve ZYMV nün karışık enfeksiyonlarında da sinerjistik etkinin ortaya çıkmasından dolayı hastalık belirtilerinin daha şiddetli görüldüğünü bildirmektedirler. Kabakgil virüslerinin karışık enfeksiyonları konusunda birçok araştırma yapılmıştır (Bourdin ve Lecoq, 1994; Iwasaki ve Inaba, 1988; Lecoq ve ark., 1981; Poolpol ve Inouye, 1986; Zeng ve ark., 2007). Bu çalışma kapsamında testlenen yabancı ot örneklerinin %50,6 sının virüslerle enfekteli olması, kabakgil üretim alanlarındaki yabancı otların virüslere önemli ölçüde konukçuluk yapabileceğini ortaya koymaktadır. Benzer olarak, Mansour (1997), bazı yabancı otların kabakgil virüslerine inokulum kaynağı olarak birinci derecede rol oynadıklarını bildirmektedir. DAS-ELISA testlemeleri yapılan yabancı ot örneklerinin %38 inin CMV, %26,7 sinin WMV-2 ve %15,5 inin de ZYMV ile enfekteli olduğu belirlenmiştir. Cooper ve ark. (2006), Quiot ve ark. (1979) na atfen, İngiltere de, CMV nün birçok yabani bitkide tespit edildiğini bildirmektedir. Desbiez ve ark. (2007), Lecoq (1992) a atfen, birçok yabancı ot türünün WMV-2 nin doğal konukçusu olduğunu bildirmektedir. Testlemeler sonucunda en fazla bulaşıklık horozibiği, sirken, tarla sarmaşığı, şeytan elması, köpek üzümü ve domuz pıtrağı adlı yabancı otlarda saptanmıştır. Costea ve ark. (2004), 3 farklı Amaranthus (horozibiği) türünün yaklaşık 80 adet virüs türünün konukçusu olduğunu bildirmektedir. Daha önce yapılan çalışmalarda A. retroflexus ve Convolvulus arvensis in CMV, Chenopodium album un CMV ve WMV-2, C. amaranticolor un CMV, PRSV-W, ZYMV ve WMV-2, D. stramonium ve S. nigrum un CMV ve WMV-2, X. orientale nin ise CMV nün konukçusu oldukları belirlenmiştir (Brunt ve ark., 2003; Zitter, 2002). Bu çalışmada elde edilen sonuçlar da daha önce yapılan çalışmaların sonuçlarıyla paralellik

81 71 göstermektedir. Çalışma sonucunda yabancı otlarda en fazla saptanan virüsün CMV olduğu belirlenmiştir. Sharifi ve ark. (2008) İran kabakgil ekim alanlarından topladıkları Citrullus colocynthis adlı yabancı otun WMV-2 ile bulaşık olduğunu tespit etmişlerdir. Yine birçok yabancı otun (Ranunculus sardous, Moluccella laevis, Lamium amplexicaule) ZYMV nün potansiyel konukçusu olabileceği, R. sardous a mekanik inokulasyonu sonucunda yabancı otun tohumlarıyla taşınabildiği yapılan çalışmalarla ortaya konulmuştur (Al-Musa, 1989; Lecoq ve ark., 1981). DAS-ELISA ile testlenen 92 adet kabakgil tohum örneklerinin sadece 8 inin virüs taşıdığı, 3 çerezlik kabak ve 1 kavun tohumunda ZYMV, 1 karpuz ve 1 kavun tohumunda WMV-2 ve 1 hıyar tohumunda ise CMV enfeksiyonu belirlenmiştir. Çerezlik kabak tohumlarında % 4,5 oranında bulunduğunu belirlediğimiz ZYMV nün kabakgil tohumlarıyla taşınmasına yönelik çalışmalarda çelişkili sonuçlar ortaya çıkmıştır. Schrijnwerkers ve ark. (1991), ZYMV nün C. pepo tohumlarında %0,047 gibi düşük bir oranda taşındığını bildirmektedirler. Bununla birlikte, Tobias ve ark. (2008) yağlık kabak tohumlarının %0,29 ile %15,34 arasında değişen oranlarla virüslerle bulaşık olduğunu, ZYMV nün tohumla taşınma oranının ortalama %1,4 olduğunu bildirmektedirler. Yine, aynı virüsün C. pepo var styriaca tohumlarında %5 ten daha fazla oranda taşınabildiği ve virüsün bu düzeydeki tohumla taşınma oranının bile %99 dan fazla ürün kaybına neden olabileceği belirtilmiştir (Riedle-Bauer ve ark., 2002). Çalışma sonuçlarımıza paralel olarak, Gümüş ve ark. (2001) hıyar tohumlarının %36,8 ve Paylan (2011) %13 oranında CMV ile enfekteli olduğunu saptamışlar. Bilindiği gibi, bir virüsün tohumla taşınması düşük oranda bile olsa, bu tohumlarn üretimin başlangıcında hastalık kaynağı oluşturması yönünden önemi fazladır (Nienhaus, 1976). Diğer taşınma yolları ile yayılmaları mümkün olabilen tohum kaynaklı virüs hastalıklarının kısa sürede büyük oranlarda artış gösterdikleri de bilinmektedir. Ayrca, tohumla taşınma dar konukçu dizisine sahip virüsler için vejetasyon dönemleri arası geçişe bir yol olarak kullanılmaktadır (Erkan, 1998).

82 Aksaray Karaman Konya 72 Çizelge 4.3. Çalışmanın gerçekleştirildiği illere bağlı ilçelerden toplanan örneklerde DAS-ELISA testleri ile saptanan tekli enfeksyionlara ait maksimum-minimum absorbans değerleri ve bulaşık örnek sayıları. Ġl Ġlçe CMV Maks.-Min SqMV WMV-2 ZYMV CMV PRSV-W SqMV WMV-2 ZYMV Altınekin ,319-0,112 0,196-0,081 0,083-0, ,073 0,296-0,066 0,454-0, Çumra 0,102 0,040 0,484-0,030 0,407-0,045 0,118-0,024 0,078 0,091-0,026 0,063-0, Ereğli 0,141-0,100 0,935-0,119 0,358-0,108 0,240-0,028 0,233 0,209-0,066 0,349-0, Merkez ,665-0,025 0,499-0,081 0,089 0,040 0,756-0,038 0,475-0, Yunak ,120-0,105 0,334-0,055 0,297 0,547-0, Ayrancı --- 0,172-0,165 0, ,387-0, K.karabekir ,192-0,189 0,351-0,038 0,680-0, Merkez 0,094-0,046 0,095-0,038 0,233-0,092 0,364 0,106-0,093 0,465-0, Gülağaç --- 0,092 0,138-0,082 0, ,075-0,062 0,489-0,030 0,067-0, Merkez ,473-0,074 0,056 0,174 0, Ortaköy ,258-0,140 0,359-0,074 0,101-0,024 0,488-0,170 0,090-0,

83 Çumra Altınekin Ġlçeler CMV+ PRSV-W CMV+ SqMV CMV+ WMV-2 CMV+ ZYMV PRSV-W+ WMV-2 PRSV-W+ ZYMV SqMV + WMV-2 SqMV+ ZYMV WMV-2 + ZYMV CMV + PRSV-W + WMV-2 CMV + SqMV + WMV-2 CMV + WMV-2 + ZYMV PRSV-W + WMV-2 + ZYMV SqMV + WMV-2 + ZYMV CMV + PRSV-W + WMV-2 + ZYMV CMV + SqMV + WMV-2 + ZYMV TOPLAM 73 Çizelge 4.4. Konya ili ilçelerinden toplanan bitki örneklerindeki ikili ve çoklu enfeksiyonların bitki türlerine göre sayıları Saptanan Virüsler Yıllar Konukçu Bitki 2009 Çerezlik Kabak Çerezlik Kabak Kavun Balkabağı Sığır dili Çerezlik Kabak Kavun Karpuz Horoz ibiği Çerezlik Kabak Kavun Karpuz Hıyar Sirken Horoz ibiği Domuz pıtrağı Tarla sarmaşığı Köpek üzümü

84 Yunak Merkez Ereğli Ġlçeler CMV + PRSV-W CMV + SqMV CMV+ WMV-2 CMV+ ZYMV PRSV-W + WMV-2 PRSV-W + ZYMV SqMV+WMV-2 SqMV+ ZYMV WMV-2 + ZYMV CMV + PRSV-W + WMV-2 CMV + SqMV + WMV-2 CMV +WMV-2 + ZYMV CMV + SqMV + ZYMV CMV+ WMV-2 + ZYMV PRSV-W + SqMV +ZYMV PRSV-W + WMV-2 + ZYMV CMV +PRSV-W + WMV-2 + ZYMV CMV + SqMV + WMV-2 + ZYMV TOPLAM 74 Çizelge Konya ili ilçelerinden toplanan bitki örneklerindeki ikili ve çoklu enfeksiyonların bitki türlerine göre sayıları (Devam ediyor) Saptanan Virüsler Yıllar Konukçu Bitki 2009 Çerezlik Kabak Balkabağı Sakızkabağı Kavun Karpuz Hıyar Balkabağı Sakızkabağı Kavun Hıyar Çerezlik Kabak Çerezlik Kabak Hıyar Acur Kavun Balkabağı Sakızkabağı Çerezlik Kabak Sirken Çerezlik Kabak Kavun Karpuz

85 Merkez K.karabekir Ayrancı Ġlçeler CMV+ SqMV CMV+ WMV-2 CMV+ ZYMV PRSV-W + SqMV PRSV-W + WMV-2 PRSV-W+ ZYMV SqMV+WMV-2 SqMV+ ZYMV WMV-2 +ZYMV CMV+ PRSV-W + ZYMV CMV + SqMV + WMV-2 CMV + SqMV + ZYMV CMV + WMV-2 + ZYMV PRSV-W + SqMV+ WMV-2 PRSV-W + SqMV + ZYMV PRSV-W + WMV-2 +ZYMV SqMV +WMV-2 + ZYMV CMV + PRSV-W + WMV-2 + ZYMV TOPLAM 75 Çizelge 4.5. Karaman ili ilçelerinden toplanan bitki örneklerindeki ikili ve çoklu enfeksiyonların bitki türlerine göre sayıları Saptanan Virüsler Yıllar Konukçu Bitki 2010 Çerezlik kabak Çerezlik Kabak 2010 Çerezlik Kabak Karpuz Kavun Çerezlik Kabak Karpuz Kavun Hıyar Çerezlik Kabak Karpuz Kavun

86 Ortaköy Merkez Gülağaç Ġlçeler CMV+ SqMV CMV+ WMV-2 CMV+ ZYMV PRSV-W + SqMV PRSV-W + WMV-2 PRSV-W + ZYMV SqMV+WMV-2 SqMV+ ZYMV WMV-2 +ZYMV CMV+ PRSV-W + ZYMV CMV + SqMV + WMV-2 CMV + SqMV + ZYMV CMV + WMV-2 + ZYMV PRSV-W + SqMV + WMV-2 PRSV-W + SqMV + ZYMV PRSV-W + WMV-2 +ZYMV SqMV +WMV-2 + ZYMV TOPLAM 76 Çizelge 4.6. Aksaray ili ilçelerinden toplanan bitki örneklerindeki ikili ve çoklu enfeksiyonların bitki türlerine göre sayıları Saptanan Virüsler Yıllar Konukçu Bitki 2010 Balkabağı Hıyar 2009 Çerezlik Kabak 2010 Çerezlik Kabak Çerezlik Kabak Horoz ibiği Çerezlik Kabak Balkabağı Kavun Hıyar

87 Moleküler ÇalıĢmalar TNA (Total Nükleik Asit) ekstraksiyon çalıģmaları Toplam nükleik asitler DAS-ELISA testleri sonucunda CMV, PRSV-W, SqMV, WMV-2 ve ZYMV ile bulaşık olduğu belirlenen bitki, yabancı ot ve tohum örneklerinden elde edilmiştir. Ekstraksiyon çalışmaları sonucunda elde edilen ekstraktlardaki toplam nükleik asit varlığı ve kalitesi agaroz jel elektroforez çalışmasıyla (Şekil 4.8) ve ayrıca nanodropta kontrol edilmiştir. Total NA miktarı ve kalitesi yüksek olan örneklere RT-PCR testi uygulanmıştır. ġekil 4.8. Kabakgil bitki örneklerinden elde edilen toplam nükleik asitler (TNA) in agaroz jeldeki görünümü RT-PCR çalıģmaları RT-PCR çalışmaları; a) DAS-ELISA testleri sonuçlarında; CMV, PRSV-W, SqMV, WMV-2 ve ZYMV ile bulaşık olduğu belirlenen kabakgil bitkileri, tohum örnekleri ve yabancı ot örneklerindeki bulaşıklığın moleküler yöntemlerle doğrulanması, b) Kabakgil bitkileri üzerinden toplanan afitlerdeki viral bulaşıklığın belirlenmesi ve

88 78 c) Bu virüslerin dizi belirleme çalışmalarında kullanılan amplifikasyon ürünlerinin elde edilmesi amacıyla gerçekleştirilmiştir. Çalışmada; ZYMV ile bulaşık 78 adet kabakgil bitkisi, 4 adet kabakgil bitki tohumu ve 2 adet yabancı ot örneği (Çizelge 4.7 ), WMV-2 ile bulaşık 55 adet kabakgil bitkisi ve 4 adet kabakgil bitki tohumu (Çizelge 4.8), CMV ile bulaşık 14 adet kabakgil bitkisi, 1 adet kabakgil bitki tohumu ve 3 adet yabancı ot örneği (Çizelge 4.9), SqMV ile bulaşık 10 adet kabakgil bitkisi örneği (Çizelge 4.10), PRSV-W ile bulaşık 1 adet kabakgil bitkisi ve 1 adet yabancı ot örneği (Çizelge 4.11) ile kabakgil bitkileri üzerinden toplanan 17 adet afit örneği (Çizelge 4.13) testlenmiştir. Ayrıca, bu çalışmalarda karışık enfeksiyonların saptandığı bazı bitki örnekleri (Çizelge 4.12) ile virüs enfeksiyonu saptanmayan bitki örnekleri de yer almıştır. RT-PCR yöntemi ile gerçekleştirilen moleküler testlerde elde edilen sonuçlar serolojik testlerin sonuçlarıyla paralellik göstermiştir. DAS-ELISA testinde pozitif olduğu ortaya konulan örneklerin moleküler olarak ta pozitif oldukları doğrulanmıştır. Serolojik testlerde negatif sonuç veren örneklerin birkaçı dışında tamamına yakınında çalışmaya konu olan virüslerle bulaşıklık tespit edilmemiştir. Çizelge 4.7. RT-PCR testi sonucunda ZYMV ile bulaşık olduğu belirlenen örnekler Yılı Yer Örnek Bitki* Ġzolat Konya-Merkez KKDT-8 ÇK Z-24 KKDT-13 ÇK Z-25 A.2/4 ÇK Z-7 A.5/7 KV Z-59 Konya-Altınekin A.1/15 ÇK Z-60 A.1 ÇK (T) Z-61 A.1/18 ÇK Z-68 Ç.1/17 ÇK Z-1 Ç.2/5 ÇK Z-2 Ç.5/5 ÇK Z-10 Ç.6/6 KR Z-16 Konya-Çumra Ç.7/8 KV Z-20 Ç.3/9 ÇK Z-21 Ç.4/15 ÇK Z Ç.2/B CYP Z-32 Ç.6/23 KV Z-73 Konya-Ereğli Er.2/8 H Z-30 Er.6/8 ÇK Z-40 Y.7/18 ÇK Z-37 Konya-Yunak Y.2/12 ÇK Z-39 Y.4/2 ÇK Z-42 Y.6/5 ÇK Z-48 Ak.7/6 ÇK Z-3 Ak.5/8 ÇK Z-4 Aksaray Ak.8/1 ÇK Z-8 Ak.6/2 ÇK Z-41 Ak.7 ÇK (T) Z-63 Karaman Ka.4/13 KR Z-17 Ka.7/4 H Z-31

89 79 Çizelge 4.7. RT-PCR testi sonucunda ZYMV ile bulaşık olduğu belirlenen örnekler (Devam) Yılı Yer Örnek Bitki* Ġzolat SHB.14p/5 AMR Z-23 İsmil.3/6 ÇK Z-46 İsmil.2/7 ÇK Z-47 İsmil.1/7 ÇK Z-54 İsmil.2/8 ÇK Z-71 İsmil.1/6 ÇK Z-74 İsmil.2/3 ÇK Z-75 Konya-Merkez Sel.HB.10 BK Z-77 Sel.HB.4 SK Z-76 Sel.HB.11 SK Z-78 Sel.HB.12 BK Z-79 Sel.HB.13 BK Z-80 Sel.HB.16 AC Z-81 Sel.HB.17 SK Z-82 Sel.HB.20 BK Z-83 KBDT-2 ÇK Z-84 ALT-10/2 BK Z-43 ALT.4/6 ÇK Z-44 ALT.11/5 ÇK Z-49 ALT.12/3 ÇK Z-51 Konya-Altınekin ALT.8/2 ÇK Z-52 ALT.9/5 ÇK Z-55 ALT.6/3 ÇK Z-56 ALT.5/2 KV Z-57 ALT.7/3 ÇK Z-58 ALT.2/9 ÇK Z-61 Ç.7/2 ÇK Z-45 Konya-Çumra 2010 Ç.9/1 H Z-50 Konya-Ereğli ER.9/1 BK Z-6 ER.11/1 ÇK Z-36 YUN.6/6 ÇK Z-33 YUN.7/1 KV Z-34 Konya-Yunak YUN.5/3 ÇK Z-35 YUN.3/2 KV Z-38 YUN.7/4 KV Z-67 AKS.8/1 ÇK Z-5 Aksaray AKS.9/5 BK Z-53 AKS.2/5 BK Z-66 AKS.9/6 CH Z-70 KAR.12/1 ÇK Z-9 KAR.8/5 ÇK Z-11 KAR.9/3 ÇK Z-12 KAR.10/2 ÇK Z-13 KAR.4/6 ÇK Z-14 KAR.5/3 ÇK Z-15 KAR.15/1 BK Z-18 Karaman KAR.3/2 ÇK Z-19 KAR.11/6 KR Z-26 KAR.16/1 KV Z-27 KAR.6/3 KV Z-28 KAR.7/3 ÇK Z-29 KAR.6 KV(T) Z-64 KAR.6 ÇK(T) Z-65 KAR.8/4 ÇK Z-69 KAR.8/1 ÇK Z-72 * AC: Acur, AMR. Horoz ibiği, BK: Balkabağı, CH: Sirken, CYP: Topalak, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı, (T): Tohum örneği.

90 80 M Z-1 Z-2 Z-3 Z-4 Z-5 Z-6 Z-7 Z-8 Z-9 Z-10 Z-11 Z-12 Z-13 Z-14 Z-15 - W + M 193bp ġekil 4.9. Kabakgil bitki örnekleri için, ZYMV ne spesifik ZYMVF1-ZYMVR1 primer çifti kullanılarak yapılan RT-PCR testi sonuçları (M: 100bp DNA Ladder, Z-1-15: örnekler, -: Negatif kontrol, W: Su kontrol, +: Pozitif kontrol) ZYMV için gerçekleştirilen ZYMVF1-ZYMVR1 kodlu primer çifti kullanılmış ve toplam 84 adet örnekten elde edilen izolatlarda 193 bp lik band oluşumu gözlenmiştir (Şekil 4.9). Bu çalışmada elde edilen sonuçlar, Hsu ve ark. (2005) tarafından bildirilen sonuçlarla paralellik göstermektedir. Aynı araştırıcılar, saflaştırılmış viral RNA ler ile ZYMVF1-ZYMVR1 primer çiftlerini kullanarak gerçekleştirdikleri RT-PCR çalışmasında ZYMV nün varlığını belirlemişlerdir. Yaptıkları bu çalışma sonucunda, agaroz jel elektroforez yöntemi ile ZYMV için 193 bp lik band gözlemişlerdir. M W-1 W-2 W-3 W-4 W-5 W-6 W-7 W bp ġekil Kabakgil bitki örnekleri için, WMV-2 ye spesifik WMV-R - WMV-F primer çifti kullanılarak yapılan RT-PCR testi sonuçları (M: 100bp DNA Ladder, W-1-8: Örnekler, -: Negatif kontrol, +: Pozitif kontrol) WMV-2 için WMV-R - WMV-F kodlu primer çifti kullanılmış ve WMV-2 ile bulaşık olduğu serolojik olarak belirlenen 59 örnekten (Çizelge 4.8) sağlanan izolatlarla gerçekleştirilen RT-PCR testi sonucunda 822 bp lik bantlar elde edilmiştir (Şekil 4.10). Bu çalışmada elde edilen sonuçlar, Sharifi ve ark.(2008) tarafından bildirilen sonuçlarla benzerlik göstermektedir. Araştırıcılar, aynı primer çiftini kullanarak WMV-2 ile

91 81 bulaşık kabakgil bitki örneklerinde gerçekleştirdikleri RT-PCR çalışmaları sonucunda 822 bp lik bantları elde etmişlerdir. Çizelge 4.8. RT-PCR testi sonucunda WMV-2 ile bulaşık olduğu belirlenen örnekler Yılı Yer Örnek Bitki* Ġzolat KKDT.2 ÇK W-30 Konya-Merkez KKDT.11 ÇK W-31 MER.2 KV (T) W-54 A.6/1 ÇK W-24 Konya-Altınekin A.5/2 KV W-27 A.4/10 ÇK W-53 Ç.2/7 ÇK W-17 Ç.7/1 KV W-19 Ç.4/3 ÇK W-20 Ç.1/20 ÇK W-50 Konya-Çumra Ç.6/33 KR W-51 Ç.19/5 AC W-52 Ç.6 KV (T) W-55 Ç.8/2 KR (T) W-56 Ç.8/1 KR (T) W-57 Ç.4/18 ÇK W-58 Er.1/5 ÇK W-9 Er.3/5 SK W-14 Konya-Ereğli 2009 Er.4/5 BK W-15 Er.2/11 KV W-23 Konya-Halkapınar HALK.1 ÇK W-43 Konya-Yunak Y.3/14 ÇK W-1 Y.5/2 KV W-3 Ak.9/8 KR W-18 Ak.4/8 ÇK W-21 Aksaray Ak.8/9 ÇK W-22 Ak.2/1 ÇK W-34 Ak.1/8 ÇK W-35 Ak.3/13 ÇK W-39 Ka.3/9 KV W-5 Ka.14/4 KV W-7 Ka.8/1 H W-8 Karaman Ka.5/4 KV W-10 Ka.12/4 H W-11 Ka.16/1 ÇK W-12 Ka.7/3 ÇK W-13 Ka.14/2 KR W-38 SHB.32-14/2 SK W-16 SHB.28-6/3 SK W-36 Konya-Merkez SHB.34P/3 H W-37 K.SELÇ. KV W-40 K.KARAT. BK W-41 SelHB.5 SK W-59 Konya-Altınekin ALT.7/2 ÇK W-42 ALT.12/5 ÇK W-45 Konya-Çumra Ç.3/1 ÇK W-44 ER.3/2 H W Konya-Ereğli ER.10/2 KV W-4 ER.7/8 KV W-6 ER.2/3 SK W-28 AKS.10/5 BK W-29 AKS.7/2 ÇK W-46 Aksaray AKS.3/3 BK W-47 AKS.4/2 BK W-48 AKS.5/1 ÇK W-49 KAR.14/4 ÇK W-25 Karaman KAR.1/7 ÇK W-26 KAR.2/4 ÇK W-32 KAR.3/1 ÇK W-33 * AC: Acur, BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı, (T): Tohum örneği.

92 82 Çizelge 4.9. RT-PCR testi sonucunda CMV ile bulaşık olduğu belirlenen örnekler Yılı Yer Örnek Bitki* Ġzolat Konya-Merkez SelHB.25 H C-17 KBDT.4 ÇK C-18 Konya-Çumra Ç.7 H (T) C Konya-Ereğli Er.5/4 SK C-10 Er.1/8 KV C-11 Karaman Ka.10/1 H C-6 Ka.12/1 KV C-14 Ka.4/3 KV C-15 Konya-Çumra Ç.7/3 ÇK C-1 Ç.18/8 CH C-2 Ç.18/6 KR C-3 Konya-Ereğli ER.3/3 H C ER.6/5 H C-7 ER.6/1 H C-8 ER.4/2 SK C-12 ER.8/5 KV C-13 Karaman KAR.2/7 AMR C-4 KAR.7/8 XA C-9 *AC: Acur, AMR. Horoz ibiği, BK: Balkabağı, CH: Sirken, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı, XA: Domuz pıtrağı, (T): Tohum örneği. M C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C bp ġekil Kabakgil bitki örnekleri için, CMV ne spesifik RW8-RV11 primer çifti kullanılarak yapılan RT-PCR testi sonuçları (M: 100bp DNA Ladder, C-1-7: Örnekler, +: Pozitif kontrol, -: Negatif kontrol) CMV için RW8 ve RV11 kodlu primer çifti kullanılmış ve CMV ile bulaşık olduğu serolojik olarak belirlenen 18 örnekten sağlanan izolatla gerçekleştirilen RT- PCR testi sonucunda 650 bp lik bantlar elde edilmiştir (Şekil 4.11). Finetti-Sialer ve ark. (1999) nın gerçekleştirdiği çalışmada da benzer sonuçlar elde edilmiştir. Araştırıcılar aynı primer çiftini kullanarak RNA2 genomu üzerinde spesifik bir bölgeyi çoğaltarak 650 bp lik bantları elde etmişlerdir.

93 83 M C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14 C-15 - W + 488bp ġekil Kabakgil bitki örnekleri için, CMV ne spesifik CP-R - CP-F primer çifti kullanılarak yapılan RT-PCR testi sonuçları (M: 100bp DNA Ladder, C-8-15: Örnekler, -: Negatif kontrol, W:Su kontrol, +: Pozitif kontrol) CMV için, CP-R ve CP-F primer çifti kullanılarak gerçekleştirilen RT-PCR çalışmaları CMV izolatlarının dizi belirleme çalışmalarında kullanılan amplifikasyon ürünlerinin elde edilmesi amacıyla yapılmıştır. Bu primer çifti RNA-3 üzerinde nükleotidler arasındaki, kılıf proteinini kodlayan bölgenin bir kısmını da içine alan 488 bp lik kısmı çoğaltmaktadır. Son yıllarda CMV izolatlarının genetik yakınlıklarını ortaya koymak için yapılan çalışmalarda, RNA3 üzerindeki hareket ve kılıf proteinini içinde bulunduran, 3a protenini kodlayan diziler kullanılmaktadır (Bashir ve ark., 2006; Bonnet ve ark., 2005; Eiras ve ark., 2004). CMV için CP-R ve CP-F kodlu primer çifti kullanılmış ve CMV ile bulaşık olduğu serolojik olarak belirlenen 18 örnekten sağlanan izolatla gerçekleştirilen RT- PCR testi sonucunda 488 bp lik bantlar elde edilmiştir (Şekil 4.12). Singh ve ark. (1995) nın gerçekleştirdiği çalışmada da benzer sonuçlar elde edilmiştir. Araştırıcılar aynı primer çiftini kullanarak RNA3 genomu üzerindeki kılıf proteininin bir kısmını çoğaltarak 488 bp lik bantları elde etmişlerdir. Çizelge RT-PCR testi sonucunda SqMV ile bulaşık olduğu belirlenen örnekler Yılı Yer Örnek Bitki* Ġzolat Konya-Çumra Ç.6/14 KR S Aksaray-Gülağaç Ak.8/3 ÇK S-9 Karaman-Merkez Ka.4/10 KV S-7 Ka.7/5 H S-8 Konya-Merkez KKK.2 KR S-4 Konya-Altınekin ALT.12/1 ÇK S Konya-Çumra Ç.9/3 H S-5 Aksaray-Merkez AKS.2/1 ÇK S-1 Aksaray-Gülağaç AKS.9/3 H S-2 AKS.10/6 KV S-6 *ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun.

94 84 M S-1 S-2 S-3 S-4 S-5 S-6 S bp ġekil Kabakgil bitki örnekleri için, SqMV ne spesifik SqMVF-SqMVR primer çifti kullanılarak yapılan RT-PCR testi sonuçları (M: 100bp DNA Ladder, S-1-7: örnekler, -: Negatif kontrol, +: Pozitif kontrol) SqMV için, daha önce SqMV ile bulaşık olduğu serolojik olarak belirlenen 10 örnekten (Çizelge 4.10) izole edilen TRNA ler ile gerçekleştirilen RT-PCR testinde virüse spesifik SqMVF ve SqMVR kodlu primer çifti kullanılmış ve test sonucunda tüm örneklerde 500 bp lik bantlar elde edilmiştir (Şekil 4.13). Yoo ve ark. (2004) nın gerçekleştirdiği çalışmada da benzer sonuçlar elde edilmiştir. Araştırıcılar aynı primer çiftini kullanarak RNA2 genomu üzerinde kılıf proteininin bir kısmını çoğaltarak 650 bp lik bantları elde etmişlerdir. Çizelge RT-PCR testi sonucunda PRSV-W ile bulaşık olduğu belirlenen örnekler Yılı Yer Örnek Bitki Ġzolat Konya-Ereğli ER.2/1 Balkabağı P Konya-Yunak YUN.7/6 Bozot P-2 M bp ġekil Kabakgil bitki örnekleri için, PRSV-W ne spesifik PRSVW-Upst.-PRSVW-Downst. primer çifti kullanılarak yapılan RT-PCR testi sonuçları (M: 100bp DNA Ladder, 1-2: Örnekler, -: Negatif kontrol, +: Pozitif kontrol, 500bp)

95 85 PRSV-W için, daha önce PRSV-W ile bulaşık olduğu serolojik olarak belirlenen 2 örnekten (Çizelge 4.11) izole edilen TRNA ler ile gerçekleştirilen RT-PCR testinde virüse spesifik PRSV-W-Upst. ve PRSV-W-Downst. kodlu primer çifti kullanılmış ve test sonucunda tüm örneklerde 820 bp lik bantlar elde edilmiştir (Şekil 4.14). Wang ve Yeh (1998) tarafından gerçekleştirilen çalışmada da benzer sonuçlar alınmıştır. Araştırıcılar, aynı primer çiftini kullanarak gerçekleştirdikleri RT-PCR testi ile virüs genomu üzerindeki, CP genini kodlayan bölgede, nükleotidler arasındaki 820 bp lik kısmı çoğaltarak, benzer bantları elde etmişlerdir. Çizelge Multiplex-RT-PCR yöntemi ile testlenen karışık enfeksiyonlara sahip bitki örnekleri Yılı Yer Örnek Bitki* Ġzolat** Konya-Altınekin A.4/8 ÇK WZ-2 Konya-Çumra Ç.4/24 KR CWZ-3 Ç.6/14 KV WZ Konya-Merkez KKDT-15 ÇK CWZ-2 Konya-Yunak Y.6/8 ÇK WZ-4 Karaman-K.Karabekir Ka.16/3 ÇK CWZ-1 Aksaray-Ortaköy Ak.5/10 ÇK WZ-1 Konya-Altınekin ALT.8/4 ÇK CWZ-4 ALT. 2/11 ÇK WZ-9 Konya-Çumra Ç.3/5 ÇK CWZ-5 Konya-Ereğli ER.7/4 SK WZ Konya-Merkez SHB.32/2 H CWZ-6 Konya-Yunak YUN.7/2 KV WZ-6 Karaman-K.karabekir KAR.16/5 KV WZ-7 Karaman-Ayrancı KAR.2/6 ÇK WZ-8 Aksaray-Merkez AKS.1/1 ÇK CWZ-7 * ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KR: Karpuz, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı. **WZ: WMV-2+ZYMV, CWZ : CMV+WMV-2+ZYMV 822bp WMV-2 M CWZ-1 CWZ-2 CWZ-3 CWZ-4 CWZ-5 WZ-1 WZ-2 WZ-3 M 488bp CMV 193bp ZYMV ġekil Kabakgil bitki örneklerindeki karışık enfeksiyonları moleküler olarak tespit etmek için gerçekleştirilen multiplex- RT-PCR testi sonuçları (M: 100bp DNA Ladder, CWZ-1-5: CMV+WMV-2+ZYMV ile bulaşık örnekler, WZ-1-3: WMV-2+ZYMV ile bulaşık örnekler)

96 86 DAS-ELISA testlemeleri sonucunda karışık enfeksiyonların saptandığı bazı bitki örnekleri (Çizelge 4.12) ndeki virüs enfeksiyonları RT-PCR yöntemi ile de doğrulanmıştır (Şekil 4.15). Çizelge RT-PCR yöntemi ile testlenen afid örnekleri ve tespit edilen virüsler Yılı Yer Örnek Türü Bitki* Saptanan virüs ER.af.1 Myzus persicae SK ---- ER.af.2 M. persicae BK ---- ER.af.5 Aphis gossypii BK ---- Konya-Ereğli ER.af.6 M. persicae H CMV ER.af.7/1 A. gossypii KV CMV ER.af.7/2 M. persicae BK ---- ER.af.8 M. persicae SK CMV ER.af.9 M. persicae BK ZYMV 2010 Mer.af.1 M. persicae BK --- Mer. af.3 A. gossypi SK WMV-2 Konya -Merkez Mer.af. 6 M. persicae BK WMV-2 Mer. af. 8 M. persicae BK --- Mer. af. 9 M. persicae BK --- Aks.af.2 A. gossypii ÇK ZYMV Aksaray Aks. af.4/1 A. gossypii ÇK ZYMV Aks.af. 4/2 A.gossypii BK --- Aks. af.9 M. persicae BK --- *BK: Balkabağı, ÇK: Çerezlik kabak, H: Hıyar, KV: Kavun, SK: Sakızkabağı. 822bp WMV-2 M M 488bp CMV 193bp ZYMV ġekil Kabakgil bitki örnekleri üzerinden toplanan afidlerdeki CMV, WMV-2 ve ZYMV bulaşıklığının ortaya koymak için gerçekleştirilen RT-PCR testi sonuçları (M: 100bp DNA Ladder, 1-3: CMV, 4-5:WMV-2, 6-8: ZYMV ile bulaşık afid örnekleri) Çalışma kapsamında kabakgil bitkileri üzerinden toplanan afid örneklerine uygulanan RT-PCR testlerinin sonuçları Çizelge 4.13 de görülmektedir. Test edilen 17 adet afid örneklerinin, 3 tanesinin ZYMV, 2 tanesinin WMV-2 ve 3 tanesinin de CMV ile bulaşık olduğu belirlenmiştir. Pozitif örneklere ait PCR ürünlerinin %1 lik agaroz jelde virüslere özgü oluşturdukları bantlar Şekil 4.16 da görülmektedir.

97 Dizi Belirleme ve BLAST Analizi ÇalıĢmaları Hıyar mozayik virüsü (CMV) dizi analizi çalıģmaları Son yıllarda CMV izolatlarının genetik yakınlıklarını ortaya koymak için yapılan çalışmalarda, RNA3 üzerindeki hareket ve kılıf proteinini içinde bulunduran, 3a protenini kodlayan diziler kullanılmaktadır (Bashir ve ark., 2006; Bonnet ve ark., 2005; Eiras ve ark., 2004). Bu çalışmada, 2010 yılında Ereğli (Konya) ilçesinden toplanan ve CMV ile enfekteli olduğu belirlenen hıyar bitkisinden izole edilen C-5 izolatı ile 2009 yılında Karaman (merkez) dan toplanan ve yine CMV ile enfekteli olduğu belirlenen kavun bitkisinden izole edilen C-14 izolatı kullanılmıştır. Her iki izolatın, RNA-3 üzerinde nükleotidler arasındaki, kılıf proteinini kodlayan bölgenin bir kısmını da içine alan 488 bp lik kısmı çoğaltılarak dünya izolatları ile karşılaştırılmıştır. Aynı zamanda, bu izolatlar GenBank a KC ve KC aksesyon numaraları ile kaydettirilmişlerdir. İki izolat arasındaki genetik fark Mega programında Kimura-2 parametresi ile %93,7 olarak hesap edilmiştir. C-5 izolatı en yüksek oranda benzerliği İran (JX kavun) izolatı ile göstermiştir. C-14 izolatı ise Avustralya (AJ domates), Sırbistan (JX Lagenaria siceraria ve HM Cucurbita pepo cv. Olinka), ABD (CMU ), Bosna-Hersek (JX Lamium maculatum) ve Macaristan (AM Domates) izolatları ile yüksek oranda benzerlik gösterdiği BLASTN programıyla belirlenmiştir (Çizelge 4.14, Şekil 4.17). Eiras ve ark. (2004) nın Brezilya da farklı bitkilerden izole ettikleri CMV izolatları arasındaki genetik yakınlığı ortaya koymak için gerçekleştirdikleri çalışmada RNA3 ün 3ʹ ucu ve kılıf proteininin bir kısmının (488bp) dizi analizini gerçekleştirmişlerdir. İzolatlar arasında %92-99 oranında benzerlik belirleyen araştırıcılar, dünya izolatları ile yaptıkları karşılaştırma çalışmaları sonucunda izolatların altgrup I e dâhil olduğunu bildirmektedirler.

98 88 Çizelge NCBI BLAST nükleotid dizi programında belirlenen CMV izolatları arasındaki benzerlik oranları % Benzerlik C-5 (KC989614) C-14 (KC989615) AJ (Avustralya) JX (Sırbistan) CMU (ABD) JX (Bosna-Hersek) AM (Macaristan) JX (Ġran) AB (Japonya) AB (Japonya) AJ (Japonya) AJ (Avustralya) AJ (Avustralya) JX (G. Kore) AB (G. Kore) AM (Ġspanya) HM (Sırbistan) AB (G. Kore) C-5 (KC989614) ,7 C-14 (KC989615) 93,7 100 ġekil C-14 izolatı için yapılan BLAST analizi sonucu (