ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Bilge ALAN DOĞU AKDENİZ BÖLGESİ NDE YETİŞTİRİLEN BAZI KIŞLIK SEBZELERDE HASTALIK YAPAN VİRÜSLERİN TANILANMASI ve KARAKTERİZASYONU BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI ADANA, 2012

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOĞU AKDENİZ BÖLGESİ NDE YETİŞTİRİLEN BAZI KIŞLIK SEBZELERDE GÖRÜLEN VİRÜS HASTALIKLARININ SAPTANMASI Bilge ALAN DOKTORA TEZİ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI Bu Tez 31/01/2012 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir Yard. Doç. Dr. Muharrem A. KAMBEROĞLU Prof. Dr. Mukaddes KAYIM Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR DANIŞMAN ÜYE ÜYE Doç. Dr. Doç. Dr. Nihal BUZKAN ÜYE.. Bayram ÇEVİK ÜYE Bu Tez Enstitümüz Bitki Koruma Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2007D28 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ DOĞU AKDENİZ BÖLGESİ NDE YETİŞTİRİLEN BAZI KIŞLIK SEBZELERDE HASTALIK YAPAN VİRÜSLERİN TANILANMASI ve KARAKTERİZASYONU BİLGE ALAN ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI Danışman : Yrd. Doç. Dr. Muharrem A. KAMBEROĞLU Yıl: 2012, Sayfa:134 Jüri : Yrd. Doç. Dr. Muharrem A. KAMBEROĞLU : Prof. Dr. Mukaddes KAYIM : Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR : Doç. Dr. Nihal BUZKAN : Doç. Dr. Bayram ÇEVİK Çalışma, yılları arasında Doğu Akdeniz Bölgesi nde yetiştirilen bazı kışlık sebzelerde (marul, ıspanak, lahana, karnabahar, turp) mevcut virüs hastalıklarının saptanması ve yaygınlık oranlarının belirlenmesi amacıyla yürütülmüştür. Surveylerde, simptomatolojik olarak, CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, CaMV, RaMV, BWYV, BCTV, BtMV, LBVV ve LiYV ile infekteli olduğundan şüphelenilen 808 marul, 330 lahana, 137 karnabahar, 225 ıspanak, 65 turp bitkisinden toplam 1595 örnek alınmış ve ELISA yöntemi ile testlenmiştir. Marulda, MiLBVV, LMV, TSWV, CMV, BWYV sırasıyla 380, 82, 3, 3, 3 bitkide; ıspanakta BWYV, CMV sırasıyla, 90, 3 bitkide, turpta BWYV, CMV, TuMV sırasıyla 11, 6, 3 bitkide saptanırken, lahana örneklerinden 10 tanesi TuMV, karnabahar örneklerinden 1 tanesi de CaMV ile infekteli bulunmuştur. Testlenen örneklerden 595 inin en az bir virüs ile bulaşık olduğu saptanmış ve infeksiyon oranı %37.3 olarak hesaplanmıştır. RT-PCR çalışmalarında beklenen band büyüklükleri elde edilmiştir. Dizi analizleri sonucunda, çalışmada kullanılan CMV izolatı, Güney Kore, Japonya, Çin izolatları ile % 44; TSWV izolatı Yunanistan, Sırbistan, Güney Kore izolatları ile % 96; TuMV izolatı Çin izolatı ile %84; LMV izolatı Amerika izolatı ile %99; MiLBVV izolatı Hollanda izolatı ile % 98; CaMV izolatı, Çin izolatı ile %95; BWYV izolatı Çin izolatı ile %89; LBVV izolatı ise, İspanya izolatı ile %95 oranında ile benzerlik göstermiştir. Anahtar kelimeler: Kışlık Sebzeler, DAS-ELISA, Mekanik İnokulasyon, RT-PCR, Dizi Analizi I

4 ABSTRACT PhD THESIS IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF VIRUSES CAUSING DISEASE IN SOME WINTER VEGETABLES GROWN IN THE EASTERN MEDITERRANEAN REGION Bilge ALAN UNIVERSITY OF CUKUROVA INSTITUTE OF BASIC AND APPLIED SCIENCE DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION Supervisor : Asst. Prof. Muharrem Arap KAMBEROGLU Year: 2012, Pages: 134 Jury : Asst. Prof. Muharrem Arap KAMBEROGLU : Prof. Dr. Mukaddes KAYIM : Assoc. Prof. Dr. Yıldız AKA KACAR : Assoc. Prof. Nihal BUZKAN : Assoc. Prof. Bayram CEVİK This study was carried out to detect the viruses and determine their prevalence on winter vegetable species (lettuce, spinach, cabbage, cauliflower, radish) cultivated in the Eastern Mediterranean region between Samples were taken from 808 lettuce, 330 cabbage, 225 spinach, 65 radishes and 137 cauliflower plants suspected of being infected with CMV, TSWV, TuMV, BWYV, LMV, LBVV, CaMV, RaMV, LiYV, BtMV, or BCTV. Totally 1595 plant samples were tested by ELISA. MiLBVV, LMV, TSWV, CMV, and BWYV were detected in 380, 82, 3, 3, 3 of lettuce samples respectively. BWYV and CMV were detected in 90 and 3 of spinach samples, respectively. BWYV, CMV, TuMV were detected in 11, 6, 3 of radish plants respectively. In addition, 10 cabbage and one cauliflower plants were found to be infected with TuMV and CaMV respectively. At least one virus was detected in 595 samples and infection rate of tested plants was 37.3 %. Expected sizes of DNA bands were obtained from RT PCR studies. Sequence analysis of CMV isolate used in this study showed 44% similarity with isolates from South Korea, Japan, and China; TSWV isolate showed 96% similarity with isolates from Greece, Serbia, and South Korea; TuMV isolate showed 84% similarity with a Chinese isolate; LMV isolate showed 99% similarity with an American isolate; MiLBVV isolate 98% with and isolate rom Netherland; CaMV isolate showed 95% similarity with a Chinese isolate, BWYV isolate showed 89% similarity with a Chinese isolate; and LBVV isolate showed 95% similarity with an isolate from Spain. Key Words: Winter Vegetables, Mechanical Inoculation, DAS-ELISA, RT-PCR, Sequence Analysis II

5 TEŞEKKÜR Çalışmalarımın yürütülmesinde beni yönlendiren danışman hocam Sayın Yard. Doç. Dr. Muharrem Arap KAMBEROĞLU na teşekkür ederim. Çalışmalarımda bilgi ve deneyimleri ile yardımcı ve destek olan Sayın Mehmet Asil YILMAZ a teşekkür ederim. Çalışmalarımın her aşamasında bilgi ve deneyimleri ile bana özveriyle yardımcı ve destek olan Sayın Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU na teşekkür ederim. Doktora tezi jüri ve tez izleme komitesi üyeleri Sayın Prof. Dr. Kazım ABAK, Sayın Prof. Dr. Mukaddes KAYIM, Sayın Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR, Sayın Doç. Dr. Nihal BUZKAN ve Sayın Doç. Dr. Bayram ÇEVİK e çalışmamda yapıcı, yönlendirici ve olumlu katkılarından dolayı teşekkür ederim. Laboratuar çalışmalarımdaki yardımlarından ve manevi destekleri ile her zaman yanımda olan Dr. Hakan FİDAN, Dr. Behçet Kemal ÇAĞLAR ve Zir. Yük. Müh. A. Dilara ÇETİNKIRAN a teşekkür ederim. Hayatımın her aşamasında olduğu gibi doktora çalışmalarım sırasında da maddi ve manevi hiçbir desteğini esirgemeyen ve beni destekleyen ailemin tüm fertlerine, gösterdikleri büyük sabırdan dolayı eşim Haşim ALAN ve kızım Defne Berra ALAN a teşekkür ederim. Projemin yürütülmesinde çalışmalarıma maddi olanak sağlayan Ç.Ü. Araştırma Fonuna teşekkür ederim III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ.....I ABSTRACT....II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VIII ŞEKİLLER DİZİNİ....X SİMGELER VE KISALTMALAR...XIV 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hıyar Mozaik Virüsü (Cucumber mosaic virus, CMV) Domates Lekeli Solgunluk Virüsü (Tomato spotted wilt virus, TSWV Şalgam Mozaik Virüsü (Turnip mosaic virus, TuMV) Marul Mozaik Virüsü (Lettuce mosaic virus, LMV) Marul iri damar virüsü (Miraflori Lettuce big vein virus, LBVV) Karnabahar Mozaik Virüsü (Cauliflower mosaic virus, CaMV) Turp Mozaik Virüsü (Radish mosaic virus, RaMV) Şekerpancarı Batı Sarılık Virüsü (Beet western yellow virus, BWYV) Şekerpancarı Tepe Kıvırcıklık Virüsü (Beet curly top virus, BCTV) Şekerpancarı Mozaik Virüsü (Beet mosaic virus, BtMV) Marul Bulaşıcı Sarılık Virüsü (Lettuce infection yellow virus, LIYV) Türkiye de Yapılan Çalışmalar MATERYAL VE METOD Materyal Survey Alanı ve Çalışma Materyali Hakkında Bilgiler Serolojik Çalışmalarda Kullanılan Materyal Mekanik İnokulasyon Çalışmalarında Kullanılan Materyal Toplam Nükleik Asit İzolasyon Çalışmalarında Kullanılan Materyal IV

7 RT-PCR ve PCR Çalışmalarında Kullanılan Materyal Agaroz Jel Elektroforez Çalışmalarında Kullanılan Materyal Metod Survey Çalışmaları, Bitki Örneklerinin Toplanması ve Muhafazası İndikatör Bitkilerin Yetiştirilmesi Serolojik Çalışmalar DAS-ELISA Mekanik İnokulasyon Yöntemi Toplam Nükleik Asit İzolasyonu RT- PCR ve PCR Çalışmaları Agarose Gel Elektroforez Çalışmaları Dizi Analizleri ve Filogenetik Sınıflandırma Çalışmaları BULGULAR VE TARTIŞMA Survey ve Örnekleme Çalışmaları DAS-ELISA Mekanik İnokulasyon Çalışmaları Toplam Nükleik Asit İzolasyon Çalışmaları RT-PCR ve PCR Çalışmaları Dizi Belirleme ve Filogenetik Sınıflandırma Çalışmaları Hıyar Mozaik Virüsü (CMV) Dizi Analizi Çalışması Domates Lekeli Solgunluk Virüsü (TSWV) Dizi Analizi Çalışması Şalgam Mozaik Virüsü (TuMV) Dizi Analizi Çalışması Marul Mozaik Virüsü (LMV) Dizi Analizi Çalışması Marul İri Damar Virüsü (MİLBVV) Dizi Analizi Çalışması Marul İri Damar Virüsü (LBVV) Dizi Analizi Çalışması Karnabahar Mozaik Virüsü (CaMV) Dizi Analizi Çalışması BWYV Şekerpancarı Batı Sarılık Virüsü (BWYV) Dizi Analizi Çalışması V

8 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ EKLER VI

9 VII

13 VII

17 VII

21 VII

22 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. Kışlık olarak yetiştirilen bazı sebzelerin türleri ve familyası... 1 Çizelge 1.2. Dünyada kışlık sebze (marul, ıspanak, karnabahar, lahana ve turp) üretiminin ülkelere göre dağılımı (FAO, 2008)... 3 Çizelge 1.3. Kışlık sebzelerin (marul, ıspanak, karnabahar, lahana ve turp) Türkiye üretim miktarı ve Adana, Mersin, Hatay, Osmaniye ve Kahramanmaraş illerine dağılımı (TUİK, 2009)... 5 Çizelge 1.4. Marul bitkisinde görülen hastalık yapan bazı viral etmenler... 7 Çizelge 1.5. Lahana, karnabahar ve turp bitkisinde görülen hastalık yapan bazı viral etmenler... 7 Çizelge 1.6. Ispanak bitkisinde görülen hastalık yapan bazı viral etmenler... 8 Çizelge 3.1. Survey yapılan il ve ilçeler, survey alanlarının büyüklüğü (da) ve örneklenen bitki sayıları Çizelge 3.2. Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanılan test bitkileri ve testlenen virüsler Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan primer çiftleri ve çoğaltılan bölgenin moleküler büyüklüğü Çizelge 3.4. Surveylerde kışlık sebzelerde aranan simptomlar Çizelge 3.5. PCR ve RT-PCR çalışmalarında kullanılan virüs izolatları, survey alanı bitki türü Çizelge 3.6. RT-PCR ve PCR çalışmasında kullanılan sıcaklık döngüleri Çizelge 3.7. Dizi belirleme çalışmalarında kullanılan virüs, izolat, survey alanı ve bitki türü Çizelge 4.1. Marul ve lahana survey alanı (da), testlenen ve infekteli bulunan bitki sayıları Çizelge 4.2. Karnabahar, ıspanak ve turp survey alanı (da), testlenen ve infekteli bulunan bitki sayıları Çizelge 4.3. ELISA da testlenen örneklerde saptanan virüsler ve bulaşıklık oranları VIII

23 Çizelge 4.4. Mekanik inokulasyon yapılan indikatör bitkiler ve gözlenen simptomlar Çizelge 4.5. NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen RNA-Polimeraz gen dizisine göre CMV-I izolatının dünya izolatları ile benzerlik oranları Çizelge 4.6. NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen kılıf protein gen dizisine göre TSWV-1 izolatının dünya izolatları ile benzerlik oranları Çizelge 4.7. NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen kılıf protein gen dizisine göre TuMV-T izolatının dünya izolatları ile benzerlik oranları Çizelge 4.8. NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen kılıf protein gen dizisine göre LMV-4 izolatının dünya izolatları ile benzerlik oranları Çizelge 4.9. NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen kılıf protein gen dizisine göre MiLBVV-4 izolatının dünya izolatları ile benzerlik oranları Çizelge NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen kılıf protein gen dizisine göre LBVV-2 izolatının dünya izolatları ile benzerlik oranları100 Çizelge NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen kılıf protein gen dizisine göre CaMV-1 izolatının dünya izolatları ile benzerlik oranları Çizelge NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen tamamlayıcı gen dizisine göre BWYV-Tizolatının dünya izolatları ile benzerlik oranları IX

24 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 4.1. Marul, lahana, turp, karnabahar, ıspanak örnek sayıları ve yüzde oranları Şekil 4.2. (A, B, C, D) MiLBVV ile infekteli marul yapraklarında renk koyulaşması, damar açılması ve şekil bozukluğu, Şekil 4.3. (A, B, C, D) LMV ile infekteli marullarda sarama, yapraklarda kabarcıklar, şekil bozukluğu ve mozaik simptomları Şekil 4.4. (A) CMV ve MiLBVV karışık infeksiyonunda marul yapraklarında damar açılması ve sararma (B) MiLBVV ve LBVV ile infekteli marul yapraklarında şekil bozukluğu, nekroz ve damar açılması (C) TSWV ile infekteli marul yapraklarında nekrotik lezyonlar (D) TSWV ile infekteli marul yapraklarında nekroz (E) CMV ile infekteli marul yapraklarında şekil bozukluğu ve sararma (F) BWYV ile infekteli marulda sararma, şekil bozukluğu ve gelişme geriliği Şekil 4.5. (A) BWYV ile infekteli turp yaprağında sararma (B) TuMV ve BWYV ile infekteli turp yaprağında mozaik (C) TuMV ve BWYV ile infekteli turp yaprağında mozaik (D) TuMV ve BWYV ile infekteli turp yaprağında mozaik ve sararma (E) TuMV ve BWYV ile infekteli turp yaprağında şekil bozukluğu ve mozaik (F) CMV ve BWYV infekteli turp yaprağında şekil bozukluğu ve mozaik Şekil 4.6. (A, B) BWYV ile infekteli ıspanak da sararma ve gelişme geriliği (C) CMV ile infekteli ıspanak yapraklarında şekil bozukluğu (D) CMV ile infekteli ıspanak yaprağında mozaik, sararma ve şekil bozukluğu Şekil 4.7. (A) TuMV ile infekteli K. lahana yaprağında halkalı lekeler (B) TuMV ile infekteli lahana yaprağında mozaik, sararma ve damar bandlaşması (C) CaMV ile infekteli karnabahar yaprağında mozaik ve damar açılması (D) TuMV ile infekteli lahana yapraklarında mozaik ve sararma Şekil 4.8. CMV ile infekteli (A) N. tabacum L. cv. Xanthi nc yapraklarında mozaik (B) N. tabacum L. cv. Xanthi nc yapraklarında şekil bozukluğu (C) N. rustica yapraklarında mozaik (D) kabak yapraklarında mozaik X

25 Şekil 4.9. CMV ile infekteli A) C. amaranticolor yapraklarında klorotik lokal lezyon (B) N. benthamiana yapraklarında sararma (C) N. tabacum L. cv. Samsun yapraklarında mozaik (D) N glutinosa yapraklarında şekil bozukluğu Şekil LMV ile infekteli (A) marul yaprağında mozaik, (B, C) C. amaranticolor yapraklarında klorotik lokal lezyon (D) C. amaranticolor da nekrotik lokal lezyon Şekil MiLBVV infekteli marul yaprağında. (A) damar bandlaşması, mozaik ve sararma (B) MiLBVV infekteli marul yapraklarında sararma, mozaik, damar bandlaşması ve daralma Şekil TSWV ile infekteli A) N. tabacum L. cv. Xanthi yaprağında meşe yaprağı deseni ve şekil bozukluğu (B) N. tabacum L. cv. Xanthi yaprağında nekrotik lokal lezyonlar (C) N. tabacum L. cv. Samsun yaprağında nekrotik lokal lezyonlar ve halkalı lekeler (D) N. tabacum L. cv. Samsun yaprağında halkalı lekeler (E) N. tabacum L. cv. Xanthi nc yaprağında nekrotik lokal lezyonlar (F) C. quinoa da klorotik lokal lezyonlar Şekil CaMV ile infekteli (A) karnabahar yapraklarında mozaik (B) lahana yapraklarında mozaik Şekil TuMV ile infekteli C. amaranticolor yapraklarında klorotik lokal lezyon Şekil LBVV e spesifik primer çifti kullanılarak yapılan Mersin ve Hatay illerine ait marul izolatları RT-PCR sonuçları (M; 50 bç DNA ladder A;LBVV-1, B;LBVV-2, C;LBVV-3, D;LBVV-4, E;LBVV-5, F; LBVV- 6) Şekil MiLBVV ye ait primer çifti kullanılarak yapılan Mersin, Adana, Hatay illerine ait marul izolatları RT-PCR sonuçları (M; 50 bç DNA ladder, A;MiLBVV-1, B;MiLBVV-2, C;MiLBVV-3, D;MiLBVV-4, E;MiLBVV-5, F;MiLBVV-6) XI

26 Şekil LMV ye ait primer çiftleri ve Mersin, Adana, Hatay illerine ait marul izolatları ile yapılan RT-PCR sonuçları (M; 50 bç DNA ladder, A- B;LMV-1, C-D;LMV-2, E-F;LMV-3) Şekil CMV ve TSWV ye ait primer çiftleri ve CMV-turp, CMV-ıspanak, CMV marul ve TSWV-marul izolatları ile yapılan RT-PCR sonuçları (M;1kb DNA ladder, A;CMV-T1, B;CMV-T2, C;CMV-I D;CMV-M, E;TSWV- 1, F;TSWV-2, G;TSWV-3) Şekil CaMV, TuMV ve BWYV e ait primer çiftleri ile yapılan RT-PCR sonuçları (M; 50bç DKA ladder, A;CaMV, B;TuMV-T, C;TuMV-L izolatı, D;BWYV-M, E;BWYV-T, F;BWYV-I) Şekil CMV nin izolatının farklı üretim bölgelerinden (Japonya, Çin, G.Kore, Macaristan, Polonya, Avusturalya, İspanya, Amerika) CMV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı) Şekil TSWV-1 izolatının farklı üretim bölgelerinden (Yunanistan, Sırbistan, G. Kore, Endonezya, Fransa, Çin, Hollanda) TSWV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı(boostrap 100 tekrarlamalı) Şekil TuMV-T izolatının farklı üretim bölgelerinden (Japonya, Vietnam, Çin, İngiltere, YeniZelanda, Tayvan) TuMV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı) Şekil LMV izolatının farklı üretim bölgelerinden (Amerika, Fransa, Brezilya, Çin, İsrail) LMV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı) Şekil MiLBV-4 izolatının farklı üretim bölgelerinden (Avusturalya, İspanya, Almanya, Hollanda) MiLBVV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı) Şekil LBVV-2 izolatının farklı üretim bölgelerinden (Avusturalya, Japonya, Brezilya, İspanya,İngiltere) LBVV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı) Şekil CaMV-1 izolatının farklı üretim bölgelerinden (Çin, Fransa) CaMV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı) XII

27 Şekil BWYV-T izolatının farklı üretim bölgelerinden (Çin, Fransa) BWYV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı) XIII

28 SİMGELER VE KISALTMALAR µl : Mikrolitre C : Santigrad derece A : Adenin (Adenine) AMV : Yonca mozaik virüsü (Alfalfa mosaic virus) APS : Amonyuım persulfat (Ammonium persülfate) BBWV : Bakla solgunluk virüsü (Broad bean wilt virus) BCTV : Şeker pancarı tepe kıvırcıklık virüsü (Beet curly top virus) BLAST : Basic local aligment search tool BMCTV : Şeker pancarı hafif kıvırcıklık virüsü (Beet mild curly top virus) BMYV : Şeker pancarı hafif sararma virüsü (Beet mild yellowing virüs) BNYVV : Pancar nekrotik sarı damar virüsü (Beet necrotic yellow vein virus) Bp : Baz çifti (Base pair) BPYV : Şeker pancarı yalancı sarılık virüsü (Beet pseudo-yellows virus) BSA : Bovine serum albumin BSCTV : Şeker pancarı şiddetli sararma virüsü (Beet severe curly top virus) BtMV : Şeker mozaik virüsü (Beet mosaic virus) BWYV : Şeker pancarı sarılık virüsü (Beet western yellow virus) BYV : Şeker sarılık virüsü (Beet yellow virüs) C : Sitozin (Cytosine) CaMV : Karnabahar mozaik virüsü (Cauliflower mosaic virus) cdna : Komplementer Deoksiribonükleikasid CMV : Hıyar mozaik virüsü (Cucumber mosaic virus) CP : Kılıf protein (Coat protein) CYSDV : Kabakgillerde sarı yanıklar oluşturan virüs (Cucurbit yellow stunting disorder virus) XIV

29 Da : Dalton datp : Deoksiadenozintrifosfat dctp : Deoksisitidintrifosfat dd : Çift distile dgtp : Deoksiguanozintrifosfat DİECA-Na : Sodyum dietildithiocarbomat DNA : Deoksiribonükleikasid dntp : Deoksinükleotidtrifosfat dsrna : Çift iplikli (Double stranded) DTT : Dithiothreitol EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid EG : Elektroforez buffer ELISA : Enzim-linked ımmunosorbent assay G : Guanin (Guanine) gr : Gram H2O : Su Kb : Kilo baz (Kilo base) kda : Kilo dalton LBVV : Marul iri damar virüsü (Lettuce big vein virus) LMV : Marul mozaik virüsü (Lettuce mosaic virus) Lt : Litre M : Molarite mg : Miligram MiLBVV : Marul iri damar virüsü (Miraflori lettuce big vein virus) ml : Mililitre mm : Milimolar M-MLV : Moloney murine leukemia virus Mol : Mol MW : Molekül ağırlığı NaDİECA : Sodium N, N-Diethylidithiocarbamate, Trihydrate NCBI : The national center for biotechnology ınformation XV

30 Nm : Nanometre PAGE : Polyacrilamid jel elektroforez PBNS : Yerfıstıgı tomurcuk nekroz virüsü (Peanut bud necrosis virus) PBS : Fosfat tuz tampon çözeltisi (Phosphate buffered saline) PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu (Polimeraz chain reaction) PEG : Polietilen Glikol ph : Hidrojen iyonu konsantrasyonu Pmol : Pikomol Pr : Primer PVX : patates x virüsü (Potato virus X) RaMV : Turp mozaik virüsü (Radish Mosaic Virus) RNA : Ribonükleik asit RNAaz : Ribonükleaz Rpm : Dakikadaki devir sayısı RT : Tersine transkripsiyon (Reverse transcription) T : Timin (Thymine) TAE : Tris Asetik Asit Taq : Taq polimeraz (Taq Polymerase) TCV : Turnip crinkle virus TE : Tris EDTA Tm : Termal erime. TMV : Tütün mozaik virüsü (Tobacco mosaic virus) ToMV : Domates mozaik virüsü (Tomato mosaic virus) TRoV : Şalgam rozetleşme virüsü (Turnip rosette virus) TStV : Tütün bodurluk virüsü (Tobacco stunt virus) TSWV : Domates lekeli solgunluk virüsü (Tomato spotted wilt virus) TuMV : Şalgam mozaik virüsü (Turnip mosaic virus) TYMV : Şalgam sararma mozaik virüsü (Turnip yellow mosaic virus) u : Ünite V : Hacim W/V : Ağırlık/Hacim XVI

31 1.GİRİŞ Bilge ALAN 1. GİRİŞ Türkiye de önemli bir yere sahip olan sebze tarımı, günümüz ülke nüfusunun yılda ortalama %2 civarında artmaya devam etmesiyle daha da önem kazanmıştır. Bugün, insan yaşamı için dengeli beslenmenin sebzesiz olamayacağı, sağlıklı ve dengeli beslenmenin ana unsurlarından birinin sebze tüketimi olduğu herkes tarafından bilinmektedir. Bu sebeple sebze üretiminde en iyi, en yüksek verim ve kalite yakalama çalışmaları ve bunun için yapılan geliştirme faaliyetleri, dünyada ve ülkemizde çok hızlı bir şekilde ilerlemeye devam etmektedir. Hem işlenerek, hem de taze olarak değerlendirilen tek veya çok yıllık otsu bitkiler olan sebzelerin, kök, gövde, sürgün, yaprak, çiçek, meyve ve tohum gibi bütün kısımları gıda kaynağıdır. Doyurucu özellikleri nedeniyle önemli bir diyet yiyeceği olan sebzeler, düşük yağ içeriğine sahip olup, vitamin, mineral madde, karbonhidrat ve protein kaynağıdır. Marul, lahana, karnabahar, turp ve ıspanak günümüzde Türkiye dâhil olmak üzere dünyanın birçok ülkesinde yaygın olarak yetiştiriciliği yapılan kış sebzeleridir (Çizelge 1.1). Bu sebzeler ülkemizin kışın çok soğuk veya çok yağış alan kısımlar hariç diğer bölgelerinde rahatlıkla üretilmektedir. Çizelge 1.1. Kışlık olarak yetiştirilen bazı sebzelerin türleri ve familyası Sebze Türleri Bitki Türleri Familya Marul Lactuca sativa Asteraceae Lahana Brassica oleracea var. capitata Brassicacea Karnabahar Brassica oleracea var. botrytis Brassicacea Turp Raphanus sativus Brassicacea Ispanak Spinacia oleracea Amaranthaceae Yılın her mevsiminde salatalarımızın lezzetli ve besleyici öğesi olan marul, Asteraceae familyası içerisinde, yaprağı yenilen, içerdiği A ve C vitaminleri ve mineral maddeler ile iştah açıcı sebzeler grubunda bulunan ve bol miktarda tüketilen bir sebzedir. Türkiye, dünya marul üretiminde önemli bir ülke konumundadır. Ülkemizde hemen hemen tüm bölgelerde evlerin bahçelerinde yetiştirilen marulun, 1

32 1.GİRİŞ Bilge ALAN ticari boyutta üretimi ise Ege, Marmara ve Akdeniz bölgelerinde haziran-ağustos arasındaki aylar hariç yılın her mevsiminde yapılmaktadır (Polat, 2001) Brassicacea familyası içerisinde yer alan yaprağı tüketilen lahana, yumrusu tüketilen turp ve çiçeği tüketilen karnabahar sebzeleri içerisindeki lahananın büyük bir kısmı Karadeniz bölgesinde üretilmektedir (Saygılı, 2005). Yıllık veya iki yıllık kültür bitkilerinden olan turp, diğer ülkelerde olduğu gibi ülkemizde de geniş alanlarda yetiştirilmekte ve yıl boyunca tüketilmektedir (megep.meb.gov.tr). Soğuk bölgelerimizde, sebze olarak değerlendirilen kısımları zarar gördüğü için karnabaharın üretimi kısıtlanmakla beraber üretim miktarı yıllara göre değişiklik göstermektedir (bilgi.sitesi.web.tr). Amaranthaceae familyasından olan ıspanak, yaprağı etli koyu parlak yeşil, sarımsı yeşil çok sayıda çiçekli tek yıllık otsu bir bitkidir. Asya kıtasının orta ve güneybatı bölgelerinin yerlisi olan bu bitki dünyanın birçok farklı bölgesinde gıda olarak tüketilmektedir (tr.wikipedia.org). Ülkemizde ise sadece aşırı yağış alan Doğu Karadeniz Bölgesi nde çok sınırlı olmak üzere, bunun dışındaki bütün bölgelerimizde büyük miktarlarda üretilen bir sebzedir ( Türkiye, yaklaşık da alanda tonluk sebze üretimi ile dünyada ilk 4 ülke arasında yer almış ve üretimin yaklaşık % 87 si açıkta % 13 ü, örtü altında gerçekleşmiştir. Bu sebzeler içerisinde lahana bitkisi ton ve marul bitkisi tonluk üretim ile başı çekmiştir (TÜİK, 2010) yılı verilerine göre, dünyada toplam marul, lahana, karnabahar, ıspanak ve turp üretim miktarı ve ülkelere göre dağılımı Çizelge 1.2 de verilmiştir. 2

33 1.GİRİŞ Bilge ALAN Çizelge 1.2. Dünyada kışlık sebze (marul, ıspanak, karnabahar, lahana ve turp) üretiminin ülkelere göre dağılımı (FAO, 2008) MARUL Ülke Üretim (MT) 1 Çin Amerika İspanya Italya Hindistan Japonya Türkiye Fransa Almanya Meksika Dünya KARNABAHAR Ülke Üretim (MT) 1 Çin Hindistan Italya İspanya Fransa Meksika Amerika Polonya Pakistan Türkiye Dünya LAHANA Ülke Üretim (MT) 1 Çin Amerika Japonya Türkiye Endonezya Fransa Italya Kore Belçika Pakistan Dünya LAHANA Ülke Üretim (MT) 1 Çin Hindistan Kore Rusya Japonya Endonezya Polonya Amerika Romanya Türkiye Dünya TURP Ülke Üretim (MT) 1 Habeşistan Pakistan Güney Batı Afrika Endonezya Papua Yeni Gine Peru Meksika Türkiye Nepal Kolombiya Dünya

34 1.GİRİŞ Bilge ALAN Çizelge 1.2 ye göre; dünyada toplam ha lık alanda ton marul üretilmiştir ( ton/ha). Dünya marul üretimi sıralamasında ton üretim ile Çin ilk sırada, Türkiye ton üretimle 7. sırada yer almıştır. Karnabahar yetiştiriciliği ise, dünyada ha lık alanda yapılmış ve üretim ton civarında olmuştur ( ton/ha). Karnabahar üretiminde Çin ton ile dünyada birinci sırada bulunurken, Türkiye ton üretimle 14. sırada yer almıştır. Ispanak üretim miktarı ,727 ton olup, bu üretim ha alanda gerçekleştirilmiştir ( ton/ha). Çin ton üretimle dünyada birinci sırada yer alırken, Türkiye ton ile 4. sırada yer almıştır. Lahana ha alanda ton üretilmiştir ( ton/ha). Lahana üretiminde, Çin ton üretimle 1. sırada yer almış Türkiye ise ton üretim ile 17. sırada yer almıştır. Turp ha lık bir alanda ton üretilmiş ( ton/ha) ve ton üretimle Habeşistan birinci sırada yer almıştır. Türkiye ise ton üretim ile 8. sırada yer almıştır. 4

35 1.GİRİŞ Bilge ALAN 5

36 1.GİRİŞ Bilge ALAN 2009 verilerine göre, Akdeniz Bölgesi nde turp un yoğun olarak yetiştirilmesi nedeniyle, Osmaniye ili kışlık sebze üretiminde ilk sırada yer almış ve bunu sırası ile Mersin, Hatay, Adana ve Kahramanmaraş illeri izlemiştir. Marul, lahana, karnabahar en fazla Mersin de üretilirken, ıspanak üretimi en fazla Hatay da, turp üretimi ise, en fazla Osmaniye de yapılmıştır. Osmaniye ve Kahramanmaraş da ekonomik anlamda karnabahar üretimi gerçekleşmemiştir (Çizelge 1.3). Kışlık sebzelerde hastalık yapan birçok hastalık ve zararlı etmen bulunmaktadır. Bunlar içerisinde viral etmenler, bitkiden bitkiye mekanik yollarla kolaylıkla bulaşabilmesi, tohum veya vejetatif üretim materyalleri veya vektörler aracılığıyla çok daha geniş alanlara kısa sürede yayılması ve özellikle diğer etmenlerde olduğu gibi bunlara karşı kullanılabilecek etkili bir kimyasal mücadele yönteminin bulunmaması nedeni ile ayrıca bir öneme sahiptirler. Bu yüzden bitkilerde hastalığa neden olan viral etmenler ile mücadele stratejisi olarak öncelikle etmenin saptanması, tanılanması ve yayılma yollarının ortaya konulması ve bunların sonucunda da etmene karşı alınacak kültürel, fiziksel önlemlerin belirlenmesi gerekmektedir. Geniş alanlarda yetiştiriciliği yapılan ve yıllık üretim miktarı ile sebzeler içerisinde ilk sıralarda yer alan marul, lahana, ıspanak, karnabahar ve turp sebzeleri üzerinde de ekonomik olarak az ya da çok önemli çeşitli viral hastalık etmeninin varlığı bildirilmiştir (Çizelge 1.4, 1.5, 1.6). 6

37 1.GİRİŞ Bilge ALAN Çizelge Marul bitkisinde görülen hastalık yapan bazı viral etmenler Viral etmenler Türkçesi Alfalfa mosaic virus, AMV Beet western yellows virus, BWYV Beet yellow stunt virus, BYSV Bidens mosaic virus, BMV Broad bean wilt virus, BBWV Cucumber mosaic virus, CMV Lettuce big vein virus, LBVV Lettuce ınfectious yellows virus, LİYV Lettuce mosaic virus, LMV Lettuce necrotic stunt virus, LNSV Lettuce necrotic yellows virus, LNYV Lettuce speckles mottle virus, LSMV Sowthistle yellow vein virus, SYVV Tobacco rattle virus, ToRV Tobacco ringspot virus, ToRV Tomato spotted wilt virus, TSWV Turnip mosaic virus, TuMV Yonca mozaik virüsü Şekerpancarı batı sarılık virüsü Şekerpancarı sarı bodurluk virüsü Bidens mozaik virüsü Bakla solgunluk virüsü Hıyar mozaik virüsü Marul iri damar virüsü Marul bulasıcı sarılık virüsü Marul mozaik virüsü Marul nekrotik bodurluk virüsü Marul nekrotik sarılık virüsü Marul nokta beneklenme virüsü Sowthistle sarı damar virüsü Tütün rattle virüsü Tütün halkalı leke virüsü Domates lekeli solgunluk virüsü Şalgam mozaik virüsü Çizelge 1.5. Lahana, karnabahar ve turp bitkisinde görülen hastalık yapan bazı viral etmenler Viral etmenler Türkçesi Beet western yellows virus, BWYV Şekerpancarı batı sarılık virüsü Cauliflower mosaic virus, CaMV Radish mosaic virus, RaMV Turnip mosaic virus, TuMV Karnabahar mozaik virüsü Turp mozaik virüsü Şalgam mozaik virüsü 7

38 1.GİRİŞ Bilge ALAN Çizelge 1.6. Ispanak bitkisinde görülen hastalık yapan bazı viral etmenler Viral etmenler Türkçesi Beet curly top virus, BCTV Beet mosaic virus, BtMV Beet western yellow virus, BWYV Broad bean wilt virus, BBWV Cucumber mosaic virus, CMV Lettuce mosaic virus, LMV Lettuce speckles mottle virus, LSMV Tobacco mosaic virus, TMV Tomato spotted wilt virus, TSWV Turnip mosaic virus, TuMV Şekerpancarı tepe kıvırcıklık virüsü Şekerpancarı mozaik virüsü Şekerpancarı batı sarılık virüsü Bakla solgunluk virüsü Hıyar mozaik virüsü Marul mozaik virüsü Marul nokta beneklenme virüsü Tütün mozaik virüsü Domates lekeli solgunluk virüsü Şalgam mozaik virüsü Bu virüsler içerisinde LMV, LBVV, TuMV, BWYV, TSWV ve CMV dünyada marul, lahana, karnabahar, ıspanak, turp gibi birçok bitkide yaygın olarak görülmekte ve ekonomik olarak büyük kayıplara sebep olmaktadır. Ülkemizde özellikle kışlık sebzeler üzerinde var olan viral kaynaklı hastalık etmenlerinin saptanması, yaygınlıklarının ortaya konulması ve karakterizasyonu konularında kapsamlı çalışmalar bulunmamaktadır. Daha önce yapılan çalışmalarda bu etmenlerden bazıları saptanmış (Bennett ve Tanrısever, 1957; Fidan ve Türkoğlu, 1988; Döken ve ark., 1993; Güldür ve ark., 1995; Kamberoğlu ve Alan, 2011; Korkmaz ve ark., 2007; Uzunoğulları ve Beşirli, 2011) fakat daha sonra çalışmalar devam etmemiş ve detaylandırılmamıştır. Bu doktora tez çalışmasında, kışlık sebzelerde (marul, ıspanak, lahana, karnabahar ve turp) hastalık yapan virüslerin saptanması ve bulaşıklık oranlarının ortaya konulması amacıyla survey çalışmaları yapılmıştır. Bu örneklerdeki viral etmenler, öncelikle ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ve/veya RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), çalışmaları ile saptanmış ve biyolojik ve moleküler yöntemler kullanılarak karakterize edilmiştir. Dizi analiz sonuçları değerlendirilerek elde edilen virüs izolatları diğer dünyadaki izolatlar ile karşılaştırılarak benzerlik oranları ortaya konulmuştur. 8

39 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Hıyar Mozaik Virüsü (Cucumber mosaic virus, CMV) CMV, ilk olarak hıyar bitkisi üzerinde (Cucumis sativus) Amerika da Price (1934) tarafından rapor edilmiştir. Dünya da yaygın bir virüstür. Termal inaktivasyon noktası C İn vitroda yaşam süresi 1-10 gündür. Bromaviridae familyasına dâhil olup, Cucumovirus grubundandır. Virionlar izometrik ve zarfsızdır. Genomları doğrusal tek iplikli RNA lardan meydana gelmiştir (Francki ve Habili, 1987). Konukçu bitkilerinin (Cucumis sativus ve diğer cucurbitler, Lycopersicon esculentum, Spinacia oleracea) yapraklarında mozaik, şiddetli sararma, bitkide gelişme geriliği ve verimde azalma meydana getirmektedir. Yaprak bitleri (Acyrthosiphon pisum, Aphis craccivora ve Myzus persicae) ile non persistent olarak, ayrıca tohum ve mekanik yollarla taşınmaktadır. Wilson ve ark. (1985), Teksas ın kış bahçesi alanlarında yetiştirilen ıspanak bitkisinde CMV nin bir izolatını teşhis etmişler ve serolojik olarak CMV nin S ırkı ile çok yakından ilişkili olarak bulunması nedeni ile CMV-S teksas ıspanak izolatı olarak adlandırılmışlardır. Test ettikleri 13 familyanın 12 sinde yetiştirilen bitkilerin ve yabani konukçularının 39 türünün virüs ile infekteli olduğunu belirlemişlerdir. İzolat %23.8 den %47.4 e ulaşan bir oran ile üç ıspanak kültürünü önemli derecede infektelemiş olduğunu saptamışlardır. Takeshita ve Takanami (2000), CMV nin CMV-D8 ırkı nın Japon turpunda sistemik olarak infeksiyon meydana getirirken, CMV-Y ırkı nın sadece lokal infeksiyon oluşturduğunu gözlemişlerdir. Bu ırklar ile infekteli bitkiler TuMV ile tekrar bir infeksiyondan sonra şiddetli sistemik mozaik simptomlar göstermiş, CMV- Y nin sistemik olarak etkili bir şekilde yayılıp biriktiği ve CMV-D8 in de taşınmasının TuMV ile artığını belirtmişlerdir. Soleimani ve ark. (2011), Tahran da 2002 ve 2003 yıllarında yapılan survey çalışmasında il genelinde 452 yaprak örneği toplamışlar, DAS-ELISA yöntemi ile LMV, CMV ve TSWV nin varlığı tespit etmişlerdir. Belirlenen tek infeksiyon oranı 9

40 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN LMV, CMV veya TSWV için sırasıyla % 20,58, 15,93 ve 9,96 olarak belirlenmiştir. Ayrıca örneklerin %15.28 i LMV + CMV, %8.19 u LMV + TSMV ile ve %7.74 i CMV + TSWV ile karışık infeksiyon oluşturduğu ve tüm örneklerin %4.65 ini bu üç virüsün infektelediğini saptamışlardır. Tüm örneklerde ise LMV% 30.54, TSWV% ve CMV%48.69 bulunduğunu belirlemişlerdir. İran da bu çalışma ile maruldaki TSWV ve Tahran da CMV ve LMV ilk olarak rapor edilmiştir Domates Lekeli Solgunluk Virüsü (Tomato spotted wilt virus, TSWV) Domates lekeli solgunluk virüsü (TSWV), 1915 yılında Brittlebank tarafından Avusturalya da domates bitkisi üzerinde tespit edilmiştir. Dünyada yaygın bir virüstür. Tospoviridae familyasındandır. Virionlar izometrik ve etrafı membran yapısında bir protein zarfla çevrili olup 85 nm dir. Genom yapıları tek iplikçikli üç ayrı RNA dan meydana gelmektedir (Gibbs, 1983). Termal inaktivasyon noktası 45 ºC ve İn vitroda yaşam süresi 5 saattir. TSWV, Tysanoptera takımından Thrips tabaci, T. setosus, T. parmi, Frankliniela occidentalis, F. shultzei, F. fusca ve Scirtothrips dorsalis ile perzistent olarak taşınmaktadır (Eckel ve ark., 1996; German ve ark., 1992). Batı çiçek tripsi (F. occidentalis ), TSWV nin en önemli vektörü olarak bildirilmiştir (Ullman ve ark., 1992). Ayrıca, mekanik ve aşı yolu ile taşınma gerçekleşmektedir. TSWV, infeksiyon zamanı ve çevre koşullarına bağlı olarak değişmekle birlikte, bulaşık bitkilerde gelişme geriliği, cüceleşme, genel solgunluk, yaprak ve meyveler üzerinde halkalı lekeler, nekrotik ve klorotik lezyonlar ve genç sürgünlerde geriye doğru ölüm şeklinde simptomlara neden olmaktadır (Güldür ve ark., 1995). Cho ve ark. (1987), Hawaii de yetiştirilen marullarda TSWV nin oldukça yıkıcı bir hastalık olduğunu belirlemişler ve Maui de yılları arasında thrips surveyi yapmışlardır. TSWV nin yoğunluğu ve thrips sayısı, yüksek yerlerdeki üretim yerleriyle karşılaştırıldığında; alçakta (366 m) bulunan bölgelerde daha fazla olduğunu belirtmişlerdir. TSWV nin taşınmasında vektörlük yapan üç thrips (Frankliniella occidentalis, F. scultzei, ve Thrips tabaci) tespit edilmiştir. F. occidentalis 366 m ve 643 m yüksekliklerde yoğun olarak bulunduğu tespit edilirken, 10

41 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN Thrips tabaci nin ise 701 m de yoğun olduğu rapor edilmiştir. Kula da üç tanesi (Neohydatothrips gracilipes, Baileyothrips limbatus ve Scirtothrips inermis) Hawaii için yeni türler olan 23 adet thrips tespit edilmiştir. TSWV nin bir marul izolatı, lila püskül çiçeği (Emilia sonchifolia) bitkisine F. occidentalis ile taşınmıştır. TSWV nin yaygınlığı ile thrips sayısı arasında belirli bir bağlantı tespit edildiği bildirilmiştir.. Cho ve ark. (1989), Hawaii de TSWV nin periodik olarak marulda şiddetli kayıplara neden olduğunu gözlemişler ve bazı yıllar özellikle yaz aylarında maruldaki bu kayıpların %50-90 arasında olduğunu tespit etmişlerdir. Yudin ve ark. (1990), TSWV tarafından infekteli marullarda erken dönemde mücadele yöntemlerinin uygulanmasıyla hastalığın daha çabuk önüne geçilebileceğini savunmuşlardır. Yapılan bu çalışma sonucunda üretim alanında thrips fazlalığının fark edilerek mücadeleye başlanması yerine, daha erken dönemde teşhisin hastalığı kontrol altına almada daha etkili olduğunu ortaya çıkarmışlardır. Kim ve ark. (2004), Korea Yesan (Güney Kore) da kırmızı biber (Capsicum annuum var. grossum) bitkisi yapraklarında nekrotik lekeler ve meyvelerde malformasyon (kusur) gözlemeleri üzerine yaptıkları çalışmada TSWV nü izole etmişler ve Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Petunia hybrida, Nicotiana glutinosa, Gomphrena globosa, ve Physalis floridana bitkilerine infekte etmişlerdir. Domates bitkisini de içeren 10 bitkide sistemik olarak TSWV infeksiyonu gözlemişler ve nükleik asit dizi analizi çalışmalarında TSWV nin N proteini gen bankasında farklı TSWV izolatları ile benzerlik oranlarını kıyaslamışlardır. Bu kıyaslamada sırasıyla % nükleotid ve % aminoasit benzerliği gösterdiğini saptamışlardır. Moreno ve ark. (2004), dünyada lahana ve marulu infektelediği bilinen virüslerin İspanya da mevcut olanlarından en önemlilerini ve bu virüslerin dağılımını belirlemek için sonbahar ve ilkbahar süresince bir survey düzenlemişler, İspanya nın önde marul ve lahana üretilen alanlarında virüs simptomu gösteren ürünlerden ve bazı tek veya çok yıllık yakın faunalarından örnekleri Yonca mozaik virüsü (AMV), Bakla solgunluk virüsü (BBWV- 1), Şeker pancarı batı sarılık virüsü (BWYV), Karnabahar mozaik virüsü (CaMV), Hıyar mozaik virüsü (CMV), Marul mozaik virüsü (LMV), Bezelye tohum kökenli mozaik virüsü (Psbmv), Şalgam 11

42 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN mozaik virüsü (TuMV) ve Domates lekeli solgunluk virüsü (TSWV) ne ve Potyvirüsler e karşı ELISA ile testlemişlerdir ilkbaharında CMV ve LMV marulda en baskın virüsler iken CaMV nin Nawarra da lahana ürünlerinde en önemli virüs olduğunu ve bunu CMV ve BWYV nin takip ettiğini bildirmişlerdir. Kışın ise virüslerin spektrumunun farklı olduğunu belirlemişlerdir; Madrid de marul ürünlerinde Potyvirüsler geniş alanlara yayılmış fakat Murcia alanında TSWV ve BWYV nin en baskın virüsler olduğunu, marulda ortaya çıkarılan baskın potyvirüsün LMV olduğunu, toplanan örneklerin hiçbirinin PSbMV ve TuMV için pozitif olmadığını saptamışlardır. Lahana ürünlerinde, özellikle Navarro alanında sonbahar ve kış ürünlerinde TSWV en çok görülen virüs olarak kaydedilmiştir. Colariccio ve ark. (2005), Brezilya da (Sao Paulo State, Sumare ve Campinas alanlarında), Lettuce cv. veronica üzerinde virüs benzeri belirtiler gözlemişler ve bu şüpheli marul örneklerini kullanılarak elektron mikroskobu, biyolojik, serolojik ve moleküler çalışmalar yapmışlardır. Saptanan örneklerden, marulunda içinde bulunduğu konukçu bitkilere yapılan mekanik inokulasyonlar sonucunda bu bitkiler üzerinde benzer virüs simptomları meydana gelmiştir. Bunun yanı sıra, Gompherena globosa test bitkisinde oluşan lokal lezyon ve sistemik mozaik simptomlarda bazı farklılıklar gözlenmiştir. Yapılan bu çalışmada, Domates klorotik spot virüs (Tomato chlorotic spot virus) ün iki izolatı DAS-ELISA ve RT-PCR ile tespit edilmiş ve gen bankasındaki TCSV dizilimi ile yüksek oranda benzerlik gösterdiği ortaya konulmuştur. Bu çalışma Brezilya da ticari hidroponik marul ürünlerinde bir Tospovirüs den dolayı kayıplara ilişkin ilk bilgi olarak rapor edilmiştir Şalgam Mozaik Virüsü (Turnip mosaic virus, TuMV) Şalgam mozaik virüsü (TuMV) ilk olarak Amerika da lahana bitkisinde (Brassica campestris ssp. chinensis, B. japonica, B. campestris ssp. rapa) Schultz (1921). tarafından rapor edilmiştir Potyvirus grubuna dahil Avusturalya, Çin ve İngiltere başta olmak üzere dünyada yaygın bir virüstür. Termal inaktivasyon noktası 62 C, İn vitro yaşam süresi 3-4 gündür. Virionlar ipliksi ve zarfsızdır (Provvidenti, 1988). 12

43 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN Yaprakbitleri (Myzus persicae ve Brevicoryne brassicae) ile non persistent olarak taşınır. Ayrıca mekanik olarak ve tohumla da taşınmaktadır. Konukçu bitkilerde (Capsella bursa-pastoris, Brassica nigra, Brassica campestris ssp. pekinensis, Stellaria media, Trifolium hybridum, Alliaria officinalis, Calanthe sp., Hesperis matronalis, Brassica campestris ssp. chinensis, B. campestris ssp. rapa, B. japonica) klorotik lokal lezyonlar, yapraklarda mozaik, buruşma simptomları oluşturmaktadır. Lin ve Lian (1983), Taiwan ın merkezinde ve güneyinde lahanagillerde rapor edilmiş olan TuMV yi lahana türlerine ve diğer test bitkilerine mekanik olarak taşımıştır. İnfekteli lahana ve turp bitkilerinde siyah halkalı leke ve mozaik simptomlar gözlemlenmiş, diğer test bitkilerinde ise (şeytan elması, domates, kabak, kavun, marul, fasulye, biber) simptom gözlenmemiştir, TuMV nin turp ırkı karalahana (Brassicao. acephala), başlahana (Botrytis capitata) ve brokoli (Botrytis italica) bitkilerinde de infeksiyon meydana getirmemiştir. Chivasa ve ark. (2001), Harera da yetiştirilen lahana (Brassica oleracea var. capitata) bitkilerinde %90 oranında nekrotik halkalar, çizgiler ve lekeler gözlemiş ve simptomların çok geniş bir alana yayıldığını saptanmışlardır. İnfekteli bitkilerden virüs izole edilmiş ve tek bir kültür lezyonu olduğu düşünülmüştür. C. quinoa bitkisinde TuMV ün tipik simptomları klorotik nekrotik lokal lezyonlar gözlenmiş ve TuMVnin varlığı lahana ve C. quinoa da PAS ELISA (Protein A Sandwich Enzyme Linked-İmminosorbent Assay) ile doğrulanmıştır. Önceden sadece lahana da varlığı bilinen TuMV, yapılan surveyde dikotiledonlardan Amaranthus hybridus, Brassica juncea, Conyza sumatrensis, Galinsoga parviflora, Portulaca oleracea, Sida alba, Sonchus oleraceus ve Hibiscus esculentus; the monokotiledonlardan Commelina bengalensis ve Musa sapientum L., Bidens pilosa ve Cyperus esculentus (monokiledon) de PAS-ELISA da pozitif olarak rapor edilmiştir. Chen ve ark. (2003), Tayvan da zambak (Zantedeschia spp.) bitkisinden iki virüs (RC4 ve YC5) izole etmişler, her iki izolatı mekanik olarak zambak bitkisinin çeşitli hibritlerine taşımışlardır. Yapılan elektron mikroskobu çalışmasında 750 nm büyüklüğünde kıvrımlı partiküllerin varlığını belirlemişlerdir. Turp (TuMV-R) ve lisianthus bitkisinden (TuMV-L) iki TuMV izolat testlenmiş, RC4 ve YC5 antijenleri 13

44 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN ile kuvvetli reaksiyon gösterdiği belirlenmiştir. Klonlama ve dizi analizleri sonucu her iki izolat arasında %95-99 oranında benzerlik saptanmış ve bu bilgiler doğrultusunda zambak bitkisinde TuMV nin doğal infeksiyonu ilk olarak rapor edilmiştir. Yeni Zelanda da ilk olarak 1936 yılında Chamberlain tarafından varlığı saptanan TuMV, Corona, ve ark. (2007), tarafından vektörle taşınma, elektron mikroskopu, mekanik inokulasyon, moleküler ve serolojik yöntemler kullanarak Safran (Crocus sativus), dönbabadön (Erodium moschatum), lobelya (Lobelia speciosa), su teresi (Nasturtium officinale) ve latin çiçeği (Tropaelum majus) ) beş bitkide daha teşhis edilmiştir. Ishikawa-Suehiro (2007), lahanagillerin yıkıcı bir hastalığı olarak bilinen, TuMV ile ilgili yaptıkları çalışmayı iki kısımda gerçekleştirmiştir. Birinci kısım TuMV moleküler ve biyolojik analizler içermekteyken diğer kısımda ise farklı şekilde partiküllere sahip virüslerin ortaya çıkarılması için hızlı ve kolaylaştırılmış bir methodolan RT-PCR ın geliştirilmesini içermiştir. Sanchez ve ark. (2007), İspanya nın farklı alanlarında lahana kültürlerinde TuMV infeksiyonunu ortaya çıkarmışlar ve farklı konukçu bitki türlerinde girit lahanası (Brassica cretica), sazlık lahana (Brassica juncea), kolza (Brassica napus), su teresi (Eruca vesicaria subsp. sativa) ve doğu su teresi (Sisymbrium orientale) beş yeni TuMV izolatını teşhis etmişlerdir. Bu beş izolatın kılıf proteinin (KP) nüleotid dizilimini belirlemişler ve bu KP nükleotidlerinin filogenetik analizleri sonucu izolatların iki farklı küme içinde guruplandığını göstermişlerdir Farzadfar ve ark. (2009) İran ın sekiz bölgesinde lahanagiller için surveyler yapmışlar ve TuMV nin konukçusu olan toplam 532 yabancı ot toplamışlardır. Bu yabancı otları DAS- ELISA ile test etmişler ve 340 örneği (% 64) TuMV ile bulaşık olarak saptamışlardır. Al-Saleh ve ark. (2009), Sudi Arabistan Riyad şehrinde iki bölgede marul ve turp üzerinde beneklenme, kloroz ve mozaik simptomlar gözlemişler ve yapmış oldukları mekanik inokulasyon sonucu turp, marul, roka ve hardal bitkilerinde mozaik simptom, C. amaranticolor da lokal lezyonlar saptamışlardır. Elektron mikroskop çalışması sonucunda Potyvirus e ait kıvrımlı partiküller görülmüştür. 14

45 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN DAS-ELISA ile TuMV varlığı belirlenmiş ve RT-PCR çalışmaları ve dizi analizi sonucunda TuMV-RA-SA gen bankasında diğer izolatlarla % , TuMV-L- SA nın ise diğer izolatlarla % oranında benzerlik gösterdiği belirlemişlerdir. TuMV-RA-SA ve TuMV-L-SA arasında ise %89 benzerlik görülmüştür. Yapılan bu çalışma ile Sudi Arabistan da TuMV marul ve turpda ilk olarak rapor edilmiştir Marul Mozaik Virüsü (Lettuce mosaic virus, LMV) Marul mozaik virüsü (LMV), ilk olarak marul bitkisi (Lactuca sativa) nde Amerika da (Florida) rapor edilmiştir (1921). Potyviridae familyasına bağlı Potyvirus cinsinden tek iplikçikli bir RNA virüsüdür. Virionlar, ipliksi partiküllere sahip ve zarfsızdır. Termal inaktivasyon noktası C, son sulandırma noktası 10-¹ ve 10-2 dir. İn vitro da yaşam süresi 1-2 gündür (Tomlinson, 1970). Bu virüse dünyada marul yetiştirilen tüm bölgelerde rastlamak mümkündür. Çoğunluğu Compositae familyasına ait 21 doğal konukçusu ve 121 tür içinde mekanik olarak taşınabilen (Horvath, 1980) geniş bir konukçu aralığına sahiptir. Marul (Lactuca sativa), ıspanak (Spinacia oleracea) ve bezelye (Pisum sativum) ekonomik anlamda önemli doğal konukçusu olan bitkilerdir. Bunun yanında, Chenopodium album, C. murale, Lamium amplexicaule, Senecio vulgaris, Sonchus asper ve Stellaria media doğada LMV ile infekteli yaygın yabancı otlardan bazılarıdır (Tomlinson, 1982). Birçok kültür bitkisi üzerinde damar açılması, mozaik görünümü, sarı benekler, nekrotik lekeler ve damar nekrozu şeklinde simptom oluşturan LMV nin konukçu dizisi oldukça geniştir (Brunt ve ark., 1996), ve çeşitli dikotiledon familyalarını kapsamaktadır. Bunlardan bezelye (Pisum sativum), nohut (Cicer arietinum), hardal (Sinapis arvensis), ıspanak (Spinacia oleracea), yabani safran (Carthomus tinctarius) ve çeşitli süs bitkilerinde (Osteospermum spp., Gazania spp., Bupleurum falcatum vb.) yaygın olarak görülmektedir. LMV, non persistent olarak doğada 15 yaprak biti türü ile taşınmaktadır. Fransa da ilk ve önemli vektörü şeftali yaprakbiti (Myzus persicae) olarak 15

46 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN belirlenmiştir. Ayrıca patates yaprakbiti (Macrosiphum euphorbiae), marulda sık gözlenen etkili bir vektördür. Pamuk yaprakbiti (Aphis gossypii) güney alanlarda önemli bir yaz vektörü olarak bildirilmiştir (Messiaen ve Lafon, 1965). Ayrıca LMV, mekanik olarak (% 3-10 oranında), tohumla ve polenle de taşınmaktadır. Dünyada potansiyel olarak marulun en yıkıcı virüsü olduğu belirlenmiştir (Dinant ve ark., 1992). Marul bitkisinde ciddi hastalıklara sebep olduğu belirlenen LMV izolatlarının geniş bir biyolojik çeşitlilik göstermekte olduğu Revers ve ark., (1997), tarafından belirlenmiştir. Marul ve LMV arasındaki moleküler ilişkilerin daha iyi anlaşılabilmesi için farklı özellikteki 10 LMV izolatının biyolojik ve moleküler karakterizasyonu yapılarak biyolojik özellikleri belirlenmiştir. Biyolojik özelliklerin karşılaştırılması ile moleküler bilgiler temelinde LMV izolatları üç gruba ayrılmıştır. Bu gruplaşmanın patojeniteden çok coğrafik orjinler ile ilişki olduğu saptanmıştır. Manoussopoulos ve ark. (1999), de Yunanistan ın iki farklı bölgesindeki (Heraklion ve Katerini) Afrika papatyası (Dimorphotheca sinuata) bitkilerinde virüs benzeri simptomlar gözlenmesi üzerine (Heraklion yakılarındaki seralarda; bitkilerde özellikle yaşlı yapraklarda klorotik leke; hafif bodurluk; Katerini yakınlarında bahçe bitkilerinde klorotik halka şeklinde) her iki alandan alınan simptomlu bitki örneklerinden, sağlıklı bitkilere inokulasyon yapılmıştır. İlk alanda bu bitkilerin özsuyundan yapılan elektron mikroskop gözlemi sonucu ipliksi partiküller görülürken, ikinci alanda izometrik partiküller belirlenmiştir. İlk alanda LMV ye ve ikinci alanda TSWV ye karşı spesifik antibadiler ile yapılan çalışmalar sonucu LMV ve TSVW; sırası ile Heraklion ve Katerini bölgelerinde teşhis edilmiştir. São Paulo State in iki bölgesinden LMV nin patotip 2 (AF198 mo1 1 veya mo1 2 genlerine sahip olmayan infekteli kültürler) ve patotip 4 (AF1999; mo1 1 veya mo1 2 genlerine sahip olan infekteli kültürler) kültürleri klonlanmış ve dizi analizi yapılmıştır. Avrupa, Orta Doğu- Kuzey Amerika ve iki Brezilya izolatından yapılan nükleotid karşılaştırmasında homologların %95 den daha fazla olması nedeniyle ırklar arasında farklılık bulunamamıştır. Buna rağmen yapılan filogenetik analizler Brezilya izolatı olan AF198 in LMV-R ve LMV-0 (patotip II, sırasıyla Amerika ve Fransa dan) ile bir arada olduğunu göstermiştir. İzolat AF199 Fransa dan iki izolat 16

47 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN (LMV-Aud ve LMV-13) ile bir arada bulunmuştur. Bu izolatların Şili de izole edilenlerle ile yakın ilişkide olduğu belirtilmiştir. Böylece dünyanın farklı kısımlarında (mo1 1 veya mo1 2 ) direnç genlerini kırabilen farklı LMV ırklarının ortaya çıkmasında, mutasyon olaylarının olabileceği fikri ortaya çıkarılmıştır (Krause-Sakate ve ark., 2001). Soleimani ve ark (2004), İran ın Tahran bölgesinde marul da yapmış oldukları çalışmada, LMV simptomları gösteren bitkilerden örnekler almışlar ve immunoprinting yöntemi ile testlemeler sonucunda üç örneğin pozitif olduğu saptanmıştır. Chenopodium quinoa, C. amaranticolor, Gomphrena globosa, Nicotiana benthamiana, Lactuca sativa indikatör bitkilerine yapılan mekanik inokulasyon çalışmasında beklenen simptomları gözlemişler ancak, Salinas 88 marul çeşidinde herhangi bir simptom gözlenmemiştir Marul İri Damar Virüsü (Miraflori lettuce big vein virus, MiLBVV- Lettuce big vein virus, LBVV) Marul iri damar virüsü (LBVV) ilk olarak Jagger and Chandler (1934), tarafından marul da Amerika da rapor edilmiştir. Avusturalya, Çekoslovakya, İtalya, Japonya, Yeni Zelanda, Hollanda, İngiltere ve Amarika da yaygın olarak görülen Varicosavirus grubuna ait bir virüsdür. Termal inaktivasyon noktası 50 C, İn vitro da yaşam süresi bir gündür. Virionları yuvarlak şekilli ve zarfsızdır (Kuvata, 1991). Dünyada marulda ılıman koşullarda iri damar hastalığının nedeni olarak LBVV (Varicosavirus) vektörünün ise toprak kökenli bir fungus Olpidium brassicae olduğu bilinmekteydi. Ancak son zamanlarda marullarda iri damar hastalığının meydana gelmesi ile ilgili olarak ikinci bir virüs olan MiLBVV ye (Ophiovirus) rastlanmıştır. LBVV ve MiLBVV, spesifik antiserumlar kullanılarak ELISA testi ile saptanmış ve ayırt edilmiştir. Her iki virüs mekanik olarak marula ve konukçularına çok düşük oranda taşınabilmiştir. LBVV, O. brassicae ile taşınmış ancak marul bitkisinde herhangi bir simptom ortaya çıkmamıştır. MiLBVV de aynı şekilde marul bitkisine taşınmış ve MiLBVV, LBVV nin varlığına ve yokluğuna bağlı olmadan iri damar hastalık simptomu meydana getirdiği gözlenmiştir (Lot ve ark., 2001). 17

48 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN MiLBVV ve LBVV nn vektörü (Olpidium brassicae) Chytridiales dir. Virüs mekanik inokulasyanla ve aşıyla da taşınmaktadır. Ancak tohumla ve polenle taşınmamaktadır., Konukçu bitkilerinde (Lactuca sativa, Sonchus oleraceus, Sonchus asper) klorotik lezyonlar, damar açılması veya sararma gibi simptomlar meydana getirmektedir (Kuvata, 1991). Colariccio ve ark. (2003), Brezilya nın São Paulo State şehrinde farklı alanlardan marul çeşitlerinde tipik damar irileşmesi simptomları gözlemlemeleri sonucu ılık mevsim süresince (gündüz C, gece C sıcaklıkta) marul örnekleri toplanmıştır. MiLBVV ve LBVV ye spesifik antiserumlar kullanılarak DAS-ELISA uygulanmış ve elektron mikroskobunda inceleme yapılması sonucu ELISA testinde her iki virüsün de pozitif olduğu ancak Elektron mikroskobunda ise sadece LBVV nin partiküllerinin var olduğu gözlenmiştir. Bu raporla hastalığın sebebinin genellikle 20 C altındaki sıcaklıklarda meydana gelmekte olan LBVV olduğu ve subtropikal alanlarda LBVV ile MiLBVV arasında bir ilişkilinin bulunduğu ilk olarak rapor edilmiştir. Colariccio ve ark. (2005), São Paulo şehrinin büyük sebze yetiştirme alanlarında surveyler yürütmüşler, Marul ve hindiba (Cichorium endivia) bitkisinin yapraklarında klorotik lekeler, büyümede durgunluk gözlemişlerdir. Biyolojik, serolojik testler ve elektron mikroskobu yöntemleriyle LBVV ve MiLBVV nin varlığını saptanmışlardır. Son dönemlerde infekteli marul bitkilerinden iki farklı viral partikül elde ediliyordu. LBVV, yuvarlak şekilde ve genom yapısı iki negatif iplik RNA dan oluşmaktaydı. Sınıflandırmada ise Varicasavirus cinsine ait olarak belirlenmişti, buna karşılık MiLBVV ise ipliksi partiküllü olup genom yapısı dört tek iplikli RNA nın çoğalmasından meydana gelmişti ayrıca sınıflandırmada Ophiovirus cinsine aitti. Bunların yanı sıra Navarro ve ark. (2004), bu iki virüsün bitkide dağılımına bakmışlar ve LBVV nin köklerde MiLBVV nin ise yaşlı yapraklarda konsantrasyonlarının daha çok olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca marul üretilen alanlarda LBVV nin MiLBVV ye göre daha hızlı yayıldığını saptamışlardır. 18

49 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN Sasaya ve ark. (2005), Tütün bodurluk virüsü (Tobacco stunt virüs, TStV) ve LBVV, arasındaki ilişkiyi değerlendirmek amacıyla 5 TStV ve 3 LBVV izolatının CP nükleotid dizilimini belirlemişler ve LBVV nin 4 ispanyol ve 1 japon izolatı ile karşılaştırmasını yapılmıştır. TStV ve LBVV arasında aminoasit ve nükleleotid dizilim benzerliği ve ölçüsü sırasıyla % ve % olarak teşhis edilmiştir. Filogenetik analizler sonucu nükleotid dizilimi TStV nin, LBVV nin farklı bir türden ırkı ile yakından ilişkili olduğu saptanmıştır. LBVV, batıda marul bitkisi yapraklarında damar açılması, bitki renginde koyulaşma, yapraklarda gevrekleşme, sararma, bitkide gür bir görünüm ve marulun baş bağlamamasına neden olan ciddi bir hastalık olarak belirlenmiştir. Bu hastalığın en fazla ıslak topraklarda devam ettiği (Campell ve Grogan 1963, Westerlund ve ark 1978a, 1978b; Hayes ve Wintermantel, 2007 den) ve ekim nöbeti yapılmayan alanlarda daha sık gözlendiğini bildirmişlerdir. Hastalığa karşı genetik dayanıklılık oluşturmanın uzun süreli korumada bir çözüm olabileceği ve Kaliforniya da kaliteli marul yetiştiriciliği için bu yöntemin önemli olduğu düşünülmüştür. infekteli Pavan ve Pasific cinslerinde simptom oluşumu azaltırken, Virosa cinsinde simptom meydana gelmediği rapor edilmiştir (Hayes ve Wintermantel, 2007). Sanches ve ark. (2008), iri damar hastalığına neden olan Lettuce big vein associated virus (LBVaV) ve Mirafiori lettuce big vein virus (MLBVV) Brezilya da karışık infeksiyon halinde saptamışlardır. Marul bitkisinden izole edilen LBVaV nın Brezilya izolatları, diğer LBVaV izolatlarını ile en az %93 oranında aminoasit dizilim benzerliği gösterdiğini belirlemişlerdir. Mavrıc Plesko ve ark. (2009), Ljubljana (Slovenya) da bulunan seralarda ve Sezana yakınlarında özel bir bahçede yetiştirilen marul bitkilerinde iri damar hastalığı görülmesi üzerine yapılan gözlemlerde bitkilerin deforme olduğunu yapraklarda klorotik damar açılmalarının meydana geldiğini ve simptomlu bitkilerin simptomsuzlara oranla daha küçük olduğunu belirlemişlerdir. Araştırıcıların belirledikleri iki alanda yapmış oldukları denemelerde ilk alandan 6 simptomatik bitki ve 2 simptomsuz fidede, İkinci alandan 3 simptomatik bitkide MiLBVV ve LBVV varlığını araştırmak amacı ile RT-PCR ile analiz etmiştir. Yapılan RT-PCR sonucu ilk alanda MiLBVV ve LBVV karışık infeksiyon olarak 4 bitkide 19

50 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN bulunurken, MiLBVV, 2 bitkide yalnız olarak belirlenmiştir, simptomsuz 2 fidede ise herhangi bir virüse rastlanmamıştır. İkinci alanda ise analiz edilen bütün bitkiler MiLBVV ve LBVV ile karışık infeksiyon halinde bulunmuştur. Bu çalışma ile Slovenya da MiLBVV ve LBVV birlikte ve MiLBVV marulda tek olarak ilk kez saptanmıştır. Barcala Tabarrozzi ve ark. (2010), marul iri damar hastalığına neden olan etmenlerden MiLBVV nin dünyada yaygın olması nedeniyle Arjantin da kış döneminde LaPata da surveyler yapmışlar ve 40 örnekte iri damar hastalığı simptomları gözlemişlerdir. DAS ELISA ve/veya üniversal primerler kullanılarak yapılan RT-PCR çalışmaları sonucu MiLBVV nin varlığını saptamışlardır. Bu çalışma ile Arjantin de MiLBVV ilk olarak rapor edilmiştir.. Heidari ve ark. (2010), iri damar hastsalığına neden olan MiLBVV ve LBVV nin KP lerinin benzer ölçülerde ancak farklı morfoloji ve serolojiye sahip olası nedeniyle Tahran bölgesinde yetiştirilen marullarda MiLBVV ve LBVV tespit ve ayırt etmek için bu bölgede simptom gösteren 344 örneği DAS-ELISA ve/veya RT-PCR ile testlemişlerdir. Testlenen örneklerin %0.87 LBVV, %0.57 MiLBVV ve %1.74 ünü karışık infeksiyon olarak saptamışlardır. Araya ve ark. (2011), marul bitkisinde yaygın olarak görülen ve ekonomik kayıpları oldukça fazla olan iri damar hastalığı nedeniyle bitkilerde deformasyon, baş oluşturamama ve en önemlisi damarlar arasında klorotik açılmalar meydana gelmekte olduğunu belirlemişler ve infekteli bitkilerde simptom yoğunluğu, protein ve viral RNA birikimi arasındaki ilişkileri araştırılmışlardır. Doğal olarak infekteli marul bitkilerindeki simptomları hafif, orta, şiddetli ve simptomsuz olarak sınıflandırmışlardır. Kılıf protein (KP) birikimi DAS-ELISA ve RT-PCR çalışmaları ile değerlendirilmiştir. Farklı simptom şiddeti gösteren marul bitkileri arasında bu hastalık ile ilgili iki virüs için KP birimi arasında fark görülmemiştir. Benzer olarak MiLBVV-RNA3 veya LBVV-RNA2 nin miktarında iri damar hastalık şiddeti derecelendirme ölçeğinde fark meydana gelmemiştir. Bu çalışmalar iri damar hastalığına maruz kalan marullarda meydana gelen simptomun şiddetini, konukçuda virüsün birikimi ile ilgili olmadığını belirlemişlerdir. 20

51 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN 2.6. Karnabahar Mozaik Virüsü (Cauliflower mosaic virus, CaMV) Karnabahar mozaik virüsü (CaMV) ilk olarak 1937 yılında Amerika da Tompkins tarafından Şalgam (Brassica campestris) ve Lahana (B. olerace) da rapor edilmiştir. Caulimoviridae familyasından dünyada yaygın bir virüstür. Termal inaktivasyon noktası C, İn vitro da yaşam süresi 7-15 gündür. Virionlar izometrik ve zarfsızdır. Genomlar çift iplikli ve daireseldir. Doğrusal olanları da bulunmuştur ancak infeksiyon yapma özellikleri bulunmamaktadır (Garrett, 1982). Küçük bir DNA bitki virüsü olan CaMV nin (Shepherd ve ark.,1968) DNA sı bitki hücreleri içerisine yabancı DNA taşımak için potansiyel bir araç olarak düşünülmüştür (Szeto ve ark., 1977). Yaprak bitleri (Brevicoryne brassicae, Myzus persicae) ile semi persistent olarak ve mekanik yolla taşınmaktadır. Konukçu bitkilerinde (Arabidopsis thaliana, Brassica spp, Raphanus spp. ve diğer Brassicaceae türlerinde, Resedaceae) damar açılması veya mozaik simptomlar meydana getirir. Yamaoka ve ark. (1982), CaMV nin sentezinin sıcaklıkla yakından ilgili olduğunu saptamışlardır. Şalgam bitkilerinin protoplastlarında virüs çoğalması için optimum sıcaklığın 20 C civarında olması gerektiğini fakat hücreler arasında virüs infeksiyonu sonrası hücre cisimciklerin oluşması için 20 C den daha yüksek sıcaklık gerektiğini, CaMV nin çoğalmasının 33 C civarında durduğunu, ancak 20 C de eski haline geri döndüğünü kaydetmişlerdir. Şalgam bitkilerinde hücrede cisimcik oluşması ve damar açılma simptomunun meydana gelme sıklığının virüsün artışı ile doğrudan ilişkili olmadığını, protoplastlarda normal cisimcik oluşumu gözlenmediğini sadece virüs partiküllerinin birikimi olduğunu bu sonuç hücreler arasında virüs infeksiyonu sonrası cisimciklerin, CaMV çoğalması için gerekli olmadığını ortaya koymuşlardır. Raybould ve ark. (1999), Dorset UK de lahanagillerin doğal populasyonlarında Şekerpancarı batı sarılık virüsü (BWYV), Karnabahar mozaik virüs (CaMV), Şalgam mozaik virüs (TuMV), Şalgam sarı mozaik virüs (TYMV) nü içeren dört virüsün surveyini gerçekleştirmişlerdir. Toplanan örneklerin; %60 ı 21

52 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN CaMV, %43 ü BWYV, %43 ü TuMV ve %18 i TYMV ile infekteli olarak bulunmuştur. Farzadfar ve ark. (2005), İran ın Fars şehrinde lahanagil bitkilerinde CaMV nin varlığını saptamak amacı ile surveyler yürütmüşler ve beneklenme, bantlaşma, mozaik, nekrotik lekeler, gelişme geriliği, sararma simptomları gösteren farklı lahanagil bitkilerinden süs lahanası (B. oleracea var. Acephala), karnabahar (B. oleracea var. Botrytis), lahana (B. oleracea var. Capitata), brokoli (B. oleracea var. İtalica) ve şalgam (B. Rapa) dan yaprak örnekleri toplamışlar ve DAS_ELISA ile teslemişlerdir. Simptomlu bitkilerin yapraklarından şalgam (B. rapa,), kanola (B. Napus), çin lahanası (B. pekinensis,) turp (Raphanus sativus) ve boru çiçeği (Datura metel) ne yaptıkları mekanik inokulasyon sonucu CaMV izolatlarının hepsi lahana bitkilerinde mozaik simptomlara neden olurken bir izolat (Ca-Sh1) boru çiçeğin de sistemik infekteli olarak bulunmuştur. Biyolojik ve serolojik çalışmalar, PCR ile doğrulanmış ve CaMV, İran da süs lahanası, karnabahar, lahana, brokoli ve şalgam da ilk olarak rapor edilmiştir. Spence ve ark. (2007), Kenya da kurmuş oldukları sera denemelerinde, TuMV tek olarak veya CaMV ile bir arada iken ticari lahana fidelerinin sayısında ve ağırlığında azalmaya sebep olduğunu göstermişlerdir. Virüs inokule edildiğinde lahanaların %25 i satılamaz duruma gelmiş ve kontrol bitkileri ile kıyaslandığında yaklaşık 20 kat bir kayıp meydana getirdiği gözlenmiştir. Sadece CaMV infekte edilen lahana bitkilerinin veriminde önemli ölçüde değişim gözlenmemiş bu nedenle, TuMV nin daha zararlı olduğunu ve hastalık yönetimde önceliği olması gerektiğini saptamışlardır. TuMV ile infekteli lahanaların sağlıklı bitkilere göre % 50 daha hafif olduğu fakat geç infeksiyonlarda daha az zarara sebep olduğu, ayrıca virüs infeksiyonunun kontrolünde fideliğin içinde bulunduğu döneminde önemli olduğunu bildirmişlerdir Turp Mozaik Virüsü (Radish mosaic virus, RaMV) Turp mozaik virüsü (RaMV) ilk olarak Amerika da (Kalifornia) turp bitkisinde (Raphanus sativus) rapor edilmiştir (Tompkins, 1939). Avusturalya, 22

53 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN Almanya, Macaristan, Italya, Japonya, Fas, Amerika ve Yugoslavya da yaygın olan virüs Comoviridae familyasındandır. Termal inaktivasyon noktası C İn vitro da yaşama süresi gündür. Virionlar izometrik ve zarfsızdır. Genomlar tek iplikli RNA virüslerinden meydana gelmektedir. RaMV, Coleoptera takımına dahil böcekler (Phyllotreta spp., Epitrix hirtipennis ve Diabrotica undecimpunctata), mekanik ve aşı yolu ile taşınmaktadır (Cambell, 1988). Spak ve Kubelkova (2000), Rusya ve Çekoslovakya da yetiştirilmekte olan çin lahanası, ketencik, şalgam ve hardal bitkilerinden alınan RaMV izolatlarının serolojik olarak farklılığını, araştırmışlardır. Farklı bölgelerde, hatta bir tarlada komşu hardal bitkileri arasında dikkat çekecek oranda serolojik bir farklılık görülmüştür. İzolatlar virüsün yeni bir konukçusu olarak kuzukulağı (Cameline sativa) n da rapor edilmiştir. Farzadfar ve Pourrahim (2004), iran'ın Kazvin ve İsfahan bölgelerinde karnabahar ve şalgam bitkilerinde mozaik, benek ve kırışıklık simptomları gözlemişler ve yapılan, mekanik inokulasyon çalışması sonucunda akkaz ayağı da klorotik lokal lezyonlar, tütün de klorotik halkalar, lekeler ve şalgam da klorotik lokal lezyonlar ve bunu takiben sistemik mozaik simptomlar rapor etmişlerdir. Yapılan DAS-ELISA ile RaMV nün varlığını İran'da ilk olarak rapor etmişlerdir Şekerpancarı Batı Sarılık Virüsü (Beet western yellow virus, BWYV) Şekerpancarı batı sarılık virüsü (BWYV) ilk olarak Amerika da pancar, ıspanak, marul ve turp bitkilerinde rapor edilmiştir (Duffus, 1961). Tüm dünyada yaygın bir luteovirüstür. Termal inaktivasyon noktası 65 C ve İn vitro da yaşam süresi 16 gündür. Virionları izometrik ve zarfsızdır. Genomlar tek iplikli doğrusal RNA lardan meydana gelmiştir. Geniş konukçu aralığına sahiptir (Beta vulgaris, Spinacia oleracea, Helianthus annuus, Lactuca sativa, Brassica napus var. napobrassica, B. campestris ssp. napus, B. campestris ssp. rapa, B. nigra, B. oleracea var. botrytis, Brassica oleracea var. capitata, Raphanus sativus, Crambe abyssinica, Citrullus lanatus, Cucumis sativus, Cucurbita pepo, Cicer arietinum, Glycine max, Pisum sativum, 23

54 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN Trifolium subterraneum, Vicia faba, Phlox drummondii, Capsicum annuum, Lycopersicon esculentum). Konukçu bitkilerinde hafif klorotik lekelenme, sararma, yaşlı yaprakların incelmesine ve gevrekleşmesine sebep olmaktadır. BWYV, yaprak bitleri ile (Myzus persicae) persistent olarak taşınır. Vektör taşınması için bir yardımcı virüse ihtiyacı yoktur. Mekanik, aşı, tohumla ve polenle taşınmaz (Duffus ve Johnstone,1983). Timmerman ve ark. (1985), Illinois da geniş bir konukçu aralığına sahip olduğu bildirilen BWYV nin Batı St. Louis alanlarında kışlak konukçusunun kuş otu, şalgam, ıspanak bitkileri olduğunu belirlenmişler ve ilkbaharda inokulumun kaynağı olabilecek ürünler üzerinde durmuşlardır yılı ilkbahar ayında yapılan araştırma sonucunda ıspanak bahçelerinin %33, şalgam bahçelerinin ise %80 inin BWYV ile infekteli olduğunu saptamışlardır. Yeşilbiber ve kırmızı köklü kazayağı bitkisinin BWYV nin yazlık konukçusu bunun yanı sıra şalgam ve ıspanak bitkilerinin de kışlık konukçusu olduğunu ELISA ve diğer birkaç metodla (taşınma, konukçu aralığı) doğrulamışlardır. Fortass ve ark. (1997), Fas'ta ta luteovirus infekteli bir nohut bitkisinden, fener çiçeğine (Physalis floridana) yaprak biti (Myzus persicae) ile virüs taşınmışlar ve hafif simptomlar elde etmişlerdir. Bilinen baklagil virüslerine karşı western blots yöntemi uygulanmış ve BWYV güçlü bir reaksiyon meydana getirmiştir. PCR' da 950 bç nin bir parçası çoğaltılmış ve bu parçanın yüksek oranda (% 96) BWYV ile bir benzerlik gösterirken diğer Luteovirüsler ile daha düşük oranda (%50-60) bir benzerlik gösterdiğini belirlemişlerdir. Bu çalışma ile Kuzey Afrika'da yetiştirilen baklagillerden nohut bitkisinde BWYV ilk olarak moleküler düzeyde rapor edilmiştir. Hauser (2000), şeker pancarında sararma hastalığına neden olan Luteoviridae familyasından Polerovirus cinsine Beet mild yellowing virus (BMYV) veya (BWYV) ü konukçu aralığı, genomik ve serolojik çalışmalar sonucu üç farklı tür içinde sınıflandırmıştır. Bu türlerden iki tanesi ilk kez belirlenmiş ve henüz ICTV tarafından düzenlenmemiştir. Bu ilk türler, BMYV, şeker pancarı ve Capsella bursapastoris i infekteleyebilmektedir. İkinci tür Lahana sararma virüs (Brassica 24

55 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN yellowing virüs) ü lahangiller familyası içinde lahana cinsine ait bitkilerin büyük bir bölümünü infekteleyebilmekte ancak şeker pancarı bitkisini infekteleyememektedir. Üçüncü tür, Şekerpancarı kloroz virüs (Beet chlorosis virüs) ü ise şeker pancarı ve Chenopodium capitatum bitkisini infekteleyebilmekte ancak Capsella bursa-pastoris bitkisini infekteleyemediği saptanmıştır. Thurston ve ark. (2001), İgiltere nin Dorset Bölgesi nde beş şehirden yabani hardal bitkilerinden örnekleme yapmışlar ve altı virüse karşı ELISA ile testlemişlerdir. Şalgam mozaik virüsü (TuMV), Şalgam sarı mozaik virüsü (TYMV), Şalgam kırışık virüs (TCV), Şalgam rozet virüs (TRoV), Şeker pancarı batı sarılık virüsü (BWYV) ve Karnabahar mozaik virüs (CaMV) ün varlığını bildirmişlerdir. 447 örneğin 48 tanesi karışık infeksiyon belirlenirken; TuMV, en az rastlanan virüs olmuştur. Mekanik veya şeftali yaprak biti (Myzus persicae) ile yapılan inokulasyonlar sonucu TuMV en hızlı (10 gün) ve ölümcül sistemik nekrozlar meydana getirmiş, diğer virüslerin her biri sistemik yayılmış ancak ölümcül simptom göstermemiştir. BWYV ise sistemik olarak yayılmış ancak gözle görülür bir simptom meydana getirmemiştir. Shahraeen ve ark. (2003), İran da önemli bir ürün olan kolza (Brassica napus ssp. oleifera) için surveyler yapmışlar ve 581 kolza örneğini DAS-ELISA ile testlemişler ve örneklerde BWYV %14.45, CaMV %12.9, TuMV %9.3, CMV%4.6 ve TSWV ile %0.51 oranında infekteli olarak saptamışlardır. BWYV, TuMV ve CaMV nin kolzada ortaya çıkması, İran da üretilen kolza için dikkati çekecek önemde olduğu ve infekteli bitkilerin diğer duyarlı sebze ürünleri için inokulum kaynağı oluşturduğunu bildirmişlerdir. Xiang ve ark. (2010), Çin de daha önce şeker pancarında, rapor edilmiş olan BWYV ve iki Çin izolatının Inner Mongolia (BWYV-IM) ve Gansu (BWYV-GS) tamamlayıcı genomik RNA dizilerinin üç pancar virüsü (BMYV, BChV ve BWYV- US) ile benzerlik oranlarını karşılaştırmışlardır. İki Çin izolatının genom uzunluğu 5,668 nt olarak belirlenmiş ve BWYV-IM diğer izolatlarla benzerlik oranı sırasıyla BWYV-GS %97.4, BWYV-US %86.6, BChV %64.4 ve BMYV %70.8 oranında olduğunu belirlemişlerdir. Sonuçta BWYV Çin izolatlarının en fazla BWYV-US ile benzerlik göstermekte olduğunu rapor etmişlerdir. 25

56 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN 2.9. Şekerpancarı Tepe Kıvırcıklık Virüsü (Beet curly top virus, BCTV) Şekerpancarı tepe kıvırcıklık virüsü (BCTV) Batı Amerika da şekerpancarı (Beta vulgaris) da Ball (1909), tarafından rapor edilmiştir. Afrika, Avrasya, Amerika, Arjantin, Bolivya, Brezilya, Kanada, Costa Rica, Kıbrıs, Mısır, Hindistan, İran, İtalya, Meksika, Puerto Rico, İspaya, Türkiye, Amerika ve Uruguay da yaygındır. BCTV, Geminivirüs grubundan olup, termal inaktivasyon noktası 80 C ve İn vitro da yaşama süresi 8 gündür. Virionları zarfsızdır. Genomlar tek iplikli dairesel DNA moleküllerinden meydana gelmiştir (Boswell, 1985). Cicadellidae ler (Kuzey Amerika da Circulifer tenellus, Akdeniz havzasında C. tenellus, C. opacipennis) ile persistent olarak taşınır. Konukçu bitkilerinde (Spinacia oleracea, Cucurbitaceae, Phaseolus vulgaris, Linum spp., Capsicum spp., Lycopersicon esculentum, Solanum tuberosum, Beta vulgaris) genç yapraklarda damar açılması, sert, bodur, sarı, kıvrılmış, kalın, gevrek, kırılgan ve deformasyona uğramış yaprak oluşumu, floemde nekroz, eksudat akıntısı, bitkide ölüm simptomları görülmektedir. Aşı ile taşınırken, mekanik ve tohumla taşınmamaktadır. Baliji ve ark. (2004), Güney Batı Teksas ta 1996 yılı süresince ıspanak bitkisinde, genç yapraklarda kıvrılma, deformasyon, bodurlaşma, sararma ve bitkide şiddetli gelişme geriliği gözlenmesi ile yapılan klonlama ve southern blot hibridizasyon yöntemleri sonucu, virüsün tamamlayıcı gen karşılaştırılmasında ıspanak bitkisinde önceden karakterize edilen Şekerpancarı tepe kıvırcıklı virüsü (BCTV), Şekerpancarı şiddetli tepe kıvırcıklı virüsü (BSCTV), Şekerpancarı hafif tepe kıvırcıklı virüsü (BMCTV), ve Yaban turpu tepe kıvırcıklık virüsü (HBCTV) ile % arasında nükleotid dizi benzerliği gösterdiğini ortaya çıkarmışlar ve bu virüsün Curtovirüs cinsinin yeni bir türü olduğu belirlenmesi ile Ispanak tepe kıvırcıklık virüsü (ICTV) olarak adlandırılmıştır. Strausbaugh ve ark. (2008), Batı Amerika Birleşik Devletleri nde kontrolü zor bir hastalık olmaya devam eden tepe kıvırcık hastalığına karşı konukçuların direncini geliştirmek ve hastalık yönetim seçeneklerini belirlemek amacı ile 26

57 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN Curtovirüs lere karşı saha denemeleri ile birlikte 246 ticari alandan örnekleme yapmışlardır. Yaprak örneklerinden DNA izole edilmiş ve 79 izolatta Şekerpancarı şiddetli tepe kıvırcıklı virüsü (BSCTV) ve Şekerpancarı hafif tepe kıvırcıklı virüsü (BMCTV) ün yaygın olarak bulunduğunu, BCTV nin ise sadece birkaç izolatta olduğunu saptamışlardır Şekerpancarı Mozaik Virüsü (Beet mosaic virus, BtMV) BtMV ilk olarak pancar bitkisinde (Beta vulgaris) Almanya da rapor edilmiştir (Schneider ve Mundry, 1956). Dünyada pancar yetiştirilen tüm alanlarda görülmektedir (Russell, 1971). Potyvirüs grubundandır. Virionlar filamentous ve zarfsızdır. Genomları tek iplikli doğrusal RNA lardan meydana gelmiştir (Heathcote ve Woods, 1982). Yaprak bitleri ile (Myzus persicae, Aphis fabae) non persistent olarak taşınmaktadır. Mekanik inokulasyon ve aşı ile de taşınırken, tohumla ve polenle taşınma gerçekleşmemektedir. Konukçu bitkilerinde (Beta vulgaris, Spinacia oleracea, Chenopodium album, Amaranthus retroflexus, Sonchus arvensis, Melilotus indicus, Trifolium incarnatum) tepe yapraklarda küçük lokal lezyonlar, beneklenme, sararma, yaprakların kıvrılması ve damar açılması meydana getirmektedir. Choueırı ve ark. (2001), Lübnan ın başlıca şekerpancarı yetiştirilen alanlarında viral hastalıkların yaygınlığı ve ortaya çıkma nedenlerini belirlemek amacıyla surveyler yapmışlar ve ticari olarak şeker pancarı üretilen 115 alandan toplam 1002 örneği ELISA ile Şeker pancarı Nekrotik Sarı Damar virüsü (BNYVV), Şeker pancarı Sararma virüsü (BYV), Şeker pancarı mozaik virüsü (BtMV), Şeker pancarı batı sarılık virüsü (BWYV) ve Hıyar mozaik virüsü (CMV) ne karşı testlemişler ve örneklerin %39,5'inin, bir veya daha çok virüsle bulaşık olduğunu saptamışlardır. BtMV, (%56,5) en çok görülen virüs hastalığı olarak teşhis edilirken BYV %29,5, BNYVV %17 ve BWYV %11 oranlarında olduğu rapor edilmiştir. Örneklerin %.2'sinin karışık infeksiyon halinde olduğu ve bu infeksiyonlar içerisinde CMV ye rastlanmadığını bildirmişlerdir. 27

58 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN Spence ve ark. (2007), yılında Kenya da pazı (Swiss chard) da BtMV ile erken inokulasyonu yaprağın niteliğinde önemli derecede azalmaya sebep olmuş (satılabilir yaprak üretiminde %50 kayıp), BtMV, pazı da hastalık yönetiminde sadece fideliğin hangi dönemde olduğu değil özellikle bitkilerin fidelikten tarlaya şaşırtıldığı zamanında önemli olduğunu ortaya çıkarmışlardır. Wang ve ark. (2007), Çin in Tai'an, Shandong Bölgesi nde sebzeleri infekteleyen virüsleri araştırmak amacı ile saha araştırmaları yürütmüşlerdir. Bir çok marul da %30-40 oranında mozaik, buruşma, geriye doğru ölüm simptomları gözmişler ve bu örneklerin SDS-agar gel double immunodiffusion testinde, Patates Y virüsü (PVY) ve Şalgam mozaik virüsü (TuMV) için pozitif, Hıyar mozaik virüsü (CMV), Tütün mozaik virüsü (TMV), ve Patates X virüsü (PVX) için negatif reaksiyon verdiğini ve Potyvirüs olduğunu belirlemişlerdir. Yapılan RT-PCR ve BLAST çalışması sonucu etmenin BtMV olduğu saptamışlardır. Marul bitkisinde doğal infeksiyon halinde BtMV ilk olarak rapor edilmiştir. İran'ın en önemli şeker pancarı yetiştirilen Razavi Horasan şehrinde, beneklenme, yaprak kıvrılması ve mozaik şeklinde simptomlara neden olduğu belirlenen BtMV teşhis etmek amacı ile yapılan surveylerde Meşhed, Neyshabour, Ghoochan, Torbat-e-Heydariyeh, Torbat-e-reçel, Fariman ve Kashmar bölgelerinden rastgele örnekler toplanmıştır. Tüm örnekler DAS-ELISA ile testlenmiş ve RT-PCR çalışması sonucunda 658 bç band elde edilmiştir. Fariman (%33.4) ve Neyshabour (%4.8) sırasıyla maksimum ve minimum oranlarda BtMV ile infekteli şehir olarak belirlenmiş ve Razavi Horasan da ortalama infeksiyon oranı 530 örnekte %14,9 olarak saptanmıştır (Gerayeli ve ark., 2010) Marul Bulaşıcı Sarılık Virüsü (Lettuce infection yellow virus, LIYV) Marul bulaşıcı sarılık virüsü (LIYV) Amerika da (Arizona ve Kaliforniya); marul, şeker pancarı, havuç bitkilerinde rapor edilmiştir (Duffus ve ark., 1982). Amerika da yaygın bir Closterovirus grubu virüstür. Virion ipliksi ve genomlar tek iplikli RNA lardan meydana gelmiştir. 28

59 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN Konukçu bitkilerinde (Lactuca sativa, Citrullus lanatus, Cucumis melo, Cucurbita pepo, C. maxima, C. moschata, Beta vulgaris, Daucus carota); şiddetli kloroz ve /veya kırmızılaşma, yapraklarda kıvrılma, gevreklik, damar açılması ve bitkide gelişme geriliği meydana getirmektedir (Brown ve Nelson, 1986). Duffus ve Molyneux (1986), Amerika Birleşik Devletlerinin Güney Batısında marul, şekerpancarı, havuç, diğer bitki ve yabancı otlara konukçuluk yapan yeni bir sararma hastalığı olarak LIYV tespit etmişlerdir. LIYV semi persistent olarak beyazsinek (Bemisia tabaci) tarafından taşındığını ancak mekanik olarak taşınmamakta olduğunu saptamışlardır. Geniş bir konukçu aralıgına (15 bitki familyasında 45 tür) sahip bir virüs olarak belirlenen LIYV nin kültür bitkilerinde ekonomik açıdan önemli kayıplara neden olduğunu bildirmişlerdir. Duffus ve Flock (1982) ve Nameth ve ark., (1985), LIYV nin California da kabakgiller de ciddi kayıplara neden olduğunu, marulda ise infeksiyon sonucu verim %75 e kadar azalabildiğini bildirmişlerdir. Brown ve Stanghellini (1988) LIYV nin Kuzey Amerika da hydroponical olarak yetiştirilen marullarda ciddi kayıplara neden olduğunu saptamışlardır (CABI ve EPPO). Beyazsinekle taşınmakta olan üç Closterovirus (Marul Bulaşıcı Sarılık virüsü (LIYV), Kabakgil sarı bodurluk bozukluk virüsü, (CYSDV) ve Şekerpancarı yalancı sarılık virüsü (BPYV) ün coğrafik olarak ortaya çıkması ve moleküler farklılıklarını araştırmak amacı ile birçok farklı coğrafik alandan kabakgil toplanmış ve 498 örnek test edilmiştir. Bu örneklerden hiçbirinde LIYV ye rastlanmamıştır (Rubio ve ark., 1999) Türkiye de Yapılan Çalışmalar Bennett ve Tanrisever (1957), ülkemizde de ilk olarak BCTV yi şeker pancarında rapor etmişlerdir Fidan ve Türkoğlu (1988), İzmir ili marul yetiştirme alanlarında, yılları arasında, LMV' nin yaygınlık oranının %5.4 oranında olduğu, % 8-9 oranında tohumla taşındığı ve şeftali yaprak biti (M. persicae) 'nin LMV'nin vektörü olduğunu tespit etmişlerdir. 29

60 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN Döken ve ark. (1993), Erzurum da 118 marulda iri damar simptomu görülmesi üzerine LBVV infekteli marulların köklerinden vektörü Olpidium brassicae (Wor.) Dong, izole ederek, sağlıklı marul bitkilerine taşımışlardır. İnfekteli bitkilerin köklerinden elde edilen zoospor süspansiyonların sağlıklı fidelerin kökleri etrafındaki toprağa yayılması ile inokulasyon yapılmış ve 1 ay sonra marul fidelerinin yapraklarında simptomlar gözlenmiştir. Marul bitkilerinde iri damar virüs hastalığına benzer hastalık simptomları İzmir in marul yetiştirilen alanlarında önceden görülmüş ancak sağlıklı marul bitkilerine hastalığın taşınması girişiminde başarısız olunmuştur TSWV, Tükiye de ilk olarak tütün bitkisinde; Çanakkale, Balıkesir, Manisa, Uşak ve Samsun illerinde, domates bitkisi üzerinde; İzmir ve Manisa illeri (Azeri, 1981; 1994) ile Çukurova da (Güldür ve ark., 1995) saptanmıştır. Erkan ve ark. (1990), ülkemizde karnabahar ve lahana üretiminin yoğun olarak yapıldığı yerlerde virüs belirtileri gösteren bir hastalık kaydetmişler ve bitkide hastalığın, vejetasyon süresinin yarısını geçtikten sonra belirgin olarak gözlendiğini bildirmişlerdir. Her iki bitkinin genç yaprakların da renk açılması, açık yeşil veya sarımsı damar bandlaşması, buna karşın daha yaşlı yapraklarda koyu yeşil band oluşumu ve deformasyon şeklinde simptomlara neden olduğunu ve ayrıca bu hastalıkla bulaşık bitkilerin bodur kaldığını ve baş oluşturamadığını gözlemişlerdir. Test bitkilerindeki simptomlar ve serolojik ilişkiler dikkate alınarak CaMV yi Türkiye de ilk olarak saptamışlardır. Marul bitkisinde son derece yaygın olarak bulunan LMV, Türkiye de GAP bölgesinde Yılmaz ve ark.(1995), tarafından saptanmıştır. TSWV nin varlığı Şanlıurfa da domates yetiştirilen alanlarda Güldür (1997), tarafından ilk kez rapor edilmiştir. Arli-Sökmen ve ark. (1998; 1999) Samsun ilinde biber yetiştirilen alanlarda yapmış oldukları bir çalışmada TSWV nin varlığını belirlemişlerdir. Tok ve Erkan (2006), Bursa ve Çanakkale illerinde şeker pancarı bitkisinde yılında yapmış oldukları arazi çalışmalarında Çanakkale ilinden 23, Bursa ilinden 29 olmak üzere toplam 52, mozaik, deformasyon, sararma, kıvırcıklaşma, klorotik lokal lezyon ve bitkilerde bodurlaşma simptomuna rastlamışlardır. Mekanik 30

61 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN inekulasyon ve ELISA sonucu BYV, BtMV ve CMV yi saptamışlar ve bu saptanan virüslerin yaygınlık oranını Çanakkale ili Biga ilçesinde %2.41 ve Bursa ili Mustafa Kemal Paşa ilçesinde %4.02 olarak belirlemişlerdir. Korkmaz ve ark., (2007), Türkiye nin Çanakkale, Balıkesir ve Bursa şehirlerinde yetiştirilen lahana bitkilerinde (Brassica oleracea, Raphanus sativus and R. raphanistrum) mozaik, leke, nekrotik halka, gelişme geriliği, sararma gibi simptom gösteren bitki örneklerini TuMV nin varlığı için DAS-ELISA yöntemi ile test etmişler ve 130 yaprak örneğinin altısı dışındaki örnekleri TuMV ile pozitif olarak belirlemişlerdir. Brüksel lahanası (B. oleracea vars. capitata gemmifera), turp (R. sativus) ve yabani turp (R. raphanistrum) TuMV ile infekteli bulunurken, karnabahar veya brokolide infeksiyon gözlenmemiştir. Pozitif sonuç veren örneklerden yapılan mekanik inokulasyon sonucunda ise, Chenopodium quinoa da klorotik lokal lezyonlar, B. rapa da şiddetli mozaik ve gelişme geriliği ile Nicotiana benthamiana da mozaik ve solgunluk simptomları gözlenmiştir. Yapılan PCR çalışması sonucunda beklenen büyüklüklerde bandlar elde edilmiş ve bu bilgi ile TuMV, Türkiye de lahana (B. oleracea), turp (R. sativus) ve yabani turp (R. raphanistrum) bitkilerinde ilk olarak rapor edilmiştir. Yardımcı ve Çulal-Kılıç (2009), Batı Akdeniz Bölgesi nde TSWV yi saptamak amacıyla domates, biber, patates, marul, kabak, ve hıyar yetiştirilen alanlarda survey çalışmaları yürütmüşler ve on iki lokasyonda tipik TSWV simptomu gösteren toplam 337 örneği ELISA ile testlemişlerdir. ELISA sonucunda 157 örneği %46.58 oranında TSWV ile infekteli olarak saptamışlardır. TSWV infeksiyonu biber, marul, domates ve kabakta sırası ile %66.16, 66.66, ve oranlarında olduğunu belirlemişlerdir. Bozdoğan (2009), Antalya ili Merkez, Serik ve Kumluca ilçelerinde yetiştirilen domates, biber ve marul alanlarında TSWV saptanması ve yaygınlığının ortaya koyulması amacı ile surveyler yürütmüş, şüpheli domates, biber ve marul örneklerini ELISA ile testlemiş ve hastalık oranını toplanan örneklerde % olarak belirlemiştir. ELISA testi sonucunda TSWV ile bulaşık olduğu belirlenen örneklerden üç tanesi, A1 (marul), S1 (domates) ve K1 (biber) izolatları şeklinde kodlamış, mekanik inokulasyon ve RT- PCR çalışmalarında kullanmıştır. A1 izolatı, 31

62 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bilge ALAN indikatör bitkiler üzerinde 7-10 gün sonra simptom oluştururken, S1 ve K1 izolatlarının gün sonra simptom çıkışına sebep olduğunu gözlemiş ve A1 izolatının daha yüksek patojeniteye sahip olduğu sonucuna varmıştır. Kamberoğlu ve Alan (2011), Adana ve Mersin illerinde toplam da den fazla bir alanda yapmış oldukları surveylerde simptom gösteren 336 marul bitkisini DAS-ELISA ile testlemişler ve 4 marul bitkisinde TSWV yi saptamışlardır. RT-PCR çalışması ile 811 bç büyüklüğünde band elde ederek bu virüsün varlığını doğrulamışlardır. Tuzlalı ve Korkmaz (2011), Çanakkale ve çevresinde karnabahar, lahana ve bürüksel lahanası bitkilerinde beneklenme, damar bantlaşması, damar açılması nekrotik lekeler, şekil bozukluğu, kloroz simptomları gösteren 56 örneği DAS- ELISA ile testlemişler ve 41 örnekte CaMV nin varlığını saptamışlardır. Tüm bu bilgileri doğrulamak amacı ile bazı örneklerde yapılan PCR sonucunda beklenen büyüklükte bant elde etmişlerdir. Uzunoğulları ve Beşirli (2011), Yalova da marul bitkisi yapraklarında sarı ve yeşil renkte beneklenmeler, yaprakta kabarma, yaprak kenarlarında deformasyon, nekrotik lekeler ve bodurluk belirtileri üzerine 400 bitkiden örnek almışlar CMV, LMV, TSWV için testlemişler ve örneklerin %40 ının LMV ile infekteli olduğunu saptamışlardır. 32

63 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Survey Alanı ve Çalışma Materyali Hakkında Bilgiler Bu çalışmanın materyalini yılları arasında ilkbahar, sonbahar ve kış dönemlerinde Adana, Mersin, Hatay, Osmaniye ve Kahramanmaraş illeri ve çevresinde marul, lahana, karnabahar, ıspanak ve turp yetiştiriciliğinin yaygın olduğu alanlarda hastalık simptomu gözlenen bitkilerden alınan dokular oluşturmuştur. Arazi çıkışlarında simptomatolojik olarak, CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, LBVV, CaMV, RaMV, BWYV, BCTV, BtMV ve LIYV ile infekteli olduğundan şüphelenilen 808 marul, 330 lahana, 225 ıspanak, 137 karnabahar ve 65 turp bitkisinden oluşan toplam 1595 bitki örneği toplanmış ve testlemek amacı ile laboratuvara getirilmiştir (Çizelge 3.1). Bu çalışma, Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü Fitopatoloji Anabilim Dalı Viroloji Laboratuvarı, Bitki Virüs Hastalıkları Araştırma Serası ve mevcut klima odalarında yürütülmüştür. 33

64 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN 34

65 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN Serolojik Çalışmalarda Kullanılan Materyal ELISA testlerinde, CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, CaMV, RaMV ve BWYV ile infekteli olduğundan şüphe edilen arazi örneklerinden alınan taze bitki dokuları ile virüs infekteli olduğu ELISA yöntemi sonucunda saptanan örneklerden yapılan mekanik inokulasyon çalışmalarında simptom gösteren indikatör bitkilerden elde edilen bitki dokuları materyal olarak kullanılmıştır. ELISA testleri, ticari olarak temin edilmiş olan ELISA kitleri (CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, CaMV, RaMV (BIOREBA) ve BWYV(AGDİA) ye spesifik), tampon çözeltiler (Ek-1), düz tabanlı, 96 kuyu içeren Maxi Sorp Mikrotiter ELISA pleytleri (NUNC-Danimarka), ELISA okuyucusu (Medispec ESR 200 ELISA Reader), otomatik pipetler ve pipet uçları ile saf su kullanılarak yapılmıştır Mekanik İnokulasyon Çalışmalarında Kullanılan Materyal Mekanik inokulasyon çalışmaları, serolojik çalışmalar sonucu çalışma konusu virüsler ile infekteli olduğu saptanan bitkilerden alınan taze bitki dokuları, indikatör bitkiler (Çizelge 3.2), havan ve havaneli, fosfat tampon çözeltisi, 2-merkaptoetanol sodyum sülfit, karborandum tozu ve çeşme suyu kullanılarak yapılmıştır. Mekanik inokulasyon çalışmalarında, indikatör bitkilerin tohumlarının ekilmesi ve fidelerin yetiştirilmesi için kum, yanmış hayvan gübresi, toprak ve torf karışımı (1:1:1:1), plastik saksılar, plastik küvetler, plastik viyoller, mikro ve makro besin elementleri içeren gübreler ve zaman zaman zararlı ve hastalık etmenlerine karşı insektisit ve fungisitler kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan indikatör bitki tohumları, Ç.Ü. Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Bölümü, Viroloji Laboratuvarı ndan temin edilmiştir. 35

66 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN Çizelge 3.2. Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanılan test bitkileri ve testlenen virüsler Bitki Virüs Chenopodium amaranticolor Akkaz ayağı CMV, LBVV, LMV, TSWV C. quinoa CMV, LBVV, TuMV N. tabacum Tütün CMV, TSWV N. glutinosa CMV, TuMV, TSWV N. benthamiana LBVV, LMV N. clevelandii LBVV, TSWV Gomphrena globosa Hanım düğmesi LMV, TSWV Lactuca sativa Marul CMV, LBVV, LMV, TuMV, TSWV Spinacia oleracea. Ispanak CMV, LMV, TuMV, TSWV Raphanus sativus Turp CMV, TuMV, CMV Brassica olerase Lahana CMV, TuMV Cucumis sativus Hıyar CMV, TSWV Cucurbita pepo Kabak TuMV, CMV Brassica oleracea Karnabahar TuMV Toplam Nükleik Asit İzolasyon Çalışmalarında Kullanılan Materyal ELISA testleri sonucunda hangi virüsler yazalım ile infekteli olduğu saptanan arazi örnekleri ile ELISA kiti bulunmayan BCTV, BtMV, LIYV ve LBVV nin oluşturduğu simptomlara benzer simptomlar gözlenen arazi örneklerinden alınan bitki dokuları materyal olarak kullanılmıştır. Ayrıca, mekanik inokulasyon çalışmalarında simptom gözlenen indikatör bitkilerden elde edilen bitki özsuları da çalışma materyalini oluşturmuştur. Toplam nükleik asit izolasyon işleminde; tampon çözeltiler (Ek-2), steril havan ve havan eli, ependorf tüpleri, ayarlanabilir mikro pipetler ve pipet uçları, masa tipi soğutmalı santrifüj (Universal 320R) kullanılmıştır RT-PCR ve PCR Çalışmalarında Kullanılan Materyal CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, CaMV, BWYV, BCTV, BtMV, LIYV ve LBVV nin moleküler tanısı ve dizi belirleme çalışmalarında kullanılacak 36

67 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN DNA ların elde edilmesi amacıyla yapılan RT-PCR ve PCR yöntemlerinde, virüs ile bulaşık bitkilerden elde edilen toplam nükleik asitler, Moloney murine leukaemia virus den oluşan reverse transcriptase enzimi (MMLV-RT, 200U/μl, FERMENTAS, EP0441) ve reverse transcriptase reaksiyon tampon çözeltisi, Taq polymeraz (Termostabil DNA polimeraz enzim, 5U/μl, FERMENTAS, EP0401) ve 10X reaksiyon tampon çözeltisi, dntps set (datp, dgtp, dctp, dttp, 25 mm, FERMENTAS R0181), MgCI 2, MgCI 2 buffer, RNaz inhibitör (40U/μl FERMENTAS, EO0311), Bench Top 1 kb DNA Ladder marker (FERMENTAS SM0311), Bench Top 50 bp DNA Ladder marker (FERMENTAS SM0371), saf su, pipet ve steril pipet uçları, PCR tüpleri ve Çizelge (3.3) de belirtilen virüs spesifik primerler (10μM) kullanılarak yapılmıştır. Virüs genomu üzerinde hedef bölgelerin çoğaltılması işleminde gerekli sıcaklıklar, TECHNE GENIUS (TC-4000) marka PCR aleti kullanılarak sağlanmıştır. 37

68 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan primer çiftleri ve çoğaltılan bölgenin moleküler büyüklüğü Primer Çiftleri CMV TSWV TuMV BWYV LMV CaMV LIYV LBVV BtMV BCTV MiLBVV Dizi RW8-(GGTTCGAAAGAGATATAACCGGG) RV11-(GTTTATTTACAAG AGCGTACGG) L1-TSWVR.(ATCAGTCGAAATGGTCGGCA) L2-TSWVF.(AATTGCCTTGCAACCAATTC) Tu-8207F (GTG GAA TTC CAA GTG AGT TGC) Tu-8822R (TCC TTC TTCTCCTTCTCCGC) LewP0- (CAGAGCTAATCGTTTCTTGAC) SP1-(TGCGCCTGAGGAATGTAATG) 1196-(AAGGCAGTAAAACTGATG) 1087-(TTTATACTACAGTCTTTA) CaMV1- (GCGTAYACAACAAGTCAGCAA ACA) CaMV2-(TCCTGGAGATTATTACTCGGGTAGA) P26-r2-(ACTATCAGTTATCGACACAACT) P26-F-(GACCACAGCTTTGACGACGGT) VP 248-(GTTTTTGACCCTGATAG) VP.249 (GTCGACTCTAGACACTTGTTGTTTGTCGTG) LN 27 (CACTCTGTAATGTGGAACAACTC) LN 26(GACACTCAGAACTATCTCGACGAAG) (GTGGATCAATTTCCAGACAATTATC) (CCCATAAGAGCCATATCAAACTTC ) VP.286 TATCAGCTCACATACTCCCTATCG VP 287.CAACTAGCTCAGAATACATGCAG Moleküler Büyüklüğü (bç) ve Yeri 650-RNA-2 Fınettı-Sialer ve ark.,(1999) 276-RNA-Polimeraz Adkins ve ark. (2005) 615-RNA-Polimeraz Suehiro ve ark.(2005) 250-Polimeraz Beuve ve ark. (2008) 800- Kılıf Protein Skate ve ark. (2001) 383-DNA Wolf ve ark. (1999) 675-RNA-2 NG ve ark. (2004) 296-Kılıf Protein Navarro ve ark. (2004) 1050-Polyprotein Nemchinov ve ark.(2004) DNA Creamer,ve ark.,(2003) 469 Kılıf Protein Navarro ve ark. (2004) Agaroz Jel Elektroforez Çalışmalarında Kullanılan Materyal Agaroz jel elektroforez çalışmalarında, toplam nükleik asit izolasyon işlemi sonucunda elde edilen çalışma konusu virüslere ait toplam nükleik asitler ile RT- PCR ve PCR çalışmalarında elde edilen PCR ürünleri materyal olarak kullanılmıştır. Agaroz jel elektroforez işleminde, agaroz (sigma), tampon çözeltiler (Ek-4), Mini Sub. DNA Cell Elektroforez cihazı (BIORAD) ve güç kaynağı, UV ışık kaynağı (UVP Ultraviolet Transilluminator), Video Graphic printer (Sony-Lip 895 CE) ile etidyum bromür muhafaza tankından yararlanılmıştır. 38

69 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN 3.2. Metod Çalışmada, öncelikle marul, ıspanak, lahana, karnabahar ve turp bitkilerinde mevcut virüs hastalıklarının ortaya konulması amacıyla, Adana, Mersin, Hatay, Osmaniye ve Kahramanmaraş illerinin belirlenen bölgelerine arazi çıkışları yapılmış ve örnekler toplanmıştır. Bu örnekler, ticari olarak antiserumlarının ve primerlerinin temin edilmesi ile birlikte ELISA ve/veya RT-PCR ve PCR yöntemleri ile testlenmiştir. Bu işlemlerden sonra çalışma konusu virüsler ile infekteli olduğu belirlenen örneklerden alınan dokular kullanılarak var olan virüslerin biyolojik (test bitkileri üzerine mekanik inokulasyon çalışmalar ile) ve moleküler karakterizasyonları (RT- PCR ve PCR çalışmaları ve dizi analizleri ile) gerçekleştirilmiştir Survey Çalışmaları, Bitki Örneklerinin Toplanması ve Muhafazası Survey çalışmaları, ilkbahar, sonbahar ve kış dönemlerinde Adana, Mersin, Hatay, Osmaniye ve Kahramanmaraş illeri ile çevresinde marul, lahana, karnabahar, ıspanak ve turp yetiştiriciliği yapılan alanlarda gerçekleştirilmiştir. Bulaşık olduğundan şüphelenilen bitkilerin belirlenmesi amacıyla öncelikle simptomatolojik gözlemler yapılmış ve (Çizelge 3.4). CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, CaMV, RaMV, BWYV, BCTV BtMV, LIYV ve LBVV ile bulaşık olduğundan şüphelenilen bitkilerinden sap, gövde, yaprak ve meyve örnekleri alınarak. örnek kodu verilmiştir. Polietilen torbayla örnek saklama kaplarında laboratuvara getirilen bitkilerin fotoğrafları çekilmiş ve biyolojik, serolojik ve moleküler çalışmalarda kullanılıncaya kadar +4 C de muhafaza edilmiştir. 39

70 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN Çizelge 3.4. Surveylerde kışlık sebzelerde aranan simptomlar Marul Ispanak K.babar Lahana Turp CMV TSWV TUMV Mozaik, damar açılması, yaprak deformasyonu, kloroz lokal ve sistemik lezyonlar. Nekrotik ve klorotik lokal lezyonlar, sistemik - solgunluk, meyvede ve yaprakta halkalı leke, mozaik oluşumu, yaprak şeklinde deformasyon, çiçeklerde renk açılması. Klorotik lokal lezyonlar yapraklarda mozaik, kıvırcıklık LMV Mozaik, damar açılması, yaprak deformasyonu, kloroz, lokal ve sistemik lezyonlar - BWYV Bitkilerde hafif klorotik lekelenme, sararma, yaşlı yaprakların incelmesi ve gevrekleşmesi. MiLBVV Klorotik lezyonlar, - - beyaz damar açılması veya sararma. CaMV - - Damar açılması veya bantlaşması, mozaik RaMV Şiddetli sistemik kloroz ve nekroz yaprak deformasyonu, çizgi ve halka şekilleri, mozaik, damar nekrozu ve yaprakların rozetleşmesi. LIYV Şiddetli kloroz ve /veya kırmızılaşma,yapraklarda kıvrılma,gevreklik, damar açılması ve bitkide gelişme geriliği BtMV - Tepe yapraklarda küçük lokal lezyonlar, beneklenme, sararma, yaprakların kıvrılması ve damar açılması BCTV - Genç yapraklarda damar açılması, sert, bodur, sarı, kıvrılmış,kalın, gevrek, kırılgan ve deformasyona uğramış yaprak oluşumu; floemde nekroz, eksudat akıntısı, bitkide ölüm

71 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN İndikatör Bitkilerin Yetiştirilmesi Test bitkilerinin tohumları, kum, yanmış hayvan gübresi, toprak ve torf karışımını (1:1.1:1) içeren küvetlere ekilmiş ve daha sonra çıkan bitkiler 4-6 yapraklı dönemde, aynı karışımın bulunduğu plastik saksılara (12 cm çapında ve 15 cm yüksekliğinde) tek tek şaşırtılmıştır. İndikatör bitkiler, C sıcaklık, %70 nem, 16 saat gündüz ve 8 saat gece 5000 lüks aydınlatma aydınlatma koşullarına sahip kontrollü klima odalarında yetiştirilmiş ve muhafaza edilmiştir (Choueiri ve ark., 1993). Bitki Koruma Bölümü Viroloji Laboratuvarı na ait klima odasında yetiştirilen bitkiler, zararlı-hastalık ve simptom gelişimi için araştırma boyunca periyodik olarak her gün kontrol edilmiş ve bitkilerin sağlıklı büyümeleri için gerekli makro ve mikro besin elementleri sulama suyuna ilave edilmiştir. Hastalık ve zararlılara karşı gerektiğinde bitkilere pestisit uygulamaları yapılmıştır (Anonymous, 1990) Serolojik Çalışmalar Arazi çıkışlarında, simptomatolojik olarak virüs ile bulaşık olduğundan şüphelenilen bitki örnekleri virüsün varlığının ortaya konulması amacıyla öncelikle DAS-ELISA yöntemi ile testlenmiştir. Ayrıca, mekanik inokulasyon çalışmaları sonunda, simptom gözlenen indikatör bitkiler de ELISA testine tabi tutulmuştur. ELISA çalışmalarında kullanılan pleytlerin her birinde, örnek tampon çözeltisi ve sağlıklı bitkilerden alınan veya firmalardan ticari olarak temin edilmiş iki farklı negatif kontrol ve ticari olarak temin edilmiş bir pozitif kontrol kullanılmıştır. ELISA testlerinde,, sağlıklı kontrol için 405 nm de elde edilen absorbans değerinin en az iki katı ve daha fazla absorbans değeri veren örnekler pozitif olarak kabul edilmiştir (Barba ve Riccioni, 1993; Helguera ve ark., 2002). 41

72 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN DAS-ELISA Testi DAS-ELISA çalışmaları, Clark ve Adams (1977), Jain ve ark., (1998) ve ELISA kitinin temin edildiği firma tarafından bildirilen yöntemlere göre modifiye edilerek aşağıdaki şekilde yürütülmüştür. 1. Testlenen virüse spesifik poliklonal γ-globulin, firmanın (TSWV, CMV, TuMV, LMV, LBVV, MiLBVV ve CaMV ye spesifik antiserumlar: BIOREBA ve BWYV e spesifik antiserum: AGDİA) bildirdiği yönteme göre kaplama tamponunda belli oranda sulandırılarak, ELISA pleytlerine her çukura 100 μl olacak şekilde iki tekrarlamalı konulmuştur. 2. Pleytler, 30 C de 4 saat inkübasyona tabi tutulduktan sonra, yıkama tamponu ile her yıkama 3 er dakika olacak şekilde 3 kez yıkanmıştır. 3. Ekstraksiyon tampon çözeltisinde 1/10 oranında hazırlanmış olan ekstrakttan her kuyuya 100 μl konulmuş ve pleytler +4 C de bir gece inkübasyona tabi tutulduktan sonra yıkama tamponu ile yukarıdaki şekilde yıkanmıştır. 4. Konjugat tamponu içerisinde sulandırılmış olan enzimle (alkaline phosphatase ) işaretli γ-globulinden (konjugate) her kuyuya 100 er μl konulmuş ve 30 C de 5 saat inkübasyondan sonra pleytler yıkama tamponu ile yıkanmıştır. 5. Pleytlerin her kuyusuna substrate tampon çözeltisinde 1mg/ml olacak şekilde hazırlanan substrattan (1mg/ml p-nitrophenyl phosphate)100 er μl ilave edilmiş ve pleytler dakika oda sıcaklığında ışıksız ortamda bekletildikten sonra ELISA okuyucusunda okunmuştur. ELISA test çalışmalarında kullanılan tampon çözeltiler Ek. 2 de verilmiştir Mekanik İnokulasyon Yöntemi ELISA, RT-PCR ve PCR yöntemleri ile saptanan virüslerin biyolojik karakterizasyonlarının da yapılması ve toplam nükleik asit çalışmalarında kullanılacak olan bitkilerin elde edilmesi amacıyla, virüs ile bulaşık olduğu saptanan arazi örneklerinden alınan dokular kullanılarak indikatör bitkilere mekanik inokulasyon çalışmaları yapılmıştır. 42

73 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanmak amacıyla, bulaşık bitkilerden alınan taze yaprak dokuları, 1:5 oranında, 2-merkaptoetanol veya sodyum sülfit içeren 0.01M fosfat tampon çözeltisi (ph 7.0) varlığında steril porselen havanda ezilmiş ve daha önceden karborandum tozu serpilmiş indikatör bitkilerin yapraklarına mekanik olarak inokule edilmiştir. Kısa bir süre bekledikten sonra inokulasyon yapılan yapraklar çeşme suyu ile yıkanmış ve indikatör bitkiler simptom gözlenmesi amacıyla (22-24 C sıcaklık, %70 nem, 16 saat gündüz ve 8 saat gece 5000 lüks aydınlatma) klima odalarında muhafaza edilmiştir (Mandal ve ark., 2001). Ayrıca, MiLBVV nin mekanik inokulasyon çalışmalarında, 5mM 2- merkaptoetanol, 1mM EDTA (Ethylenediaminetetra acetic acid) ve 5mM NaDIECA (Sodium N, N-Diethylidithiocarbamate, Trihydrate) içeren 50 mm fosfat tampon çözeltisi (ph 7.0) kullanılmıştır (Roggero ve ark., 2000). Çalışmalar, Ç.Ü.Z.F. Bitki Koruma Bölümü Bitki Virüs Hastalıkları Araştırma Serası ve klima odalarında yürütülmüştür Toplam Nükleik Asit İzolasyonu Toplam nükleik asit izolasyonu, 1. ELISA testleri sonucunda CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, CaMV, BWYV ile infekteli olduğu saptanan arazi örnekleri, 2. ELISA kiti bulunmayan ve simptomatolojik olarak BCTV, BtMV, LIYV ve LBVV bulaşık olduğundan şüphelenilen arazi örnekleri, 3. Mekanik inokulasyon çalışmaları sonucunda simptom gösteren otsu indikatör bitkilerden alınan taze bitki dokuları kullanılarak, Astruc ve ark. (1996) nın önerdiği yönteme göre yürütülmüştür. Toplam nükleik asit izolasyonu yönteminde izlenen basamaklar: a. Örnekler ezme tamponu (100mM Tris-HCI ph.8.0, 50mM EDTA b-ph. 7.0, 500 NaCI, 10mM 2.merkapto etanol (1/1000) ) ile 1:2 (ağırlık/hacim) oranında sulandırılarak ekstrakte edilmiş ve elde edilen bitki özsuyu steril tülbentten geçirilmiştir. b. Bitki özsuyundan 1ml alınarak eppendorf tüplerine aktarılmış ve örnekler 3 dakika devir/dakika de santrifüj edilmiştir. 43

74 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN c. Sıvı kısım üzerine %20 lik Sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisinden 50 µl ilave edilerek vorteks ile karıştırılmış ve sonra tüpler 65 ºC de 30 dakika su banyosunda inkübe edilmiştir. d. Tüplere 250 µl potasyum asetat (5M) ilave edilerek 20 dakika buz içerisinde bekletilmiş ve 15 dakika devir/dakika santrifüj yapılmıştır. h. Elde edilen sıvı kısım ikiye bölünmüş ve 500 µl si eppendorf tüplerine aktarılarak -70 º C de saklanmıştır. Geriye kalan 500 µl sıvı kısım yeni hazırlanan eppendorf tüplerine konulmuş ve üzerine %100 lük etil alkolden 500 µl ilave edilip 1ml ye tamamlanarak vorteks ile karıştırılmıştır. ı. Daha sonra tüplere 50µl sodyum asetat (3M) ilave edilmiş ve örnekler tekrar karıştırılarak -70 ºC de bir gece bekletilmiştir. i. Örnekler 15 dakika devir/dakika da santrifüj edilerek sıvı kısım ortamdan uzaklaştırılmıştır. j. Eppendorf tüpleri filtre kağıdı üzerinde ters çevrilerek 5 dakika kurutulmuş ve pellet üzerine % 70 lik etil alkolden 1ml ilave edilmiştir. k. Örnekler RNA ları çöktürmek amacıyla 5 dakika devir/dakika santrifüj edilmiş ve tüp içerisindeki etil alkol atılarak eppendorf tüpleri kurutma kağıtları üzerinde kurutulmuştur. l. Elde edilen nükleik asitler 50 µl RNaz saf su ile sulandırılarak, 15µl ve 35 µl olmak üzere ikiye bölünmüş ve -70 ºC de muhafaza edilmiştir. Daha sonra agaroz jel elektroforez çalışmasıyla toplam nükleik asitlerin varlığı kontrol edilmiştir RT- PCR ve PCR Çalışmaları Çalışma konusu virüslerin moleküler tanısını yapmak, dizi belirleme çalışmalarında kullanılacak DNA ların elde edilmesini sağlamak ve ticari olarak ELISA kiti bulunmayan BCTV, BtMV, LIYV ve LBVV nü moleküler olarak saptamak amacıyla yapılan RT-PCR ve PCR çalışmaları, Prieto ve ark. (2001) ve Sidek ve ark. (1999)'a göre modifiye edilerek yürütülmüştür. 44

75 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN RT- PCR ve PCR çalışmalarında, örnek sayısının çok fazla olması nedeniyle ELISA da en yüksek absorbans değerini veren arazi örnekleri ile BCTV, BtMV, LIYV ve LBVV olabileceğinden şüphelenilen örnekler seçilerek ilçelere ve bitkilere göre kodlanmış ve moleküler çalışmalarda izolat olarak kullanılmıştır (Çizelge 3.5). Çizelge 3.5. RT-PCR ve PCR çalışmalarında kullanılan virüs izolatları, survey alanı bitki türü Virüs İzolatı Survey Alanı Bitki Türü Yöntem LBVV-1 LBVV-2 Mersin Marul RT-PCR LBVV-3 LBVV-4 Adana Marul RT-PCR LBVV-5 LBVV-6 Hatay Marul RT-PCR MiLBVV-1 MiLBVV-2 Mersin Marul RT-PCR MiLBVV-3 MiLBVV-4 Adana Maru RT-PCR MiLBVV-5 MiLBVV-6 Hatay Marul RT-PCR LMV-1 LMV-2 Mersin Marul RT-PCR LMV-3 LMV-4 Adana Marul RT-PCR LMV-5 LMV-6 Hatay Marul RT-PCR CMV-I Adana Ispanak RT-PCR CMV-M Kahramanmaraş Marul RT-PCR CMV-T Osmaniye Turp RT-PCR TSWV-1 TSWV-2 TSWV-3 Adana Marul RT-PCR CaMV-1 Mersin Karnabahar PCR TuMV-L Adana Lahana RT-PCR TuMV-T Osmaniye Turp RT-PCR BWYV-M Adana Marul RT-PCR BWYV-I Osmaniye Ispanak RT-PCR BWYV-T Osmaniye Turp RT-PCR BCTV BCTV Adana Ispanak PCR BtMV BtMV Adana Ispanak RT-PCR LIYV LIYV Adana Marul RT-PCR İki aşamada gerçekleştirilen RT-PCR yönteminde, birinci aşamada; RT (Reverse transcription) işlemi ile komplamenter DNA (cdna)'lar elde edilmiş, ikinci aşamada ise, cdna'lar kullanılarak PCR işlemi yapılmıştır. 45

76 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN I. Aşamada; PCR eppendorf tüpüne 1μl Toplam nükleik asit, 2 μl primer (10 pmol/μl,) ve 10μl su konularak PCR aletinde 95 C de 3 dakika bekletilerek nükleik asitlerin denatüre olması sağlanmıştır. Tüpler PCR aletinden alındıktan sonra buz üzerine konulmuştur. Bu sayede tüp içerisindeki revers primerin RNA üzerindeki hedef bölgeye yapışması sağlanmıştır. Daha sonra tüp içerisine 10 μl reverse transcriptase karışımı (1μl ddntp, 0,1 μl M-MLV enzimi, 5μl RT-buffer, 0,3 μl RNaz inhibitörü, 3,6 μl saf su) ilave edilerek son hacim 25 μl ye tamamlanmış ve örnekler 42 C de 1 saat inkube edilerek cdna sentezi gerçekleştirilmiştir. II-PCR aşamasında ise, ayrı bir PCR tüpüne, yukarıdaki işlemde elde edilen cdna dan 1 μl konulmuş, üzerine 16.8 μl saf su, 2.5 μl 10X PCR tampon çözeltisi (100 mm Tris- HC1 (ph 8.8), 500 mm KC1, % 0.8 Nonidet P40), 1.5 μl MgCl2, 1 μl dntp (2 mm), 0.2 μl Taq DNA polimeraz, 1 μl forward primer ve 1 μl revers primer ilave edilmiştir Daha sonra tüpler Çizelge 3.6 da görülen sıcaklıklar doğrultusunda ayarlanmış PCR aletine yerleştirilerek PCR aşaması tamamlanmıştır. RT-PCR çalışmalarının sonuçları agaroz jel elektroforez yöntemi kullanılarak gözlenmiştir. Reverse Transcriptase çalışması sonucunda elde edilen cdna nın çoğaltılması sırasında kullanılan 25 mm MgCl2 stok solüsyonu çalışma hacminde 1,5 mm, Mg Free Buffer (10X) son hacimde 1X olacak konsantrasyonda, Taq DNA Polimeraz (5u/μl) enzimi ve son olarak su son hacmi tamamlayacak miktarda kullanılmıştır. Moleküler çalışmalarda, son çalışma hacminde, reverse transcriptase (M- MLV, stok 200u/μl) enziminden 10-20u, M-MLV Buffer (stok 5X) dan 1X, RNaz inhibitörü (stok 40u/μl) nden 15u olacak şekilde kullanılmıştır (Cillo ve ark., 2004). 100 er mm olarak satın alınan Deoksinükleotid trifosfat (dttp, datp, dgtp, dctp) lardan 20 şer μl alınmış ve 25 mm olan 80μl lik dntps karışımına 120μl su ilave edilmek suretiyle 200 μl ye tamamlanmıştır. Bu karşım sonucunda dntp ler 10 mm olarak elde edilmiştir. CaMV ve BCTV nin DNA virüsü olması nedeniyle RT aşaması uygulanmamış, sadece PCR yöntemi uygulanmıştır. Serolojik çalışmalarda saptanmayan RaMV ne karşı RT-PCR çalışması uygulanmamıştır. 46

77 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN Çizelge 3.6. RT-PCR ve PCR çalışmasında kullanılan sıcaklık döngüleri LBVV ve MiLBVV LMV 95 C de 2 dakika 1 döngü 95 C de 30 saniye 62 C de 30 saniye 35 döngü 72 C de 2 dakika 72 C de 10 dakika 1 döngü BtMV ve BCTV 95 C de 2 dakika 1 döngü 95 C de 30 saniye 62 C de 30 saniye 35 döngü 72 C de 2 dakika 72 C de 10 dakika 1 döngü 94 C de 3 dakika 1 döngü 95 C de 1 dakika 41 C de 1dakika 35 döngü 72 C de 2 dakika 72 C de 10 dakika 1 döngü LİYV 94 C de 4 dakika 1 döngü 94 C de 30 saniye 50 C de 30 saniye 30 döngü 72 C de 2 dakika 72 C de 10 dakika 1 döngü RT PCR CMV 94 ºC de 4 dakika 1 döngü 94 ºC de 30 saniye 64 ºC de 1 dakika 35 döngü 72 ºC de 2 dakika 72 ºC de 10 dakika 1 döngü BWYV 94 C de 3 dakika 1 döngü 96 C de 30 saniye 60 C de 30 saniye 35 döngü 72 C de 3 dakika 72 C de 10 dakika 1 döngü TuMV 94 C de 4 dakika 1 döngü 94 C de 45 saniye 58 C de 45 saniye 35 döngü 72 C de 45 saniye 72 C de 10 dakika 1 döngü TSWV 94 C'de 2 dakika 1 döngü 94 C de 30 saniye 53 C de 30 saniye 35 döngü 72 C de 2 dakika 72 C'de 10 dakika 1 döngü BCTV CaMV PCR 95 C de 2 dakika 1 döngü 94 C de 30 saniye 59 C de 30 saniye 35 döngü 72 C de 90 saniye 72 C de 5 dakika 1 döngü 94 C de 3 dakika 1 döngü 96 C de 30 saniye 60 C de 30 saniye 35 döngü 72 C de 3 dakika 72 C de 10 dakika 1 döngü Agaroz Gel Elektroforez Çalışmaları 47

78 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN Agaroz jel elektroforez çalışması Galitelli ve Minafra (1994), nın önerdiği yöntem kullanılarak aşağıda belirtildiği şekilde yürütülmüştür. a- PCR ürünlerinin büyüklüğüne bağlı olarak agarozun %1,2, %2 ve %1,5 konsantrasyonları 20 ml 1x TBE yada 1x TAE içerisine konulmuştur. b-agaroz-tbe karışımı eriyinceye kadar mikrodalgalı bir fırın içerisinde ısıtılmış ve sonra hacim 30 ml ye ayarlanmıştır. c-karışım tekrar 60 C ye kadar soğumaya bırakılmış ve tank içerisine boşaltılarak tarak geçirilmiştir. d-jel donduktan sonra tarak dikkatli bir şekilde çıkartılmıştır. Daha sonra jel in üzerini 1-2 mm kadar kaplayıncaya kadar tank içerisine TBE ilave edilmiştir. e- 10 μl örnek üzerine 2 μl yükleme tamponu ilave edildikten sonra, toplam 12 μl karışım jeldeki çukurlara dikkatli bir şekilde yerleştirilmiştir. İlk çukura ticari bir markır (1μl yükleme tamponu +1μl markır+ 4 μl saf su) konulmuş ve yükleme tamponundaki turuncu renk (orange G) jelin sonuna gelene kadar jel tankına 40V elektrik akımı verilmiştir. f-elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra jel, oda sıcaklığında 10 dakika 10mg/ml etidyum bromür (100 ml H2O +30 μl) karışımı içerisinde boyanmıştır. Jeldeki fazla etidyum bromür uzaklaştırıncaya kadar 5 dakika saf su içerisinde tutulmuş ve sonuçlar UV transilluminatörde kontrol edilmiştir. Çalışmada kullanılan solüsyonlar Ek.4 de verilmiştir Dizi Belirleme ve Filogenetik Sınıflandırma Çalışmaları Serolojik ve moleküler çalışmalar sonucunda çalışma konusu virüsler ile infekteli olarak saptanan bitkilerden ELISA da yüksek absorbans değeri veren örnekler ve PCR da net bir bant oluşturan örnekler, alındıkları bölge ve bitki türlerine göre seçilmiş ve kod verilerek dizi belirleme ve analiz çalışmalarında izolat olarak kullanılmıştır (Çizelge 3.7). 48

79 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN Çizelge 3.7. Dizi belirleme çalışmalarında kullanılan virüs, izolat, survey alanı ve bitki türleri Virüs İzolat Survey Alanı Bitki LBVV LBVV-2 Mersin Marul MiLBVV MiLBVV-4 Adana Marul LMV LMV-4 Adana Marul CMV CMV-I Adana Ispanak TSWV TSWV-1 Adana Marul CaMV CaMV-1 Mersin Karnabahar TuMV TuMV-T Osmaniye Turp BWYV BWYV-T Osmaniye Turp DNA dizi belirleme çalışmaları iontek ( firmasından hizmet alınarak yapılmıştır. Bu amaçla, serolojik ve moleküler olarak tanısı yapılan virüslere ait PCR ürünleri, diziliminin belirlenmesi için iontek firmasına gönderilmiştir. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda izolatların çoğaltılan kısımları dünyada saptanmış olan diğer izolatlarla karşılaştırılarak benzerlik oranları belirlenmiştir. İzolatların dünyanın diğer izolatları ile benzerlik oranları belirlenmesinde amacıyla, 1. NCBI (The National Center for Biotechnology Information) ( 2. BLAST (Basic Local Aligment SearchTool), ( 3. Chromas ( 4. ClustalX , ( 5. Tree View ( programları sırasıyla kullanılmıştır. 49

80 3.MATERYAL VE METOD Bilge ALAN 50

81 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Survey ve Örnekleme Çalışmaları Çalışmanın konusunu oluşturan CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, LBVV, CaMV, RaMV, BWYV, BCTV, BtMV ve LIYV nin saptanması amacıyla yıllarını kapsayan ilkbahar, sonbahar ve kış dönemlerinde Adana, Mersin Hatay, Osmaniye ve Kahramanmaraş illeri ile çevresinde marul, lahana, karnabahar, ıspanak ve turp yetiştiriciliği yapılan toplam dekar arazi gezilmiş ve bu arazilerde bulunan bitkilerin %10 u simptomatolojik olarak tek tek incelenerek şüpheli bitkilerden örnekler alınmıştır (Şekil 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7). ELISA testleri sonucunda, alınan örneklerde varlığı saptanan çalışma konusu virüslerin bitkilerde meydana getirdiği arazi simptomlarının farklı araştırıcıların bildirdikleri simptomlarla benzer olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmada, CMV nin infekteli marul bitkilerinde; kıvrılma, sararma, mozaik, turp bitkilerinde; mozaik, sararma, ve kıvrılma, ıspanak bitkilerinde ise, deformasyon, bodurluk, yapraklarda kıvrılma meydana getirdiği gözlenmiştir. Genel olarak CMV ile infekteli bitkilerde gelişme geriliği, kıvrılma, sararma, ve mozaik simptom en çok gözlenen simptomlar arasında bulunmaktadır. Fletcher (2008) CMV nin marul bitkilerinin gelişiminde gerileme, nekrotik yaprak lekeleri ve alacalı yaprak görünümüne sebep olduğunu bildirmiştir. Thomson ve Procter (1966) marullarda bodurlaşma, özellikle yaşlı yapraklarda kloroz ve düzensiz nekrotik lezyonlar oluştuğunu, nekrozların bitkinin çürümesine ve fungal infeksiyonlara neden olduğun bildirmişlerdir. TSWV ile bulaşık olduğu saptanan bitkilerde, soğuktan zararlanmış gibi simptomlar ortaya çıktığı ve kısa sürede bu bitkilerde çürüme meydana geldiği gözlenmiştir. Konukçu aralığı çok geniş bir virüs olarak bildirilen TSWV, bitkilerde genel olarak klorotik lokal lezyon, halkalı leke, deformasyon, geriye doğru ölüm meydana getirmektedir. Bitkinin erken dönemde infeksiyonlarında, genelde bitkiler ölmekte, geç dönem infeksiyonlarında ise, bitkilerde solgunluk, sararma, kahverengi nekrozlar 51

82 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN veya yapraklarda nekrotik halkalar ile kendini göstermektedir. İnfeksiyon genellikle bitkinin bir bölgesinde meydana gelmekte ve bitki bükülmüş gibi bir görünüm almaktadır (Fletcher 2008). Buna ilaveten, Antignus ve ark. (1997) da, TSWV nin bulaşık olduğu bitkilerde, doku nekrozları, kıvrılma nekrotik lekeler ve halkalı lekeler meydana getirdiğini bildirmişlerdir. Benzer simptomlar özellikle doku nekrozları yaptıkları surveyler sırasında TSWV ile infekteli bulunan bitkilerde gözlenmiştir. TuMV, bulaşık genç bitkilerde küçük, açık yeşil, yapraklarda dairesel ve düzensiz lezyonlar meydana getirmektedir, ilerleyen dönemlerde ise yaprakların ince uzun olup, simetrisinin bozulması şeklinde simptomlar geliştirmektedir. Bitki erken dönemde infeksiyona uğradığında, gelişme geriliği meydana gelmektedir (Fletcher 2008), Bunların yanı sıra bitkilerde nekrotik halka, leke ve çizgiler meydana gelmektedir (Chivasa ve ark., 2001). Özellikle lahana ve turp da TuMV belirgin simptomlar meydana getirmiş ve araştırıcıların bildirmiş olduğu simptomlar bu araştırmada yapılan surveylerde bitkilerde gözlenmiştir. Bunların yanı sıra bu çalışmada, TuMV saptanan turp bitkilerinin aynı zamanda BWYV ile de bulaşık olduğu kaydedilmiştir. LMV, infekteli marul bitkilerinde çoğunlukla sararma, kıvrılma ve mozaik simptom meydana geldiği gözlenmiştir. Marul tarlalarında LBVV ve MiLBVV ye göre LMV nin yoğunluğunun daha az olduğu saptanmıştır. Fletcher (2008), marul bitkilerinde düzensiz yaprak şekilleri, kıvrılma, yaprak lekeleri ve mozaik simptom, damar açılması veya nekrozlar, Brunt ve ark. (1996), bitkilerde damar açılması, mozaik simptom, sararma, nekrotik lekeler meydana geldiğini, Reverse ve ark. (1997), bitkide bodurluk ve bitkinin verimsiz olduğunu bildirmişlerdir. Dinant ve ark. (1992), ise yaptıkları gözlemlerde bitkilerde bodurluk, göbek oluşturmama, lekeler ve damar açılmaları gözlemişlerdir. LBVV ve MiLBVV ile infekteli olduğu teşhis edilen bitkilerin alınmış olduğu tüm marul tarlalarında bu hastalığın yaygınlık oranının %90 civarında olduğu yapılan makroskopik inceleme sonucu belirlenmiş ve bu iki virüsün bitkide en çok oluşturduğu simptomun marul yapraklarında damar açılması, yaprakların koyu renk alması ve gürleşmesi şeklinde olduğu gözlenmiştir. Fletcher (2008) hava sıcaklığının 52

83 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN 16ºC altına düştüğü zaman şiddeti artan iri damar hastalığına sebep olan LBVV ve MiLBVV nin gelişmede gerilik medana getirdiği, karakteristik olarak iri damar oluşumuna sebep olduğunu, yapraklarda kabarmanın görüldüğünü, Hayes (2007) ise, LBVV ve MiLBVV nin marul bitkilerinin yapraklarında damar açılması, gevrekleşme, bitki renginde koyulaşma ve bitkide dolgun yapraklı bir görünüm oluştuğunu bildirmişlerdir. Arazi çalışmalarında, bitkilerde özellikle yapraklarda mozaik ve bitkide genel gelişme geriliği gözlenmiş ve bu bitkilerde CaMV nin varlığı ELISA testleri ile ortaya konulmuştur. Benzer olarak, Farhadzar ve ark. (2005) CaMV ile bulaşık bitkilerde alacalı renk oluşumu, bantlaşma, mozaik, nekrotik lekeler, sararma, deformasyon gibi simptomlar ortaya çıktığını bildirmişlerdir. BWYV ile infekteli olduğu saptanan bitkilerde, arazi koşullarında genel bir sarama ve ilerleyen dönemlerde gevrek bir yapı gözlenmiştir. Fletcher (2008) BWYV ile bulaşık bitkilerde, özellikle yaprak uçlarının hafif klorotik lekeli göründüğünü, yaprakların gitgide sararıp incelerek çabuk kırılır bir duruma geldiğini ve bu simptomların magnezyum eksikliğine benzemekte olduğunu bildirmiştir. Simptomatolojik gözlemlerle virüsün kesin tanısı mümkün olmadığından, bu çalışmada, Adana Mersin, Hatay, Osmaniye ve Kahramanmaraş illerine bağlı ilçelerde, toplam dekar araziden alınan 808 marul, 330 lahana, 137 karnabahar, 255 ıspanak ve 65 turp olmak üzere toplam 1595 örnek spesifik antiserumlar kullanılarak ELISA ile testlenmiştir. Çalışmada toplanan marul, lahana, turp, karnabahar, ıspanak örnekleri türler düzeyinde incelendiği zaman örneklerin % 50 sini marul, % 21 ini lahana, % 16 sını ıspanak, % 9 unu karnabahar, % 4 ünü turp oluşturmuştur (Şekil 4.1). 53

84 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN Şekil 4.1. Marul, lahana, turp, karnabahar, ıspanak örnek sayıları ve yüzde oranları 54

85 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN A B C Şekil 4.2. (A, B, C, D) MiLBVV ile infekteli marul yapraklarında renk koyulaşması, damar açılması ve şekil bozukluğu, D 55

86 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN A B C Şekil 4.3. (A, B, C, D) LMV ile infekteli marullarda sarama, yapraklarda kabarcıklar, şekil bozukluğu ve mozaik simptomları D 56

87 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN A B C D A E Şekil 4.4. (A) CMV ve MiLBVV karışık infeksiyonunda marul yapraklarında damar açılması ve sararma (B) MiLBVV ve LBVV ile infekteli marul yapraklarında şekil bozukluğu, nekroz ve damar açılması (C) TSWV ile infekteli marul yapraklarında nekrotik lezyonlar (D) TSWV ile infekteli marul yapraklarında nekroz (E) CMV ile infekteli marul yapraklarında şekil bozukluğu ve sararma (F) BWYV ile infekteli marulda sararma, şekil bozukluğu ve gelişme geriliği F 57

88 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN A B C D E F Şekil 4.5. (A) BWYV ile infekteli turp yaprağında sararma (B) TuMV ve BWYV ile infekteli turp yaprağında mozaik (C) TuMV ve BWYV ile infekteli turp yaprağında mozaik (D) TuMV ve BWYV ile infekteli turp yaprağında mozaik ve sararma (E) TuMV ve BWYV ile infekteli turp yaprağında şekil bozukluğu ve mozaik (F) CMV ve BWYV infekteli turp yaprağında şekil bozukluğu ve mozaik 58

89 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN A B C D Şekil 4.6. (A, B) BWYV ile infekteli ıspanak yapraklarında sararma ve gelişme geriliği (C) CMV ile infekteli ıspanak yapraklarında şekil bozukluğu (D) CMV ile infekteli ıspanak yapraklarında mozaik, sararma ve şekil bozukluğu 59

90 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN A B C D Şekil 4.7 (A) TuMV ile infekteli K. lahana yaprağında halkalı lekeler (B) TuMV ile infekteli lahana yaprağında mozaik, sararma ve damar bandlaşması (C) CaMV ile infekteli karnabahar yaprağında mozaik ve damar açılması (D) TuMV ile infekteli lahana yapraklarında mozaik ve sararma 4.2. DAS-ELISA Çalışmaları Arazi çıkışlarında simptomatolojik olarak, CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, CaMV, RaMV ve BWYV ile infekteli olduğundan şüphelenilen 808 marul, 330 lahana, 225 ıspanak, 65 turp ve 137 karnabahardan oluşan toplam 1595 bitki örneği ELISA yöntemi ile testlenmiştir (Çizelge 4.1, 4.2) ELISA testleri sonucunda, 808 marul bitkisinden 380 inde MiLBVV, 82 sinde LMV, 3 ünde TSWV, 3 ünde CMV, 3 ünde BWYV; 255 ıspanak bitkisinden 90 ında BWYV, 3 ünde CMV; 330 lahana bitkisinden 10 unda TuMV; 65 turp bitkisinden 11 inde BWYV, 6 sında CMV ve 3 ünde TuMV;

91 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN karanabahar bitkisinden 1 bitkide CaMV infeksiyonu saptanmıştır. RaMV infeksiyonuna ise, testlenen arazi örneklerinin hiçbirinde rastlanmamıştır. ELISA testlerinde, toplam 1595 arazi örneğinden 595 tanesi en az bir virüs bakımından pozitif bulunmuştur. 61

92 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN 62

93 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN 63

94 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN Çizelge 4.3. ELISA da testlenen örneklerde saptanan virüsler ve bulaşıklık oranları % İnfeksiyon oranı Marul Lahana Karnabahar Turp Ispanak LMV 10, BWYV 0, ,9 35,2 CMV 0, ,2 1,17 MiLBVV CaMV - - 0, TSWV 0, TuMV - 3,03-4,61 - MiLBVV+LMV 2, MiLBVV+CMV 0, CMV+BWYV ,5 - TuMV+BWYV ,6 - Araziden toplanan örneklerin ELISA yöntemi ile testlenmesi sonucunda, elde edilen % infeksiyon oranlarına göre, marulda MiLBVV, %47 (380 bitki), turp ve ıspanakta BWYV sırasıyla (65 bitki) %16,9 ve (255 bitki) %35,2 infeksiyon oranları ile en fazla saptanan virüsler olarak ortaya konulmuştur. Lahanada, en fazla (330 bitki) %3,03 oranında TuMV, karnabaharda ise, (137 bitki) %0,72 oranında CaMV infeksiyonu saptanmıştır. Marulda (21 bitki) %2,59 oranında MiLBVV+LMV ve (1 64

95 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN bitki) %0,12 oranında MiLBVV+CMV karışık infeksiyonlarına karşılık, turpta (1 bitki) %1,53 oranında CMV+BWYV ve (3 bitki) %4,6 TuMV+BWYV karışık infeksiyonları ortaya konulmuştur. Testlenen toplam 1595 bitki içinde değerlendirildiğinde 26 örnekte (22 marul, 4 turp) karışık infeksiyon saptanmış ve infeksiyon oranı %1,46 olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.3) Mekanik İnokulasyon Çalışmaları Yapılan mekanik inokulasyon çalışmaları sonucunda aşağıda verilen bulgular elde edilmiştir. Maruldan izole edilen CMV, N. tabacum L. cv. Samsun ve N. rustica yapraklarında mozaik, N. tabacum L. cv. Xanthi nc yapraklarında şekil bozukluğu meydana getirmiştir. Ispanaktan izole edilen CMV, C. amaranticolor da klorotik lokal lezyon, N. bentamiana da sararma, N. tabacum L. cv. Xanthi nc ve N. rustica yapraklarında mozaik simptom meydana getirmiş ve her iki izolat ile aşılanan indikatör bitkilerde simptomlar inokulasyondan bir hafta sonra gözlenmiştir. Turptan elde edilen CMV izolatı ise, C. amaranticolor yapraklarında klorotik lokal lezyon, N. bentamiana yapraklarında sararma, N. tabacum L. cv. Samsun, N. glutinosa ve N. tabacum L. cv. Xanthi yapraklarında mozaik, N. glutinosa yapraklarında şekil bozukluğuna sebep olmuş ve simptomlar inokulasyondan sonraki dördüncü günden itibaren gözlenmeye başlamıştır. Bu izolatın aşılandığı kabak bitkisi üzerinde ise, mozaik, şekil bozukluğu ve sararma simptomları ortaya çıkmıştır (Şekil 4.8, 4.9). Thomson ve Procter (1966), maruldan izole ettikleri CMV ile mekanik inokulasyon çalışmalarında, N. glutinosa, N. tabacum L. cv. Samsun ve Cucumis sativus da sistemik simptomlar gözlemişler ve CMV nin farklı ırklarından dolayı N. glutinosa da farklı şiddetlerde sistemik simptomlar meydana geldiğini bildirmişlerdir. Ayrıca, C. amaranticolar da küçük nekrotik lezyonlar ve N. glutinosa da klorotik lokal lezyonlar oluştuğunu rapor etmişlerdir CMV izolatları ile yapılan diğer bir çalışmada, mekanik inokulasyonlarda hıyar bitkisinde mozaik ve bodurluk, N. rustica ve C. quinoa da nekrotik lokal lezyonlar gözlendiği bildirilmiştir (Kaper ve Waterworth, 1981). 65

96 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN A B C D Şekil 4.8. CMV ile infekteli (A) N. tabacum L. cv. Xanthi nc yapraklarında mozaik (B) N. tabacum L. cv. Xanthi nc yapraklarında şekil bozukluğu (C) N. rustica yapraklarında mozaik (D) kabak yapraklarında mozaik 66

97 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN A B C D Şekil 4.9. CMV ile infekteli A) C. amaranticolor yapraklarında klorotik lokal lezyon (B) N. benthamiana yapraklarında sararma (C) N. tabacum L. cv. Samsun yapraklarında mozaik (D) N. glutinosa yapraklarında şekil bozukluğu ve mozaik 67

98 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN LMV bulaştırılan marul yapraklarında mozaik simptomu ortaya çıkarken, C. amaranticolor yapaklarında ileri dönemlerde nekrotiğe dönüşen klorotik lokal lezyonlar gözlenmiştir (Şekil 4.10). Sao Paulo da LMV ile yapılan mekanik inokulasyon çalışmalarında sadece C.quinoa da lokal lezyonlar gözlenmiş ve bu lezyonları gösteren indikatör bitkilerden direç geni içeren marul bitkilerine yapılan inokulasyonlar sonucu, LMV bu bitkilere mekanik olarak taşınmıştır (Stangarling, 1997: Krause-Skate ve ark., 2001 den). Seçilen altı farklı marul kültüründen iki tanesinde lokal lezyonlar gözlenmiş ve simptom gösteren bu bitkilerden LMV, N. benthamiana Domin. e başarı ile taşınmıştır. Mekanik inokulasyon işlemi %0.1 sodyum sülfit (w/v) içeren 0.2 M potasyom fosfat buffer (ph;7.2) ile, bitkiler 4-6 yapraklı dönemde iken sera koşullarında, karborandum (600 mesh) kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Krause- Skate ve ark., 2001). 68

99 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN A A B C D Şekil LMV ile infekteli (A) marul yaprağında mozaik, (B, C) C. amaranticolor yapraklarında klorotik lokal lezyonlar (D) C. amaranticolor da nekrotik lokal lezyonlar 69

100 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN Mekanik olarak MiLBVV aşılanan marul yapraklarında damar bandlaşması, mozaik, sararma ve daralma meydana gelmiştir (Şekil 4.11). Roggero ve ark. (2000), MiLBVV nin mekanik inokulasyon çalışmalarında, C. quinoa, N. occidentalis, N. benthamiana, N. tabacum White Burley ve Samsun tütün çeşitlerini ve marul bitkilerini kullanmışlardır. İnokulasyondan on gün sonra serada C de (gece-gündüz) ve sıcaklığı hiç bir zaman 20 C üzerine çıkarmadan, C.quinoa, N. tabacum White Burley yapraklarında sadece lokal lezyonlar, N. benthamiana da inokulasyondan iki hafta sonra simptom gözlenmeyen sistemik infeksiyon ve N. occidentalis yapraklarında on gün içinde lokal lezyonlar ve bunu takiben sistemik lekeler ve nekrozlar gözlemişlerdir. A B Şekil MiLBVV infekteli marul yaprağında (A) damar bandlaşması, mozaik ve sararma (B) sararma, mozaik, damar bandlaşması ve daralma 70

101 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN Maruldan izole edilen TSWV, N. tabacum L. cv. Samsun yapraklarında nekrotik lokal lezyonlar, halkalı lekeler ve şekil bozukluğu, N. tabacum L. cv. Xanthi nc yapraklarında, şekil bozukluğu, nekrotik lokal lezyonlar, N. tabacum L. cv. Xanthi bitkisinde, şekil bozukluğu, nekrotik lokal lezyonlar ve meşe yaprağı deseni, C. quinoa da klorotik lokal lezyonlar, marul yapraklarında daralma, solgunluk ve geriye doğru ölüm simptomları ortaya çıkmıştır. İndikatör bitkilerde simptomlar inokulasyondan sonra 7-10 gün içinde gözlenmiştir (Şekil 4.12). Ie (1970), bildirdiğine göre, Chatzivassiliou ve ark (1996) TSWV ile bulaşık indikatör bitkilerin yapraklarında genel olarak deformasyon, nekrotik ve klorotik lezyonlar, solgunluk, halkalı lekeler ve bitkide geriye doğru ölüm şeklinde simptomlar gözlemişlerdir. Bozdoğan (2009), maruldan izole etmiş olduğu A1, TSWV izolatını mekanik inokulasyon çalışmasında kullanmış ve 7-10 gün gibi kısa bir sürede C. quinoa da nekrotik lokal lezyonlar, N. glutinosa da kloroz ve bodurluk simptomlarına ilaveten geriye ölüm ve nekrotik lokal lezyonlar, N. tabacum L. cv. Xanthi ve N. tabacum L. cv. Samsun da deformasyon, kloroz, kıvrılma ile bitkide bodurluk gözlemiş, N. tabacum L. cv. Xanthi nc ve N. rustica da bu simptomlara ilaveten halkalı lekeler de meydana geldiğini bildirmiştir. Ayrıca C. annum da benzer olarak deformasyon, bodurluk, kloroz, yaprak kıvrılması ve halkalı lekeler simptomlarını saptamıştır. 71

102 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN A B C D E F Şekil TSWV ile infekteli A) N. tabacum L. cv. Xanthi yaprağında meşe yaprağı deseni ve şekil bozukluğu (B) N. tabacum L. cv. Xanthi yaprağında nekrotik lokal lezyonlar (C) N. tabacum L. cv. Samsun yaprağında nekrotik lokal lezyonlar ve halkalı lekeler (D) N. tabacum L. cv. Samsun yaprağında halkalı lekeler (E) N. tabacum L. cv. Xanthi nc yaprağında nekrotik lokal lezyonlar (F) C. quinoa da klorotik lokal lezyonlar 72

103 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN Karnabahardan izole edilen CaMV izolatı ise, lahana ve karnabahar bitkilerinde mozaik ve şekil bozukluğu meydana getirmiştir. İndikatör bitkiler üzerinde beklenen simptomların çıkışı yaklaşık 30 gün sürmüştür (Şekil 4.13). Farzadfar ve ark. (2005), İran da bantlaşma, mozaik, nekrotik lekeler, gelişme geriliği, sararma simptomları gösteren ve CaMV ile infekteli olarak belirlenen lahanagillerden (süs lahanası, karnabahar lahana brokoli ve şalgam) şalgam, kanola, çin lahanası, turp ve boru çiçeği (Datura metel) ne yapmış oldukları mekanik inokulasyonlar sonucunda, bitkilerde mozaik simptomlar meydana geldiğini gözlemiş ve bir izolatın (Ca-Sh1) boru çiçeği nde sistemik infeksiyona neden olduğunu bildirmişlerdir. Lahanadan elde edilen TuMV izolatı, C. amaranticolor bitkilerinde klorotik lokal lezyonlar meydana getirmiştir (Şekil 4.14). Eiras ve ark. (2007), Brezilya da yaban turpunda saptamış oldukları TuMV izolatından yapmış oldukları mekanik inokulasyonlar sonucunda, C. amaranticolor, C. quinoa, N. clevelandii, N. megalosiphon, N. sylvestris, N. tabacum White Burley ve Samsun bitkilerinde nekrotik lokal lezyonlar gözlerken, N. glutinosa ve Brassica oleraceae da sistemik klorotik lezyonlar, mozaik ve nekrozlar gözlemişlerdir. Ancak C. murale, Datura stramonium ve C. murale, Datura stramonium ve Gomphrena globosa bitkilerinde herhangi bir simptom saptamamışlardır. Harera da TuMV infekteli, nekrotik halka, çizgi ve leke şeklinde simptom gösteren lahanadan C. quinoa ya yapılan mekanik inokulasyonlar sonucu, bitkilerde klorotik ve nekrotik lokal lezyonlar gözlenmiştir (Chivasa ve ark.2001) Lin ve Lian (1983), TuMV infekteli lahana ve turptan 0,1M fosfat buffer (ph;0,7) ve karborandum (600 mesh) kullanarak mekanik inokulasyon yapmışlar ve 30 gün boyunca serada test bitkilerini gözlemişlerdir. Bitkilerden simptom göstermeyenlerin infekteli olup olmadığını doğrulamak amacı ile tekrar C. amaranticolor bitkisine inokule etmişler ve sonuç da Gompherana globosa, C. amaranticolor, N. tabacum L. cv. Samsun bitkilerinde klorotik veya nekrotik lokal lezyonlar ortaya çıkarken, C. quinoa, N. glutinosa ve N. rustica bitkilerinde sistemik lezyonlar saptamışlardır. 73

104 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN A B Şekil CaMV ile infekteli (A) karnabahar yapraklarında mozaik (B) lahana yapraklarında mozaik Şekil 4.14 TuMV ile infekteli C. amaranticolor yapraklarında klorotik lokal lezyonlar. 74

105 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN 75

106 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN 4.4. Toplam Nükleik Asit İzolasyon Çalışmaları Toplam nükleik asitler, 1. ELISA testleri sonucunda, CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, CaMV ve BWYV infekteli olduğu saptanan arazi örneklerine ait taze bitki dokularından 2. ELISA kiti bulunmayan BCTV, BtMV, LIYV ve LBVV nin oluşturduğu simptomlara benzer belirtiler gözlenen bitki dokularından 3. mekanik inokulasyon yöntemi ile virüs bulaştırılan otsu indikatör bitkilerden alınan taze bitki dokularından elde edilmiş ve TBE tampon çözeltisinde hazırlanan % 1.5 lik agaroz jel kullanılarak elektroforez yöntemi ile gözlenmiştir RT-PCR ve PCR Çalışmaları Günümüzde viroloji alanında yapılan çalışmalarda yoğun şekilde kullanılan RT-PCR yöntemi, antiserumu bulunmayan LIYV, BtMV, BCTV ve LBVV nin moleküler olarak saptanması ve ELISA testleri sonucu teşhis edilen CMV, TSWV, TuMV, BWYV, LMV, MiLBVV ve CaMV nin dizi belirleme çalışmalarında kullanılan amplifikasyon ürünlerinin elde edilmesi amacıyla ile yürütülmüştür. Çalışmada, CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, LBVV, CaMV ve BWYV ne ait primer çiftleri ile yapılan PCR işlemlerinde beklenen büyüklüğe sahip bandlar elde edilmiş, ancak LIYV, BtMV ve BCTV ye ait primer çiftleri ile yapılan PCR çalışmalarında herhangi bir band gözlenmemiştir. 76

107 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN M A B C D E F bç LBVV 50 Şekil LBVV e spesifik primer çifti kullanılarak yapılan Mersin ve Hatay illerine ait marul izolatları RT-PCR sonuçları (M; 50 bç DNA ladder A;LBVV-1, B;LBVV-2, C;LBVV-3, D;LBVV-4, E;LBVV-5, F; LBVV-6) LBVV için VP 248 ve VP 249 kodlu primer çifti kullanılarak maruldan izole edilen Mersin (LBVV-1, LBVV-2) ve Hatay (LBVV-5, LBVV-6) izolatlarına ait 296 bç büyüklüğünde bandlar elde edilmiş (Şekil 4.15), ancak Adana izolatları (LBVV-3, LBVV-4)'ndan sonuç alınamamıştır. Ticari antiserumu bulunmayan LBVV çalışmada sadece RT-PCR yöntemi kullanılarak teşhis edilebilmiştir. M A B C D E F bç MiLBVV Şekil MiLBVV ye spesifik primer çifti kullanılarak yapılan Mersin, Adana, Hatay illerine ait marul izolatlarının RT-PCR sonuçları (M; 50 bç DNA ladder, A;MiLBVV-1, B;MiLBVV-2, C;MiLBVV-3, D;MiLBVV-4, E;MiLBVV-5, F;MiLBVV-6) 77

108 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN MiLBVV için VP 286 ve VP 287 kodlu primer çifti kullanılması sonucunda maruldan izole edilen Mersin (MiLBVV-1, MiLBVV-2), Adana (MiLBVV-3, MiLBVV-4), ve Hatay (MiLBVV-5, MiLBVV-6) izolatlarına ait 469 bç lik bandlar elde edilmiştir (Şekil 4.16) Bu sonuçlar Navarro ve ark. (2004) nın yapmış olduğu çalışma ile benzerlik göstermiştir. Aynı araştırıcılar, yukarıda kodu verilen primerleri kullanılarak sırasıyla, LBVV2 ye ait 296 bç ve MiLBVV e ait 469 bç lik bandlar elde etmişlerdir. M A B C D E F bç LMV Şekil LMV ye ait primer çiftleri ve Mersin, Adana, Hatay illerine ait marul izolatları ile yapılan RT-PCR sonuçları (M; 50 bç DNA ladder, A-B;LMV-1, C-D;LMV-2, E-F;LMV-3) LMV için 1196 ve 1087 primer çiftinin kullanılması sonucunda, Mersin (LMV-1, LMV-2) Adana (LMV-3, LMV-4) ve Hatay (LMV-5, LMV-6) illerine ait marul izolatlardan 800 bç lik band elde edilmiştir (Şekil 4.17). Bu sonuç Krause- Sakate ve ark. (2001) nın yaptıkları çalışma sonucu ile benzerlik göstermiştir. Aynı araştırıcılar, marul bitkisinden elde ettikleri LMV izolatlarını saptamak amacıyla, 1196 ve 1087 kodlu primer çiftini kullanmışlar ve 800 bç büyüklüğe sahip band gözlemişlerdir. 78

109 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN M A B M C D E F G 650 bç CMV bç CMV 276 bç TSWV Şekil CMV ve TSWV ye ait primer çiftleri ile CMV-turp, CMV-ıspanak, CMV marul ve TSWV-marul izolatları için yapılan RT-PCR sonuçları (M;1kb DNA ladder, A;CMV-T1, B;CMV-T2, C;CMV-I D;CMV-M, E;TSWV- 1, F;TSWV-2, G;TSWV-3) CMV için RW8 ve RV11 kodlu primer çifti kullanılmış ve CMV nin Osmaniye den alınan turp izolatları (CMV-T1, CMV-T2) Adana dan alınan ıspanak izolatı (CMV-I), marul izolatı (CMV-M) na ait 650 bç lik bandlar elde edilmiştir (Şekil 4.18). Bu sonuç, Sialer ve ark (1999) nın yapmış oldukları çalışma sonucu ile paralel bir sonuç göstermiştir. Aynı araştırıcılar yaptıkları çalışmada, 650 bç lik band elde etmişlerdir. TSWV için L1 TSWVR ve L2 TSWVF kodlu primer çiftinin kullanılması sonucunda, Adana marul izolatlarına (TSWV-1, TSWV-2, TSWV-3) ait 276 bç lik band elde edilmiştir (Şekil 4.18). Bu sonuç, Adkins ve ark. (2005), yaptıkları çalışma ile uygunluk göstermektedir. Aynı araştırıcılar, yaptıkları çalışmada 276 bç lik band elde etmişlerdir. 79

110 BULGULAR VE TARTIŞMA Bilge ALAN M A B C D E F 383bç CaMV bç TuMV 250bç BWYV 50 Şekil CaMV, TuMV ve BWYV e ait primer çiftleri ile yapılan RT-PCR sonuçları (M; 50bç DKA ladder, A;CaMV, B;TuMV-T, C;TuMV-L izolatı, D;BWYV-M, E;BWYV-T, F;BWYV-I) CaMV için CaMV1 ve CaMV2 kodlu primerlerin kullanılması sonucunda CaMV ile infekteli karnabahar izolatından (CaMV-1) 383 bç lik band elde edilmiştir (Şekil 4.19). Bu sonuç, Wolf ve ark. (1999), nın yaptıkları çalışma sonucu ile benzerlik göstermiştir. Aynı araştırıcılar yaptıkları çalışmada 383 bç büyüklüğünde band elde ettiklerini bildirmişlerdir. TuMV için Tu-8207F ve Tu-8822R kodlu primer çiftinin kullanılması sonucunda TuMV ile infekteli Osmaniye den turp izolatı (TuMV-T) ve Adana dan lahana izolatına (TuMV-L) ait 615 bç lik band elde edilmiştir (Şekil 4.19). Bu sonuç, Suehiro, ve ark. (2005), yaptıkları çalışma sonucu ile benzerlik göstermiştir. Aynı araştırıcılar çalışmalarında 615 bç büyüklüğünde band elde etmişlerdir. BWYV için LewP0+ ve -SP1- kodlu primer çiftinin kullanılması ile BWYV ile infekteli olduğu saptanmış Adana dan marul izolatı (BWYV-M), Osmaniye den turp (BWYV-T) ve ıspanak (BWYV-I) izolatlarına ait 250 bç lik band elde edilmiştir (Şekil 4.19). Bu sonuç, Beuve ve ark. (2008) nın yaptıkları çalışma sonucu ile benzerlik göstermiştir. Aynı araştırıcılar çalışmasında 250 bç büyüklüğünde band elde etmişlerdir. 80

Daha göster