ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Petek PİNER LAMBDA-CYHALOTHRİNİN Oreochromis niloticus da KARACİĞERDE PİPERONİL BÜTOKSİT MODÜLATÖRLÜĞÜNDE OKSİDATİF STRES POTANSİYELİNİN BELİRLENMESİ, STRES PROTEİNLERİ ve APOPTOZİS ÜZERİNE ETKİLERİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ LAMBDA-CYHALOTHRİNİN Oreochromis niloticus da KARACİĞERDE PİPERONİL BÜTOKSİT MODÜLATÖRLÜĞÜNDE OKSİDATİF STRES POTANSİYELİNİN BELİRLENMESİ, STRES PROTEİNLERİ ve APOPTOZİS ÜZERİNE ETKİLERİ Petek PİNER DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu Tez / / 2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği / Oy Çokluğu ile Kabul Edilmiştir. İmza.. İmza... İmza... Prof.Dr. Nevin ÜNER Prof.Dr. Cahit ERDEM Doç.Dr. Bedii CİCİK DANIŞMAN ÜYE ÜYE İmza... Yrd.Doç. Dr. Özcan AY ÜYE İmza... Yrd. Doç Dr. Yusuf SEVGİLER ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod no: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri Birimi Tarafından desteklenmiştir. Proje No: FEF2008D1 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ LAMBDA-CYHALOTHRİNİN Oreochromis niloticus da KARACİĞERDE PİPERONİL BÜTOKSİT MODÜLATÖRLÜĞÜNDE OKSİDATİF STRES POTANSİYELİNİN BELİRLENMESİ, STRES PROTEİNLERİ ve APOPTOZİS ÜZERİNE ETKİLERİ Petek PİNER ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Nevin ÜNER Yıl : 2009, Sayfa: 92 Jüri : Prof.Dr. Nevin ÜNER : Prof.Dr. Cahit ERDEM : Doç.Dr. Bedii CİCİK :Yrd.Doç.Dr. Özcan AY : Yrd.Doç.Dr. Yusuf SEVGİLER Bu çalışmanın amacı α-siyano sentetik piretroid insektisid ve akarisid lambdacyhalothrinin juvenil Oreochromis niloticus da karaciğer dokusunda, GSH redoks durumu ve GSH-bağımlı enzimlere, lipid peroksidasyonuna, stres proteinleri ve apoptozise etkilerini sitokrom P450 modülatörü PBO etkisinde araştırmaktır. Bu amaçla, balıklar 0.48 µg/l lambda-cyhalothrin ve 0.01 mg/l PBO içeren suda 96 saat ve 15 gün sürelerle bekletilerek karaciğer dokularında tgsh, GSH, GSSG ve TBARS miktarları ile GSH/GSSG oranı, GPx, GR, GST ve kaspaz-3 enzim aktiviteleri spektrofotometrik yöntemlerle, HSP70 miktarı ELISA test tekniği ile araştırılmıştır. Lambda-cyhalothrinin akut etkide TBARS miktarında artışa neden olduğu, subakut etkide lipid peroksidasyonunu engellemek üzere tgsh ve GSH miktarları ile GST enzim aktivitesini artırdığı belirlenmiştir. PBO varlığında lambda-cyhalothrinin akut ve subakut etkide tgsh, GSH miktarları ile GST enzim aktivitesinin yanında subakut etkide GPx enzim aktivitesi ile HSP70 ve TBARS miktarlarını artırdığı belirlenmiştir. Akut etkide kaspaz-3 aktivitesi artan GST aktivitesiyle ilişkili olarak inhibe olmaktadır. Bu çalışmada uygulanan derişimde lambda-cyhalothrinin oksidatif strese neden olduğu ve oksidatif strese karşı GSH ve GSH-bağımlı enzimler ile adaptasyon sağlandığı belirlenmiştir. PBO modülasyonu lambda-cyhalothrinin oksidatif toksisitesine sinerjist etki yapmaktadır. HSP70 indüksiyonunun artan oksidatif strese karşı adaptif bir yanıt olabileceği düşünülmektedir. Kaspaz-3 inhibisyonunun artan GST aktivitesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Lambda-cyhalothrin etkisinde GST aktivitesindeki artışın bileşiğin detoksifikasyonunda GSH konjugasyonu için değil, bileşiğin oksidatif etkilerini gidermek için olduğu düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Oreochromis niloticus, Lambda-cyhalothrin, Oksidatif stres, Apoptozis, Piperonil bütoksit I

4 ABSTRACT Ph.D. THESIS DETERMINATION of OXIDATIVE STRESS POTENTIAL of LAMBDA- CYHALOTHRIN in the PRESENCE of PBO and ITS EFFECTS on STRESS PROTEINS and APOPTOSIS in the LIVER of Oreochromis niloticus Petek PİNER UNIVERSITY of ÇUKUROVA INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES DEPARTMENT of BIOLOGY Supervisor: Prof.Dr. Nevin ÜNER Year: 2009, Page: 92 Jury: Prof.Dr. Nevin ÜNER : Prof.Dr. Cahit ERDEM : Assoc.Prof.Dr. Bedii CİCİK : Assist.Prof.Dr. Özcan AY : Assist.Prof.Dr. Yusuf SEVGİLER The aim of the present study was to investigate the effects of α-cyano synthetic pyrethroid insecticide and acaricide lambda-cyhalothrin in the presence of PBO, a modulator of cytochrome P450, on glutathione redox status and GSH-related enzymes activities, lipid peroxidation, stress proteins and apoptosis in the liver of Oreochromis niloticus. For this aim, fish were placed in 0.48 µg/l lambdacyhalothrin and 0.01 mg/l PBO containing water for 96-h and 15-d. tgsh, GSH, GSSG and TBARS contents, GSH/GSSG ratio, GPx, GR, GST and caspase-3 enzymes activities were determined spectrophotometrically, while HSP70 content was measured by ELISA test technique. It was shown that acute treatment of lambda-cyhalothrin causes an increase in TBARS contents while tgsh and GSH contents and GST enzyme activity were increased to block lipid peroxidation in subacute effect. Beside an elevation in GPx enzyme activity and HSP70, TBARS contents in subacute effect; tgsh, GSH contents and GST enzyme activity were increased in both acute and subacute effects of lambda-cyhalothrin+pbo treatment. A relationship was observed between reduced caspase-3 and increased GST activities in acute treatment. Results of the present study revealed that lambda-cyhalothrin causes oxidative stress in the applied concentration and increases in GSH and GSH-related enzymes supply an adaptation to its oxidative effects. PBO synergistically modulates the oxidative stress potential of lambda-cyhalothrin. HSP70 induction could be an adaptive response to oxidative stress caused by lambda-cyhalothrin+pbo treatment. It was shown that inhibition of caspase-3 activity is related to the induced GST enzyme activity. Induced GST enzyme activity suggested an adaptive response against oxidative stress induced by lambda-cyhalothrin treatment, rather than a conjugation reaction with GSH for detoxicification. Key Words: Oreochromis niloticus, Lambda-cyhalothrin, Oxidative stress, Apoptosis, Piperonyl butoxide II

5 TEŞEKKÜR Çalışmalarım süresince her konuda yardım ve desteğini esirgemeyen tez danışmanım Sayın Prof.Dr. Nevin ÜNER e, Sayın Prof.Dr. Cahit ERDEM e, Sayın Yrd.Doç.Dr. Yusuf SEVGİLER e ve laboratuvar arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER.. IV ÇİZELGELER DİZİNİ. VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VII 1. GİRİŞ Serbest Radikaller ve Serbest Radikal Hedefi Biyomoleküller Antioksidant Savunma Sistemi Glutatyon Apoptozis Isı Şok Proteinleri Apoptotik Süreçlerin Isı Şok Proteinleri Tarafından Düzenlenmesi Mitokondriyal Düzeyde Isı Şok Proteinleri Hedefleri Post Mitokondriyal Düzeyde Isı Şok Proteinleri Hedefleri Isı Şok Proteinleri ve Homeostazis Redoks Homeostazında Isı Şok Proteinlerinin Rolü Piretroid Pestisidler Lambda-Cyhalothrin Piperonil Bütoksit ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Kimyasal Maddeler Cihazlar ve Diğer Sarf Malzemeleri Yöntem Lambda-Cyhalothrinin Oreochromis niloticus da 96 Saat LC 50 Değerinin Belirlenmesi Toksisite Denemeleri Analiz Yöntemleri IV

7 Total Glutatyon Yöntemi Okside Glutatyon Yöntemi Glutatyon Peroksidaz Yöntemi Glutatyon Redüktaz Yöntemi Glutatyon S-Transferaz Yöntemi TBARS Yöntemi Bradford Yöntemi ile Protein Tayini İndirekt Non-competitive ELISA ile HSP70 Miktarının Belirlenmesi Kaspaz-3 Yöntemi İstatistiksel Analiz BULGULAR ve TARTIŞMA Bulgular Lambda-Cyhalothrinin Jüvenil O. niloticus da 96 Saat LC 50 Değeri Çözücü Asetonun Parametrelere Etkileri Lambda-Cyhalothrin ve PBO nun GSH Redoks Durumuna Etkileri Lambda-Cyhalothrin ve PBO nun GSH-Bağımlı Enzim Aktivitelerine Etkileri Lambda-Cyhalothrin ve PBO nun HSP70 ve TBARS Miktarları ile Kaspaz-3 Enzim Aktivitesine Etkileri Tartışma SONUÇ ve ÖNERİLER. 73 KAYNAKLAR.. 74 ÖZGEÇMİŞ V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Total Glutatyon Yöntemi Çizelge 3.2. Okside Glutatyon Yöntemi Çizelge 3.3. Glutatyon Peroksidaz Yöntemi Çizelge 3.4. Glutatyon Redüktaz Yöntemi Çizelge 3.5. Glutatyon S-Transferaz Yöntemi Çizelge 3.6. TBARS Standart Grafiğinin Hazırlanması. 43 Çizelge 3.7. TBARS Yöntemi Çizelge 3.8. HSP70 Yöntemi Çizelge 3.9. Kaspaz-3 Yöntemi Çizelge 4.1. O. niloticus da karaciğer dokusunda asetonun parametrelere etkileri Çizelge 4.2. O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO nun GSH redoks durumuna etkileri.. 54 Çizelge 4.3. O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO nun GSH-bağımlı enzim spesifik aktivitelerine etkileri. 58 Çizelge 4.4. O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO nun HSP70 ve TBARS miktarları ile kaspaz-3 enzim spesifik aktivitesine etkileri 61 VI

9 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. GSH Standart Grafiği.. 36 Şekil 3.2. Protein Standart Grafiği Şekil 3.3. HSP70 Standart Grafiği Şekil 3.4. p-na Standart Grafiği.. 50 Şekil 4.1. Uygulanan derişimlerde gözlenen yüzde ölüm oranı Şekil 4.2. O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde tgsh miktarının kontrole göre yüzde değişimi 53 Şekil 4.3. O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde GSH miktarının kontrole göre yüzde değişimi. 55 Şekil 4.4. O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde GSSG miktarının kontrole göre yüzde değişimi 55 Şekil 4.5. O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde GSH/GSSG oranının kontrole göre yüzde değişimi 56 Şekil 4.6. O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde GPx spesifik aktivitesinin kontrole göre yüzde değişimi 57 Şekil 4.7. O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde GR spesifik aktivitesinin kontrole göre yüzde değişimi Şekil 4.8. O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde GST spesifik aktivitesinin kontrole göre yüzde değişimi 59 Şekil 4.9. O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde HSP70 miktarının kontrole göre yüzde değişimi.. 60 Şekil O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde kaspaz-3 spesifik aktivitesinin kontrole göre yüzde değişimi VII

10 Şekil O. niloticus da karaciğer dokusunda lambda-cyhalothrin ve PBO etkisinde TBARS miktarının kontrole göre yüzde değişimi Şekil O. niloticus da karaciğer dokusunda 15 gün lambdacyhalothrin etkisinde tgsh ve TBARS miktarları arasındaki korelasyon (P<0.05).. 63 Şekil O. niloticus da karaciğer dokusunda 15 gün lambdacyhalothrin+pbo etkisinde TBARS ve HSP70 miktarları arasındaki korelasyon (P<0.05) 63 VIII

11 1. GİRİŞ Petek PİNER 1. GİRİŞ Giderek artan çeşitlilikte endüstriyel ve tarımsal kimyasalların çevreye salınımı ile omurgalı ve omurgasız birçok organizma bu bileşiklerin etkisinde kalmaktadır. Polinükleer aromatik hidrokarbonlar, pestisidler, endüstriyel ürünler ve ağır metalleri içeren kontaminantlar farklı toksisite mekanizmalarına sahiptir. Normal biyolojik süreçlerde ve ksenobiyotik toksisitesinde radikal tepkimelerin öneminin belirlenmesi ile prooksidant-antioksidant süreçlerle ilgili araştırmalar giderek artmıştır (Livingstone., 2001). İn vitro ve in vivo çalışmalarla bu kontaminantların toksik etkilerinin araştırılması çevre kirliliğinin toksikolojik değerlendirilmesi açısından da önemlidir Serbest Radikaller ve Serbest Radikal Hedefi Biyomoleküller Organizmaların sahip olduğu en önemli özellik hücrede enerji akışının kontrol edilebilmesidir. Bu durum, aerobik organizmalarda ATP gibi yüksek enerjili fosfat bağı içeren bileşiklerin sentezi için substratların moleküler oksijen (O 2 ) ile oksidasyonu sonucu sağlanmaktadır (Jesberger ve Richardson, 1991). Moleküler oksijen tetravalent ya da univalent redüksiyona uğrayabilmekte ve O 2 nin univalent redüksiyonu sırasında radikal ara ürünleri ya da yüksek reaktif substratlar meydana gelebilmektedir (Jesberger ve Richardson, 1991). O 2 e bir elektron transferi ile süperoksit radikali (O.- 2 ) meydana gelmektedir. O.- 2 ne ikinci bir elektronun eklenmesi ile peroksit radikallerinin oluşumunu başlatan hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) oluşmaktadır. O 2 e üçüncü elektronun transferi, oldukça toksik ve reaktif bir bileşik olan hidroksil radikalinin (HO. ) oluşumu ile sonuçlanmaktadır. Yüksek derecede reaktif olan HO. yu substrat olarak kullanan hiçbir enzim sistemi bulunmamaktadır ve hücrelerin bu radikalle tek savunma şekli oluşumunun engellenmesidir. HO., H 2 O 2 den metallerin katalizörlüğünde Fenton ve Haber-Weiss tepkimeleri ile oluşturulabilmektedir (Jesberger ve Richardson, 1991). 1

12 1. GİRİŞ Petek PİNER Haber-Weiss Tepkimesi O 2. + H 2 O 2 + Fe 2+ Fe 3+ + O 2 + OH - + HO. (1) Fenton Tepkimesi H 2 O 2 + Fe 2+ Fe 3+ + HO. + OH - (2) Başta mitokondriyal elektron transportu olmak üzere ksenobiyotikler ve özellikle çevresel kirleticilerin metabolizması, fagositik aktivasyon, çeşitli sentez ve yıkım tepkimelerinde ROS oluşmakta ve bu prooksidantlara karşı oluşturulan antioksidant sistem arasındaki dengenin prooksidantlar lehine kayması sonucunda gelişen oksidatif stres, çeşitli mekanizmalar ile biyomoleküllere hasar vermektedir (Cooke ve ark., 2003). Serbest oksijen radikalleri, oksidatif strese neden olan ve hücresel hasara yol açan, proteinler, membran lipidleri, nükleik asitler ve ektraselüler matriksi destekleyen yapılar ile tepkime vermektedir. Serbest radikaller ile proteinlerin modifikasyonu metallere bağlanma kapasiteleri ve karbohidrat içermeleri gibi yapısal karakteristiklere bağlıdır. Proteinlerde serbest radikal etkisi sonucu oluşan yapısal değişimler temelde üç gruba ayrılabilir: 1. Amino asitlerin modifikasyonu 2. Proteinlerin fragmentasyonu 3. Proteinlerin çapraz bağlanmaları ve agregasyonu Triptofan, tirozin, fenilalanin gibi aromatik amino asitler doymamış yapılarından dolayı oksidatif hasara karşı en duyarlı amino asitlerdir. Serbest radikallere duyarlı olan diğer amino asitler sülfür içeren sistein ve sistindir. Bu amino asitleri içeren proteinlerin yapılarındaki değişimler disülfid bağları ve sülfidril gruplarının özellikle serbest radikal etkisine eğilimlerinden kaynaklanır. Proteinlerin hücresel lokalizasyonu ve serbest radikallerin özellikleri, protein hasarının düzeyini belirlemektedir. Proteinlerin temel yapısındaki değişimler antijenitedeki değişimler, konformasyonel işlev kaybı ve proteolize duyarlılık şeklinde ortaya çıkar. Membran kolesterolünde ve yağ asitlerinde bulunan doymamış bağlar ROS hasarına karşı oldukça duyarlıdır ve lipidlerde peroksidasyona neden olur. Oluşan her bir lipid peroksiti bir serbest radikaldir ve peroksidasyon süreci, oluşan her bir lipid peroksitinin, diğer lipid peroksitlerini oluşturmak üzere komşu yağ asidini etkilemesi 2

13 1. GİRİŞ Petek PİNER ile devam eder. Oluşan bu lipid peroksitleri membranda ve diğer bazı organellerde sabit bölgelerde peroksidasyonu devam ettirerek hasarı artırır. Lipid peroksidasyonu membran akışkanlığını etkileyerek membranın işlev ve yapısını değiştirebilir. Serbest radikallerce başlatılan peroksidasyonun serebral hipoksiya, iskemi gibi patolojik durumlarda ve normal yaşlanma süreci ile ilgili membran hasarında yer aldığı bilinmektedir (Jesberger ve Richardson, 1991). Lipid peroksidasyonu ROS indüklü hasar ile ilgili en çok araştırılan süreçlerden bir tanesidir. Membranlarda bulunan fosfolipidler ROS un etki edebileceği, en bol bulunan hedeflerdir. Özellikle poliansatüre yağ asidi (PUFA) grupları ROS tepkimelerine oldukça duyarlıdırlar. Lipid peroksidasyonunu belirlemede en yaygın olarak kullanılan indeks tiyobarbitürik asid reaktif maddelerinin (TBARS) oluşumunun tiyobarbiturik asit (TBA) tepkimesi ile ölçülmesidir (De Zwart ve ark., 1999). DNA molekülleri nukleusta kompartmantalize olmuştur ve ROS ile etkileşme tehlikeleri çok düşüktür. Buna ek olarak DNA molekülü histonlar tarafından korunmaktadır ve eğer DNA hasarı meydana gelirse DNA tamir enzim sistemleri ile onarılabilmektedir. DNA nın organik bileşenleri HO. ya oldukça duyarlıdır. Çift iplikli DNA nın ROS ile tepkimesi sonucu şeker fosfat iskeletinin ve bazların modifikasyonu ile tek iplik kırılması meydana gelir ve bu durum kromozomal delesyon ve normal olmayan gen ekspresyonu ile hücre ölümüne neden olabilir (Jesberger ve Richardson, 1991) Antioksidant Savunma Sistemi Hücreler normal hücresel solunum ve inflamasyon gibi diğer hücresel süreçlerde üretilen ROS hasarına karşı koruyucu antioksidantlar ya da ROS temizleyici sistemlere sahiptir. Antioksidant savunma sisteminin bileşenleri enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidantlardır ve bunlar hep birlikte ROS hasarına karşı proteinler, lipidler, DNA gibi makromoleküller ile hücreyi korurlar (Jesberger ve Richardson, 1991). 3

14 1. GİRİŞ Petek PİNER Antioksidant savunma sisteminin ilk basamağını süperoksid dismutaz (SOD; EC ), katalaz (CAT; EC ) ve glutatyon peroksidaz (GPx; EC ) enzimleri oluşturmaktadır. Glutatyon peroksidaz aktif merkezinde selenosistein bulunduran selenyum taşıyan bir enzimdir ve redükte glutatyonu (GSH) kullanarak H 2 O 2 in indirgenmesini katalizleyen tek peroksidazdır, sitosol ve mitokondride bulunur. GPx aktivitesi pentoz fosfat yolunda üretilen NADPH varlığında gerçekleşir. GPx hücrede bulunan toksik peroksitleri detoksifiye ederken GSH ı okside glutatyona (GSSG) okside eder (Beutler, 1989). Enzimatik olmayan diğer antioksidantlar askorbat (C vitamini), tokoferol (E vitamini), beta karoten ve GSH ı içermektedir ve hücredeki bu antioksidantlardan en önemlisi GSH dır (Jesberger ve Richardson, 1991). GSH elektofilik ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu ve ROS un hücreden uzaklaştırılması gibi çok sayıda hücresel işleve sahiptir (Meister ve Anderson, 1983) Glutatyon Glutatyon hücrede bol bulunan, protein yapıda olmayan, düşük moleküler ağırlıklı bir tiyoldür. Hücrede milimolar derişimlerde bulunur ve ROS hasarına karşı hücreyi koruma kapasitesi oldukça yüksektir (Hall, 1999). Glutamat (Glu), sistein (Cys) ve glisinden (Gly) meydana gelen GSH, aynı zamanda Glu ile Cys arasında γ- peptid bağı içermektedir. Bu bağ GSH ı birçok peptidazın hidroliz etkisinden korumaktadır (Anderson, 1998). Serbest radikallerin temizlenmesinde GPx enziminin katalizlediği tepkimeyle GSH ın okside formu olan GSSG oluşur. GSSG hücreler için oldukça toksiktir ve hücreden uzaklaştırılması gerekmektedir. Hücrede GSSG, glutatyon redüktaz (GR; EC ) enziminin katalizlediği tepkimeyle fizyolojik koşullarda NADPH ın varlığında tekrar GSH a indirgenir ve böylece hücrede GSH/GSSG oranı sabit tutulmaya çalışılır (Hall, 1999). Hücrenin indirgeme kapasitesi yetersiz kaldığında GSH/GSSG oranı azalmaktadır. İntrasellüler GSSG miktarı oksidatif stresin bir indikatörü olarak değerlendirilirken, GSH/GSSG oranı hücresel redoks durumunu yansıtmaktadır (Cnubben ve ark., 2001). ROS un 4

15 1. GİRİŞ Petek PİNER temizlenmesinin yanı sıra GSH, GSH konjugatları oluşturmak üzere toksik bileşiklerle non-enzimatik ya da enzimatik olarak glutatyon S-transferaz (GST; EC ) ailesi aracılığı ile tepkimeye girerek ksenobiyotiklerin detoksifikasyonunda da rol oynamaktadır (Anderson, 1998). Hücrede GSH düzeyi, üretimi ile kullanılması arasındaki dengenin korunması ile kontrol edilmektedir. GSH ın de novo sentezi gama-glutamil-sisteinil sentetaz (γ-gcs; EC ) ve glutatyon sentaz (GS; EC ) enzimlerinin aktivitesiyle birbirine bağımlı ATP içeren iki basamakta meydana gelir. γ-gcs aktivitesi GSH tarafından feedback inhibisyonla kontrol edilir. Okside şartlar altında GSH miktarı düşük ise γ-gcs aktivitesi artacaktır. Belirli hücreler membran-bağımlı bir enzim olan gama-glutamil transpeptidaz (γ-gt; EC ) aktivitesi ile GSH ı hücre içine alabilir. Normal şartlarda GSH ın tüketim oranı ROS un temizlenmesini sağlayan hücresel yol ile belirlenmektedir. GSH tüketimi eksojen okside edici ajanların ya da tiyol reaktif toksinlerin uygulanması durumunda artmaktadır. İntraselüler GSH düzeyi geçici olarak düşebilir; ancak birçok hücre tüketilen GSH ı yerine koyacak kapasiteye sahiptir. Hücre GSH düzeyinin tekrar eski haline gelmesi GR aktivitesiyle GSSG den tekrar indirgenmesi ve de novo sentezinin artırılması ile gerçekleşir (Hall, 1999). Serbest radikallerin hücrenin fiziksel durumunu modüle ettiği ve hücre ölümünü etkilediği bilinmektedir. Birçok deneysel bulgu ile ROS ve apoptozis arasında bir ilişki bulunduğu da gösterilmiştir. Apoptozis H 2 O 2, diamid, etoposid ve semikinonlar gibi prooksidant ajanlar tarafından indüklenebilmektedir. PUFA dan serbest radikallerin üretiminin yanında PUFA nın peroksidasyonu ile meydana gelen okside metabolitler de apoptozisi indüklemektedir (Igarashi ve Miyazawa, 2000). Arita ve ark. (2003) HL-60 hücrelerinde UV radyasyonu ile meydana gelen n-3 ya da n-6 PUFA ların oksidasyon ürünlerinin apoptozisi indüklediklerini göstermişlerdir. Konjuge eikosapentaenoik asit (EPA) ve konjuge dokosaheksaenoik asit (DHA) gibi okside olmuş n-3 PUFA ların lipid peroksidasyonu aracılıklı apoptozisin indüklenmesiyle kanser hücrelerine sitotoksik etki yaptıkları gösterilmiştir (Igarashi ve Miyazawa, 2000). 5

16 1. GİRİŞ Petek PİNER 1.3. Apoptozis Hücre ölümü apoptozis ya da nekrozis denilen iki farklı süreçten biri ile meydana gelmektedir. Nekrozis hücredeki aşırı travma ya da hasarın bir sonucu olarak gelişen akut işlevsel bozukluğa bağlı olarak hücrenin ölümüdür. Hücrede iyon akışının kontrolü hızla kaybedildiği için pasif ve yıkıcı bir süreç olarak değerlendirilmektedir. İyon akış kontrolünün kaybedilmesi hücre içerisine fazla miktarda su girişine, hücre ve organellerin enerji harcanmasına gerek kalmadan şişerek sitolize uğramalarına neden olmaktadır. Ölen hücre içeriğinin ekstraselüler alanlara akması ve pro-enflamatuvar hücrelere infiltrasyonu ile komşu hücrelerin ölmesi ve doku hasarının yaygınlaşması meydana gelmektedir (Samali ve Orrenius, 1998). Nekrozis ve apoptozis, 1. Benzer patofizyolojik etki sonucu açığa çıkabilirler. 2. Antiapoptotik mekanizmalar ile önlenebilirler. 3. Gelişimleri sırasında birbirlerine dönüşebilirler. Apoptozis enerji bağımlı olan ve evrimsel süreçte genler tarafından kontrol edilen programlanmış fizyolojik bir süreçtir, belirli fizyolojik ve morfolojik değişimlerle karakterize edilir. Morfolojik değişimler; nükleer kondensasyon, hücre büzülmesi, membran şişmesi gibi değişimleri kapsarken, fizyolojik değişimler; spesifik endonükleazlarla DNA nın bazlık oligonükleotid fragmentlerine parçalanması, kaspazların aktivasyonu sonucu proteinlerin sindirilmesini kapsamaktadır (Sreedhar ve Csermely, 2004). Apoptotik hücre ölümü 3 fazda meydana gelmektedir. Bunlar; indüksiyon fazı, efektör faz ve yıkım fazıdır. İndüksiyon fazında hücre apoptotik uyartı alır ve geri dönüşümsüz bir şekilde ölüm fazına yönlendirilir. Bunu ATP ve diğer hücresel bileşenlerin durumunda meydana gelen değişimleri kapsayan mitokondriyal işlevlerin modifikasyonları, hücre içerisinde nükleer kromatinin yoğunlaşması, sitoplazmik kısalma, membran şişmesi, nükleer fragmentasyon ve apoptotik yapıların oluşması ile hücre yapısında belirgin morfolojik değişimler ile karakterize edilen bir efektör faz takip eder. Yıkım fazında ise makrofajlar ya da komşu hücreler tarafından 6

17 1. GİRİŞ Petek PİNER apoptotik yapıların yıkımının ve fagositozlarının meydana geldiği hedef hücrenin büyük çaplı yıkımı gerçekleşir (Samali ve Orrenius, 1998). Apoptozis embriyogenezde temel olan bir ölüm tipidir ve organizmalarda gelişimin ilerleyen evrelerinde hücresel homeostazın sağlanmasında görevlidir (Solary ve ark., 2000). Apoptotik hücre ölümünde kaspazlar olarak bilinen sistein proteaz ailesi tarafından yürütülen iki süreç vardır. Bu süreçler intrinsik ya da mitokondriyal yol ve ekstrinsik ya da ölüm reseptörleri yoludur. Bu iki yol apoptotik hücre ölümünde morfolojik ve biyokimyasal değişimlere öncülük eden efektör kaspaz olarak da adlandırılan kaspaz-3 düzeyinde birleşir (Lanneau ve ark., 2008). İntrinsik yol intraselüler ölüm sinyallerinin proapoptotik moleküllere iletilerek aktivasyonlarının sağlandığı süreçleri içerir (Lanneau ve ark., 2008). Bu moleküller, Bcl-2 (B cell lymphocytic-leukaemia proto-oncogene) ailesine ait proteinlerin kontrolünde olan mitokondriyal apoptojenik moleküllerin salınımını başlatmak için, mitokondri ile birleşir. Bcl-2 proteinleri, Bcl-2 ve Bcl-xL gibi anti-apoptotik üyeler ile B ve Bak gibi pro-apoptotik proteinleri içerir (Wei ve ark., 2001; Cheng ve ark., 2001). Mitokondriden salınan moleküllerden biri de sitosolik apoptotik proteaz aktivasyon faktörü-1 (Apaf-1) ve pro-kaspaz-9 ile apoptozom oluşturmak üzere kaspaz-3 ü aktive etmek için birleşen sitokrom c dir (Li ve ark., 1997). Diğer iki mitokondriyal molekül aktive olmuş kaspazların inhibisyonunu sağlayan inhibe edici apoptotik proteinleri nötralize ederek apoptozisi aktive eden Smac/Diablo ve Htra2/Omi proteinleridir (Du ve ark., 2001). Ekstrinsik yol, ölüm reseptörleri olarak bilinen tümör nekroz faktör (TNF) reseptör ailesinin plazma membran proteinlerine bağlanması ile tetiklenir. Bu durum ölüm indükleyici sinyal kompleksi (DISC) içinde reseptör proksimal kaspaz-8 ya da kaspaz-10 un doğrudan aktivasyonlarına öncülük eder. Kaspaz-8 hem doğrudan kaspaz yolunu aktive eder, hem de mitokondriyal geçirgenliği değiştiren ekstrinsik ve intrinsik yolları birbirine bağlayan Bid in aktif formu olan tbid e dönüşümünü sağlar (Luo ve ark., 1998). Kaspazlar olarak bilinen proteaz ailesi aspartat rezidüsünden proteinleri parçalar. Kaspazlar inaktif zimojenler (prokaspaz) olarak bulunurlar. Literatürde 14 grup kaspaz rapor edilmektedir ve 3 ana gruba ayrılırlar. Bunlar sırasıyla başlatıcı 7

18 1. GİRİŞ Petek PİNER kaspazlar, enflamatuvar kaspazlar ve efektör kaspazlardır. Kaspazlar çeşitli apoptotik yollarda bir dizi şeklinde organize olurlar. Böylece TNF indüklü apoptozis başlatıcı kaspazların (kaspaz-8 ve kaspaz-10) aktivasyonlarını ve bunların etkisiyle bir sonraki aşamada efektör kaspazlar olan kaspaz-3, kaspaz-6, kaspaz-7 nin aktivasyonunu içerir. Mitokondriyal apoptozom aracılıklı yol efektör kaspazları (kaspaz-3, kaspaz-6, kaspaz-7) aktive eden başlatıcı kaspaz olan kaspaz-9 un aktivasyonunu içerir (Sreedhar ve Csermely, 2004). Bu enzimler hedef substratlarını aktive ya da inaktive etmek üzere yıkıma uğratmaktadırlar. Kendi otokatalitik aktivite süreçlerini meydana getirmek üzere başlatıcı kaspazlar spesifik adaptör moleküllerle etkileşmektedirler. Bu etkileşme sonucunda başlatıcı kaspaz aktif halde olmayan efektör kaspazların yıkımını ve böylece aktivasyonlarını gerçekleştirir ve apoptozisde görülen morfolojik değişimler açığa çıkar (Beere, 2004). Ekstrinsik ya da intrinsik süreçler sonunda en yaygın ölçülen kaspaz aktivitesi kaspaz-3 tür (Migliarini ve ark., 2005) ve kaspaz-3 aktivitesi pestisid etkisinde apoptozis için bir markır olarak değerlendirilmektedir (Pena-Llopis ve ark., 2003). Apoptozis, büyüme hormonunun azalması, hipoksiya, DNA hasarı ya da sitotoksik ilaçların kullanımı gibi durumlarda indüklenebilir. Bu tür uyaranlar hücrede aynı zamanda ısı şok proteinlerinin (HSP) akümülasyonuna neden olmaktadır ve ölüm uyaranlarının hücrede koruyucu yanıta neden olduğu gösterilmiştir. Son 10 yılda yapılan çalışmalar HSP lerin anti-apoptotik özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. HSP ler stres sinyalleri ve apoptotik molekülerle ilişkilidir ve böylece hücre ölümünü bloke ederek hücrenin yaşamasını, çoğalmasını ve farklılaşmasını destekleyebilmektedir (Sreedhar ve Csermely, 2004) Isı Şok Proteinleri Hücre bir stres etkeni ile karşılaştığı zaman hücre iskeletinde, sitoplazmik yapılarda, hücre yüzey morfolojisinde, hücresel redoks durumunda, DNA sentezinde, protein metabolizmasında ve protein stabilitesinde modifikasyonlar meydana gelmektedir. Stres moleküler hasar meydana getirir ve stres durumunda genellikle anormal katlanmış proteinler açığa çıkmaktadır. Bu proteinler hücre içerisinde 8

19 1. GİRİŞ Petek PİNER agregatlar oluştururlar, bu da ardışık stres yanıtının açığa çıkmasına neden olmaktadır (Verbeke ve ark., 2001). Isı şok proteinleri ısı şoku tarafından indüklenen ve hücrede çok iyi korunan bir protein ailesi olarak keşfedilmiştir (Parcellier ve ark., 2003). Stres proteinleri de denilen HSP ler ısı gibi fiziksel ajanlar, çeşitli farmasötikleri ya da çevresel kirleticileri kapsayan kimyasal ajanlar, virüsler, bakteriler ve ökaryotik parazitler gibi patojenlerin oluşturduğu moleküler hasara karşı hücresel yanıt olarak sentezlenmektedir (Hightower ve Ryan, 1997). Hücrede HSP ler; yeni sentezlenen proteinlerin katlanmasının düzenlenmesi, nükleer bütünlüğün ve matriks materyalinin korunması, yapısı bozulmuş proteinlerin onarılması, hasar görmüş proteinlerin eliminasyonları, proteinlerin organel düzeyinde lokalizasyonu, organele alınması ya da organelden atılması gibi çok sayıda göreve sahiptir. Bir diğer işlevi geri dönüşümsüz hasara uğramış polipeptidlerin proteolizine yardım etmektir. HSP lerin bir kısmının kendi başlarına proteaz aktivitesi gösterdikleri ya da yıkılması gereken polipeptidlerin proteazlarla etkileşmelerine yardım ettikleri belirlenmiştir (Feder ve Hofmann, 1999). Isı şok proteinleri moleküler ağırlıklarına göre; HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40 ve düşük moleküler ağırlıklı HSP (Ubiquitin ve HSP27) aileleri olmak üzere 6 gruba ayrılırlar. Bu aile üyelerinden bazıları hücrede sürekli olarak sentezlenirken, bazılarının stres koşullarında sentezleri artmaktadır. Diğer aile üyeleri ise yalnızca stres etkisi sonucunda sentezlenmektedir (Samali ve Orrenius, 1998). Büyük moleküler ağırlıklı HSP ler ATP bağımlı şaperonlardır, kendi konformasyonlarının düzenlenmesi ve ATP bağlanması için ko-şaperonlara gereksinim duyarlar. HSP27 gibi küçük şaperonlar ATP bağımlı değildirler (Parcellier ve ark., 2003). HSP sentezi transkripsiyonel düzeyde ısı şok faktörleri (HSF) tarafından düzenlenir. Çok sayıda HSF belirlenmesine karşın, HSF-1 kısa süreli HSP indüksiyonunda ana düzenleyici olarak görev yapmaktadır (Sreedhar ve Csermely, 2004). Organizmalarda en iyi korunan ve en çok çalışılan grup HSP70 ailesi üyeleridir. HSP70 ailesi insanda en az 11 gen tarafından kodlanan moleküler ağırlığı 66 ile 78 kd arasında değişen proteinleri içermektedir. Bu protein ailesinin 9

20 1. GİRİŞ Petek PİNER indüklenebilir HSP70 (HSP72) ve bazal metabolizmada sentezlenen HSC70 gibi üyeleri sitosolde lokalize olurken, bir grup HSP70 mitokondride (mthsp70) ve diğer bir grup üyesi de endoplazmik retikulumda lokalize olmuştur (Grp78/Bip) (Jaattela ve ark., 1998). Ökaryotik HSP70 proteini iki işlevsel bölgeye sahiptir. Bunlar; ATP ye bağlanan -NH 2 terminal bölge (ABD bölgesi) ve peptide bağlanan -COOH terminal bölge (PBD bölgesi) dir. Normal koşullarda HSP70 ailesine ait proteinler yeni sentezlenen proteinlerin düzgün katlanmaları, multiprotein komplekslerin oluşması, hücresel membranlardan proteinlerin taşınması gibi işlevlere sahip ATP bağımlı moleküler şaperonlardır (Shi ve Thomas, 1992). HHIP, HOP, HIP, BAG-1 ve BAG- 3 HSP70 in ko-şaperonlarıdır. Bu proteinler HSP70 in PBD ya da ABD bölgelerine bağlanarak bu proteinin şaperon aktivitesini düzenleyebilir. Anti-kanser ilaçları içeren uyaranlar uyartının oranına bağlı olarak stresle indüklenen HSP70 sentezini artırabilirler. Gen ablasyon yöntemleri HSP70 in apoptozisde önemli bir role sahip olduğunu göstermiştir. Fare embriyonik hücrelerinde indüklenebilir HSP70, HSP70.1, HSP70.3 genleri çıkarıldığında çok sayıda letal uyaranlara karşı duyarlılığın arttığı belirlenmiştir (Schmitt ve ark., 2003). Laboratuvar çalışmaları HSP70 in çevresel çalışmalarda biyomarkır olarak kullanımının olanaklı olduğunu göstermektedir (Bierkens ve ark., 1998). Bu nedenle, HSP ler çevresel kirliliğin kuvvetli biyomarkırları ve bu kirleticileri izleme çalışmalarında yararlı araçlar olarak önerilmektedir (Sanders ve Martin, 1993; Schröder ve ark., 2000). Hücrede meydana gelen hasar paradoksal olarak birbirine zıt iki yanıt mekanizmasının tetiklenmesine neden olmaktadır. Apoptozis yukarıda değinildiği gibi yaygın enflamasyonu önlemek üzere hasar gören hücrelerin uzaklaştırılmasına neden olurken, ısı şoku ya da stres yanıtı hücreyi hayatta tutmak üzere hasar gören yapıların kurtarılmasını sağlamaktadır. Stresin biyolojik sonuçları üzerinde baskın etkilere sahip olan bu iki süreç arasındaki etkileşimler hücrenin geleceğini belirlemektedir (Beere, 2004). HSP ler farklı apoptotik proteinler ile etkileşerek apoptozisin kritik kontrol noktalarında düzenleyici etki yapmaktadırlar (Parcellier ve ark., 2003). Apoptozisin düzenlenmesinde oldukça kompleks rollere sahip olan 10

21 1. GİRİŞ Petek PİNER HSP ler öncelikle hücresel koruyucu özelliklerinden dolayı apoptotik yanıtı inhibe etmektedirler. Bunun yanında apoptozisin başlaması ve ilerlemesinde önemli görevler alan sinyal proteinlerinin şaperonları olarak görev almakta ya da doğrudan apoptozisin ilerlemesine neden olmaktadırlar (Sreedhar ve Csermely, 2004) Apoptotik Süreçlerin Isı Şok Proteinleri Tarafından Düzenlenmesi Isı şok proteinleri kaspaz aktivasyonunu engelleyerek apoptozisi bloke edebilirler. HSP27, HSP70, HSP60 ve HSP90 ın aşırı sentezlenmesi apoptozisi inhibe edebilir. Farklı hücre modellerinde HSP lerin yanlış katlanmış proteinlerin birikmesini engellediği ve serbest radikaller ile DNA hasarına neden olan hücresel stres durumlarında apoptozisi inhibe ettikleri gösterilmiştir. Bunun aksine HSP27, HSP70, HSP60 ve HSP90 ın yeterli düzeyde sentezlenmemesi hücrelerin apoptotik uyaranlara duyarlılığını artırır. Bazı hücrelerde HSP70 kaybı herhangi bir ek stres faktörü olmaksızın kaspaz-3 aktivasyonu ile başlatılan apoptotik süreç için yeterlidir. Böylece HSP ler doğrudan ya da dolaylı olarak kaspaz aktivasyonunun modülasyonu ile apoptozisde görev almaktadır. HSP ler intrinsik ve ekstrinsik apoptotik yolları, üç noktada anahtar proteinlerle tepkimeye girerek bloke edebilir. Bu noktalar; 1. Mitokondriden önceki süreçte sinyal yollarının düzenlenmesi, 2. Mitokondride gerçekleşen apoptojenik moleküllerin salınmasının kontrolü, 3. Post mitokondriyal süreçte apoptozom oluşumunun kontrolüdür (Lanneau ve ark., 2008) Mitokondriyal Düzeyde Isı Şok Proteini Hedefleri Hücre kültürlerinde HSP27 nin sitokalasin D ya da staurosporin etkisinde hücre iskeletinin bozulmasını ve mitokondriden sitokrom c salınımını engellediği belirlenmiştir (Paul ve ark., 2002). HSP27 aynı zamanda mitokondriden Smac salınımını da inhibe edebilir (Chauhan ve ark., 2003). HSP70 HSP40 ile eşleşerek B ların mitokondri dış membranına lokalizasyonunu engeller ve mitokondri dış 11

22 1. GİRİŞ Petek PİNER membran geçirgenliğini korur (Stankiewicz ve ark., 2005). HSP60 ile B proteinleri kompleks oluşturarak apoptozisi inhibe edebilmektedir (Ruchalski ve ark., 2006). HSP60 ın B dan ayrılması bu proteinin mitokondriye bağlanmasına neden olur ve apoptozis indüklenebilir (Kirchhoff ve ark., 2002). Tümör hücrelerinde HSP90 mitokondride TRAP molekülü ile birlikte bulunur. Mitokondride bulunan HSP90 mitokondri membran geçirgenliğini ve sitokrom c salınımını kontrol eder. HSP90 ın çeşitli ajanlarla inhibisyonu mitokondri membranında depolarizasyona neden olur ve doza bağımlı sitokrom c salınımı gözlenir. Bu durum HSP90 ın normal hücre mitokodrilerinde değil de tümör hücrelerindeki mitokondrilerde şaperon işlevlerinin kanser tedavisinde kullanılması açısından önemli olabilir (Kang ve ark., 2007). Bazı araştırmalar mast hücrelerinde Bcl2/HSP90 kompleksinin mitokondrilerden sitokrom c salınımını inhibe ederek kaspaz-3 aktivasyonunu engellediğini göstermiştir (Cohen-Saidon ve ark., 2006) Post Mitokondriyal Düzeyde Isı Şok Proteinleri Hedefleri HSP27 nin mitokondriden sitosole sitokrom c salınımını engelleyerek kaspaz aktivasyonunu inhibe ettiği gösterilmiştir (Bruey ve ark., 2000). İnsan monositlerinde apoptozis sırasında HSP27 nin aktif kaspaz-3 ü bloke ettiği belirtilmiştir (Voss ve ark., 2007). HSP27 aynı zamanda hücrede serbest radikal miktarını azaltarak ve okside proteinlerin toksik etkilerini nötralize ederek antioksidant savunmayı artırır (Rogalla ve ark., 1999). HSP27 apoptozisin son aşamalarında meydana gelen membran şişmesi gibi morfolojik değişimleri de etkileyebilir (Coleman ve ark., 2001). Aktin-miyozin sistemi membran şişmesinde kontraktil gücü sağlar, burada HSP27 f-aktin nin reorganizasyonunda görev alır (Pivovarova ve ark., 2007). HSP70 in sitokrom c salınımını inhibe ederek kaspaz-3 aktivasyonunu engellediği ve böylece apoptozisi inhibe ettiği belirlenmiştir (Li ve ark., 2000). Buna ek olarak HSP70 in Apaf-1 molekülüne doğrudan bağlanarak prokaspaz-9 ile apoptozom oluşumunu engellediği belirtilmiştir (Beere ve ark., 2000). HSP70 in ATPaz bağlanan bölgesi bu etkileşim için gereklidir (Saleh ve ark., 2000). TNF indüklü apoptozisde HSP70 kaspaz-3 aktivasyonuna engel olmaz, fakat fosfolipaz 12

23 1. GİRİŞ Petek PİNER A2 nin aktivasyonu gibi hücre ölümünün karakteristiği olan morfolojik değişimlerden korur (Jaattela ve ark., 1998). Apoptozisin yıkım fazında kaspaz-3 aktivasyonunu takiben kromozomal DNA, DNAaz CAD tarafından (Kaspaz ile aktive olan DNAaz) parçalanır. Enzimatik aktivite ve CAD ın katlanması HSP70 tarafından HSP40 ve ICAD ın ko-şaperon etkisiyle düzenlenir. ICAD CAD ın inhibitörüdür (Sakahira ve Nagata, 2002). HSP90 Apaf-1 in işlevini negatif yönde etkiler. HSP90 Apaf-1 e doğrudan bağlanır ve prokaspaz-9 ile oligomerizasyonunu engeller (Pandey ve ark., 2000). Ara filamentlerin en önemli bileşeni olan vimentin apoptotik uyartılara yanıt olarak parçalanır. HSP90 vimentine bağlanır ve apoptotik parçalanmayı engeller (Zhang ve ark., 2006). HSP60 ve HSP10 un proapoptotik rollerinin olduğu gösterilmiştir. HeLa ve Jurkat hücrelerinde camptothecin ya da staurosporin ile kaspaz-3 aktivasyonu mitokondriden HSP60 ve HSP10 un salınımı ile birlikte meydana gelir. Çalışmalar in vivo ve in vitro ATP bağımlı süreçte prokaspaz-3 ün sitokrom c ile aktivasyonunun HSP60 ve HSP10 ile ilişkili olduğunu göstermiştir (Samali ve ark., 1999) Isı Şok Proteinleri ve Homeostazis Isı şok proteinleri yalnızca proteinlerin tekrar katlanması ya da yanlış katlanmış, denatüre olmuş proteinlerin eliminasyonlarına yardımcı olmaz, aynı zamanda birçok açıdan hücresel yaşamda kritik rolü olan çok sayıda hücresel proteinin sentezlenmesini sağlar. Hücresel homeostazın sağlanmasında HSP lerin çok sayıda rolü bulunmaktadır (Sreedhar ve Csermely, 2004) Redoks Homeostazında Isı Şok Proteinlerinin Rolü Oksidatif stres apoptotik süreç için önemli bir sinyaldir. Hücresel redoks durumunda meydana gelen değişimler farklı apoptotik yolları düzenlemek için etkili bir yoldur. HSF-1 geni çıkarılan farelerin oksidatif strese daha duyarlı oldukları belirlenmiştir (Yan ve ark., 2002). HSP ler hücresel redoks durumunun 13

24 1. GİRİŞ Petek PİNER korunmasında antioksidant olarak görev yaparlar. Hem oksijenaz, bilirubin ve biliverdin antioksidantların üretiminden sorumlu bir HSP dir. HSP70 in oksidatif stres koşullarında peptid kompleks stabilitesi ve peptid bağlanma yeteneğinin artırılmasını sağladığı bilinmektedir. Hücrede redoks durumu HSP70 sentezini etkiler. Böylece azalmış GSH düzeyi HSF-1 in doğrudan aktivasyonuna neden olabilir. Bunun aksine güçlü oksitleyici ajanlar DNA ya bağlanma yeteneğini engelleyerek HSF-1 in trimerizasyonunu inhibe ederler. Sonuç olarak redoks homeostazında orta düzeydeki bir değişim HSF-1 in aktivasyonuna neden olurken, redoks homeostazında büyük değişimler HSF-1 i inhibe etmektedir (Sreedhar ve Csermely, 2004) Piretroid Pestisidler Piretroidler dünyada 30 yılı aşkın bir süredir tarımda, halk sağlığı için evlerde ve küçükbaş hayvanlarda ektoparazitlere karşı yaygın olarak kullanılmaktadır. Düşük memeli toksisiteleri nedeniyle piretroid bileşiklerin kullanımı son zamanlarda artış göstermiş ve 1990 ların ortalarında dünya insektisid pazarının %23 ünü piretroid bileşikler oluşturmuştur (Soderlund ve ark., 2002). Piretroidler organofosforlu pestisidlerden sonra en yaygın kullanılan bileşiklerdir (Soderlund ve ark., 2002). Piretroid grubu insektisidler memelilerde düşük toksisitelerine karşın dünya çapında ve uzun yıllardır kullanılıyor olmaları nedeniyle uzun süreli hasar konusunda tehlike oluşturmaktadırlar (Wolansky ve Harrill, 2008). Piretroidlerin tek başına değil piperonil bütoksit (PBO) gibi sedimentte birikebilen ve yarı ömrü 8 haftadan fazla olan sinerjistik ajanlarla birlikte ve önemli düzeylerde kullanılıyor olmaları diğer önemli bir risk konusudur (Woudneh ve Oros, 2006). Piretroidlerin birçok alanda yaygın olarak kullanımından kaynaklanan etkilerine ek olarak bu bileşikler çevredeki birikimleri ile de zararlıdır (Grossman, 2007). Piretroidler Chrysanthemum cinerarifolium bitki ekstraktında doğal olarak bulunan piretrinlerin yapısal türevleridir. Birçok piretroid merkez ester ya da eter bağı ile aromatik alkollere bağlı olan siklopropen karboksilik asid grubu taşır. Bu temel piretroid yapısındaki modifikasyon insektisid aktivitesini ve fotostabilitesini 14

25 1. GİRİŞ Petek PİNER artırmak için dizayn edilmiştir ve bu durum hedef olmayan türlerde piretroid aktivitesinin değişimine neden olabilir. Diğer önemli bir modifikasyon alkol grubuna α-siyano grubunun eklenmesidir ve bu ekleme insektisid aktivitesinde kritik role sahip olduğu için sentetik piretrin analoglarının geliştirilmesinde önemlidir. Piretroidler chiral moleküllerdir ve piretroidlerin konformasyonları biyolojik aktivitenin en önemli belirleyicisidir. Chiralite diğer pestisid gruplarının da biyolojik aktivitesini etkilemektedir. Piretroidler 2 ya da 4 chiral merkeze sahiptir. Aynı bileşiğin stereoizomerleri hedef veya hedef olmayan organizmalarda geniş bir potansiyele sahiptir. Piretroidlerin α-siyano grubu taşıyanları bu grubun uzaydaki konumuna bağlı olarak farklı izomerik konfigürasyona sahip olabilir. [S] konfigürasyonları hedef olan ya da hedef olmayan organizmalarda [R] konfigürasyonlarından daha yüksek aktiviteye sahiptir. Piretrinlerin ve piretroidlerin metabolizması ester hidrolizi ya da sitokrom P450 aracılıklı oksidasyonla gerçekleştirilir. Piretroidlerin sıçan ve farelerde oral uygulaması ile yapılan in vivo toksikokinetik çalışmalar eliminasyonlarının yaklaşık 2-8 günde tamamlandığını ve sıçanlarda yarı ömürlerinin saat olduğunu göstermiştir. Piretroidlerin detoksifikasyon oranı izomerler arasında farklılık gösteren uzaysal konformasyonlarına bağlıdır. Böylece piretroidlerin izomerik kompozisyonları biyolojik aktivitenin belirlenmesinde önemli role sahip olur (Wolansky ve Harrill, 2008). Piretroidler sinir sisteminde voltaj bağımlı sodyum kanallarını düzenleyen proteinlere bağlanarak toksik etki gösterirler. Voltaj bağımlı sodyum kanalları aksona iyonların girişine izin veren yollardır ve eksitasyon ile sinirsel sinyal iletimini sağlar. Bu kanallar aracılığı ile sinyal iletimi gerçekleşirken kanallar açılır ve sinyalin sonlandırılması için kapanır. Herhangi bir nedenle bu kanallar açık kaldığında sinir hücreleri sürekli uyarılarak sonuçta paralizi durumu ortaya çıkar. Piretroid insektisidler voltaj bağımlı sodyum kanallarına bağlanarak kapanmasını engeller. Tip I and Tip II piretroidlerin -siyano grubu taşımalarına bağlı olarak toksik semptomları farklıdır. Permethrin gibi Tip I piretroidler merkezi sinir sisteminde bulunan sodyum kanallarını kesintiye uğratarak nörotoksisiteye neden 15

26 1. GİRİŞ Petek PİNER olurlar. Lambda-cyhalothrin gibi Tip II piretroidler sinirsel işlevler için önemli olan klor ve kalsiyum kanallarını etkilerler (He ve ark., 2008). Piretroidler lipofilik oldukları için biyolojik membranlar ve dokular tarafından kolayca alınabilirler. Piretroid etkisinde organizmalarda hipereksitasyon, titreme, konvülsiyon, paralizi ve bunları takiben ölüm meydana gelebilir. Piretroidler beynin hippokampus bölgesinden asetilkolinesteraz (AChE) salınımını düzenlerler ve ATPaz aktivitesini inhibe ederler. Hormonal işlevleri de kesintiye uğratabilirler. Memelilerde piretroidler progesteron ve estradiol sentezini azaltabilir ve kadınlarda östrojenik etki erkeklerde antiandrojenik etki gösterebilir. Bunların dışında piretroidlerin hücre döngüsünü inhibe ederek hücre stresine neden olduğu ve immun sistemi baskılayıcı etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. Uzun süreli etkide solunum organlarının yüzeyinde hasara neden olur ve renal iyon düzenlenmesini kesintiye uğratabilirler (Oros ve Werner., 2005). Piretroidler akuatik omurgasızlar ve balıklara yüksek derecede nörotoksik etkiler göstermektedirler (Moore ve Waring, 2001). Bu proje çalışmasında etkileri araştırılmak üzere pestisid olarak piretroid insektisid ve akarisid lambda-cyhalothrin seçilmiştir Lambda-Cyhalothrin Lambda-cyhalothrin 1977 yılında geliştirilmiş sentetik piretroid insektisid ve akarisiddir. Moleküler yapısında bulunan -siyano grubu ile Tip II piretroidlere dahil edilmiştir. Kimyasal formülü; [α-cyano-3-phenoxybenzyl 3-(2-chloro-3,3,3-trifluoro- 1-propenyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate] dır (WHO, 1990). Lambda-cyhalothrin pamuk, tahıllar, süs bitkileri, patates, çeşitli sebze ve meyvelerde yaprak biti, yaprak yiyen kın kanatlılar ve kelebek larvalarına karşı yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunların dışında insan sağlığı için tehlike oluşturan hamamböceği, sivrisinek, kene ve karasineklere karşı da uygulanmaktadır (EXTOXNET, 1996). Lambda-cyhalothrin oda sıcaklığında katı, sarı renkte bir bileşiktir, düşük buhar basıncına sahiptir ve kolay buharlaşmaz. Lambda-cyhalothrin 1:1 oranında iki 16

27 1. GİRİŞ Petek PİNER farklı sterioizomerden meydana gelir. Bu izomerler (S)-α-cyano-3-phenoxybenzyl- (Z)-(1R,3R) 3 - (2 chloro - 3, 3, 3 trifluoroprop 1 enyl) 2, 2-dimethyl cyclopropanecarboxylate ve (R)-α-cyano-3-phenoxybenzyl-(Z) -(1S,3S)- 3-(2- chloro-3, 3,3-trifluoroprop-1-enyl)-2, 2- dimethylcyclopropanecarboxylate dır. Log K ow değeri 7 dir ve oldukça lipofilik bir bileşiktir. Lambda-cyhalothrin gibi yüksek K ow değerine sahip bileşikler biyolojik membranları geçerek dokulara kolayca absorbe olabilir ve canlılarda birikme eğilimindedirler. Lambda-cyhalothrinin sutoprak organik karbon dağılım katsayısı (K oc ) yüksek olduğu için organik maddeye kolay bağlanır ve yer altı sularına süzülme riski düşüktür. Su içerisinde kil ve organik maddeyi içeren askıda katı maddeye adsorbe olma eğilimindedir (He ve ark., 2008). Isı ve ışığa karşı stabildir. Alkali koşullarda hızla hidrolize olurken asidik ve nötral ortamlarda hidrolize olmamaktadır (WHO, 1990). Toksikolojik araştırmalarda kimyasal inhibitör ya da indükleyicilerin kullanımı ksenobiyotik metabolizmasında önemli metabolik yolların belirlenmesinde en önemli stratejilerden biridir (El-Merhibi ve ark., 2004). Bu amaçla kullanılan sitokrom P450 (CYP450) inhibitör ve indükleyicilerinden birisi PBO dur Piperonil Bütoksit Piperonil bütoksit 50 yılı aşkın süredir ticari amaçla insektisidlerle birlikte sinerjistik ajan olarak kullanılmaktadır. PBO CYP450 aktivitesini inhibe ederek piretroid insektisidlerin toksisitesini artırmaktadır (Rose ve Hodgson, 2004). Sitokrom P450 bağımlı monooksijenazlar; ilaçlar, pestisidler, bitkisel toksinler gibi ksenobiyotiklerin ve hormon, yağ asitleri, steroidler gibi endojen substratların katabolizması ve anabolizmasında görev alan oldukça önemli metabolik sistemlerdir. Monooksijenazlar bakterilerden memelilere kadar aerobik birçok canlı grubunda bulunur ve terminal oksidaz olarak görev yapan hemoproteinlerdir. Monooksijenazlar geniş bir substrat grubunu okside edebilirler ve oksidasyon için moleküler oksijen ve NADPH ı kullanırlar. Ökaryotlarda CYP450 ler mitokondri ve endoplazmik retikulum da bulunur ve mitokondride farklı elektron transport zincirini kullanırlar. Monooksijenazların en önemli özelliği farklı substrat spesifikliğine sahip 17

28 1. GİRİŞ Petek PİNER olmalarıdır. Örneğin CYP1A1 20 den fazla substratı metabolize edebilirken CYP7A1 tek bir substratı metabolize edebilmektedir. Buna ek olarak tek bir substratın metabolize edilebilmesi için çok sayıda CYP450 görev alabilmektedir. Bazı CYP450 ler bir substrattan tek bir metabolit oluştururken diğer bir grup CYP450 çok sayıda metabolit oluşturabilmektedir. CYP450 lerin tüm bu özellikleri tek bir amino asit değişimine bağlı olarak substrat spesifikliğindeki değişimlerle ilişkilidir (Scott, 1999). İnsanda bu enzimler 18 aileden oluşmaktadır ancak bunların CYP 1-4 aileleri eksojen kimyasalların metabolizmasında görev almaktadır. Bu ailelerin içerisinde ksenobiyotik metabolizmasına katkıda bulunan en önemli izoformlar ve alt aileler bulunmaktadır. Bu enzimlerin en önemlileri CYP3A4, CYP1A1, CYP1A2, CYP2B6, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2E1 dir. Birçok CYP450 ksenobiyotikler tarafından indüklenebilir ya da inhibe edilebilir. CYP450 lerin ksenobiyotiklere etki şeklini diğer ksenobiyotikler ve endojen substratlar da etkilemektedir. Ksenobiyotik metabolizmazında meydana gelen olumsuz sonuçlar, ksenobiyotiğin biyoaktivasyonu ile daha toksik ya da karsinojenik metabolitlerin oluşması ya da toksik ksenobiyotiğin mebolize olma oranının azalmasından kaynaklanabilmektedir. Çok sayıda ksenobiyotik CYP1A, CYP1B, CYP2B, CYP2E, CYP3A ve CYP4A enzimlerini indüklemektedir. Örneğin steroidler, pestisidler gibi ksenobiyotikler CYP3A izoformları tarafından metabolize edilebilmekte ve bu enzimleri indükleyebilmektedir (Hodgson ve Rose, 2007). Piperonil bütoksit metilendioksifenil (MDP) grubu bir bileşiktir ve CYP450 proteininin hem bölgesi ile stabil kompleks oluşturur. MDP bileşikler saflor, izosaflor ve sesamex gibi çeşitli bitkilerde bulunan bileşiklerdir. PBO MDP bileşiklerin sentetik yapıda olanıdır. PBO memeliler ve böcekler üzerine pestisidlerin etkilerinin araştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır ve son dönemlerde akuatik faunada da çalışmalar yapılmaktadır (Ankley ve Collyard, 1995). PBO kullanımı akuatik faunada benzer bileşiklerin toksik etkisinin ve metabolitlerinin araştırılmasına olanak sağlamaktadır. Bu uygulama ayrıca belirli organizmalarda bileşiklerin metabolizmalarında CYP450 enziminin görev alıp almadığının araştırılmasına olanak sağlamaktadır (El-Merhibi ve ark., 2004). 18