Güven Özdemir 1, Mehmet Salih Yıkılmaz 1, Esra Menfaatli 2, Mamadou Malick Diallo 1, Hüseyin Özaydın 1 1

Transkript

1 Konya ve Şanlıurfa İllerinde Ev Sineği (karasinek) ve Sivrisineklerin Piretroitler ve Neonikotinoitlere Karşı Geliştirdikleri Moleküler ve Biyokimyasal Direncin Belirlenmesi Güven Özdemir 1, Mehmet Salih Yıkılmaz 1, Esra Menfaatli 2, Mamadou Malick Diallo 1, Hüseyin Özaydın 1 1 Ege Ünivesitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü 2 Ege Ünivesitesi, Fen Fakültesi, Biyokimya Bölümü

2 Türkiye'de, ev sinekleri ve sivrisineklerle mücadelede kullanılan insektisitlerin çoğu sentetik piretroitlerdir. Ayrıca, bunun dışında neonikotinoit grubuna ait bazı aktifler de özellikle ev sinekleriyle mücadelede kullanılmaktadır. Ülkemizde uzun zamandır kullanılan bu insektisitlere karşı direnç durumunun ne olduğunu belirlemek için Sağlık Bakanlığı bir pilot proje başlatmıştır.

3 Pilot projenin ön çalışmalarına 2017 yılında Konya ve Şanlıurfa illerinde başlanmıştır. Projenin bioassay uygulamaları "Konya Gıda ve Tarım Üniversitesi" ve "Harran Üniversitesi'nde, biyokimyasal ve moleküler genetik analizler ise "Ege Üniversitesi'nde" yapılmaktadır.

4 SENTETİK PİRETROİTLERDE MOLEKÜLER DİRENÇ TİPLERİ Sivrisineklerde, voltaja duyarlı sodyum kanal geninin kodonunda meydana gelen üç tip kdr (knock down resistance) mutasyonu piretroitlere karşı moleküler direncin temelini oluşturmaktadır. Bu mutasyonlar lösin amino asidinin; fenilalanin (L1014F), serin (L1014S) veya sistein (L1014C) ile yer değiştirmesiyle meydana gelir. (L1014C) mutasyonu nadiren gözlendiği için projede bu mutasyona bakılmayacaktır.

5 Sodyum kanal proteini genel yapısı ve Culex pipiens de piretroit direnciyle ilişkili sodyum kanal protein mutasyonları

6 SENTETİK PİRETROİTLERDE MOLEKÜLER DİRENÇ TİPLERİ Kdr mutasyonları ev sineklerinde iki tiptir ve sivrisineklerdekine benzer kodonda meydana gelen mutasyonlar sırasıyla, L1014F ve L1014H olarak bilinir. Ev sineklerinde M918T ile L1014F mutasyonunun birlikte görülmesi durumu ise skdr (süper kdr) mutasyonu olarak tanımlanır.

7 NEONİKOTİNOİTLERDE MOLEKÜLER DİRENÇ TİPLERİ Ev sineklerinde neonikotinoidlere karşı moleküler dirence sebep olan herhangi bir mutasyon henüz saptanmamıştır. Ancak, neonikotinoide maruz kalmanın ardından bazı P450 (detoksifikasyon enzimi) genlerinin ekspresyonunda artış olduğu bilinmektedir.

8 BİYOKİMYASAL DİRENÇ Metabolik direnç, vücuda alınan insektisitin böceklerde doğal olarak bulunan detoksifikasyon enzimleri yardımıyla biyotransformasyona uğrayarak, toksik olmayan veya suda çözünen türevlerine indirgenip vücuttan dışarı atılmasıyla gerçekleşir. İnsektisit, bağlanarak etki göstereceği hedef bölgeye gidemeden metabolize olur.

9 Sitokrom P-450 sistemi/p450 monooksidazlar (CYP-450/P450), Esterazlar/hidrolazlar (EST ler) ve Glutathion-S transferazlar (GST ler) metabolik dirence neden olan başlıca enzim aileleridir

10 MOLEKÜLER ANALİZ YÖNTEMLERİ

11 Ev Sineği (Musca domestica) Direnç mutasyonlarını tespit etmek için vssc geni hedef alınmış İki pozisyonda: L F; 1014H M T Piretroidlere direnç veren üç bilinen VSSC alleli tanımlanmıştır: 1. KDR= L1014F 2. KDR-his= L1014H 3. süperkdr (skdr) = M918T + L1014F

12 Ev Sineği (Musca domestica) 1014 pozisyonunda: Bir SimpleProb (1014H mutantına spesifik ), iki çift spesifik primer ve her varyant için bir kontrol olacak şekilde sentezlenmiştir. VGSC geni 1014 pozisyonu BAĞLANTI POZİSYONU KDR F gatcgagtccatgtgggact Forward KDR S TCCATgTgggACTgCATgTATg Forward KDR R CAgTCggggCTgATAAACTAgA Reverse KDR A CATCAgAAgCCTCCATCCTg Reverse L1014 TCgTgAXITCggCAATCTTgTggTAAgT--PH Forward F TCgTgAXITCggCAATTTTgTggTAAgT--PH Forward H TCgTgAXITCggCAATCATgTggTAAgT--PH Forward

13 Ev Sineği (Musca domestica) 918 pozisyonunda: Bir SimpleProb (M918 a spesifik ), iki çift spesifik primer ve her varyant için bir kontrol olacak şekilde sentezlenmiştir. VGSC geni 918 pozisyonu BAĞLANTI POZİSYONU s-kdr F CAAATCgCCAgCTTCgTgTAT Forward s-kdr S ggcaaaatcatggtccacactg Forward s-kdr R TCCCATCACggCAAAgATg Reverse s-kdr A AgTACAAATgTCAgATTACCCAATgC Reverse T TgTCCggCCCaTAAXITCgAAATgA--PH Reverse SP [M918] TgTCCggCCCgTAAXITCgAAATgA--PH Reverse

14 SİVRİSİNEK (Culex pipiens) Direnç mutasyonlarını tespit etmek için vssc geni (1014 pozisionda) hedef alınmış; L F; 1014S (KDR mutasyon) Bir SimpleProb (1014S mutantına spesifik ), iki çift spesifik primer ve her varyant için bir kontrol olacak şekilde sentezlenmiştir.

15 SİVRİSİNEK (Culex pipiens) VGSC geni 1014 pozisyonu BAĞLANTI POZİSYONU KDR F TCACCgACTTCATgCACTCA Forward 9-25 KDR S TggATCgAATCCATgTgggAC Forward KDR R CTTTAggTgTggACCTTCATCTg Reverse KDR A TggCgATgTTTTgACAgCTC Reverse L1014 CCgTAgTgAXITAggAAATTTAgTCgTgA--PH Forward F CCgTAgTgAXITAggAAATTTTgTCgTgA--PH Forward _TTC CCgTAgTgAXITAggAAATTTCgTCgTgA--PH Forward S CCgTAgTgAXITAggAAATTCAgTCgTgA--PH Forward

16 gdna izolasyonu ve rt-pcr gdna izolasyonu: High Pure PCR Template Preparation DNA Kiti kullanılarak DNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen DNA ların spektrofotmetrik olarak ölçümü Nanodrop Thermo Scientific 2000c cihazı ile gerçekleştirilmiş olup, ağırlık (ng) ve saflık kontrolleri yapılmıştır. Real time PCR: LightCycler FastStart DNAMaster HybProbe kiti kullanarak analiz yapılmıştır. Real-time PCR reaksiyonu Roche LightCycler 96 cihazında gerçekleştirilmiştir Sonuçlar onaylaması: Her reaksiyonun geçerliliği için, kontrollerin kullanımı gerekiyor ve erime sıcaklığı (tm) uygun derecede olmalıdır.

17 Kontrollerin onaylanması (Ev sineği) 1014 pozisyonunda; Sırasıyla 1014F, L1014 ve1014h, 54 C; 60 C ve 66 C de erime sıcaklığı olmalıdır 918 pozisyonunda erime sicakları, 918T=61 C ve M918=67 C de olmalıdır.

18 Kontrollerin onaylanması (Sivrisinek) 1014 pozisyonunda erime sicakları: o 1014F= 54 C o 1014F_TTC= 58 C o L1014 = 60 C o 1014S= 66 C de 1014F_T TC 1014 F L S

19 Örnekleme Ev sinekleri Konya ve Şanlıurfa illerinden alınmıştır. Birinci dönem: Konya ilinin 5 ilçesinden (Karapınar, Akşehir, Seydişehir, Kaşınhanı ve Cihanbeyli) gönderilen popülasyonlardan bu dönem için toplam 150 birey ve Şanlıurfa ilinde de Konya ile aynı olacak şekilde, 5 farklı istasyondan 150 birey kullanılmıştır. Her bir popülasyon için 15 erkek ve 15 dişi olmak üzere toplam 30 birey kullanılmıştır. İkinci dönem: Sadece Konya ilinden örnekler gönderilmiştir. Birinci dönemle aynı olacak şekilde 5 ilçeden toplam 150 birey kullanılmıştır.

20 Örnekleme Sivrisinekler Konya ve Şanlıurfa illerinden alınmıştır. Bir dönem toplanmıştır: Konya ilinin 2 ilçesinden (Karapınar ve Konya merkez) gönderilen 4 popülasyon için toplam 120 birey (60 dişi ve 60 erkek) kullanılmıştır. Şanlıurfa ilinde Konya ile aynı olacak şekilde, 3 farklı istasyondan gönderilen popülasyonlar için toplam 90 birey kullanılmıştır. Her bir popülasyon için 15 erkek ve 15 dişi olmak üzere toplam 30 birey kullanılmıştır.

21 BİYOKİMYASAL ANALİZ YÖNTEMLERİ

22 Ev Sineği (Musca domestica) ve sivrisinek İlgili Üniversitelerden gönderilen ev sineklerinden her bir popülasyon için 30 tane dişi kafaları uzaklaştırılarak tüplerin içine alınmış ve -80 o C de saklanmıştır.

23 Konya ilinden 4 farklı noktadan ve Şanlıurfa ilinden 3 farklı noktadan gönderilen sivrisinekler popülasyonlarına ait 30 ar adet dişi Culex pipiens türü sivrisinek enzim aktivitesi tayinleri için alınmış ve -80 o C de saklanmıştır.

24 Ev Sineği (Musca domestica) ve sivrisinek (Culex pipiens) HOMOJENİZASYON Kafası uzaklaştırılmış örnekler PMSF (1 mm), DTT (1 mm), EDTA (1mM) içeren potasyum fosfat (100 mm, ph 7.2) içerisinde homojenize edilip santrifujlenmiştir. Süpernatantlar tampon ile gerekli oranlarda seyreltilerek biyokimyasal testlerde kullanılmıştır.

25 Ev Sineği (Musca domestica) ve sivrisinek (Culex pipiens) PROTEİN TAYİNİ Bradford yöntemi kullanılarak bireylerin total protein miktarı belirlenmiştir. Standart olarak sığır serum albumini kullanılmıştır. Aktivite değerleri mg proteine karşılık gelecek şekilde hesaplanmıştır.

26 Ev Sineği (Musca domestica) ve sivrisinek Enzim aktivitelerinin belirlenmesi Enzim aktiviteleri spektroskopik olarak tabloda belirtilen substratlar ile belirlenmiştir. Enzim Glutatyon S Transferaz Sitokrom P450 Esteraz Substrat 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) 3,5,3,5 -tetrametilbenzidin (TMBZ) 4-Nitrofenil asetat

27 Genel değerlendirme ve sonuçlar Projede önemli bir mesafe kat edilmesine rağmen biyolojik etkinlik testleri (biyoassaylar), moleküler analizler ve biyokimyasal testler henüz tamamlanmamıştır. Ön veriler genel bir direnç eğilimi olduğu yönündedir fakat kesin değerlendirmenin yapılabilmesi için yukarıda bahsi geçen bütün testlerin tamamlanması gerekmektedir. Testler tamamlandıktan sonra oluşturulacak bilimsel bir komitenin değerlendirmesi ile direncin niteliği, derecesi ve zaman içindeki olası seyri üzerine bir rapor hazırlanacak ve ilgili kurumlarla paylaşılacaktır

28 Thank you Amäsägnalähu Teşekkür ederim धन यव द təşəkkür edirəm gracias Merci Thank you 谢谢