Çukurova Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Balcalı Adana

Transkript

1 LAMBDA-CYHALOTHRİNİN Oreochromis niloticus da KARACİĞERDE PİPERONİL BÜTOKSİT MODÜLATÖRLÜĞÜNDE OKSİDATİF STRES POTANSİYELİNİN BELİRLENMESİ, STRES PROTEİNLERİ ve APOPTOZİS ÜZERİNE ETKİLERİ * Çukurova Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Balcalı Adana Petek PİNER Biyoloji Anabilim Dalı Nevin ÜNER Biyoloji Anabilim Dalı ÖZET Bu çalışmanın amacı α-siyano sentetik piretroid insektisid ve akarisid lambda-cyhalothrinin juvenil Oreochromis niloticus da karaciğer dokusunda, GSH redoks durumu ve GSH-bağımlı enzimlere, lipid peroksidasyonuna, stres proteinleri ve apoptozise etkilerini sitokrom P450 modülatörü PBO etkisinde araştırmaktır. Bu amaçla, balıklar 0.48 µg/l lambda-cyhalothrin ve 0.01 mg/l PBO içeren suda 96 saat ve 15 gün sürelerle bekletilerek karaciğer dokularında tgsh, GSH, GSSG ve TBARS miktarları ile GSH/GSSG oranı, GPx, GR, GST ve kaspaz-3 enzim aktiviteleri spektrofotometrik yöntemlerle, HSP70 miktarı ELISA test tekniği ile araştırılmıştır. Lambda-cyhalothrinin akut etkide TBARS miktarında artışa neden olduğu, subakut etkide lipid peroksidasyonunu engellemek üzere tgsh ve GSH miktarları ile GST enzim aktivitesini artırdığı belirlenmiştir. PBO varlığında lambdacyhalothrinin akut ve subakut etkide tgsh, GSH miktarları ile GST enzim aktivitesinin yanında subakut etkide GPx enzim aktivitesi ile HSP70 ve TBARS miktarlarını artırdığı belirlenmiştir. Akut etkide kaspaz-3 aktivitesi artan GST aktivitesiyle ilişkili olarak inhibe olmaktadır. Bu çalışmada uygulanan derişimde lambda-cyhalothrinin oksidatif strese neden olduğu ve oksidatif strese karşı GSH ve GSH-bağımlı enzimler ile adaptasyon sağlandığı belirlenmiştir. PBO modülasyonu lambda-cyhalothrinin oksidatif toksisitesine sinerjist etki yapmaktadır. HSP70 indüksiyonunun artan oksidatif strese karşı adaptif bir yanıt olabileceği düşünülmektedir. Kaspaz-3 inhibisyonunun artan GST aktivitesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Lambda-cyhalothrin etkisinde GST aktivitesindeki artışın bileşiğin detoksifikasyonunda GSH konjugasyonu için değil, bileşiğin oksidatif etkilerini gidermek için olduğu düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Oreochromis niloticus, Lambda-cyhalothrin, Oksidatif stres, Apoptozis, Piperonil bütoksit ABSTRACT The aim of the present study was to investigate the effects of α-cyano synthetic pyrethroid insecticide and acaricide lambda-cyhalothrin in the presence of * Doktora Tezi-Ph.D. Thesis

2 PBO, a modulator of cytochrome P450, on glutathione redox status and GSHrelated enzymes activities, lipid peroxidation, stress proteins and apoptosis in the liver of Oreochromis niloticus. For this aim, fish were placed in 0.48 µg/l lambdacyhalothrin and 0.01 mg/l PBO containing water for 96-h and 15-d. tgsh, GSH, GSSG and TBARS contents, GSH/GSSG ratio, GPx, GR, GST and caspase-3 enzymes activities were determined spectrophotometrically, while HSP70 content was measured by ELISA test technique. It was shown that acute treatment of lambda-cyhalothrin causes an increase in TBARS contents while tgsh and GSH contents and GST enzyme activity were increased to block lipid peroxidation in subacute effect. Beside an elevation in GPx enzyme activity and HSP70, TBARS contents in subacute effect; tgsh, GSH contents and GST enzyme activity were increased in both acute and subacute effects of lambda-cyhalothrin+pbo treatment. A relationship was observed between reduced caspase-3 and increased GST activities in acute treatment. Results of the present study revealed that lambda-cyhalothrin causes oxidative stress in the applied concentration and increases in GSH and GSHrelated enzymes supply an adaptation to its oxidative effects. PBO synergistically modulates the oxidative stress potential of lambda-cyhalothrin. HSP70 induction could be an adaptive response to oxidative stress caused by lambdacyhalothrin+pbo treatment. It was shown that inhibition of caspase-3 activity is related to the induced GST enzyme activity. Induced GST enzyme activity suggested an adaptive response against oxidative stress induced by lambdacyhalothrin treatment, rather than a conjugation reaction with GSH for detoxicification. Key Words:Oreochromis niloticus, Lambda-cyhalothrin, Oxidative stress, Apoptosis, Piperonyl butoxide Giriş Reaktif oksijen türleri, oksidatif strese neden olan ve hücresel hasara yol açan, proteinler, membran lipidleri, nükleik asitler ve ektraselüler matriksi destekleyen yapılar ile tepkime vermektedir (Jesberger ve Richardson, 1991). Hücreler normal hücresel solunum ve inflamasyon gibi diğer hücresel süreçlerde üretilen ROS hasarına karşı koruyucu antioksidantlar ya da ROS temizleyici sistemlere sahiptir. Hücredeki bu antioksidantlardan en önemlisi GSH dır (Jesberger ve Richardson, 1991). GSH elektofilik ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu ve ROS un hücreden uzaklaştırılması gibi çok sayıda hücresel işleve sahiptir (Meister ve Anderson, 1983). Serbest radikallerin temizlenmesinde GPx enziminin katalizlediği tepkimeyle GSH ın okside formu olan GSSG oluşur. Hücrede oluşan GSSG, glutatyon redüktaz (GR; EC ) enziminin katalizlediği tepkimeyle fizyolojik koşullarda NADPH ın varlığında tekrar GSH a indirgenir ve böylece hücrede GSH/GSSG oranı sabit tutulmaya çalışılır (Hall, 1999). ROS un temizlenmesinin yanı sıra GSH, GSH konjugatları oluşturmak üzere toksik bileşiklerle non-enzimatik ya da enzimatik olarak glutatyon S-transferaz (GST; EC

3 ) ailesi aracılığı ile tepkimeye girerek ksenobiyotiklerin detoksifikasyonunda da rol oynamaktadır (Anderson, 1998). ROS un hücrenin fiziksel durumunu modüle ettiği ve hücre ölümünü etkilediği bilinmektedir. Birçok deneysel bulgu ile ROS ve apoptozis (programlanmış hücre ölümü) arasında bir ilişki bulunduğu da gösterilmektedir. Apoptotik hücre ölümünde kaspazlar olarak bilinen sistein proteaz ailesi tarafından yürütülen iki süreç vardır. Ekstrinsik ya da intrinsik apoptotik süreçler sonunda en yaygın ölçülen kaspaz aktivitesi kaspaz-3 tür (Migliarini ve ark., 2005) ve kaspaz-3 aktivitesi pestisid etkisinde apoptozis için bir markır olarak değerlendirilmektedir (Pena-Llopis ve ark., 2003). Apoptozisi tetikleyen uyartılar hücrede aynı zamanda ısı şok proteinlerinin (HSP) akümülasyonuna neden olmaktadır. Son 10 yılda yapılan çalışmalar HSP lerin anti-apoptotik özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. HSP ler stres sinyalleri ve apoptotik molekülerle ilişkilidir ve böylece hücre ölümünü bloke ederek hücrenin yaşamasını, çoğalmasını ve farklılaşmasını destekleyebilmektedir (Sreedhar ve Csermely, 2004). Laboratuvar çalışmaları HSP70 in çevresel çalışmalarda biyomarkır olarak kullanımlarının olanaklı olduğunu göstermektedir (Bierkens ve ark., 1998). Lambda-cyhalothrin 1977 yılında geliştirilmiş sentetik piretroid insektisid ve akarisiddir. Moleküler yapısında bulunan -siyano grubu ile Tip 2 piretroidlere dahil edilmiştir (WHO, 1990). Lambda-cyhalothrin log K ow değeri 7 olup, oldukça lipofilik bir bileşiktir ve canlılarda birikebilme yeteneğindedir. Toksikolojik araştırmalarda kimyasal inhibitör ya da indükleyicilerin kullanımı ksenobiyotik metabolizmasında önemli metabolik yolların belirlenmesinde en önemli stratejilerden biridir (El-Merhibi ve ark., 2004). Bu amaçla kullanılan sitokrom P450 (CYP450) inhibitör ve indükleyicilerinden birisi PBO dur. Bu çalışmada sentetik piretroit insektisid ve akarisid lambda-cyhalothrinin toksik etkileri bir model organizma olan O. niloticus da karaciğer dokusunda GSH metabolizması, stres proteinleri, lipid peroksidasyonu ve apoptozis üzerine etkileri belirlenerek PBO modülatörlüğünde araştırılmıştır. Ayrıca GSH metabolizması, stres proteinleri ve apoptozis arasındaki ilişki de değerlendirilmiştir. Materyal ve Yöntem Araştırmada model organizma olarak kullanılan juvenil O. niloticus örnekleri (15.49±2.1 g ağırlık ve 10.28±0.86 cm boy) Ç.Ü. Su Ürünleri Fakültesi yetiştirme havuzlarından alınarak dinlendirilmiş musluk suyu içeren 130 L lik cam akvaryumlarda 1 ay süreyle laboratuvar koşullarına adapte edilmişlerdir. Akvaryumlarda havalandırma merkezi sistemle sağlanmıştır. Laboratuvar sıcaklığı 20 2 o C de tutularak 12 saat aydınlatma periyodu uygulanmıştır. Suyun özellikleri; sıcaklık 20.14±0.38 C, ph 8.1±0.19, çözünmüş oksijen 7.17±0.22 mg/l, toplam sertlik 269 mg/l CaCO 3, alkalinite 285 mg/l CaCO 3 tür. Balıklar deneme süresince günde bir kez aynı saatlerde ağırlıklarının %3 ü kadar hazır yavru sazan balık yemi ile beslenmişlerdir (Çamlı Yem, İzmir, Türkiye). Denemeler stok akvaryumlarla aynı laboratuvar koşullarında altı tekrarlı olmak üzere kontrollü olarak yürütülmüştür

4 Pestisid olarak lambda-cyhalothrinin ticari formülasyonu olan Karate Zeon 2.5, Syngenta (50 g/l)] seçilmiştir. Toksisite Denemeleri Lambda-cyhalothrinin O. niloticus da 96 saatlik LC 50 değeri APHA, AWWA, WEF, 1998 protokolüne uygun olarak belirlenmiştir. Toksisite denemeleri 130 L dinlendirilmiş musluk suyu içeren 5 adet cam akvaryumda yürütülmüştür. Her bir akvaryuma 12 balık yerleştirilmiştir. Ön denemelerle belirlenen lambdacyhalothrinin 96 saat LC 50 değerinin 1/6 sı olan 0.48 µg/l ve 0.01 mg/l PBO 96 saat (akut) ve 15 gün (subakut) sürelerle uygulanmıştır. Denemelerde PBO asetonda çözümüştür. Toksisite denemeleri süresince balıklar her gün taze hazırlanmış toksikant içeren akvaryumlara aktarılarak su değişimi sağlanmıştır. Denemeler kontrollü olarak yürütülmüştür. Deneme süreleri sonunda her bir akvaryumdan 6 balık alınarak ağırlıkları ve boyları ölçülerek dekapitasyonla öldürülmüştür. Karaciğer dokuları disekte edilerek fizyolojik su (%0.59 NaCl) ile yıkandıktan sonra iki kısma ayrılarak tartılmış ve analizlere kadar -80ºC de saklanmıştır. Biyokimyasal Analizler Karaciğer dokularının birinci kısmı fosfat ile tamponlanmış tuz çözeltisi (ph 7.4) ile homojenize edilip +4ºC de x g de 20 dakika santrifüjlenmiştir (De Boeck ve ark., 2003). Elde edilen süpernatant HSP70, MDA, protein miktarları ve GPx, GR, GST enzim aktivitelerinin belirlenmesinde kullanılmıştır. tgsh, GSSG miktarlarının belirlenmesi amacıyla, hazırlanan süpernatantlar 1/0.5 oranında %10 luk 5-sülfosalisilik asit ile karıştırılıp x g de 5 dakika santrifüjlenmiştir. Karaciğer dokularının ikinci kısmı kaspaz-3 enzim aktivitesinin belirlenmesi amacıyla kaspaz-3 aktivite kitinin içerisinde bulunan lizi tamponu ile homojenize edilip +4ºC de x g de 15 dakika santrifüjlenmiştir (Meki ve ark., 2004). Total GSH miktarı, DTNB, NADPH ve GR varlığında enzimatik döngü prosedürü ile ölçülmektedir (Anderson, 1985). GSSG miktarı indirgenmiş fraksiyonun 2-vinilpiridin ile türevlendirilmesi ile analiz edilmiştir (Griffith, 1980). GPx aktivitesi Beutler, 1984 yöntemiyle, GR aktivitesi Carlberg ve Mannervik, 1975 yöntemiyle, GST aktivitesi Habig ve ark. (1974) nın önerdiği yönteme göre, lipid peroksidasyonunun belirteci olan TBARS düzeyleri Ohkawa ve ark. (1979) yöntemine göre, protein derişimi Bradford yöntemi ile (1976), HSP70 miktarı ELISA test tekniği kullanılarak De Boeck ve ark. (2003) nın önerdiği yönteme göre, kaspaz-3 enzim aktivitesi kolorimetrik deney kiti kullanılarak belirlenmiştir. İstatistiksel analiz Biyokimyasal analiz sonuçları SPSS 16.0 paket programında OneWay- ANOVA ve LCD post-hoc testi kullanılarak P<0.05 önem derecesinde belirlenmiştir

5 Sonuçlar Lambda-Cyhalothrinin Jüvenil O. niloticus da 96 saat LC 50 Değeri Derişimlere göre ölen balık sayısı kullanılarak probit analizi istatistik yöntemi ile O. niloticus da lambda-cyhalothrinin 96 saat LC 50 değeri µg/l olarak belirlenmiştir. Çözücü Asetonun Parametrelere Etkileri Çalışılan parametreler üzerine asetonun kontrole göre ve uygulama zamanlarına göre herhangi bir etkisi bulunamamıştır (P>0.05,). Lambda-cyhalothrin ve PBO nun GSH Redoks Durumuna Etkileri Karaciğer dokusunda 96 saat sonunda lambda-cyhalothrin ve lambdacyhalothrin+pbo etkisinde tgsh ve GSH miktarında herhangi bir değişim belirlenmemiştir. 15. gün sonunda tgsh ve GSH miktarları lambda-cyhalothrinin ve lambda-cyhalothrin+pbo etkisinde artmaktadır. Lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde GSSG miktarı ile GSH/GSSG oranında herhangi bir değişim belirlenmemiştir. Lambda-cyhalothrin ve PBO nun GSH-Bağımlı Enzim Aktivitelerine Etkileri Lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde GPx ve GR spesifik aktivitelerinde herhangi bir değişim bulunmamıştır. Lambda-cyhalothrin+PBO etkisinde GPx aktivitesi lambda-cyhalothrin etkisine göre %66 artış göstermiştir. Lambdacyhalothrin uygulaması GST spesifik aktivitesinin 15 gün sonunda %75 oranında artmasına neden olmuştur. GST spesifik aktivitesi, PBO ve lambdacyhalothrin+pbo nun 96 saat etkisinde indüklenmiştir. Lambda-cyhalothrin+PBO etkisinde 15 gün sonunda karaciğer dokusunda GST spesifik aktivitesi %30 oranında artmıştır. Aktivitede meydana gelen artış ile aynı sürede artan tgsh ve GSH miktarları arasında herhangi bir ilişki saptanmamıştır (sırasıyla r= ve r= ; P>0.05, N=12). Lambda-cyhalothrin ve PBO nun HSP70 ve TBARS Miktarları ile Kaspaz-3 Enzim Aktivitesine Etkileri Lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde 96. saatte HSP70 miktarında herhangi bir değişim bulunmamıştır. Lambda-cyhalothrin+PBO etkisinde 15. günde HSP70 miktarı kontrole göre %93 oranında artış göstermiştir. Kaspaz-3 spesifik aktivitesi lambda-cyhalothrin+pbo nun 96 saat etkisi sonunda kontrole göre %56 oranında azalma göstermiştir. Aktivitede meydana gelen azalma aynı sürede tgsh ve GSH miktarlarında görülen artışla ilişkili değildir (sırasıyla r=0.313 ve r=0.386, P>0.05, N=12). 15. günde kaspaz-3 spesifik aktivitesi kontrol düzeylerine ulaşmıştır. 15. gün sonunda kontrol düzeylerine ulaşan kaspaz-3 aktivitesi ile aynı sürede artış gösteren tgsh ve GSH miktarları arasında korelasyon olduğu saptanmıştır (sırasıyla r=0.664, r=0.683, P<0.05, N=12). Lambda-cyhalothrin 96 saat sonunda TBARS miktarının kontrole oranla %51 oranında artışına neden olmuştur. TBARS miktarı lambda-cyhalothrinin 15 gün etkisi sonunda da %37 oranında artış göstermiştir ve bu artışın aynı sürede artan tgsh miktarı ile ilişkili olduğu belirlenmiştir (r=0.652, P<0.05, N=12). PBO etkisinde 15. günde TBARS miktarında kontrole göre %84 oranında artış belirlenmiştir. Lambda

6 cyhalothrin+pbo nun 15 gün etkisi sonunda TBARS miktarında %86 oranında artış saptanmıştır. TBARS miktarında meydana gelen artışın aynı sürede artan HSP70 miktarı ile ilişkili olduğu da belirlenmiştir (r=0.794, P<0.05, N=12). Tartışma Bu çalışmanın bulgularına göre O. niloticus da karaciğer dokusunda bir α- siyano sentetik piretroid insektisid ve akarisid olan lambda-cyhalothrin, oksidatif stresi belirlemede sıklıkla kullanılan lipid peroksidasyonunu akut ve subakut artırarak oksidatif etkiler göstermektedir. Subakut etkide O. niloticus da karaciğer dokusunda tgsh ve GSH miktarlarının artırılması yoluyla lambda-cyhalothrinin oksidatif etkilerine karşı adaptasyon sağlanılmaya çalışılmıştır. Artan lipid peroksidasyonu ile tgsh miktarı arasındaki korelasyon bu durumu desteklemektedir. GSH ın oksidatif strese karşı koruyucu ve adaptif rolü akuatik organizmalarda yoğun bir şekilde araştırılmıştır (Regoli ve Principato, 1995; Ahmad ve ark., 2006). Sentetik piretroid insektisid deltamethrinin 48 saat etkisinde kalan Channa punctata da karaciğer ve böbrek dokularında GSH miktarının ve lipid peroksidasyonunun artış gösterdiği saptanmıştır. Deltamethrinin balık dokularında oksidatif stres indükleme potansiyelinin olduğu ve GSH ın deltamethrinin peroksidatif etkisine uyum sağlamak üzere artırıldığı bildirilmiştir (Atif ve ark., 2005). Lambda-cyhalothrinin GSH ile konjugasyon yapıp yapmadığına ilişkin herhangi bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu çalışmada subakut etkide tgsh ve GSH miktarlarında meydana gelen artışın, lambda-cyhalothrinin detoksifikasyonu yerine, lipid peroksidasyonu indüksiyonu nedeniyle bu bileşiğin oksidatif etkilerini gidermeye yönelik olduğu düşünülmektedir. Subakut etkide lambda-cyhalothrin ve PBO nun birlikte uygulamasında GPx aktivitesinin lambda-cyhalothrinin tek başına uygulamasına oranla önemli düzeyde artması bu durumu desteklemektedir. Ellinger-Ziegelbauer ve ark. (2005) PBO etkisinde Nrf-2 indüksiyonu ile GSH sentezinden sorumlu γ-gcs enziminin katalitik ünitesinin ve GS enziminin ekspresyonunda artış olduğunu bulmuşlardır ve bu çalışmada lambdacyhalothrin+pbo etkisinde lambda-cyhalothrinin ayrı etkisine göre tgsh ve GSH miktarlarındaki artış bu bulgu ile ilişkilendirilebilir. GST multienzim ailesi GSH ı kullanarak çok sayıda ksenobiyotiğin detoksifikasyonunda görev alır ve lipid hidroperoksidlerin detoksifikasyonu ile oksidatif strese karşı hücrenin korunmasında önemli role sahiptir (Fournier ve ark., 1992). Zararlı böcek türlerine karşı kullanılan diğer insektisid gruplarından farklı olarak, GST enzim ailesi piretroid bileşiklerin detoksifikasyonunda yer almazlar (Vontas ve ark., 2002). Bunun yerine piretroid bileşiklerin indüklediği lipid peroksidasyonu ürünlerinin detoksifikasyonu yoluyla dokuları oksidatif hasardan korurlar ve bu şekilde dirençlilik sağlarlar (Vontas ve ark., 2001). O. niloticus'da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrinin tek başına ve PBO ile birlikte etkisinde meydana gelen GST enzim indüksiyonunun lipid peroksidasyonu yoluyla oksidatif hasardan korunmak üzere adaptif bir yanıt olduğu düşünülmektedir. Som balığı kültürlerinde deniz bitlerine karşı koruyucu olarak

7 kullanılan sentetik piretroid cypermethrin etkisinde Carcinus maenas da GST enzim aktivitesinin artış gösterdiği belirlenmiş ve GST indüksiyonunun cypermethrin kontaminasyonu için olası bir biyomarkır olduğu bildirilmiştir (Gowland ve ark., 2002). Deltamethrin etkisinde C. punctatus da karaciğer ve böbrek dokusunda GST enzim aktivitesinin arttığı, bu durumun ROS artışına bağlı olumsuz etkilere karşı koruma sağladığı ve artışın aynı sürede gözlenen GSH artışı ile ilişkili olduğu bildirilmiştir (Sayeed ve ark., 2003). Bu çalışmada, lambda-cyhalothrin ve PBO nun birlikte etkisinde subakut etkide belirlenen GST indüksiyonunun artan tgsh ve GSH miktarlarından bağımsız olması, tgsh ve GSH miktarının GST aktivitesinde tek başına sınırlayıcı faktör olmadığını göstermektedir. Çeşitli bölgelerden alınan kontamine suların etkisinde bırakılan A. anguilla da böbrek dokusunda GST aktivitesi artarken GSH miktarında herhangi bir değişim bulunamamıştır ve değişmeyen GSH düzeylerinden yola çıkarak GST enzimi için GSH düzeyinin tek başına sınırlayıcı etken olamayacağı bildirilmiştir (Ahmad ve ark., 2006). Değişik strüktürel yapılardaki bileşiklerin GST enziminin ekspresyonunu artırabilmesi nedeniyle GST enziminin indüksiyonunda bir takım farklı mekanizmaların bulunduğu bildirilmektedir (Mitchell ve ark., 1997). Reaktif oksijen türleri proteinlerdeki yan zincirlerde bulunan aminoasitlerin oksidasyonuna, protein-protein çapraz bağlarının oluşmasına ya da protein iskeletinin oksidasyonuna neden olmaktadır ve ROS üretimine neden olan tüm tepkimeler protein oksidasyonuna yol açabilmektedir (Berlett ve Stadtman, 1997). Moleküler şaperonlar olarak HSP ler doğal konformasyonunda olmayan proteinlerin doğal konformasyonuna kavuşturulması ve protein agregatlarının yıkımı ve hücreden uzaklaştırılmasında görev alırlar (Feder ve Hofmann, 1999). HSP ler içerisinde özellikle HSP70 in çevresel kirleticileri de kapsayan farklı stres etkenlerinin varlığı için spesifik olmayan bir biyomarkır olarak kullanılabileceği bildirilmiştir (Boutet ve ark., 2004). Lambda-cyhalothrin ve PBO nun birlikte etkisinde subakut sürede HSP70 indüksiyonu ile PBO nun lambda-cyhalothrinin oksidatif stres etkisini artırarak sinerjist etki gösterdiği belirlenmiştir. PBO nun sıçan karaciğerinde oksidatif protein hasarı ile ilgili genlerin ekspresyonunda artışa ve uzayan etki süreçlerinde hücrelerde nekroza neden olduğu bildirilmektedir (Ellinger-Ziegelbauer ve ark., 2005). PBO etkisinde oksidatif hasar görmüş proteinlerin hücreden uzaklaştırılmasına yönelik ilgili genlerin ekspresyonlarındaki artışla, bu proteinlerin sitotoksisitesine karşı adaptasyon oluşturulacağı belirtilmektedir. Sentetik piretroid esfenvalerate etkisinde Morone saxatilis karaciğer dokusunda HSP70, HSP90 ve ROS artışına neden olabilen CYP1A1 gen ekspresyonlarında artış olduğu bildirilmiştir (Geist ve ark., 2007). Bu çalışmada HSP70 miktarında meydana gelen artış lipid peroksidasyonundaki artış ile ilişkilidir. HSP70 ailesi üyelerinin düşük moleküler ağırlıklı HSP lere benzer şekilde oksidatif etkilerden korunmada etkili oldukları bildirilmektedir (Sreedhar ve Csermely, 2004). Sentetik piretroid lambdacyhalothrinin PBO ile birlikte etkisinde HSP70 indüksiyonunun oksidatif stres ile

8 ilişkili olduğu ilk kez bu çalışma ile gösterilmiştir. Özellikle lipid peroksidasyonu ile HSP artışı arasındaki ilişkinin, proteinlere oksidatif hasarı belirlemede sıklıkla kullanılan protein karbonil düzeylerinin ölçülmemiş olmasına karşın, lambdacyhalothrin-indüklü yoğun oksidatif koşullara bir kanıt olduğu ve HSP70 indüksiyonunun lipid peroksidasyonu ürünlerinin etkisiyle proteinlerin modifikasyonuna karşı koruyucu olabileceği düşünülmektedir. Lipid peroksidasyonu ürünü 4-hidroksi-2-nonenal in hücrede proteinlerde bulunan histidin, lizin ve sistein ile kovalent bağlar yaparak proteinlerde modifikasyona neden olduğu belirtilmiştir (Butterfield ve Lauderback., 2002). Kaspazlar, apoptozisin düzenlenmesinde görev alan anahtar enzimlerdir. Kaspaz-3 başta olmak üzere efektör kaspazların aktivasyonu organizmalarda apoptozis markırı olarak değerlendirilmektedir (Liu ve ark., 2007) ve çeşitli çevresel kirleticilerin kaspaz-3 aktivasyonu ile apoptozise neden olduğu belirlenmiştir (Chen ve ark., 2003; Risso-de Faverney ve ark., 2004; Ali ve ark., 2007). Organofosforlu dichlorvos etkisinde A. anguilla'da karaciğer dokusunda kaspaz-3 ve GST enzim aktivitelerinin 96 saatlik etki süresi sonunda azaldığı bildirilmiştir (Pena-Llopis ve ark., 2003). GSH redoks durumunun dichlorvos-indüklü oksidatif stresi ve kaspaz-3 inaktivasyonunu belirlediği ve hücrelerin apoptotik ya da nekrotik ölümlerinde rolü olduğu bildirilmiştir. O. mykiss de hepatositlerde Cd etkisinde mitokondriden sitokrom c salınımının arttığı ve buna bağlı olarak kaspaz- 3 aktivasyonu ile apoptozisin indüklendiği bildirilmiştir, bu sürecin 2,2,6,6- tetrametilpiperidinil-1-oksil (TEMPO) ve NAC gibi antioksidantlarla indirgenebildiği belirlenmiştir (Risso-de Faverney ve ark., 2004). Bu çalışmada akut sürede lambda-cyhalothrin+pbo etkisinde tgsh ve GSH miktarlarında herhangi bir değişim belirlenmemiştir, ancak aktivitesi artan GST enziminin apoptotik süreçlerde aktif rol alarak kaspaz-3 inaktivasyonuna neden olduğu düşünülmektedir. GSTM-1 ve GSTM-2 enzimleri apoptozis sinyal düzenleyici kinaz-1 (ASK-1) ve c-jun N- terminal kinazın (JNK) direkt inhibitörleri olarak kabul edilmektedir ve bu özellikleri katalitik detoksikasyon aktivitelerinden ve hücresel GSH düzeylerinden bağımsızdır (Adler ve ark., 1999; Cho ve ark., 2001). Adler ve ark. (1999) aşırı GST ekspresyonu yapan tümör hücrelerinin yüksek intrinsik JNK inhibitör aktivitesi yoluyla apoptozisten kaçtıklarını belirlemişlerdir. Bu kanıtlar osmotik stres, TNF-α ve UV radyasyonu gibi apoptotik sinyallere karşı GST lerin hücre korunmasında yer aldıklarını göstermektedir (Gilot ve ark., 2002). Bu çalışmada subakut sürede lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde normalleşen kaspaz-3 aktivitesinin artan tgsh ve GSH miktarları ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Apoptozis ile hücresel redoks durumunun yakın ilişkili olduğunu gösteren birçok çalışma bulunmaktadır (Creagh ve ark., 2000; Pena-Llopis ve ark., 2003). Kaspaz-3 normalleşmesinin, lambda-cyhalothrinin oksidatif etkilerinden korunmak üzere hücresel adaptasyon mekanizması olarak tgsh ve GSH miktarlarındaki artışa bağlı, olası apoptotik sinyallerin azaltılmasının bir sonucu olduğu düşünülmektedir. Aynı sürede artan lipid peroksidasyonu, hücrelerin apoptozisten nekrozise yönlendiğini göstermesi bakımından önemli bir bulgudur. A. anguilla da dichlorvos etkisinde azalan kaspaz-3 aktivitesinin antioksidant NAC

9 varlığında kontrol düzeylerine yaklaştığı bildirilmiştir (Pena-Llopis ve ark., 2003). O. mykiss de hepatositlerde Cd etkisinde meydana gelen kaspaz-3 aktivasyonunun TEMPO ve NAC gibi antioksidantlarla indirgenebildiği belirlenmiştir (Risso-de Faverney ve ark., 2004). Sonuç O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrinin oksidatif strese neden olduğu lipid peroksidasyonundaki artışla gösterilmiştir. Lambda-cyhalothrinin neden olduğu oksidatif strese karşı tgsh, GSH ve GSH-bağımlı enzimler ile adaptif yanıt oluşturulduğu ortaya çıkarılmıştır. PBO nun lambda-cyhalothrinin oksidatif stres oluşturma potansiyelini artırarak sinerjist etki gösterdiği belirlenmiştir. Lambda-cyhalothrinin PBO ile birlikte subakut etkide HSP70 indüksiyonuna neden olduğu ve bu artışın oksidatif etkileri azaltmaya yönelik olduğu bulunmuştur. Lambda-cyhalothrin etkisinde akut etkide belirlenen kaspaz-3 inhibisyonunun artan GST aktivitesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Lambda-cyhalothrin etkisinde GSH miktarı ve GST aktivitesindeki artışın bileşiğin detoksifikasyonunda GSH konjugasyonu için değil, bileşiğin oksidatif stres etkilerini gidermek için olduğu düşünülmektedir. Teşekkür Projeye sağladığı finansal destek (FEF2008D1) nedeniyle Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimine teşekkürlerimizi sunarız. Kaynaklar ADLER, V., YIN, Z., FUNCHS, S.Y., BENZERA, M., ROSARIO, L., TEW, K.D., PINCUS, M.R., SANDANA, M., HENDERSON, C.J., WOLF, C.R., DAVIS, R.J., RONAI, Z., Regulation of JNK signaling by GSTp. The EMBO Journal, 18: AHMAD, I., PACHECO, M., SANTOS, M.A., Anguilla anguilla L. oxidative stress biomarkers: an in situ study of freshwater wetland ecosystem (Pateira de Fermentelos, Portugal). Chemosphere, 65: ALI, M., RAHMAN, S., REHMAN, H., BHATIA, K., ANSARI, R.A., RAISUDDIN, S., Pro-apoptotic effect of fly ash leachates in hepatocytes of freshwater fish (Channa punctata Bloch). Toxicology in Vitro, 21: ANDERSON, M.E., Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples. Methods in Enzymology, 113: ANDERSON, M.E., Glutathione: an overview of biosynthesis and modulation. Chemico-Biological Interactions, : APHA, AWWA, WEF, Standard Methods. American Public Health Association, New York, 1085s. ATIF, F., PARVEZ, S., PANDEY, S., ALI, M., KAUR, M., REHMAN, H., KHAN, H.A., RAISUDDIN, S., Modulatory effect of cadmium exposure on

10 deltamethrin-induced oxidative stress in Channa punctata Bloch. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 49: BERLETT, B.S., STADTMAN, E., Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry, 272: BEUTLER, E., Red Cell Metabolism: A Manual of Biochemical Methods, 2 nd edition. Grune and Starton, New York, 160s. BIERKENS, J., MAES, J., PLAETSE, F.V., Dose-dependent induction of heat shock protein 70 synthesis in Raphidocelis subcapitata following exposure to different classes of environmental pollutants. Environmental Pollution, 101: BOUTET, I., TANGUY, A., MORAGA, D., Response of the Pacific oyster Crassostrea gigas to hydrocarbon contamination under experimental conditions. Gene, 329: BRADFORD, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72: BUTTERFIELD, D.A., LAUDERBACK, C.M., Lipid peroxidation and protein oxidation in Alzheimer s disease brain: potential causes and consequences involving amyloid β-peptide-associated free radical oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine, 32: CARLBERG, I., MANNERVIK, B., Purification and characterization of the flavoenzyme glutathione reductase from rat liver. Journal of Biological Chemistry. 250, CHEN, X.C., FANG, F., ZHU, Y.G., CHEN, L.M., ZHOU, Y.C., CHEN, Y., Protective effect of ginsenoside Rg1 on MPP1-induced apoptosis in SHSY5Y cells. Journal of Neural Transmission, 110: CHO, S.G., LEE, Y.H., PARK, H.S., RYOO, K., KANG, K.W., PARK, J., EOM, S.J., KIM, M.J., CHANG, T.S., CHOI, S.Y., SHIM, J., KIM, Y., DONG, M.S., LEE, M.J., KIM, S.G., ICHIJO, H., CHOI, E.J., Glutathione S-transferase Mu modulates the stress-activated signals by suppressing apoptosis signalregulating kinase 1. The Journal of Biological Chemistry, 276: CREAGH, E.M., CARMODY, R.J., COTTER, T.G., Heat shock protein 70 inhibits caspase-dependent and independent apoptosis in jurkat T cells. Experimental Cell Research, 257: DE BOECK, G., DE WACHTER, B., VLAEMINCK, A., BLUST, R., Effect of cortisol treatment and/or sublethal copper exposure on copper uptake and heat shock protein levels in common carp, Cyprinus carpio. Environmental Toxicology and Chemistry, 22: ELLINGER-ZIEGELBAUER, H., STUART, B., WAHLE, B., BOMANN, W., AHR, H.J., Comparison of the expression profiles induced by genotoxic and nongenotoxic carcinogens in rat liver. Mutation Research, 575: EL-MERHIBI, A., KUMAR, A., SMEATON, T., Role of piperonyl butoxide in the toxicity of chlorpyrifos to Ceriodaphnia dubia and Xenopus laevis. Ecotoxicology and Environmental Safety, 57:

11 FEDER, M.E., HOFMANN, G.E., Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology. Annual Review of Physiology, 61: FOURNIER, D., BRIDE, J.M., POIRIE, M., BERGE, J.B., PLAPP, F.W., Insect glutathione S-transferases. In: biochemical characteristics of the major forms from houseflies susceptible and resistant to insecticides. The Journal of Biological Chemistry, 267: GEIST, J., WERNER, I., EDER, K.J., LEUTENEGGER, C.M., Comparisons of tissue-specific transcription of stress response genes with whole animal endpoints of adverse effect in striped bass (Morone saxatilis) following treatment with copper and esfenvalerate. Aquatic Toxicology, 85: GILOT, D., LOYER, P., CORLU, A., GLAISE, D., LAGADIC-GOSSMANN, D., ATFI, A., MOREL, F., ICHIJO, H., GUGUEN-GUILLOUZO, C., Liver protection from apoptosis requires both blockage of initiator caspase activities and inhibition of ASK1/JNK pathway via glutathione S-transferase regulation. The Journal of Biological Chemistry, 277: GOWLAND, B.T.G., MOFFAT, C.F., STAGG, R.M., HOULIHAN, D.F., DAVIES, I.M., Cypermethrin induces glutathione S-transferase activity in the shore crab, Carcinus maenas. Marine Environmental Research, 54: GRIFFITH, O.W., Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 2-Vinylpyridine. Analytical Chemistry, 106: HABIG, W.H., PABST, M.J., JAKOBY, W.B., Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. Journal of Biological Chemistry, 249: HALL, A.G., The role of glutathione in the regulation of apoptosis. European Journal of Clinical Investigation, 29: JESBERGER, J.A., RICHARDSON, J.S., Oxygen free radicals and brain dysfunction. International Journal of Neuroscience, 57: LIU, C., YU, K., SHI, X., WANG, J., LAM, P.K.S., WU, R.S.S., ZHOU, B., Induction of oxidative stress and apoptosis by PFOS and PFOA in primary cultured hepatocytes of freshwater tilapia (Oreochromis niloticus). Aquatic Toxicology, 82: MEISTER, A., ANDERSON, M.E., Glutathione. Annual Review of Biochemistry, 52: MEKI, A.M.A., ESMAIL, E.E.F., HUSSEIN, A.A., HASSANEIN, H.M., Caspase-3 and heat shock protein-70 in rat liver treated with aflatoxin B1: effect of melatonin. Toxicon, 43: MIGLIARINI, B., CAMPISI, A.M., MARADONA, F., TRUZZI, C., ANNIBALDI, A., SCARPONI, G., CARNEVALI, O., Effects of cadmium exposure on testis apoptosis in the marine teleost Gobius niger. General and Comparative Endocrinology, 142:

12 MITCHELL, A.E., MORIN, D., LAKRITZ, J., JONES, A. D., Quantitative profiling of tissue- and gender- related expression of glutathione S- transferase isoenzymes in the mouse. Biochemical Journal, 325: OHKAWA, H., OHISHI, N., TAGI, K., Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical Chemistry, 95: PARCELLIER, A., GURBUXANI, S., SCHMITT, E., SOLARY, E., GARRIDO, C., Heat shock proteins, cellular chaperones that modulate mitochondrial cell death pathways. Biochemical and Biophysical Research Communications, 304: PENA-LLOPIS, S., FERRANDO, M.D., PENA, J.B., Fish tolerance to organophosphate-induced oxidative stress is dependent on the glutathione metabolism and enhanced by N-acetylcysteine. Aquatic Toxicology, 65: REGOLI, F., PRINCIPATO, G., Glutathione, glutathione-dependent and antioxidant enzymes in mussel, Mytilus galloprovincialis, exposed to metals under field and laboratory conditions: implications for the use of biochemical biomarkers. Aquatic Toxicology, 31: RISSO-DE FAVERNEY, C., ORSINI, N., SOUSA, G., RAHMANI, R., Cadmium induced apoptosis through the mitochondrial pathway in rainbow trout hepatocytes: involvement of oxidative stress. Aquatic Toxicology, 69: SAYEED, I., PARVEZ, S., PANDEY, S., BIN-HAFEEZ, B., HAQUE, R., RAISUDDIN, S., Oxidative stress biomarkers of exposure to deltamethrin in freshwater fish, Channa punctatus Bloch. Ecotoxicology and Environmental Safety, 56: SREEDHAR, A.S., CSERMELY, P., Heat shock proteins in the regulation of apoptosis: new strategies in tumor therapy. A comprehensive review. Pharmacology and Therapeutics, 101: VONTAS, J.G., SMALL, G.J. HEMINGWAY, J., Glutathione S-transferases as antioxidant defence agents confer pyrethroid resistance in Nilaparvata lugens. Biochemical Journal, 357: VONTAS, J.G., SMALL, G.J., NIKOU, D.C., RANSON, H., HEMINGWAY, J., Purification, molecular cloning and heterologous expression of a glutathione S-transferase involved in insecticide resistance from the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens. Biochemical Journal, 362:

13 145