T.C. SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ TERFEZIA BOUDIERI CHATIN, FOMES FOMENTARIUS (L.) FR., PHELLINUS IGNIARIUS (L.) QUÉL. VE TRICHOLOMA ANATOLICUM H.H.DOGAN&INTINI NĠN MEME KANSERĠ HÜCRELERĠNE ANTĠKANSER VE MODÜLASYON ETKĠLERĠNĠN BELĠRLENMESĠ Özdem ÖZDEMĠR YÜKSEK LĠSANS TEZĠ Biyoloji Anabilim Dalını Eylül-2014 KONYA Her Hakkı Saklıdır

2

3

4 ÖZET YÜKSEK LĠSANS TEZĠ TERFEZIA BOUDIERI CHATIN, FOMES FOMENTARIUS (L.) FR., PHELLINUS IGNIARIUS (L.) QUÉL. VE TRICHOLOMA ANATOLICUM H.H.DOGAN&INTINI 'NĠN MEME KANSERĠ HÜCRELERĠNE ANTĠKANSER VE MODÜLASYON ETKĠLERĠNĠN BELĠRLENMESĠ Özdem ÖZDEMĠR Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı DanıĢman: Prof. Dr. Hasan Hüseyin DOĞAN Yardımcı DanıĢman: Yrd. Doç. Dr. Meltem DEMĠREL KARS 2014, 79 Sayfa Jüri Prof.Dr.Hasan Hüseyin DOĞAN Doç. Dr. Rüstem DUMAN Yrd. Doç. Dr. Hakan ALLI Mantarlar yüzyıllardan beri insanoğlu tarafından besin ve tedavi amaçlı kullanılmaktadır. Günümüzde makrofunguslar ile birçok bilim dalı değiģik araģtırmalar yapmakta ve tedavi amaçlı yeni çalıģmalar planlanmaktadır. Birçok yenen ve yenmeyen mantar türlerinden önemli tıbbi etkiler elde edilerek, hastalıkların tedavisinde yaygın olarak kullanılmaya baģlanmıģtır. Kanser hücre hatlarında ve tümörlerde kemoterapötik ajanlara karģı geliģen dirençlilik çoklu ilaç dirençliliği olarak bilinir (MDR). Bu dirençlilik pek çok antikanser ilacın hastalar üzerinde beklenen etkisini gösterememesine ve hastalığın ilerlemesine neden olmaktadır. ÇalıĢmada mantar türleri ultrasonikasyon yöntemiyle ekstrakte edilmiģtir. Ġki antikanser ajana (paklitaksel ve vinkristin) karģı dirençli olan MCF-7 hücre hatlarında dört farklı mantar türü ekstraktının sitotoksik etkisi araģtırılıp dirençliliği geri çevirme özellikleri belirlenmiģtir. Ekstraktların paklitaksel ve vinkristine dirençli MCF-7 hücrelerindeki hücre yaģam ve üreme profillerine etkileri XTT testleriyle belirlenmiģtir. Mantarların MCF-7/Vinc ile sitotoksisite analizleri sonucunda IC 50 değerleri mg/ml arasında, MCF-7/Pac 'deki IC 50 değerleri mg/ml arasında tespit edilmiģtir. Mantar ekstraktlarının MCF-7 hücrelerinde modülasyon etkileri çeģitli floresan ölçümleriyle (Flow sitometri) belirlenmiģtir. Mantar ekstraktlarının her iki dirençli hücre için MDR modülatör (dirençliliği geri çeviren ajan) olma potansiyeli taģıdığı belirlenmiģtir. Ayrıca süspansiyondaki fenolik bileģikler HPLC ile belirlenip ayrıģtırılmıģtır. Analiz sonucunda kullanılan fenolik bileģiklerde en iyi değerleri yenilmeyen mantarlar olan Fomes fomentarius ve Phellinus igniarius vermiģtir. AraĢtırma sonucu elde edilen bulgular yeni kemoterapötiklerin ve modülatörlerin geliģtirilmesine katkı sağlayacaktır. Anahtar Kelimeler: Antitümör etki, Çoklu Ġlaç Dirençliliği, Makromantarlar, MCF-7. iv

5 ABSTRACT MS THESIS DETERMINATION OF ANTICANCER AND MODULATION EFFECTS OF TERFEZIA BOUDIERI CHATIN, FOMES FOMENTARIUS (L.) FR., PHELLINUS IGNIARIUS (L.) QUÉL. AND TRICHOLOMA ANATOLICUM H.H.DOGAN&INTINI ON BREAST CANCER CELLS Özdem ÖZDEMĠR THE GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE OF SELÇUK UNIVERSITY THE DEGREE OF MASTER OF SCIENCE BIOLOGY Advisor: Prof. Dr. Hasan Hüseyin DOĞAN Co-Advisor: Assist. Prof. Dr. Meltem DEMĠREL KARS 2014, 79 Pages Jury Prof.Dr.Hasan Hüseyin DOĞAN Doç. Dr. Rüstem DUMAN Yrd. Doç. Dr. Hakan ALLI Fungi have been used as food or treatment by people for centuries. Nowadays, various scientific fields have been done different research projects on the macrofungi and many projects are being planned for the therapies. By the help of important medical effects were obtained many edible and inedible fungal species, it has been used widely in the treatment of disease. The resistance developed against chemotherapeutic agents in cancer cell lines and tumours is known as multiple drug resistance (MDR). This resistance developed against chemotherapy causes most of the chemotherapeutic agents not to show expected impact on the patients and leads to the progression of the disease. In the experiment, dried fruiting body of fungal species were extracted by ultrasonication. After investigation of the cytotoxic effects of extracts from four different fungi species on the paclitaxel and vincristine resistant MCF-7 cell lines, drug resistance reversing ability of the extracts were determined. The effects of extracts on paclitaxel and vincristine resistant cells were determined by cytotoxicity tests XTT. As a result of the cytotoxicity assay of mushrooms, IC 50 values for MCF-7/Vinc were between 1.20 and 1.90 mg/ml, IC 50 values for MCF-7/Pac were found between 1.10 and 3.00 mg/ml. Modulation effects of mushroom extracts at MCF-7 cells were determined with fluorescence measurements (flow cytometry). It has been determined that, the mushroom extracts has the potential to become MDR modulator (the agent reversing resistance) for both resistant cells. Furthermore phenolic compounds were determined by HPLC method. Fomes fomentarius and Phellinus igniarius which are non-edible mushrooms contain the highest level of phenolic compounds which are used in the result of analysis. agents. Thus, the findings will contribute to the development of new chemotherapeutic and modulator Keywords: Antitumour effect, macrofungi, MCF-7, MDR Reversal, Multiple Drug Resistance v

6 ÖNSÖZ Tezimin her aģamasında benden bilgilerini ve yardımlarını esirgemeyen danıģman hocam Prof. Dr. Hasan Hüseyin Doğan a; yardımlarından, bilgilerinden ve desteğinden dolayı yardımcı danıģman hocam Yrd. Doç. Dr. Meltem Demirel Kars a, tez projemi destekleyerek gerekli maddi olanağı sağlayan Selçuk Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri (BAP) Koordinatörlüğü ne, yüksek lisansım boyunca yardımlarını esirgemeyen arkadaģlarım Ayça Ceylan, Ümmühan Alparslan, Zeynep Nalvuran ve Nilgün Zengin e, hayatım boyunca desteklerini ve sevgilerini benden esirgemeyen değerli aileme teģekkürü bir borç bilirim. Özdem ÖZDEMĠR KONYA-2014 vi

7 ĠÇĠNDEKĠLER ÖZET... iv ABSTRACT... v ÖNSÖZ... vi ĠÇĠNDEKĠLER... vii SĠMGELER VE KISALTMALAR... ix 1. GĠRĠġ GENEL BĠLGĠLER Mantarların Tanımı Tıbbi Özelliğe Sahip Mantarlar Kanser Meme Kanseri Çoklu Ġlaç Dirençliliği, Dirençliliğin Geri Çevrilmesi ve Kemoterapi Antikanser ve Antikanser Aktiviteye Sahip Olan Mantarlar KAYNAK ARAġTIRMASI MATERYAL VE YÖNTEM Mantar Türleri, Toplanması ve Lokasyonları Mantar Türlerinin Tanımları Mantarların Ekstraksiyonu Mantarların ultra saf su ile ekstraktının hazırlanması Mantarların metanol ve etanol ile ekstraktlarının hazırlanması Mantarların Metanol ve Etanol Ekstraktlarının Evaporatör ile Uçurulması Mantar Ekstraktlarının Liyofilizasyonu Mantar Ekstraktlarında Fenolik BileĢiklerin HPLC (High Performance Liquid Chromotography) Ġle Belirlenmesi Hücre hatları, Kültür Ortamı Sitotoksisite Testleri, IC 50 Değerlerinin Belirlenmesi Ġlaç Akümülasyon Analizleri ve Dirençliliğin Geri Çevrilmesi ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA Mantar Ekstraktı Üzerine Uygulanan Analizler Mantar Ekstraktlarındaki Fenolik BileĢiklerin Miktarları Sitotoksisite Testleri Sonuçları ve IC 50 Değerleri Flow Sitometri ile Ġlaç Akümülasyon Analizi Sonuçları SONUÇLAR VE ÖNERĠLER Sonuçlar vii

8 6.2 Öneriler KAYNAKLAR ÖZGEÇMĠġ viii

9 SĠMGELER VE KISALTMALAR LEM : Lentinus edodes miseli PSP : Polisakkaropeptid PSK : Polisakkaropeptid krestin MDR : Multidrug resistance DNA : Deoksiribonükleik asit HPLC : High Performans Liquid Chromotography COX-1,2 : Siklooksijenaz 1,2 NSAIDs : Steroid yapıda olmayan iltihap önleyici ilaç P-gp : P-glikoprotein ATP : Adenozintrifosfat MRP1 : Multiple Drug Resistance Associated Protein 1 BRCP : Breast Cancer Resistance Protein SSG : Scleroglukan As 2 O 3 : Arseniktrioksit IC 50 PBS FAR CMPTR AAL PET BT NMR TNM : Ġnhibisyon konsantrasyonu : Phosphate Buffered Saline : Floresan Activity Ratio : Karboksimetilatlı Pleurotus tuber-regium : Agrocybe aegerita Lektini : Positron emisyon tomoğrafi : Bilgisayarlı tomoğrafi : Nükleer manyetik rezonans tekniği : Tümör-Nod-Metastaz ix

10 1 1. GĠRĠġ Mantarlar tarih boyunca, dünyadaki farklı toplumlar tarafından lezzetli ve besleyici gıda olarak bilinmiģ ve kullanılmıģlardır. Birçok kültür, mantarların yenilebilir olanlarıyla zehirli türleri ayırt edebilecek pratik bilgileri nesilden nesile aktarmıģlardır. BaĢta Doğu ülkeleri, bazı mantarların insan sağlığına olan faydalarını fark etmiģ ve yaygın olarak kullanmıģlardır. Ancak bazı ülkelerde ise mantar zehirlenmelerinden korkulduğu için mantarların kullanımı çok az olmuģtur (Smith ve ark., 2002). 50 milyon yılı aģkın bir süredir mantarları tüketen ve onlarla beslendiği bilinen Attini (Formicidae) familyası karıncaları ve diğer pek çok termitler biyolojik araģtırmaların doğal sınırlarını oluģturmaktadır (Mueller, 1998). Ġnsanlığın küçüklü büyüklü topluluklar halinde yaģamaya baģlamasından beri, doğada hastalıklarla mücadele biyolojik araģtırmalarda hiç bitmeyen bir hikâye olmuģtur. Bu bilgiler nesilden nesile aktarılmıģ ve böylece yaģam kalitesinin iyileģtirilmesine yönelik çabalar sözlü veya metinsel olarak derlenmiģtir. Günümüzdeki doğal ilaçlar, saf ve etkili olarak belirlenmiģ kemoterapötik kimyasal maddelerde de kullanılmaktadır (Lahiri, 2010). Mantarlarla ilgili çalıģmalar 4000 yıl öncesine kadar uzanmaktadır. Antik Romalılar mantarların gök fırtınaları sırasında Jüpiter tarafından yeryüzüne yıldırımla geldiklerine inanmıģ ve mantarlara Tanrıların gıdası demiģlerdi. Mısırlılar ise mantarları Tanrı Osiris den bir hediye olarak kabul etmiģlerdir. Çin'de ise mantarlar hayat iksiri olarak bilinmekteydi (Smith ve ark., 2002). Afrika kıtasındaki mantar kullanımının en eski arkeolojik kanıtı, M.Ö en az 5000 yıllarına uzanan Cezayir deki mağara duvarlarındaki temsili resimlerde görülebilir. Resimde; dansöz 80 cm. uzunluğundaki maskeyle ve dönemin kaya resimlerindeki tipik duruģu ile görünmektedir. Bu tarihi resimde bir Ģaman ve halusinojenik bir mantar sembolize edilmiģtir (ġekil 1.1). Avrupa kıtasında Fransa nın Bego dağında yapılan bir kazıda mağaradaki Ģekillerde Ģamanistik bir öğe olan Amanita dıģında bazı mantarlar da figürlerde kullanılmıģtır. Diğer önemli arkeolojik bir belgede antik Yunan kültüründe bulunmuģtur. Aristo, Platon ve Sofokles in mantar tüketimini ele alan dini törenlerde yer aldıklarına inanılır.

11 2 ġekil 1.1. M.Ö yılında mağarada en eski arkeolojik Ģaman görüntüsü (Smith ve ark., 2002) Mısır firavunları mantarı tanrıların besini olarak gördüklerinden halka yasaklamıģlardı. Roma imparatorluğunda lejyonerlere güç verdiğine inanılan mantar, orduların besin kaynağı olarak kullanılırdı. Ortaçağ da ise simyacılar mantarların sihirli olduğunu ve reenkarnasyonu simgelediğini düģünmüģler ve birçok iksir, ilaç ve zehir yapımında kullanmıģlardır. Belki de antik çağlarda mantar kullanımının en etkileyici yönlerinden biri bazı mantarların psikoreaktif halusinojenik özellikleri ile alakalıdır. Bazı mantarların antik dini inanıģlarda ve uygulamalardaki yerini anlatan yaygın bir literatür vardır. AraĢtırmalar, küçük halusinojenik mantarlar olan Psilocybe spp. ve Panaeolus spp. in Orta Amerika da ve Amanita muscaria (L.) Lam. nın Kuzey Avrupa da, Sibirya da ve Sanara bölgesinde paleolitik zamanlara kadar uzanan yaygın kullanımını göstermiģtir. Bugüne kadar toplanan detaylı bilgiler, dinin ilkel biçimlerinde halusinojenik mantarların kullanımını belirtmektedir. Orta Amerika da M.Ö 3000 yıllarına dayanan birçok mantar taģları vardır. Bu taģlar Guatemala daki maya kazı bölgelerinde bulunmuģtur (Smith ve ark., 2002), (ġekil.1.2.).

12 3 ġekil 1.2. Orta Amerika da yaklaģık 3000 yıl öncesine ait mantar bibloları (Smith ve ark., 2002) BağıĢıklık sisteminin kuvvetlendirilmesi, Çin tıbbında uzun süreden beri önemli bir yere sahiptir ve Fu Zheng terapisi olarak adlandırılmaktadır. Tıbbi özelliğe sahip olan mantarların ürettikleri bileģikler sayesinde mantarlar, hastalık direncini artırmak ve vücut fonksiyonlarının normal seviyede kalması için Doğu ülkelerinde eski zamanlardan bu zamana kadar hala yaygın olarak kullanılmaktadır lı yıllardan bu yana tıbbi mantarlar hakkında yapılan araģtırmalar sonucunda mantarların klasik anlamda tamamının kullanılmasından ziyade daha çok mantar ekstraktlarının elde edilip, onların etkileri hakkında bilgiler ortaya konulmaya çalıģılmıģtır. Yapılan bu araģtırmalar sonucunda mantarların direkt olarak bakteri, virüs veya kanser hücrelerini öldürmediği fakat bağıģıklık sistemini düzenleyip, güçlendirdikleri tespit edilmiģtir (Smith ve ark., 2002). Tüm hastalıkların tedavilerinde esas rolü vücudun bağıģıklık sistemi üstlenmektedir. BağıĢıklık sistemini zayıflatan etmenlerin ortadan kaldırılması tedavinin ilk basamağıdır ve bağıģıklık sisteminin güçlenmesi sayesinde vücut hastalıklara karģı daha dirençli hale gelmekte ve iyileģme süreci kısalmaktadır. Ġlaçlardan kesin sonuç alınamaması, insanları son yıllarda alternatif tedavi yöntemlerine baģvurmaya zorlamıģtır. Bu konuda alternatif tıp adı altında yeni yöntemler geliģtirilmeye çalıģılmaktadır. Bunların baģında da doğal bitki ve mantarlardan elde edilen ham veya içerikleri belirlenmiģ ekstraktlar son yıllarda oldukça popüler konuma gelmiģtir. Bu ekstraktlar doğrudan tedavi amaçlı kullanılabildiği gibi, vücut bağıģıklığını destekleyici roller üstlenebildikleri için uygulanan tedavilere ilave materyaller olarak da tercih edilmektedirler. Bu konu üzerinde dünyada farklı mantar türleri değiģik kanser

13 4 çalıģmalarında kullanılmıģ ve olumlu sonuçlar elde edilmiģtir. Bu mantarlara örnek olarak Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst., Lentinula edodes (Berk.) Singer, Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.) Pilát, Trametes versicolor (L.) Lloyd, Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm., Flammulina velutipes (Curtis) Singer ve Grifola frondosa (Dicks.) Gray verilebilir (Smith ve ark., 2002). Mantarların antikanser çalıģmaları üzerindeki araģtırmalar günümüzde oldukça popüler olmasına rağmen ülkemizde bu konu üzerinde fazla sayıda çalıģmalara rastlanılmamıģtır. Ülkemiz mantar çeģitliliği açısından zengin olduğu halde, mantarların tıbbi amaçla kullanılması pek tercih edilmemektedir. Ülkemizden toplanıp yurt dıģına ihraç edilen farklı mantar türleri bulunmasına rağmen bunların üzerinde detaylı bir araģtırma ne yazık ki bulunmamaktadır. Bu çalıģmada kullanılan Tricholoma anatolicum ve Terfezia boudieri buna örnek verilebilir. Tricholoma anatolicum ülkemiz için endemik bir tür olup sonbahar aylarında toplanarak herhangi bir iģlem yapılmadan doğrudan Japonya ya ihraç edilmekte, Terfezia boudieri ise ilkbahar aylarında toplanıp iç pazarlarda tüketilmekte veya Ortadoğu ülkelerine ihracı yapılmaktadır. Önemli ticari girdi sağlayan bu mantarlar hakkında detaylı bir araģtırma yapılmaması ülkemiz milli değerlerini koruma stratejisi açısından bir eksikliktir. Ayrıca Phellinus igniarius ve Fomes fomentarius gıda olarak tüketilmemesine rağmen değiģik medikal özelliklere sahiptirler. Ġki yenen tür (Tricholoma anatolicum ve Terfezia boudieri) ve diğer iki yenmeyen tür (Fomes fomentarius ve Phellinus igniarius) ekstraktlarının kanser hücrelerinin üremeleri üzerindeki etkileri araģtırılmıģtır. ÇalıĢmada kullanılan mantar türlerinin su, metanol ve etanol ekstraktları elde edildikten sonra MCF-7 hücreleri üzerine etkileri belirlenmiģtir. Elde edilen bulgular yeni kemoterapötikler ve modülatörler geliģtirilmesine katkı sağlayacaktır. Aynı zamanda mantar ekstraktlarının HPLC ile içerdikleri fitokimyasalları tespit edilerek antikanser özelliği olan bileģiklerin varlığı tespit edilmiģtir. Belirtilen mantarların literatür taramalarına göre antikanser çalıģmalarında kullanılmaması nedeniyle bu türler özellikle seçilmiģtir.

14 5 2. GENEL BĠLGĠLER 2.1. Mantarların Tanımı Mantarlar; ökaryotik, klorofil içermeyen, tüp Ģeklinde ipliksi hücrelerden meydana gelen, spor oluģturan ve heterotrof yaģayan ve biyolojik çeģitliliği sağlayan en önemli organizmalardan biridir (Chang ve Miles, 1987). Mantarlar kendi besinlerini kendileri yapamadıklarından dolayı saprofit, parazit veya mikorizal olarak yaģayabilirler. Yüksek yapılı mantarlar (Ascomycota ve Basidiomycota) morfolojilerine göre kabaca mikrofunguslar ve makrofunguslar olarak ikiye ayrılmaktadır. Fruktifikasyon organları gözle görülemeyecek kadar küçük olanlar mikrofunguslar, fruktifikasyon organları gözle görülebilecek Ģekilde olanlar makrofunguslar olarak bilinirler (Chang ve Miles, 1987). Makrofunguslar, ormanlık ve çayırlık alanlarda organik madde bakımından zengin topraklar veya canlı, ölü ağaçlar, çürümüģ dal, kütükler gibi habitatlarda geniģ yayılıģ gösterirler. YayılıĢ gösterdikleri bu habitatlarda dikkat çekici renklerde ve Ģekillerde fruktifikasyon organı meydana getirirler. Bu özellikleri ile sürekli olarak insanoğlunun ilgisini çekmiģ ve mantarlardan yararlanma yolları araģtırılmıģtır. Toplum tarafından besin maddesi eldesinde ve doğrudan doğruya gıda olarak da kullanılmaktadır. Gıda olarak kullanılanlar doğal habitatından toplanıp yendiği gibi, kültüre alınıp yenilenleri de vardır. Kullanılabilir mantarlar ormancılık, sanayi, biyoteknoloji, biyoremidasyon, restorasyon, ağaçlandırma, tıbbi amaçlar vb. gibi alanlarda kullanılmaktadır (Lahiri, 2010). Dünyanın büyük bir kısmında özellikle Avrupa'da yabani mantarlar düzenli bir Ģekilde toplanıp ve doğrudan temel besin kaynağı olarak ya da çorbalara, çaylara ve yemeklere ilave edilerek kullanılmıģlardır. Et, süt ve yumurta ile mukayese edildiğinde yenilebilir mantarların da son derece besleyici olduğu bilinmektedir. Mantarlardaki sindirilebilir protein kaynağı, et ve sütten daha az fakat çoğu sebzedeki proteinden de daha çok olabilmektedir. Kuru ağırlık olarak bakıldığında protein miktarı %10-40 oranında değiģmektedir. Mantarlar bütün esansiyel amino asitleri içerir fakat kükürt ihtiva eden amino asitler sistin ve metionin bakımından sınırlayıcı olabilir (Chang, 1991; Breene, 1990). Aynı zamanda hücre, doku, organların büyümesi ve tamiri için gerekli olan alanin, arginin, glisin, glutamik asit, aspartik asit, serin ve praline gibi esansiyel olmayan amino asitlerde ihtiva etmektedirler (Leon-Guzman ve ark., 1997). Taze mantarlar (kuru ağırlık) yaklaģık %55-88 (w/w) oranında karbonhidrat

15 6 içermektedirler. Aynı zamanda, mantarların kayda değer karbonhidrat oranı insanlar tarafından kolayca sindirilemeyen liflerden oluģmaktadır. Karbonhidrat bileģenleri, pentoz, metil pentozlar, heksozlar, disakkaritler, amino Ģekerler, Ģeker alkoller ve Ģeker asitleri de dahil olmak üzere geniģ bir yelpazeden oluģmaktadır (Crisan ve Sands, 1978). Glikojen, monosakkaritler ve disakkaritler (örneğin trehaloz gibi), Ģeker alkolleri (örneğin mannitol gibi) mantarlarda bulunan ve aynı zamanda enerji kaynağı olarak büyük önem taģıyan ortak karbonhidratlardandır (Barros ve ark., 2007). Mantar Ģekeri olan trehaloz tüm mantarlarda var olarak kabul edilse de, bu Ģeker sadece genç örneklerde önemli miktarda oluģur ve mantar olgunlaģtıkça glikoz olarak hidrolize edilmektedir (Barros ve ark., 2007). Mantarlar sadece diyet takviyesi olmamalı aynı zamanda hastalıkları önleyici ve tedavi edici özelliği olan gıda olarak tüketilmelidir. Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach (kültür mantarı), Lentinus edodes (Shiitake mantarı), Pleurotus ostreatus (istiridye mantarı), Auricularia auricula-judae (Bull.) Quél. (kulak mantarı), Flammulina velutipes (Enoki mantarı), Volvariella volvacea (Bull.) Singer (çeltik saman mantarı), Morchella esculenta (L.) Pers. (morel, kuzu göbeği), Tremella fuciformis Berk. (gümüģ kulak), Tuber melanosporum Vittad. (siyah truffle, domalan) gibi mantarlar yaygın olarak tüketilen mantar türleri arasındadır. Tricholoma spp. (Ġspanya), Cantharellus spp., Hydnum spp., Lactarius spp., Xerocomus spp., Amanita spp. ve Hygrophorus spp. (Yunanistan), Lactarius spp., Tricholoma spp., Leucopaxillus spp., Sarcodon spp. ve Agaricus spp. (Portekiz), Ramaria spp., Psathyrella spp. ve Termitomyces spp. (Nijerya) ve Agaricus spp., Amanita spp., Boletus spp., Hydnum spp., Hypholoma spp., Lactarius spp., Pleurotus spp., Russula spp. ve Tricholoma spp. (Türkiye) gibi çeģitli ülkelerden gelen mantar türlerinin besin değerleri ve antioksidan aktiviteleri birçok bilim insanı tarafından araģtırılmıģtır (Aletor, 1995; Demirbas, 2001; Di ez and Alvarez, 2001; Barros ve ark., 2007; Ferreira ve ark., 2007; Ouzouni ve ark., 2007). Mantarlardaki niģasta yapısında olmayan polisakkaritler bağırsak içeriğinin geçiģini hızlandırmanın yanı sıra kolon kanseri, divertikül hastalığından (kalın bağırsağın mukoza adı verilen iç yüzeyinin zayıfladığı belirli alanlarda dıģarıya doğru cepleģmesi veya fıtıklaģması) ve irretabl (huzursuz) bağırsak sendromundan vücudu korumaktadır. β-glukan gibi bazı fonksiyonel karbonhidratlar kan kolesterol ve kan Ģeker seviyesinin azaltılması dıģında bağıģıklık artırıcı özelliklere de sahiptir (Thorn ve ark., 2001). Mantar kaynaklı polisakkaritler, insanlarda ve hayvanlarda immün yanıtları

16 7 modüle eden ve bazı tümör büyümelerini önleyebilen bileģikler olarak dikkate alınmaktadır. Yapılan klinik denemeler sonucunda birçok mantar polisakkaritlerinin önemli bir antitümör aktivitesine sahip olduğu gösterilmiģtir. Bazı çalıģmalarda Lentinus edodes 'den Lentinan, Schizophyllum commune Fr. 'nin besiyerinde geliģtirilen misellerinden Schizophyllan, Trametes versicolor' un misel kültüründen elde edilen PSK ve PSP, Grifola frondosa 'dan da Grifon-D gibi polisakkarit ürünleri belirlenmiģtir. Tıbbi özelliğe sahip mantarların içerdiği bileģikler birçok durumda yaģam standardı ve kalitesinin artmasına yardımcı olmaktadır. Gün geçtikçe bu bileģiklerin bazıları, standart radyoterapi ve kemoterapiye katkı olarak artık Japonya, Çin ve Kore de yaygın bir biçimde kullanılmaktadır (Smith ve ark., 2002). Bilim insanları makrofunguslar üzerinde daha birçok araģtırma yaparak mantarların büyük bir kısmının farklı türdeki bakteri, virüs ve aynı zamanda çeģitli kanser hücrelerine karģı son derece etkili olduğunu yani antibakteriyel, antiviral ve antikanser etkilerinin olduğunu belirtmiģlerdir Tıbbi Özelliğe Sahip Mantarlar Tıbbi özelliğe sahip mantarlar tarih boyunca birçok hastalığın tedavisi için insanlar tarafından kullanılmıģtır. Günümüzde de baģta Japonya, Çin, Kore ve diğer Asya ülkeleri olmak üzere dünyada modern klinik uygulamalarında mantar kökenli tedavi takviyesi yapılarak, hastalıkların tedavisinde alternatif çözüm yolları üretilmeye çalıģılmaktadır (Wasser, 2008). Kimyasal madde üreten enstitüler, ilk insanlığın hastalıklara karģı ilaç keģfetmesinin ve biyolojik araģtırmalarının oldukça uzun bir yoldan geçerek günümüze kadar ulaģtığını belirtmektedirler (DNP, 2010). 20.yüzyılda Penicillium notatum Westling küfünden elde edilen penisilindeki antibakteriyel özellikler, doktorlar tarafından bulaģıcı hastalıklara karģı savaģta güçlü bir silah olarak kullanılmıģtır (Ji ve ark.,2009). 18.yüzyıla kadar tıbbi mantarların kullanımı, Fomes fomentarius ve 'Iceman' olarak kaydedilen Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst. mantarının yaraları iyileģtirmede kullanıldığı tespit edilmiģtir (Stamets, 2002). Slav ülkelerinin geleneksel medikal kitaplarında yaklaģık 40 Ģifalı mantar türünün sayısız insan hastalıklarına iyi geldiği ileri sürülmüģtür. Kamçatka kırsal Rus halkı, Amanita muscaria (sinek mantarı)' ya "Tanrının sert içkisi ya da Ģefin zehirli iksiri" demiģlerdir. Kostroma bölgesinde bu mantar karın ağrısı ya da mide hastalıkları ve diğer hastalıklara karģı tentür olarak

17 8 kullanılmaktadır. Tentür bitkilerin kök, gövde, çiçek, yaprak veya dallarının bitkisel alkol (Ģeker kamıģından elde edilir), sirke veya su ile karıģtırılmasından elde edilen karıģıma verilen genel isimdir. Çiftçiler uykuya dalmak için bu tentürden 5-6 damla alarak uyutucu ilaç gibi kullanmıģlardır. Belarus'ta halk, ağrılı bölgelere sürerek romatizmal ağrılara karģıda kullanmıģtır. Sibirya'da bu tentür meydana gelen kırıklardan sonra kırık kemiklerin iyileģmesine yardımcı içecek olarak kullanılmıģtır (Lahiri, 2010). Ġlk tıbbi mantarlardan biri olan Fomitopsis officinalis (Vill.) Bondartsev & Singer Rus Çar'ının emri ile toplatılmıģtır. Daha sonraları bu mantar kanamayı durdurucu, müshil, bronģiyal astım ve tüberküloz hastalarının gece terlemelerini tedavi etmek için kullanılmıģtır. Amerikalılar ve Hintliler, Fomitopsis officinalis mantarının mucizevî güçleri olduğuna inanmıģlardır. Antik Roma yaģlıları tarafından, mide, hazımsızlık, karaciğer, böbrek ve üriner sistem hastalıkları (özellikle mesane taģlarından kaynaklanan zor idrara çıkma), tüberküloz, astım, epilepsi ve yılan ya da akrep sokmalarına karģı panzehir olarak kullanılmıģtır. Sibirya çiftçileri, kanayan yarayı durdurucu olarak, hazımsızlığa, hemoroide, rahim, meme, yemek borusu ve mide kanserlerine karģı kullanmıģlardır. Benzer bir Ģekilde Fomitopsis pinicola (Sw.) P. Karst. (kırmızı kuģaklı polypor) mantarı Doğu ülkelerinde antitümör ve sedatif özelliği nedeniyle çok yaygın olarak tüketilmektedir. Ayrıca, 19.yüzyıl Amerikan ilaç kitabında F. pinicola, kasılmalı ateģ, kronik ishal, dizanteri, sarılık ve diüre gibi hastalıklarda kullanılması tavsiye edilmiģtir. Bu tür Doğu Kanada'da mideyi temizlemek için kusturucu ilaç gibi kullanılmıģtır (Denisova,1998). Chaga mantarı olarak bilinen Inonotus obliquus, Ural, Sibirya, Polonya ve Baltık ülkeleri dâhil olmak üzere Rusya genelinde farklı gastrointestinal hastalıklardan ülser ve gastritin tedavisi için kullanılmaktadır. Yüzyıllardan beri kötü huylu tümörlerin tedavisi Inonotus obliquus ve Phellinus nigricans (Fr.) P. Karst. ile yapılmaktadır. Rusya'da yapılan bir çalıģmada Piptoporus betulinus mantarının kaynatma yolu ile özünden faydalanarak parotis bezi kanserini durdurduğu belirlenmiģtir (Denisova,1998). Birçok tıbbi mantardan elde edilen ekstraktların en göze çarpan özelliklerinden biri immunmodülatör olarak iģlev görme yeteneğinin olmasıdır. Bu nedenle Uzakdoğu tıbbında, mantar bileģiklerinin alımı sayesinde homeostazın düzenlenmesi ve hastalıklara karģı direncin artırılması gibi savunma mekanizmalarının geliģimi sağlanmıģtır. Antikanser maddeler, antioksidan, antihipertansif, antifibrotik, antiinflamatuar, kolesterol düģürücü, karaciğer koruyucu, antidiyabetik, antiviral ve antimikrobiyal gibi aktiviteler gösteren polisakkaritleri içeren mantarlar besin takviyesi

18 9 olarakta önemli yere sahiptirler (Zjawiony, 2004). Mantarlar, sağlık ve sporun geliģtirilmesinde biyoaktif bileģiklerin alımını artırmasının yanı sıra insanlar tarafından düzenli bir gıda olarak tüketilmek üzere diyet takviyesi için kullanılması önerilmektedir. Ticari odaklı olan Grifola frondosa, Lentinula edodes, Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Agaricus blazei Murrill, Cordyceps sinensis, Hericium erinaceus (Bull.) Pers. ve Schizophyllum commune gibi 600'den fazla tıbbi mantar türlerinin bağıģıklık sistemini uyarım etkileri saptanmıģtır (Casey, 2008). Mantarlar fonksiyonel gıda olarak çeģitli insan hastalıklarının önlenmesi ve tedavisinde kullanımı önemli ölçüde artmaktadır (Chang and Buswell, 1996). Kolesterol miktarını azaltmada; Auricularia auricula-judae, Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc., Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Pleurotus ostreatus ve Tremella fuciformis mantarları, trombosit bağlayıcılığını azaltmada; Auricularia auricula-judae, Calyptella sp., Ganoderma lucidum, Kuehneromyces sp., Neolentinus adhaerens (Alb. & Schwein.) Redhead & Ginns ve Panus sp., kan basıncını azaltmak için; Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Tricholoma mongolicum S. Imai, trigliserid seviyesini azaltmak için; Cordyceps sinensis, Grifola frondosa, Lentinus edodes gibi mantar türleri büyük oranda spesifik tedavi potansiyelleri olduğu belirtilmektedir (Francia ve ark., 1999). Makrofunguslar, tıbbi özellikleri nedeniyle araģtırmacıların dikkatini çekmektedir. Polisakkaritlerin bağıģıklık sistemini güçlendirmesi ve antikanser etkisinin olduğu yapılan çalıģmalarda bulunmuģtur (Smith ve ark., 2002). Ancak glikoproteinlerin ve ergosterol gibi diğer küçük moleküllerinde bağıģıklık sistemini desteklediği anlaģılmıģtır. AraĢtırmacılar makrofungusların sahip oldukları önemli özellikler sebebiyle, biyolojik süreçlerin zenginleģtirilmesine ve güçlendirilmesine katkıda bulunmuģlardır. Yakın geçmiģte bağıģıklık sisteminin güçlenmesini sağlayan birtakım biyolojik etkiden sorumlu olduğu düģünülen ve hedef bölge ile en iyi Ģekilde etkileģerek biyolojik cevabı baģlatmak için gerekli özelliklere sahip olan grupların bulunmasıyla antitümör tedavisi gibi sistemlerin getirilmesine tanık olmuģtur. Ayrıca anti-cd20 ilaçlar, doğal antagonistler, antikorlar ve çözünebilir reseptörlerin geliģtirilmesi klinik evreler için daha da artırılmıģtır (Cassatella ve Perretti, 2006). Polisakkaritler veya polisakkaritprotein kompleksleri gibi yüksek molekül ağırlıklı bileģikler, Lentinus edodes, Grifola frondosa, Schizophyllum commune, Trametes versicolor ve Sparassis crispa (Wulfen) Fr. gibi çeģitli mantarlarda bulunmuģ ve bu mantarlarda bulunan bileģiklerin bağıģıklık

19 10 sistemini düzenleyici aktiviteye sahip olduğu bildirilmiģtir (Wasser ve Weis, 1999; Gordon, 1995; Lindequist ve ark., 2005). Phellinus linteus (Berk. & M.A. Curtis) Teng 'in misel kültürünün saflaģtırılması sonucunda elde edilen aktif polisakkaritlerin bağıģıklık sistemini uyardığı bilinmektedir (Kim ve ark., 1996). Brezilya poliporları [Phellinus rimosus (Berk.) Pilát, Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill, Hymenochaete rheicolor (Mont.) Lév., Hexagonia papyracea Berk., Datronia caperata (Berk.) Ryvarden, Lepiota sp.] gibi çeģitli mantarların ise bağıģıklık sistemin baskılanmasına neden olduğu bilinmektedir (Silva ve ark., 2009). Biyoaktivite değerlendirmelerinin çoğu antimikrobiyal, antikanser etkileri ve bağıģıklık sistemiyle ilgilidir (Zjawiony, 2004). Fakat polipor mantarlarının antiinflamatuvar ve farmakolojik değerlendirmeleri ile ilgili bilgiler yeterli değildir. Phellinus linteus, Ganoderma lucidum, Phellinus durissimus (Lloyd) A. Roy 'un önemli bir antiinflamatuvar aktiviteye sahip olduğu rapor edilmiģtir (Koyama ve ark., 1997). Ayrıca Morchella esculenta ve Grifola frondosa mantarlarında bazı non polar moleküller vardır ve bu moleküllerin siklooksijenaz COX-1 ve COX-2 yi inhibe ettiği rapor edilmiģtir. Böylece çeģitli taksonlarda bulunan mantar özütlerinin metabolitlerinin antiinflamatuar aktiviteye sahip olduğu söylenebilir (Zhang ve ark., 2002). ÇeĢitli türde iltihaplı hastalıklar genelde steroid yapıda olmayan iltihap önleyici ilaçlar (NSAIDs) veya COX-2 inhibitörleri ile tedavi edilir. Bu durum semptomatik olarak rahatlama sağlayabilir ancak hastalığın ilerlemesini engellemede yetersizdir. Ayrıca steroid yapıda olmayan iltihap önleyici ilaçların (NSAIDs), COX-2 inhibitörleri ile yer değiģtirmesi nedeniyle önce gastrointestinal rahatsızlıklar ve daha sonra da miyokardiyal enfarktüse neden olduğu belirlenmiģtir. Olumsuz etkilerin ortaya çıkmasından dolayı, steroid yapıda olmayan iltihap önleyici ilaçlara (NSAIDs) ve COX-2 inhibitörlerine duyarlı hastalar nedeniyle kullanıma sınırlama getirilmiģtir (Sciulli ve ark., 2005). Son yıllarda bazı mantarların, immünolojik ve antikanser, antioksidasyon, antihipertansif ve kolesterol düģürücü özellikleri, karaciğer koruması, antiinflamatuvar, antidiyabetik, antiviral ve antimikrobiyal özelliklerinin ortaya çıkması ile hastalıkların tedavilerinde potansiyel olarak önemli yararlar sağladıkları bulunmuģtur. Ayrıca homeostazinin düzenlemesine de büyük katkı sağlarlar. Bu özellikler, yeni bulunacak biyomedikal moleküller için tıbbi mantarlara zengin bir kaynak gözüyle bakan pek çok ilaç firmasının da ilgisini çekmektedir. Funguslar tarafından üretilen pek çok polisakkarite bağlı protein ABD Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından antitümör kimyasal madde olarak sınıflandırılmıģtır (Çizelge 2.1.).

20 11 Çizelge 2.1. Tıbbi özelliklere sahip mantarlar ve biyoaktiviteleri (Zhang, 2006) MANTARLAR POLĠSAKKARĠT BĠYOAKTĠVĠTESĠ KAYNAĞI Agaricus blazei Miselyum, fruktifikasyon Antitümör Armillariella tabescens Miselyum Antitümör Auricularia auricula-judae Fruktifikasyon Hiperglisemi, antitümör, antiinflamatuar, antiradyoaktif, immunmodülatör Clitopilus caespitosus Fruktifikasyon Antitümör Cordyceps sp. Fruktifikasyon, miselyum Ġmmunmodülatör, antitümör, hiperglisemi Dictyophora indusiata Fruktifikasyon Antitümör, hiperlipidemi Flammulina velutipes Miselyum, fruktifikasyon Antitümör, antiinflamatuar, antiviral, immunmodülatör Ganoderma applanatum Fruktifikasyon Antitümör Ganoderma lucidum Fruktifikasyon, misel Hiperglisemi, antitümör, antioksidatif, bağıģıklık sistemi koruyucu, yaģlanma geciktirici Grifola frondosa Fruktifikasyon Antiinflamatuar,antitümör, immunmodülatör,antiviral,karaciğer koruyucu Hericium erinaceus Miselyum, fruktifikasyon Hiperglisemi, antitümör, immunmodülatör Inonotus obliquus Miselyum, fruktifikasyon Antitümör, immunmodülatör Lentinus edodes Misel, fruktifikasyon Antitümör, antiviral, immunmodülatör Morchella esculenta Fruktifikasyon Antitümör, hiperglisemi Omphalia lapidescens Fruktifikasyon Antiinflamatuar, Ġmmunmodülatör Peziza vesiculosa Fruktifikasyon Ġmmunmodülatör, antitümör Phellinus linteus Fruktifikasyon Antitümör Pleurotus citrinopileatus Fruktifikasyon Antitümör Pleurotus ostreatus Fruktifikasyon Antitümör, hiperglisemi, antioksidan Pleurotus tuber-regium Sclerotium, miselyum Karaciğer koruyucu, anti meme kanseri Polyporus umbellatus Miselyum Antitümör, immunmodülatör Polystictus versicolor Miselyum, fruktifikasyon Antitümör, antiinflamatuar, antiradyoaktif, immunmodülatör, hiperglisemi Schizophyllum commune Miselyum Antitümör Sclerotinia sclerotiorum Sclerotium Antitümör Trametes robiniophila Miselyum Ġmmunmodülatör, antikanser, karaciğer koruyucu Tremella aurantialba Miselyum,fruktifikasyon Ġmmunmodülatör,hiperglisemi Tremella fuciformis Fruktifikasyon, miselyum Hiperglisemi, antitümör, antiyaģlanma, hiperlipidemi, immunmodülatör, antitrombus Tricholoma mongolicum Fruktifikasyon Antitümör

21 Kanser Kanser, bazı etkenlerle değiģime uğramıģ hücrelerin kontrolsüz olarak çoğalıp büyümesi sonucu oluģan habis hastalıklar grubudur (ġekil 2.1). Ayrıca kanser geliģmiģ veya geliģmekte olan ülkelerde ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Kanser hücrelerinin vücudun içine doğru yayılma kabiliyetinde olmaları, kanseri kanser yapan en mühim özelliktir. Kanser, önce yakınındaki dokulara yayılım gösterir. Bu durum lokal belirtilere ve tahribata yol açar. ġekil 2.1. Kanserli ve normal hücrenin Ģematize edilmiģ hali Kanser çok eski çağlardan beri bilinmekte ise de, 20. yüzyılda dikkatleri üstüne çekmiģ ve çağımız insanlarının en çok çekindiği bir hastalık olma vasfını kazanmıģtır yılında ABD 'de Doll ve Peto isimli bilim adamları yaptıkları araģtırmalarla kanser ölümlerinin oranlarını tahmin etmiģlerdir. Kanser ölümlerinin %2'sinin kirlilik, %30 oranında tütün ürünlerinden, %35 oranında da yanlıģ beslenmeden olduğu tahmin edilmektedir. Alkol, gıda katkı maddeleri, sanayi ürünleri, ilaçlar, jeofizik faktörleri ve enfeksiyon gibi diğer faktörlerde çeģitli oranlarda verilmiģtir (Clapp ve ark., 2007). Yunan-Roma döneminde tüm tümörler (Yunanca'da: onkoi, anormal ĢiĢlikler) inflamatuvar kökenli olarak kabul edilmiģtir. Ġstenmeyen vücut sıvılarının, doku ve boģluk içine damar dıģından taģması sonucunda oluģtuğu söylenmiģtir. Celsus'un açıklamasına göre yangı, ağrı, kızarıklık, ısı ve ĢiĢlik ile karakterize edilmektedir. Ancak iltihap ağrısı, kızarıklığı ve ısısı yavaģ yavaģ vücut yüzeyine yakın olurken, tümörün anormal ĢiĢlik veya kitle olarak ortaya çıktığı kabul ediliyordu. Bu fikir 18.yüzyılın sonlarına kadar devam etmiģtir (Retief ve Cilliers, 2001). Tümörlerin neoplastik doğası yaklaģık iki asırlık bir kavram olarak bilinmektedir. Hipokrat'a göre tümörler çoğunlukla karkinomata, phumata ve oidemata olarak sınıflandırılmıģtır. Phumata, tümörlerin inflamatuvar ve neoplastik kökenli ve çoğunlukla iyi huylu olan çok çeģitli kısmına dâhildir. Oidemata, yumuģak, ağrısız tümörler ve ödemide (su toplaması) içermektedir. Diğer kategoriler büyük olasılıkla ara

22 13 sıra olan kanserlere dâhil olsada malign yani kötü huylu tümörlerin büyük bir çoğunluğu "karkinoi karkinomata" olarak adlandırılmaktadır. 19.yüzyılın sonlarında tümör oluģumu ve karsinogenezin kavramlarının Yunan-Romen kuramları ve bugünkü modern kavramlarından farklı olduğu bilinmektedir (Retief ve Cilliers, 2001). Sağlıklı vücut hücreleri bölünebilme yeteneğine sahiptirler. Ölen hücrelerin yenilenmesi ve yaralanan dokuların onarılması amacıyla bu yeteneklerini kullanırlar. Fakat bu yetenekleri de sınırlıdır. Sonsuz bölünemezler. Her hücrenin hayatı boyunca belli bir bölünebilme sayısı vardır. Sağlıklı bir hücre ne zaman ve nerede bölünebileceğini bilme yeteneğine sahiptir. Buna karģın kanser hücreleri, bu bilinci kaybeder, kontrolsüz bölünmeye baģlar ve çoğalırlar. Kanser hücreleri toplanarak tümörleri oluģtururlar, tümörler normal dokuları sıkıģtırabilirler, içine sızabilirler ya da tahrip edebilirler. Eğer kanser hücreleri oluģtukları tümörden ayrılırsa, kan ya da lenf dolaģımı aracılığı ile vücudun diğer bölgelerine gidebilirler. Gittikleri yerlerde tümör kolonileri oluģturur ve büyümeye devam ederler. Kanserin bu Ģekilde vücudun diğer bölgelerine yayılması olayına metastaz adı verilir (Kosova ve Arı, 2008). Kanserler oluģmaya baģladıkları organ ve mikroskop altındaki görünüģlerine göre sınıflandırılırlar. Farklı tipteki kanserler, farklı hızlarda büyürler, farklı yayılma biçimleri gösterirler ve farklı tedavilere cevap verirler. Bu nedenle kanser hastalarının tedavisinde, var olan kanser türüne göre farklı tedaviler uygulanır. Aynı zamanda her kanserde aynı yapıya sahip değildir. Hücre büyümesi, genetik kodlar ve DNA da bulunan düzenleyici sistemler tarafından kontrol edilir. Anormal hücreler, normal insan hücrelerinin nesil sonra bölünmesinin durmasından, hücrelerin ömürlerini tamamladıktan sonra apoptosis denilen sürece girmelerinden ve önceden programlanmıģ hücre ölümlerinden sorumludur (Anonim, 2013). Çağımızda kanserin en yaygın hastalıklardan biri olmasında, kesin teģhis imkânlarının artmıģ olmasının da rolü büyüktür. Batı toplumlarında her yıl kiģiden biri kansere yakalanmaktadır. 60 yaģın üzerinde ise kansere yakalanma sıklığı daha da artmaktadır. Kanserin yaklaģık %80-90'ı çevresel faktörler tarafından meydana gelmektedir. Günümüzde toplumda en fazla sayıda kansere neden olan kanserojenler sigara dumanında bulunmaktadır. Aynı zamanda kalıtım yoluyla meydana gelme olasılığı da çevresel faktörlere oranla çok daha azdır. Birçok ailede kanser olmaya güçlü bir kalıtsal eğilim vardır. Kansere yakınlığı bulunan ailelerin genomlarında bir veya daha fazla mutasyona uğramıģ gen bulunmaktadır. Higginson ve Muir, tüm kanserlerin

23 14 %80'inin çevresel etkenler nedeniyle olduğunu iddia etmiģlerdir (Higginson ve Muir, 1977). Kanser ilk geliģtiği yerden vücudun diğer kesimlerine de sıçrarsa (metastaz) iyileģme ümidi hemen hemen yok gibidir. Günümüzde kesin teģhis ve tedavi imkânları oldukça arttığından, erken teģhis edilen birçok vaka tedavi edilebilmektedir. Fakat teģhis, hastaların çoğu defa ihmalleri yüzünden erken yapılamamakta, dolayısıyla da kanser, ölüm sebepleri arasında ilk sıralarda yer almaktadır. Birçok geliģmiģ ülkelerde ve yurdumuzda kanserden olan ölümler ikinci sırayı almaktadır. Ülkemizde her sene bin kiģinin kanserden öldüğü tahmin edilmektedir (Anonim, 2013). Kanserin bir genetik hastalık olduğu inancı, gün geçtikçe artmaktadır. Kanserin sebebi ve meydana geliģ mekanizması kesin olarak bilinmemektedir. Monoklonal immün globülin yapan lenfoit doku tümörleri, kromozom iģaretleri ve enzim iģaretleri ile yapılan çalıģmalar organizmadaki bütün tümör hücrelerinin kanserleģmiģ tek bir hücreden geliģtiği izlenimi vermektedir. Kanser olmaya potansiyel gücü olan normal genlere protoonkojen gen denmektedir. Onları bu tip bir değiģime zorlayan sebepler çevre, diyet yahut genetik faktörlerdir (Anonim, 2013). Kanser tek bir hastalık değildir. 100'den fazla farklı ve kendine özgü çeģitleri vardır. Bunlar; meme kanseri, kolon kanseri, cilt kanseri, lösemi, lenfoma, multipl miyelom, kemik kanseri ve daha birçok çeģidi sayılmaktadır. Ülkemizde en sık görülen kanserler erkeklerde akciğer, prostat, kalın bağırsak, rektum, mide ve pankreas; kadınlarda meme, akciğer, kalın bağırsak, rektum, serviks, over, mide ve pankreas kanserleri olarak sıralanabilir (ġekil 2.2). Ayrıca yapılan çalıģmalarda meme, mide, kolon (kalın bağırsak), prostat, akciğer kanserlerinin yakın akrabalar arasında görülme riskinin, normal popülasyona göre üç kat daha fazla olduğu belirlenmiģtir (TaĢtemir, 2008).

24 15 ġekil 2.2. Kadınlarda ve erkeklerde kanserin tahmini görülme sıklığı ve tahmini ölüm oranları Kanserlerde dıģ tesirlerin de rol oynayabileceği bilinmektedir. Kansere yol açtığı düģünülen bu faktörleri üç ana grupta toplamak mümkündür. Bunlar; kimyasal ajanlar, virüsler ve radyasyondur. Radyoaktivitenin kanser geliģiminde rolü olabileceğine iyi bir örnek, Japonya ya atılan atom bombasından sonra kan kanserinin o bölgede yaģayanlarda yüksek bir artıģ göstermesidir. Kansere sebep olduğu düģünülen maddelere kanserojen ismi verilmektedir. Bu maddeler hücre çekirdeği ile etkileģime girerler. Örneğin; asbestoz hastalığı ile akciğer zarı kanseri (mesothelioma) ve akciğer kanseri arasında sıkı bir iliģki vardır (Anonim, 2013). Yine kadmium, uranyum, arsenik, nikel ve katranın da kanserle iliģkili olduğu durumlar bildirilmiģtir. Kanser tedavisinde kullanılan bazı ilaçların da baģka tür kanserlere sebep olduğundan söz edilmektedir. Bazı hormonların kanserle iliģkisi olduğu ileri sürülmektedir. Buna örnek olarak içinde sentetik östrojen (kadınlık hormonu) bulunan doğum kontrol hapları ile rahim ve meme kanserleri arasındaki

25 16 iliģki, testosteron (erkeklik hormonu) ile prostat kanseri arasındaki iliģki verilebilir. Alkol ve sigaranın da kanserin meydana geliģinde rolleri olduğu kabul edilmektedir. Mesela akciğer kanseri sigara içenlerde içmeyenlere göre 100 kat daha fazladır. Alkoliklerde mide ve karaciğer kanseri daha fazla görülmektedir (Anonim, 2013). Virüslerle yapılan incelemelerde, bozuk genlerin görünüģü genlerin kanserde rol aldığına dair ipucudur. Virüslerin genetik materyali DNA yada RNA olduğu için, böyle bir araģtırmaya çok müsaittirler de Kaliforniya Üniversitesi nde araģtırmacılar tarihi bir araģtırma yapmıģlardır. Tavuklarda kansere sebep olan bir virüsle çalıģırken genlerden birini çekip çıkardıklarında, kanser yapıcı özelliğinin kaybolduğunu görmüģlerdir. Virüslerin de insanda kansere sebep olduklarına dair bulgular gittikçe artmaktadır (Anonim, 2013). Kanserlerin ortaya çıkmasında sürekli mekanik, fiziki ve iltihabi tahriģler ve güneģ ıģığına aģırı yahut devamlı maruz kalınmasının da rolü büyüktür. Bütün bu sebeplerin yanı sıra Ģahsın bedeni ve ruhi bünyesinin zayıflaması da kansere bir zemin teģkil edebilmektedir. Ġmmünolojik teori; vücutta sürekli olarak anormal hücrelerin meydana geldiğini, ancak vücudun savunma mekanizmalarının bunları yok ettiğini, fakat bilinmeyen sebeplerle bu savunma sisteminin kırılması durumunda anormal hücrelerin çoğalarak kansere yol açtığını ileri sürmektedir. Bugün bu teori en çok taraftar bulan teorilerden biridir (Anonim, 2013). Kanser hücresi, normal hücrelere benzemez. Kanser, normal hücre çoğalmasını kontrol eden faktörlerin denetimi dıģındadır. Vücut, kanser hücrelerini yabancı bir doku olarak değerlendirip reddetmeksizin benimser, hâlbuki normalde bütün parazitlere karģı vücut ret cevabı gösterir. AraĢtırmacılar, insanın mesane kanseri hücrelerinden DNA yı çekip, test tüplerinde geliģen sıhhatli farelere aģıladılar. Böylece farenin hücrelerinde kanser yapmayı baģardılar. Sonra, bu tip sağlam farelere DNA nın daha küçük parçalarını çekerek aģıladılar. Böylece, kansere sebep olan geni ortaya çıkardılar. Bu parça, protoonkojenlerin bir parça değiģiğidir. O zamandan beri çeģitli onkojenler bulunmuģtur. Hepsi protoonkojenlere benzerler ancak bunlar sağlam hücreleri kanser yapmaz (Anonim, 2013). Sonuç olarak, insan kanserlerinin oluģ mekanizmalarının kesinlikle anlaģılamadığını belirtmek gerekir. Bilinen bütün karsinojenlerin de hücrenin genetik materyelini doğrudan veya dolaylı olarak etkiledikleri anlaģılmaktadır. Çevremizde çeģitli sebeplerle karsinojenlerin sürekli olarak artmaktadır.

26 17 Kanserojen kimyasal maddeler de çok büyük bir hızla artmaktadır. Yeni kimyasal ürünlerin sentezi, atmosfer, su ve besin maddelerinin kirlenmesi, değiģik ilaçların klinik kullanım sahasına girmesi bu tehlikeyi artırmaktadır. Herhangi bir kimyasal maddenin kanserojen olup olmayacağını önceden kesin olarak tespit edebilecek deneyler de henüz geliģtirilememiģtir. (Anonim, 2013). Kanser hemen her yaģta görülmesine rağmen, en çok 40 yaģın üzerinde rastlanılmaktadır. Yani yaģlandıkça, kansere yakalanma ihtimali artmaktadır. Çocuklarda ve gençlerde en sık rastlanan kanserler; kan kanserleri, sarkomlar (örneğin kemik kanseri) ve böbrek kanserleridir. Kanserle mücadele ve tedavide her Ģeyden önce kanseri kontrol etmesini öğrenmeli ve erken safhada yakalamalıdır. Bilim adamlarının çoğunluğu kanseri yenmek için hastalığın öldürücü safhaya gelmeden fark edilmesi ve bugünkünden daha iyi tedaviler bulunması hususunda hemfikirdirler. Kemoterapi (ilaç tedavisi) ve Ģua (ıģın) tedavisi faydalı kabul edilmemektedir. Onlar kanser hücrelerini tahrip ederken sağlam hücreleri de öldürmektedirler. Ekseriya bulantı, saç dökülmesi gibi yan etkileri de olmaktadır (Anonim, 2013). Halen yapılan ve çoğu defa vücuda zararlı olan kemoterapi ve Ģua tedavisi yerine, kansere karģı vücudun kendi müdafaa sistemi olan "Ġmmün sistemi" uyarmanın daha iyi olacağı kabul edilmektedir. Ġmmün sistemin kanser dokusunu seçme kabiliyeti vardır. Ġmmün sistem, vücudu koruyan hücrelerden yapılmıģtır. Onlar virüsleri ve bazı bakterileri ve bunlara benzer yabancı ajanları tanır ve tahrip ederler. Bu faaliyetlerini vücutta bulunan ve adı geçen yabancı ajanlara karģı meydana getirdikleri antikorlarla yaparlar. Bu bilgiler çerçevesinde kanserin tedavi edilebilir bir hastalık olduğu söylenebilir. Bilim adamları antijenlere karģı antikorlardan immün sistem parçalarını yapabilmektedirler. Bu parça vücuda girince immün sistemi uyarır. Spesifik kanser tiplerine karģı gelen ve "monoklonal" denen antikorlar halen yapılabilmektedir. Monoklonal antibadiler (MAB) halen tecrübe safhasındadır. Erken teģhisi sağlamak için herkes ve kanser risk grupları altı aylık aralarla periyodik kontrollerden geçirilmeli, en ufak bir kanser Ģüphesi durumunda derhal ilgili hekime veya kuruluģa baģvurulmalıdır. Son zamanlarda tıp alanında, bir yandan hastalıkların tedavisinde yeni yöntemler araģtırılırken, bir yandan da sağlıklı bir hayat sürdürme ve hastalıkları önleme yolunda yoğun çabalar sarf edilmektedir.

27 Meme Kanseri Meme kanseri, memenin süt bezlerinde ve üretilen sütü meme baģına taģıyan kanalları döģeyen hücreler arasında, çeģitli etkenler sonucu kontrolsüz Ģekilde çoğalan ve baģka organlara yayılma potansiyeli taģıyan hücrelerden meydana gelen tümöral oluģumdur. Meme kanseri, meme dokusunun terminal dukto-lobüler biriminden kaynaklanmaktadır. Bazal membranı istila eden meme kanserlerine invaziv (istilacı) kanserler denirken, bazal membranı istila etmeyen meme kanserine de in situ (doğal yerinde) karsinom olarak adlandırmaktadır. Ġnvaziv tip, uzak organ metastazlarına neden olmaktadır (Kars, 2008). Bazı tümörler daha çok küçükken metastaz yapma potansiyeline sahip olmalarına rağmen, bazı tümörler ise 3-4 cm çapa ulaģtıkları halde aksiller lenf nodu (koltuk altı) metastazı yapmamaktadırlar. Meme kanseri, akciğer kanserinden sonra dünyada görülme sıklığı en yüksek olan kanser türüdür. Her 8 kadından birinin hayatının belirli bir zamanında meme kanserine yakalanacağı bildirilmektedir. Erkeklerde de görülmekle beraber, kadın vakaları erkek vakalarından 100 kat fazladır. 1970'lerden bu yana meme kanserinin görülme sıklığında artıģ yaģanmaktadır. Kuzey Amerika ve Avrupa ülkelerinde görülme sıklığı, dünyanın diğer bölgelerinde görülme sıklığından daha fazladır. Tarih öncesi dönemlerde yer alan diğer büyük kültürlerde, Hint, Çin, Aztek- Maya-Ġnka kazıtlarında meme hastalıkları ile ilgili ciddi araģtırma yapılmamıģ veya kayıtlara rastlanmamıģtır. Sadece M.Ö de doğduğu belirtilen Çin Ġmparatoru Huang-Di nın yazdığı tıp kitabında genel olarak tümörlerin tanımlaması yapılmakta ve tedavi yöntemleri anlatılmaktadır (Beenken ve ark., 2004). Esir Yunan doktor Democedes tarafından Atossa'nın büyük karısı Darius'un meme tümörünü iyileģtirdiğini, M.Ö. 6.yüzyılın baģlarında Herodot tarafından belirtilmiģtir. Democedes bir tedavi ile kanserden çok, iyi huylu meme tümörünün tedavisini iģaret ederek vaatlerde bulunmuģtur (Retief ve Cilliers, 2001). 20.yüzyıl bittiğinde hala meme kanserinin gerçek nedeni saptanamamıģtır. Buna karģılık tümörün oluģmasına yol açabilecek hücresel büyüme faktörleri, hücre içi haberleģme yolları, hangi genlerin ne tür bozulmalar ile karģılaģırlarsa meme kanserine yol açabilecekleri ve genlerin eksprese ettikleri proteinler bilinmektedir. Meme kanseri tedavi edilmezse biyolojik davranıģına göre, uzak organ metastazları yapar ve sonunda ölüme neden olur. Ortalama olarak klinik tanı konduktan sonra hastalar beģ yıl içinde ölürler. Ölümlerin büyük çoğunluğu organ metastazlarından

28 19 olur. Kemik metastazları ile daha uzun süre yaģanabildiği halde, beyin, karaciğer, akciğer metastazları ortaya çıktıktan sonra yaģamda kalma süresi ayları geçmez. Uzak organ metastazları oraya çıktıktan sonra bugün için bilinen küratif bir tedavisi yoktur. Bu nedenle meme kanseri, yayılmadan önce, erken tespit edilirse, hasta %96 yaģam Ģansına sahiptir. Ayrıca kadınların her ay düzenli olarak kendi kendilerini meme muayenesi (KKMM) etmeleri de hem ucuz hem de risksiz bir yöntemdir. KKMM yi düzenli olarak yapan kadınlarda, yapmayan kadınlara göre meme kanserinin daha erken evrede ve tümör küçük iken saptandığı, evre küçüldükçe sağ kalım oranının arttığı da belirlenmiģtir (Aydıner ve ark., 2000). Meme kanserinde tek bir etiyolojik faktörden (Hastalık oluģumuna katkıda bulunan risk faktörleri) söz etmek olası değildir. Ayrıca doğurganlık yaģı ve çocuk sayısı, beslenme alıģkanlığı, sosyoekonomik durum, yaģam tarzı ve çevresel etkenlerin önemi de göz ardı edilmemelidir. Meme kanseri için öncelikle kadın olmak, ikinci olarak da yaģ önemli faktörlerdendir. Meme kanserinde hastalığın evresi, patolojik inceleme sonrası saptanan tümör özelliklerine göre cerrahi, kemoterapi, radyoterapi, hormonal tedavi ve biyolojik tedaviler tek baģlarına veya bir arada kullanılarak tedavi yapılmaktadır. Tümörün boyutu, evresi ve diğer özellikleri tedavi tipinin seçilmesindeki en önemli faktörlerdendir. Aynı zamanda ilerlemiģ meme kanseri tedavisinde, kemoterapi protokolleri siklofosfamit, metotreksat, 5- fluorousil, prednizon ve vinkristin kombinasyonlarından oluģmaktadır (Harris ve ark., 2000). Ġn vitro çalıģmalarda bilim adamlarının, tümör tipleri için model hücre hatlarına ihtiyaçları vardır. Çünkü bazı analizler model hücre hatlarında gerçekleģmektedir. Örneğin, MCF-7 meme epitel kanseri için bir model hücre hattıdır (Zava ve ark., 1977). MDA-MB-231, T47D, MDA-MB-468, SUM185, BT474 gibi hücre hatları da hücre kültürü çalıģmalarında yaygın olarak kullanılan hücre hatlarından bazılarıdır (ġekil 2.3).

29 20 ġekil 2.3. Meme kanseri hücre hatlarından bazılarının mikroskopik görüntüsü, [(a)mda-mb-231, (b) MCF-7, (c) T47D] 2.6. Çoklu Ġlaç Dirençliliği, Dirençliliğin Geri Çevrilmesi ve Kemoterapi Kanserli dokuya seçici ve özgün sitotoksik ajanların uygulanması olan kimyasal tedavi (kemoterapi), kanser tedavi yöntemlerinden birisidir (Lage, 2003). Kemoterapi, kanser hücrelerini ilaçlarla yok etmek için uygulanan kanser tedavisidir. Bu ilaçlar genellikle antikanser ilaç olarak adlandırılırlar ve büyüyerek ya da çoğalarak kanser hücrelerini yok ederler (Hirsch, 2006). Kemoterapi kanserli hasta üzerinde yardımcı tedavi olarak yaģama oranını geliģtirmesine rağmen tüm tedavi edilen hastaların yaklaģık %50 sinde nüksetmektedir (Harris ve ark, 1993). Kemoterapide artırılan ilaç dozları hastalarda görülen yan etkilerin artmasına neden olmaktadır. Ayrıca dirençlilik nedeniyle zaman ve ilaç kaybı olmakta, hastaların tedavisi zorlaģmaktadır. Yeni geliģtirilen antikanser ajanlara hücreler tarafından dirençlilik gösterilmesi, daha etkin kemoterapötik ajanların ve dirençlilik modülatörlerinin geliģtirilmesi yönünde çalıģmaları artırmaktadır. Bitkilerden elde edilen doğal kimyasal bileģikler, bu bileģiklerin kimyasal olarak değiģtirilmiģ formları veya tamamen sentetik ajanların hücrelere etkisi bilim adamları tarafından araģtırılmaktadır (Ugocsai ve ark, 2005; Engi ve ark, 2006; Molnar ve ark, 2004). Aspirin, digitoksin, progesteron, kortizon, morfin, vinkristin, paklitaksel (taksol) vb. gibi klinikte kullanılan ilaçlar doğrudan ya da dolaylı olarak bitkilerden elde edilmiģtir. Bitkilerde bulunan maddeler gibi mantarlarda da bulunan bileģenlerin sağlık açısından önemli etkileri vardır. Örneğin; penisilin, griseofulvin, siklosporin ve ergot

30 21 alkoloidleri gibi iyi tanınan klinikte önemli olan ilaçlar mantar kökenli olarak bilinmekte ve kullanılmaktadır (Ajith ve Janardhanan, 2007). Paklitaksel ve vinkristin gibi antimikrotübül maddeler yaygın olarak çeģitli tümörlerin tedavisinde kullanılmaktadır. Paklitaksel intravenöz meme kanseri ve yumurtalık kanseri tedavisi için kullanılan baģarılı bir kemoterapik maddeler arasındaki taksoid grubu ilaçtır (ġekil 2.4). Paklitaksel vinkristinden farklı bir yerde tübülin dimerlerine bağlanır. Bu ilaç mikrotübül alt-ünitelerine bağlanarak mikrotübül depolimerizasyonunu ve hücre bölünmesini önler (Giannakakau ve ark, 2000; Chan ve ark, 1999). Vinkristin bitki alkaloidi (vinca) olarak bilinen kemoterapi ilaçlarının genel grubuna aittir. Vinca alkaloidleri tübülün üzerinde özel bir tanıma bölgesinde tübülin dimerlerine bağlanır. Tübülin-ilaç kompleksi parakristalin agregatları meydana getirirler. Vinkristin bir mikrotübül inhibitörü olup mikrotübül polimerizasyonunu inhibe eder (Lobert ve ark, 1996). Vinkristine ile tedavi edilen hücreler yetersiz iplik oluģturur ve bu yüzden düzgün mitoz bölünme yoluyla ilerleme yeteneklerini kaybederler. Hasarlı hücreler daha sonra ölür (Kavallaris,2001). ġekil 2.4. Vinkristin ve paklitakselin kimyasal gösterimi Bu ilaçların çeģitli tümör hücrelerine uygulanmasının MDR fenotipine neden olduğu gösterilmiģtir (Sanfilippo ve ark, 1991; Slovak ve ark, 1988). Paklitaksele dirençli MCF-7/Pac ve vinkristine dirençli MCF-7/Vinc hücre hatları MDR1 ve MRP1 genlerini aģırı ifade etmekle birlikte, pek çok dirençlilik mekanizmaları da gen ifade profilleriyle belirlenmiģtir (ĠĢeri ve ark, 2010, Kars ve ark, 2010).

31 22 Sıklıkla, kemoterapiye cevap vermeyen hastalarda değiģik etki mekanizmaları olan birden fazla antineoplastik ajana dirençlilik geliģmektedir (Lage, 2003). Bu mekanizmalar "çoklu ilaç dirençliliği" (ÇĠD) (multidrug resistance-mdr) fenotipinin geliģmesine yol açmaktadırlar (Ueda ve ark, 1987). Çoklu ilaç dirençliliği, kanser tedavisi için de önemli bir engeldir. ÇĠD, en az iki tip farklı mekanizma esas alınarak ayırt edilebilir. Bunlardan ilki klasik yani MDR bağlı P-glikoproteini (P-gp) ve diğeride atipik yani MDR-bağlı olmayan P- glikoproteindir. P-glikoproteini (P-gp), MDR1 (ABCB1) geni tarafından kodlanır. Bu klasik MDR fenotipini veren mekanizmanın altında, ABC taģıyıcılarının (Adenozin trifosfat bağlayıcı kaset), membran glikoproteini olan 170 kda'luk P-gp üyesinin (P- 170, PGY1, MDR1, ABCB1) aģırı hücresel üretimi vardır (Lage, 2003). ABCtaĢıyıcıları enerji bağımlı ilaç atım pompaları olarak hareket ederler, böylece hücre içi ortam içerisinde sitotoksik maddelerin birikmesini azaltmaktadır (ġekil 2.5.). ġekil 2.5. Meme kanserinde, ilaç direnci aracılı ABC taģıyıcılarının çeģitli eylem imkanlarını gösteren Ģema. (a)abc- taģıyıcıları ağırlıklı olarak sitoplazma membranında lokalizedir. ATP ye bağımlı Ģekle gelmiģ olan ilaçlar (D) taģıyıcı proteinler ile hücre dıģına çıkarılır. (b) ABC-taĢıyıcılarının pompa aktivitesi, sitotoksik ilaçların veziküler kompartmanlaģmasına katkıda bulunmaktadır. (c) ABCtaĢıyıcıları, endoplazmik retikulumun lümeninin içine ksenobiyotik maddeleri taģıyarak faz-ii ilaç metabolizmasını kolaylaģtırmaktadır. (D)-antikanser ilaç. (Lage, 2003) Hücrelerdeki, zararlı ve toksik maddeleri uzaklaģtıran biyokimyasal sistemlerin olduğu bilinmektedir. Ġlaç tedavileri sırasında bu sistemlerin güçlendiği ve kemoterapötik ilaçların etkili bir Ģekilde hücre dıģına atıldığı görülmüģtür. Çoklu ilaç dirençliliğine sebep olan mekanizmalardan bazıları; ABC taģıyıcı gen ailesi proteinlerinin ekspresyonlarındaki artıģ, hücreleri programlanmıģ ölüme (apoptoz) götüren yolaklardan bazılarının bloke olması ve ilaç hedef moleküllerindeki değiģimlerdir (Ren ve ark, 2004; Kavallaris ve ark, 1997; Fitzpatric ve Wheeler, 2003).

32 23 En iyi bilinen dirençlilik mekanizması ATP bağlayan taģıyıcı protein (ABC transporters) ailesi üyelerinin ifadelerindeki değiģimlerdir. ABC taģıyıcı gen ailesinin üyeleri pekçok maddeyi hücre dıģı ve içi zarlardan taģınmasını sağlayan hücre zarı proteinleridir. Bu proteinler, ATP bağlayarak taģıma için gerekli enerjiyi elde ederler. ABC taģıyıcı proteinleri, ATP bağlayan bölgelerinin dizisine ve organizasyonuna bağlı olarak sınıflandırılırlar. Bu bölge, amino asit ile ayrılmıģ Walker A ve B motiflerinden oluģmaktadır. ABC genleri aynı zamanda Walker B motifinin üst kısmında bulunan Walker C imza motifine de sahiptir (Dean ve ark, 2001). ĠĢlevsel bir ABC proteini, tipik olarak iki tane ATP bağlayan bölgeye sahiptir. Bu genler, gen yapısındaki benzerliklere, bölgelerin sırasına ve dizilerindeki benzerliklere göre alt ailelere bölünmüģtür. Memelilerde yedi adet ABC taģıyıcı gen alt ailesi bulunmaktadır. Kemoterapi ajanlarının ATP ye bağlı olarak tümör hücrelerinden atılması, bazı ABC genlerinin ifadelerinde artıģa neden olabilir. Çoklu ilaç dirençliliğinde etkili ABC genlerinden en önemlileri ABCB1 (MDR1), ABCC1 (MRP1), ABCG2 (BCRP) ve LRP dir (Sparreboom ve ark, 2003; Lage, 2003; Filipits ve ark, 1996; Bodo ve ark, 2003) (ġekil 2.6). ġekil 2.6. ABC taģıyıcı süper ailesi Bu kapsamda özellikle günümüzde kanserin tedavisinde gerek görsel basında gerekse yazılı basında üzerinde en çok durulan ve konuģulan konulardan biri de antikanser özellikteki gıdalardır.

33 Antikanser ve Antikanser Aktiviteye Sahip Olan Mantarlar Antikanser, kontrolsüz Ģekilde çoğalan çeģitli tümör hücrelerinin bölünmesini durdurmak ve bu tümör hücrelerinin ölüm hızlarını artırmak olarak bilinmektedir. Son yıllarda kanseri önlemek için tıbbi tedavinin yanı sıra çeģitli doğal kaynaklara olan eğilim gittikçe artmaktadır. Kullanılan kaynaklardan biri de mantarlardır. Mantarlar çeģitli immunolojik, antikanserojen, antioksidan, antihipertansiyon, antiviral, antimikrobiyal, karaciğer koruyucu özelliklerinden dolayı ilaç üreten Ģirketler tarafından kullanılmasına sebep olmuģtur (Wasser, 2002). Ülkemizin mantar çeģitliliği yönünden önemli bir potansiyele sahip olması ve özellikle de yenen türlerin tabi ortamlarından bol miktarda toplanıp tüketilmesi bu talebe paralellik arz etmektedir. Özellikle Basidiomycota bölümüne ait mantarlar, hem biyolojik hem de terapötik açıdan yararlı aktif maddelerin kaynağı olarak bilinmektedir (Smith ve ark., 2002). Bu bölüme ait önemli farmakolojik aktiviteye sahip olduğu tespit edilen yaklaģık 700 tür belirlenmiģtir. Basidiomycota üyeleri tarafından üretilen birçok polisakkarit protein kompleksleri antikanserojen maddeler olarak sınıflandırılmıģtır (Çizelge 2.2). Çizelge 2.2. Ġçerdikleri polisakkaritler ile antikanser ve immun sistemi düzenleyici aktiviteye sahip olan Basidiomycota ya ait bazı cinsler

34 25 Antikanser özellik hemen hemen tüm bitkilerde, meyvelerde, sebzelerde, mikroorganizmalarda, mantarlarda bulunmakta olup çoğunlukla polisakkarit yapıdaki maddelerdir. Bu polisakkaritlerin en önemlileri; β-d-glucan kompleksleri, heteroglukan, schizopyllan, heteroglikan peptit, polisakkarit-protein kompleksi, lentinan, skleroglukan (SSG), proteoglukan, grifolan, mannan, glukan, galaktomannan, glikoprotein, polisakkaropeptid krestin (PSK), montadial, fomesin A ve fomesin B, tylopilan, egonol vb. bileģikler örnek olarak verilebilir (Çizelge 2.3-4). Bitkilerde ana hücre duvarı polisakkariti selülozken (1,4 beta glukan), mantarlarda ise prototipik polisakkarit 1,6 bağlantılı yan zincirleri olan 1,3 beta glukandır (ġekil 2.7). Bunlar suda çözünebilen polisakkaritlerle ve proteoglukanlarla (proteine bağlı polisakkaritler) birlikte çoğu mantarın immünolojik açıdan aktif temel bileģenleridir. ġekil 2.7. β-1,3 ve 1,6 glukan kimyasal yapısı 1980'lerde Harvard Üniversitesi'ndeki araģtırmacılar tıbbi mantarların hücre duvarındaki polisakkarit bileģeninin bağıģıklık arttırıcı özelliklerini gözlemiģlerdir. Polisakkarit bir glikoz molekülüdür. Glikoz yan zincirlerindeki uzun zincirli molekül tipine bir beta-glukan adı verilmektedir. Beta-glukan moleküllerinin makrofaj adı verilen önemli bağıģıklık hücrelerinin yüzey reseptörleriyle bir anahtar-kilit iliģkisi vardır. Makrofajlar vücudumuzun zararlı bir patojen olarak tanımladığı herhangi bir Ģeyi, bir virüs, bakteri ve diğerlerini, kelimenin tam anlamıyla yutarlar. Beta-glukan molekülü ile bu bağlantı kurma süreci makrofaj aktivitesini uyarmaktadır. Beta-glukan molekülleri makrofaj hücrelerinin yüzeyine kilitlenmekte ve patojen inaktif hale getirilmektedir (Topuz, 2009). Doğal katil hücreler (NK) ve nötrofiller gibi diğer bağıģıklık hücrelerinin üzerinde baģka reseptör yerleri bulunmuģ, değiģik biçimli beta-glukan moleküllerinin

35 26 farklı bağıģıklık yanıtları ürettiği de belirlenmiģtir. Ġlkbahar ve sonbahar aylarında bol miktarda çıkan ve yöre halkı tarafından bol miktarda yenen mantarların bileģimlerinde taģıdıkları antikanser içeriklerinin ortaya çıkarılması, bu türlerin daha dikkatli Ģekilde tüketilmesine yardımcı olacaktır. Antikanser polisakkaridleri; antibiyotiklere karģı direnç gösteren viral, bakteriyal, fungal ve protozoal enfeksiyonları önlemek için vücudun humoral bağıģıklığını harekete geçirir. Birçok kanser ve AIDS hastası bağıģıklık sistemi çöktüğü için çeģitli enfeksiyonlardan kolayca etkilenerek ölür. Bazı mantar polisakkaritlerinin, Ectromelia virüsü ve Cytomegalovirüsüne antiviral aktivite gösterdiği belirlenmiģtir (Chang ve Miles, 2004). Terfezia boudieri üzerinde yapılan bir çalıģmada ise Gram (+) bakterilerine karģı antimikrobial aktivite gösterdiği tespit edilmiģtir (Gücin ve Dülger, 1997). Mantarlar, tümör hücrelerinin üremesini önlemeye yarayan farklı içeriklere sahiptirler. Belirlenen bazı antikanser içerikleri ve mantar türleri aģağıdaki gibidir; AHCC (Active Hexose Correlated Compound) olarak bilinen Lentinan Lentinula edodes (Shiitake) de (Chihara ve ark.,1970); PSK olarak adlandırılan polisakkaropeptid krestin Coriolus versicolor da (Cui ve Chisti, 2003); β-d-glukan, aktif heteroglukan ve protein kompleksleri Ganoderma lucidum (Reishi)'da (Mizuno ve ark., 1984); PSP olarak adlandırılan polisakkaropeptid kompleksi Tricholoma sp. de (Mizuno ve ark., 1984), TML-1, TML-2 Tricholoma mongolicum da (Wang ve ark., 1995), siklofosfamit Agaricus blazei de (Delmanto ve ark., 2001) bulunmaktadır. Farklı mantar türleri kullanılarak çeģitli kanser hatları üzerine antikanser çalıģmaları yapılmıģtır. Pleurotus florida Singer ve Calocybe indica Purkay. & A. Chandra ile mesane kanseri (Selvi ve ark., 2011), Agaricus blazei ile kolon kanseri (Ziliotto ve ark., 2009), Agaricus bisporus ile HL-60 hücreleri (Jagadish ve ark., 2009), Inonotus obliquus ile kolon kanseri (Lee ve ark., 2009), Coriolus versicolor ile MCF-7 meme kanseri, HL-60 lösemi, mide ve bağırsak kanseri (Cui ve Chisti, 2003) çalıģılmıģ ve Ganoderma lucidum ile ilgili yapılan çalıģmalarda oldukça fazladır. Kanseri önlemede oldukça etkili olduğu belirlenmiģ ve çeģitli formlarda (ilaç, çay, kahve, kozmetik ürünü vb.) insanlar tarafından kullanımları da bulunmaktadır (Shavit, 2009).

36 27 Çizelge 2.3. Antitümör ve immunostimülan özelliğe sahip polisakkaritlerin kimyasal yapısı (Wasser, 2002) POLİSAKKARİTLER MANTARLAR POLİSAKKARİTLER MANTARLAR GLUCAN GLYCAN α-(1-3)-glucan Linear α-(1-3)-glucan Armillariella tabescens Amanita muscaria Agrocybe aegerita Arabinogalactan Pleurotus citrinopileatus α-(1-4)-; β-(1-6)-glucan α-(1-6)-; α-(1-4)- glucan β-(1-6)-glucan Agaricus blazei Agaricus blazei Lyophyllum decastes Armillariella tabescens Fucogalactan Sarcodon asperatus β-(1-6)-; β-(1-3)-glucan Agaricus blazei Grifola frondosa Glucogalactan Ganoderma tsugae β-(1-6)-; α-(1-3)-glucan Agaricus blazei Galactoglucomannan Lentinus edodes β-(1-3)-glucuronoglucan Ganoderma lucidum β-(1-2)-; β-(1-3)- glucomannan Agaricus blazei Mannoxyloglucan Grifola frondosa Glucomannan Agaricus blazei Galactoxyloglucan Hericium erinaceus α-(1-3)-mannan Dictyophora indusiata Xyloglucan Grifola frondosa Polyporus confluens Pleurotus pulmonarius Mannoglucoxylan Hericium erinaceus Xylogalactoglucan Inonotus obliquus Glucoxylan Hericium erinaceus Pleurotus pulmonarius Mannogalactoglucan Pleurotus pulmonarius Pleurotus cornucopiae Ganoderma lucidum Agaricus blazei Xylan Hericium erinaceus Galactomannoglucan Flammulina velutipes Hohenbuehelia serotina Leucopaxillus giganteus Mannogalactofucan Grifola frondosa Arabinoglucan Ganoderma tsugae Mannogalactan Pleurotus pulmonarius Riboglucan Agaricus blazei α-(1-6)- mannofucogalactan Fucomannogalactan Fomitella fraxinea Dictyophora indusiata

37 28 Çizelge 2.4. Mantarlardan elde edilen farklı gruplardaki biyoaktif bileģenler (Moradali ve ark., 2007) Temel BileĢik Grupları Örnekler Tıbbi Özellikler Polisakkaritler Polisakkarit- peptid Proteinler Terpenoidler Grifolan Lentinan Schizophyllan PSP PSK Fips Ganoderik asitler Ganoderiol Ganoderenik asitler Lusidenik asitler Ganolucidic asitler Lucimudol Ganoderol Ġmmunmodülatör Antitümör Antiviral Antimikrobiyal Antitümör Antiviral Antimikrobiyal Sitotoksik Ġmmunmodülatör Applanoxidik asit Steroidler Polioksijenli ergosterol türevleri Sitotoksik Antitümör Yağ asitleri Organik germanyum Linoleik asit Palmitik asit 11-oktadecanoik asit Bis-β-carboxyethyl-germanium sesquoxide Anti-HIV aktivite Antitümör Sitotoksik Histamin salınımı inhibisyonu Antihipertansiyon Antiinflamatuar Antibakteriyel Antimutajenik Antibakteriyel Antitümör Dünyada farklı mantar türleri değiģik kanser çalıģmalarında kullanılmıģ ve olumlu sonuçlar elde edilmiģtir. Mantarlarla ilgili son 40 yıldır 1600'ün üzerinde antikanser, antivirüs özelliklerini araģtıran çalıģmalar yapılmıģtır. Örneğin; üzerinde en çok çalıģılan mantar Çin de Lingzhi, Japonya da "Reishi" ya da "Ölümsüzlük mantarı" olarak bilinen Ganoderma lucidum'dur. En az 400 yıllık tıbbi amaçla kullanımı ile en uzun tarihsel kullanıma sahip mantardır. Günümüzde Çin, Tayvan, Japonya ve ABD de kültürü yapılmakta olup fiyatı oldukça yüksektir. Ganoderma'nın bünyesinde bulunan polisakkaritler (özellikle Beta-D-glukan), proteinler ve triterpenoidler bağıģıklık sistemini düzenleyici etkiye sahiptirler. Ġçerdiği polisakkaritler sabebiyle antikanser ve antiinflamatuar ajan olarak tedavi edici etkisi ile bağıģıklık sistemini düzenleyen özellikleri iliģkilendirilmiģtir. Kanserin önlenmesi veya tedavisinde radyoterapi ya da kemoterapi ile kombinasyon halinde kullanılması adjuvan (ilaçların etkisini arttıran, immün sistemi uyaran yardımcı maddeler) rol oynamaktadır. Ayrıca kemoterapi ve radyoterapi sırasında ortaya çıkan halsizlik, iģtahsızlık, saç dökülmesi ve kemik iliğinin baskılanması gibi yan etkileri azaltarak iyileģtirici etki göstermektedir (Liu ve Zhang,

38 ). Bu yararlı etkileri sebebiyle Ganoderma son yıllarda oldukça yoğun ilgi görmektedir. Acı tadı ve sindirilemeyen yapısı nedeniyle yenilemeyen bir mantar olmasına rağmen sıcak su ekstrakları dünyanın her yerinde tablet ve sıvı ürünler halinde mevcuttur. Japonya da dans eden mantar anlamına gelen Maitake denmesinin yanı sıra halk arasında Orman tavuğu adıyla da bilinen Grifola frondosa, içerdiği polisakkaritlerin insan vücudunun doğal bağıģıklık sistemini güçlendirdiği ve genel sağlığı iyileģtirdiği bilinmektedir. Mantardan elde edilen polisakkarit ve polisakkaritprotein kompleksinin önemli bir antikanser aktivitesi olduğu gösterilmiģtir. ABD ve Japonya daki sınırlı sayıdaki çalıģmalar; saflaģtırılmıģ polisakkarit parçalarının; göğüs, akciğer, karaciğer, prostat ve beyin kanserine karģı oldukça etkili olduğunu ortaya çıkarmıģtır. Fareler üzerinde yapılan denemelerde bu mantarın kanser hücrelerinin inhibisyonunu güçlü bir Ģekilde etkilediği belirlenmiģtir. Seçilen kanser hastalarına, Maitake' nin içerisinde bulunan D-fraksiyonu tabletleri ya sadece tablet olarak yada kemoterapiye ek olacak Ģekilde tablet verilmiģtir. ÇalıĢma sonucunda, 15 meme kanseri hastasından 11' inde, 18 akciğer kanseri hastasından 12' sinde ve 15 karaciğer hastasından 7' sinde tümör gerilemesi ve önemli belirtiler görülmüģtür. Kemoterapi ile birlikte alınan mantarda ise %12-28 oranında iyileģme gösterdiği belirtilmiģtir. Kemoterapinin zararlı etkilerine karģı koruyucu olduğu gösterilmiģtir. Hayvan çalıģmalarında meme kanserinin geliģmesini ve metastazını inhibe etmiģtir (Nanba, 1997) (ġekil 2.8). ġekil 2.8. Grifola frondosa nın kanser hastaları üzerine yüzdelik olumlu etkileri (Nanba, 1997)

39 30 Japonya da Shia ağacı ile tarihsel bağından ötürü Shiitake olarak bilinen Lentinula edodes, iyi bilinen iki polisakkaritin kaynağıdır. Hücre duvarı polisakkariti olan Lentinan-a ve yalnızca miselyumdan elde edilen protein bağlı polisakkarit olan LEM-a dır. Her iki bileģen de antikanser aktivite göstermiģtir. Ġlk kanser ilacı olan Lentinan, 1972 yılında kanser ilacı olarak tescil edilmiģtir. Bu tür bileģenlerin direkt olarak kanser hücresine saldırmasından çok bağıģıklık sistemini güçlendirerek fayda sağladığı görüģü hâkimdir (Chihara, 1992) (ġekil 2.9). Benzer Ģekilde Japonya da kanser hastalarının radyoterapi ve kemoterapi tedavisi sırasında bağıģıklık sistemine yardımcı olması amacıyla; giderek arttırılan dozlarla kullanılır. Bu uygulama bazı kanser hastalarının hayatta kalma süresini uzatmıģtır (Mizuno, 1995). ġekil 2.9. Bir β-d-glukan olan Lentinanın antitümör aktivite mekanizması. Mac, makrofaj; TL(H), T- lenfosit; NK, doğal öldürücü hücre; IL-1,-2 ve -13, interlökin-1,-2,-13; CSF, koloni stimüle edici faktör; MAF, makrofaj aktivite edici faktör; PC-TL, presitolitik T lenfosit; CTL, sitolitik T lenfosit; BL, B lenfosit. Belirtilen türler dünyada en çok bilinen ve tüketimi yapılan antikanser özelliğe sahip olan mantarlardır. Bunların dıģında antikanser ve bağıģıklık sistemini düzenleyen birçok mantar bulunmaktadır.

40 31 3. KAYNAK ARAġTIRMASI Mantarların antikanser özellikleri ile ilgili çalıģmalar bilimsel olarak oldukça uzun bir geçmiģe dayanmaktadır. Literatür taramalarına göre mantarlar üzerindeki ilk antikanser çalıģmaları 1969 lu yıllarda baģlamıģtır. Ikekawa ve ark. (1969), Lentinus edodes, Flammulina velutipes, Pleurotus ostreatus, Pleurotus spodoleucus (Fr.) Quél., Pholiota nameko (T. Itô) S. Ito & S. Imai, Tricholoma matsutake (S. Ito & S. Imai) Singer, Auricularia auricula-judae gibi mantar türlerinin sulu ekstraktları kullanılarak Ġsviçreli albino farelere transplante edilen Sarkoma 180'e karģı antitümör aktivitelerini belirlemiģlerdir. ÇalıĢma sonucunda Auricularia auricula-judae dıģında bütün sulu ekstraktlarının tümörlerin büyümesini yüksek derecede inhibe ettiği belirlenmiģtir. Ayrıca Lentinus edodes'de bulunan antitümör bileģen sayesinde tümör inhibisyonuna karģı en etkili olduğu gösterimiģtir. Aktif bileģeni en iyi bilinen mantarlardan biride Lentinus edodes tir. Bu tür özellikle Asya da oldukça fazla tüketilen bitkilerde parazitik bir mantar olmasının yanında antimikrobiyal ve antikanser özellikleri ile de bilinmektedir. Chihara ve ark. (1970), L. edodes in kolon kromotografisi sonucunda altı tane polisakkarit elde etmiģtir. Bunlar lentinan, LC-11, LC-12, LC-13, EC-11 ve EC-14 dür. Lentinan ve LC-11 polisakkaritlerinin güçlü antitümör etkiye sahip olukları, ayrıca lentinanın farelere implante edildiğinde Sarcoma-180 nin büyümesini engellediği de ortaya konmuģtur. Mizuno (1995) çalıģmasında, L. edodes 'in içerdiği Lentinan polisakkaritinin, Japonya da kanser hastalarının radyoterapi ve kemoterapi tedavisi sırasında bağıģıklık sistemine yardımcı olması amacıyla; giderek arttırılan dozlarla kullanıldığını ve bu uygulamanın bazı kanser hastalarının hayatta kalma süresini uzattığını belirlemiģtir. Wang ve ark. (1995), Tricholoma sp. nin misel kültürü ile immunomodulatör ve antitümör faaliyetleri incelenerek içerdiği polisakkarit-peptid kompleksinin makrofajları aktive ederek T-hücrelerinin çoğalmasını uyardığını belirlemiģlerdir. Bu nedenle de Tricholoma cinsinin çoğu türleri bazı kanser tedavilerinde doğrudan kullanılmaktadır. Wasser ve Weis (1999), yapılan klinik deneylerde Tremella fuciformis'in polisakkaritinin leukopeniye karģı radyoterapi ve kemoterapi ile beraber uygulandığında bağıģıklık sisteminin fonksiyonlarını arttırarak lökosit faaliyetlerini harekete geçirdiğini belirlemiģtir. Smith ve ark. (2002), Schizophyllum commune 'nin, klinik deneylerde iyi bir antikanser aktivite gösteren schizophyllan polisakkaritini içerdiği için farmokolojik

41 32 açıdan çok önemli olduğunu belirtmiģlerdir. Yapılan bir çalıģmada mide kanserine yakalanmıģ olan 367 hastanın kemoterapi ile birlikte uygulanan tedavi sonrasında yaģayan sayısında belirgin bir artıģın olduğunu belirlemiģtir. Schizophyllum mantarından elde edilen Schizophyllan polisakkariti kanser ilacı olarak tescil edilmiģ mantar polisakkariti olarak tarihe geçmiģtir. Cui ve Chisti (2003), Trametes versicolor un yenen bir mantar olmamasına rağmen geleneksel Çin tıbbında birçok hastalığın tedavisinde kullanıldığını, içerisinde bulunan "(polisakkaropeptid krestin) PSK" ve "(polisakkaropeptid) PSP" bileģenin kanser hücrelerine direkt sitotoksik etkisi olup interferon üretimini teģvik ederek antiviral etki oluģmasını sağladığını belirlemiģlerdir. T. versicolor'da proteine bağlı polisakkaritler ve polisakkaropeptidlerin çeģitli kanserlerin ve bulaģıcı hastalıkların terapisinde, kemoterapi ve radyoterapiyi tamamlamak için kullanılan etkili bağıģıklık kuvvetlendirici etkisi de belirlenmiģtir. Aynı zamanda PSP'nin kemoterapi ajanlarıyla olan sinerjistik mekanizmalarına ve etkilerine bakılmıģ, PSP'nin antikanser potansiyelinin lösemi ile sınırlı olmadığını, aynı zamanda, meme kanserlerinde de adjuvan (tamamlayıcı, destekleyici) tedavide kullanılabileceğini ortaya koymuģlardır. Daba ve Ezeronye (2003), S. commune, L. edodes ve G. frondosa'nın misel ekstraktları ve fruktifikasyonları kullanılarak farklı kanser hücre hatlarındaki antitümör aktivitelerini incelemiģlerdir. Mantarlardan elde edilen polisakkarit ekstraktlarının sarkoma 180, meme adenokarsinoma 755, lösemi L-1210 ve diğer bazı tümörlere karģı güçlü bir antitümör etki gösterdiğini belirlemiģlerdir. Sliva ve ark. (2003), farklı bölgelerden toplanan Ganoderma lucidum örneklerinin çeģitli hücreler üzerinde antikanser etkilerini araģtırmıģlardır. Kullanılan bazı Ganoderma örneklerinin, NF-kB hücresinde etkili antikanser aktivite göstermesine rağmen bazı örneklerin ise meme kanseri (MDA-MB-231) ve prostat kanserine (PC-3) etkisinin çok az ya da hiç aktivite göstermediğini tespit etmiģlerdir. Aynı türün farklı örneklerinde gözlemlenen bu farklı etkilerin sebebini tam olarak ortaya koyamamıģlardır. Zhao ve ark. (2003), Agrocybe aegerita (V. Brig.) Singer da bulunan lektinlerin antitümör aktivitelerini incelenmiģler, yapılan çalıģmalar sonucunda Agrocybe aegerita lektininin (AAL), HeLa, SW480, SGC-7901, MGC80-3, BGC-823, HL-60 ve sarkoma S-180 gibi tümör hücre hatlarının büyümesini engellediğini belirlemiģlerdir. Zhang ve ark. (2004), Pleurotus tuber-regium (Rumph. ex Fr.) Singer in in vivo (S-180 tümörü Balb/c faresine implante edilmiģtir) ve in vitro (HL-60 tümör hücre

42 33 kültürü) antitümör deney sonuçlarında HAE (sıcak alkali ekstraktı) fraksiyonunun bağıģıklık sistemi üzerinde direkt güçlü sitotoksik etkisinin olduğunu görmüģlerdir. Ng ve ark. (2006), Flammulina velutipes' in mantar miselyumları ile yapılan deneyde proflamin denilen yeni bir antikanser glikoproteinini izole etmiģlerdir. Ayrıca bu mantarın Beta (1-3)-D-glukan proteini bulundurması sebebiyle bağıģıklık sistemini düzenleyici ve antikanser özellik gösterdiğini belirlemiģlerdir. Sarangi ve ark. (2006), Pleurotus ostreatus misellerinden çeģitli metodlarla suda çözünebilen proteoglikan fraksiyonlarını saflaģtırmıģ ve bu fraksiyonların in vivo / in vitro olarak immunomodülatör ve antikanser etkilerini Sarcoma-180'le enfekte olmuģ fareler üzerinde test ederek antitümör etkisini ortaya koymuģlardır. P. ostreatus'un kanser tedavisi için kuvvetli biyolojik yanıt düzenleyici olarak ve antikanser ilaçları gibi kullanılabileceği tespit edilmiģtir. Nitha ve ark. (2007), Morchella esculenta nın misellerinin etanolik ekstraktının antiinflamatuar ve antitümör aktivitelerini araģtırmıģ, hem akut hemde kronik inflamasyonda önemli oranda doza bağlı inhibisyon oranlarını gözlemlemiģlerdir. Fruktifikasyon organlarından elde edilen polisakkaritlerin de immün sistemi uyarıcı aktivite sergilediği belirlenmiģtir. ÇalıĢma sonucunda araģtırıcılar, M. esculenta miselyumunun sulu-etanolik ekstraktının potansiyel terapötik olarak kullanımını önermiģlerdir. Lee ve ark. (2009), Inonotus obliquus un sıcak su ekstraktlarını melanoma B16- F10 hücreleri üzerinde denemiģler ve hücre büyümesinin inhibe olduğunu, hücre döngüsünün G 0 /G 1 fazının durmasını sağladığını ve hücre farklılaģmasının indüklendiğini tespit etmiģlerdir. I. obliquus'un aynı zamanda insan kolon kanseri hücrelerinin çoğalmasına karģı da inhibitör aktivite gösterdiğini belirlemiģlerdir. Jagadish ve ark. (2009), yemeklik mantarlar içerisinde en çok tüketilen ve kültür mantarı olarak da bilinen Agaricus bisporus un etanol ekstraktının antioksidan, antikanser ve antimikrobiyal aktivitesini incelemiģlerdir. A. bisporus ekstraktlarının, Candida albicans' a karģı antikandidal faaliyetinin yanı sıra hem gram pozitif hemde gram negatif bakterilere karģı antibakteriyal aktivite göstermiģtir. Ayrıca apoptozis indüksiyonu ile HL-60 lösemi hücrelerinin çoğalmasını engellediği görülmüģtür. Bu yüzden A. bisporus antimikrobik, antioksidatif ve antikanser aktivite gösteren fonksiyonel bir gıda olarak kabul edilebilir. Ziliotto ve ark. (2009), çalıģmalarında fare kolon karsinogenezi kullanarak insan kanser hücre hatlarında Agaricus blazei nin in vitro ve in vivo antitümör aktivitesini

43 34 araģtırmıģlardır. Aktif bileģenlerinin beta (1,3), (1,4), (1-6)-glukan ve alfa/ksilo/galakto glukan içeren polisakkaritler olduğunu ve beta glukanların bağıģıklık sistemi faaliyetlerini, özellikle T- hücrelerin alt kümelerini canlandırdığı, böylece tümör oluģumunu önlediği belirlenmiģtir. Youn ve ark. (2009), Inonotus obliquus un sıcak su ekstraktı kullanılarak B16- F10 melanom tümör hücrelerine etkisini değerlendirmek için çalıģma yapmıģlardır. Bu çalıģma sonucunda normal kontrol hücreleri ile melanom hücreler karģılaģtırıldığında dendrit benzeri çıkıntıların ortaya çıktığını ve bu yapıların konsantrasyonun artması ile giderek geniģlediğini gözlemlemiģlerdir. Ayrıca Inonotus un etkilerinin B16-F10 hücreleri üzerinde etkisinin olup olmadığını kontrol etmek amacıyla pozitif kontrol olarak arsenik trioksit (As 2 O 3 ) kullanılmıģtır (ġekil 3.1). Hücre farklılaģması indüksiyonu doza bağlı olarak bariz dendrit yapıların oluģtuğunu göstermiģtir. ÇalıĢma sonucunda B16-F10 melanoma hücrelerine karģı potansiyel antikanser aktivite sergilediği belirlenmiģtir. Bin (2010), Beyaz jelli mantar, Beyaz Koru Kulağı olarak bilinen Tremella fuciformis ile yapılan in vitro çalıģmalarda, mantarın antitümör özellikler sergilediğini, kemoterapi ya da radyasyon uygulanan kanser hastalarında kan hücrelerinin düzeylerini stabilize ettiğini ve akyuvar aktivitesini uyardığını gözlemlemiģtir. Selvi ve ark. (2011), T24 mesane kanseri hücre hatlarına karģı terapötik potansiyeli öğrenmek için Pleurotus florida ve Calocybe indica olmak üzere iki tıbbi mantar çeģidi ile çalıģmıģ ve elde edilen testler sonucunda T24 hücre hatlarına karģı antitümör potansiyel gösterdiği açıklanmıģtır. Bunun sonucunda P. florida ve C.indica mantarları mesane kanserine karģı potansiyel bir antikanser ilaç olarak kullanılabileceği belirtilmiģtir. Wu ve ark. (2012), çalıģmalarında Armillaria mellea (Vahl) P. Kumm. ekstraktını kullanarak 50, 100, 200 ve 400 μg/ml konsantrasyonlarda, insan akciğer kanser hücre hattı olan A549 hücreleri ile muamele etmiģlerdir. A.mellea' nın 200 μg/ml konsantrasyonun tümör hücrelerinin çoğalması üzerine inhibitör etkisinin olduğunu ve A549 hücrelerinin büyümesini güçlü bir Ģekilde baskılayıcı etkiye sahip olduğunu belirlemiģlerdir. Liu ve ark. (2013), yaptıkları çalıģmada Ramaria flava (Schaeff.) Quél. 'nın antikanser, antioksidan ve antibiyotik aktivitelerini araģtırmıģlardır. R.flava 'nın etanol ekstraktını kullanarak 200 μg/ml konstrasyondan baģlayarak 3 farklı kanser hücre hattına (BGC-803, NCI-H520, MDA-MB-231) karģı etkisini incelemiģlerdir. ÇalıĢma

44 35 sonucunda BGC-803 hücre hattında %33.83, NCI-H520 hücre hattında %54.63 ve MDA-MB-231 hücre hattında ise %71.66 oranında inhibisyon olduğunu belirlemiģlerdir. Ġnhibisyon oranlarında en fazla büyüme önleyici aktiviteye MDA-MB- 231 meme kanseri hücre hattının sahip olduğunu ve bu mantarın içerisindeki ergosterol peroksidazın neden olabileceğini düģünmektedirler. Jiao ve ark. (2013), 13 farklı mantar (Agrocybe cylindracea, Amauroderma rude (Berk.) Torrend, Tremella fuciformis, Auricularia polytricha (Mont.) Sacc., Cordyceps militaris (L.) Fr., Auricularia auricula, Ganoderma lucidum, Coriolus versicolor, Sarcodon imbricatus (L.) P. Karst., Grifola frondosa, Hericium erinaceus, Lentinula edodes, Boletus edulis Bull. ve farklı kanser hücre hatları (MB231, BEAS-2B, 4T-1, MCF-7, MB468, MT-1, MB231, A459, U87, Jurkat, HepG2, DU145, Hela ) kullanarak mantarların antikanser aktivitesini incelemiģlerdir. Her bir ekstrakttan 400 μg/ml kullanmıģlardır. AraĢtırma sonuçlarına göre Amauroderma rude' nin, diğer mantarlara göre kanser hücrelerini öldüren en yüksek aktiviteye sahip olduğunu bulmuģlardır. Antikanser aktivitesi en iyi bilinen tıbbi mantarlardan olan Ganoderma lucidum' dan bile daha yüksek aktiviteye sahip olduğunu belirtmiģlerdir. Li ve ark. (2014), yaptıkları çalıģmada Hericium erinaceus ekstraktının insan gastrointestinal kanserlerine karģı antikanser etkisini incelemiģlerdir. H.erinaceus' un çeģitli konsantrasyonlarda ( mg/ml) etanol ekstraktı (HTJ5 ve HTJ5A) kullanılarak HepG2, Huh-7, HT-29 ve NCI-87 hücre hatlarına karģı antiproliferatif aktiviteleri incelendiğinde IC 50 değerlerinin sırasıyla 2.507±0.25 ve 2.007±0.25, 0.807±0.08 ve 1.507±0.28, 1.257±0.06 ve 1.257±0.05, ve 5.007±0.22 ve 4.507±0.14 mg/ml olduğunu hesaplamıģlardır. Sonuçlara göre de bu mantarın mide kanseri türlerine karģı antikanser aktivite gösterdiği belirlenmiģtir.

45 36 4. MATERYAL VE YÖNTEM 4.1. Mantar Türleri, Toplanması ve Lokasyonları GerçekleĢtirilen tez çalıģmasında daha önceden meme kanseri üzerine etkileri belirlenmeyen ikisi yenilen, ikisi de yenilmeyen özellikte olan Tricholoma anatolicum Doğan & Intini, Terfezia boudieri Chatin, Fomes fomentarius (L.) J. Kickx f. ve Phellinus igniarius (L.) Quél seçilmiģtir. Tricholoma anatolicum Türkiye ye özgü endemik bir türdür. Amerika da bol miktar da yetiģen Tricholoma magnivelare ve Japonya daki Tricholoma matsutake'ye benzerlik göstermesine rağmen kendine has koku ve lezzetiyle bu türlerden kolaylıkla ayırt edilmektedir. Ülkemizde yalnızca Akdeniz bölgesinde Toros dağlarında sedir ormanlarında yetiģir. Halk tarafından Katran mantarı diye bilinmektedir. Terfezia boudieri dünyada Çöl mantarı olarak bilinmektedir. Çok lezzetli bir tür olan T. boudieri, aynı zamanda bazı antimikrobiyal ve çeģitli etkilerinden dolayı halk tarafından kullanılmaktadır. Ülkemizde doğal olarak Ġç Anadolu, Doğu ve Güneydoğu Anadolu nun step vejetasyonunda yetiģmektedir. Halk tarafından domalan, kumi, keme, dümbelek, tombalak diye bilinen, besin ve ekonomik açıdan değere sahip bir mantardır. Phellinus igniarius yenmeyen ve ağaç paraziti mantardır. Ġbreli ve yapraklı ağaçların hemen hepsinde yetiģebilmektedir. Fomes fomentarius ağaçlar üzerinde görülen yenmeyen parazit ve kozmopolit bir türdür. Eskiden mantardan elde edilen toz kan dindirmek için kullanılmaktaydı. Halk tarafından Kav mantarı olarak bilinmektedir Mantar Türlerinin Tanımları Ascomycota Terfeziaceae Terfezia boudieri Chatin Makroskobik ve Mikroskobik Özellikleri Askokarp: cm çapında, küre-top, yuvarlağımsı, üst kısmı basık ve dalgalı, genellikle patates yumrusu Ģeklindedir (ġekil 4.1). Yüzey genelde düz, bazen pürüzlü, geniģ oluklara ayrılmıģ, kırmızımsı-soluk kahverengi, bazen sarımsı veya gül rengindedir. Ekzoperidyum 1-2 mm kalınlığında, glebadan kolaylıkla soyularak ayrılabilmektedir.

46 37 Gleba: Dolgun, sıkı ve sulu, krem renkte, dip kısmı koyu kenarlar orta kısma nazaran daha açık ve mermer görünümündedir. Sporlar: µ çapında, subgloboz, çeperi tüberküllü veya mozaik görünüģlü, açık sarımsı renktedir. YetiĢme Yeri Özellikleri Ġlkbaharda yağmurların hemen arkasından çıkmakta, su tutma kapasitesi az olan ve hemen kuruyan geçirgen, kumlu topraklar içerisinde yetiģmektedir. Mantar fruktifikasyonunu toprak altında yaptığı için toprak yüzeyinde meydana getirdiği çatlaklar ve ĢiĢkinliklerden bulunabilmektedir. Helianthemum bitkisi ile mikorhizal yaģamaktadır. ġekil 4.1. Terfezia boudieri Chatin Basidiomycota Polyporaceae Fomes fomentarius (L.) Fr. Makroskobik ve Mikroskobik Özellikleri Bazidyokarp: 5-45 cm çapında, 2-25 cm yüksekliğinde ve at tırnağı Ģeklindedir (ġekil 4.2). Her yıl geliģme ile üst üste yığılmıģ farklı kalınlıkta, gri renkli, konsantrik zonlar meydana gelmekte, gri-gri kahverengidir. Gençken kenarda beyaz renkte dairesel bir halka bulunur. DıĢ kısmı sert ve odunsu bir yapıdadır. Trama: Sert, tarçın kahverengi, olgunlaģınca çakmak tozu Ģeklinde dökülür. Tazeyken meyve kokusundadır. Himenyum: Porlu, yuvarlak, mm de 2-3 por bulunmakta, tüpler 2-5(8) mm uzunluğunda ve gri kahverengidir. Sporlar: µ, eliptik-silindirik, düz, hiyalindir.

47 38 YetiĢme Yeri Özellikleri Yapraklı ağaçların her çeģidi üzerinde geniģ bir yayılıģ alanı göstermektedir. AraĢtırma alanında söğüt ve kavak ağaçları üzerinde tespit edilmiģtir. ġekil 4.2. Fomes fomentarius (L.) J. Kickx f. Phellinus igniarius (L.) Quél. Makroskobik ve Mikroskobik Özellikleri Bazidyokarp: x cm çapında, 3-15 cm kalınlığında, önce yuvarlağımsı, yaģlandıkça tırnak (ungulat) Ģeklini alır (ġekil 4.3). Kenarları kalın ve enli, kıvrık, geniģ ve sık zonlu, dikine çatlaklı, bazen çatlaklar zonlara paralel oluģur ve genelde mantar çok değiģken Ģekildedir. Zonlar veya bantların kalınlığı 2-4 cm çapında, yüzey gri kahverengi veya pas kahverengi, kenarında önce beyazımsı, sonra gri beyaza dönen ve yuvarlağımsı yapıda bir zon bulunur. Trama: Koyu kahverengi, sert ve odunsudur. Himenyum: Porlu, yuvarlağımsı, mm de 5-6 por bulunmakta ve tüplerin uzunluğu 2-8 mm kadardır. Porlar tarçın kahverengi, yaģlandıkça beyazlaģmaktadır. Sporlar: µ, subgloboz, düz, hiyalindir. YetiĢme Yeri Özellikleri Yaygın bir parazittir. Ġbreli ve yapraklı ağaçların hemen hemen hepsinde görülmektedir. Genelde söğüt, kavak, köknar ve sedir ağaçlarının gövdeleri üzerinde yetiģtiği tespit edilmiģtir.

48 39 ġekil 4.3. Phellinus igniarius (L.: Fr.) Quél. Tricholomataceae Tricholoma anatolicum HH.Doğan & Intini Makroskobik ve Mikroskobik Özellikleri ġapka: 4-20 cm çapında, önce sapa bitiģik topuz Ģeklinde, sonra açılarak yarı kubbe Ģeklinden düzgünleģir (ġekil 4.4). Gençken beyaz-krem, geliģme ilerleyince sarımsı kreme döner. Yüzeyi ince yünümsü tüylü, kenarında yünümsü velar kalıntılar asılı bulunur. Etli kısım: 2-5 cm kalınlığında, beyaz, sıkı yapılı ve dolgun, katran kokusunda ve tadı çok güzeldir. Lameller: Krem beyaz, sapa ince bir girinti yaparak birleģir. Sap: 4-10 x 2-5 cm, silindirik ve tabana doğru biraz incelmektedir. Önce beyaz, sonra krem beyazdan krem sarıya döner. Üzerinde ince yünümsü yapıda velar kalıntılar ve annulus bulunur. Sporlar: µ, geniģ eliptik veya subgloboz, renksiz, siyanofiliktir. Spor baskısı krem beyazdır. YetiĢme Yeri Özellikleri Sedir ormanı içinde kumlu yerlerde sedir ağacı ve Astragalus ların dibinde ektomikorhizal yaģamaktadır.

49 40 ġekil 4.4. Tricholoma anatolicum HH.Doğan & Intini Tez çalıģmasında kullanılacak olan mantarlardan Tricholoma anatolicum, Fomes fomentarius ve Phellinus igniarius sonbahar döneminde Ekim, Kasım aylarında, Konya-TaĢkent, Hadim, Bozkır, SeydiĢehir; Karaman-Ermenek-BaĢyayla; KahramanmaraĢ-Göksun; Adana-Feke, Pozantı; Muğla-Fethiye; Antalya- Beydağlarından, Terfezia boudieri ise Konya, Karaman, Adana-Pozantı bölgelerinin step alanlarından Ġlkbahar döneminde Nisan, Mayıs aylarında toplanmıģtır Mantarların Ekstraksiyonu Araziden toplanan örnekler 37 C de kurutma dolabında yaklaģık 3-5 günde kurutulmuģtur. Kurutulan örnekler değirmende öğütülerek toz haline getirilmiģtir. Toz halindeki mantarların her birinden 10 gr tartılmıģtır. Tez çalıģmasında kullanılan Tricholoma anatolicum, Terfezia boudieri, Phellinus igniarius ve Fomes fomentarius un her biri için ayrı ayrı solvent kullanılmıģtır. Bu solventler; ultra saf su, metanol ve etanol' dür Mantarların ultra saf su ile ekstraktının hazırlanması Ekstraksiyon yapılırken ilk önce beher içerisine toz mantarlar ve 250 ml ultra saf su konularak ºC sıcaklıkta ultrasonik homojenizatör cihazı (Bandelin SONOPULS MS73) ile 1 saat ultrasonikasyona tabii tutulmuģlardır. Ultrasonikasyon sonrasında sıvı ekstrakt falkonlara eģit olacak Ģekilde ayarlanarak 8500rpm de 15dk soğutmalı santrifüjde (NÜVE NF 800R) santrifüj edilmiģtir. Santrifüj sonrasında süpernant kısım baģka bir ĢiĢeye alınmıģtır. Pelletler toplanarak üzerine tekrar 200 ml ultra saf su konulmuģ ve 8500rpm de 15dk santrifüj edilmiģtir. Süpernant kısım

50 41 alınmıģtır. Pellet üzerine 150 ml ultra saf su ilave edilerek 1 saat daha ultrasonikatör ile parçalanması sağlanmıģtır. Parçalama bittikten sonra son kez 15dk daha santrifüj edilmiģtir (ġekil. 4.5). Protokol sırasında örneklerdeki fitokimyasalların sıcaklıktan dolayı bozulmasını önlemek amacıyla sıcaklığın 40 ºC'nin altında tutulmasına özellikle dikkat edilmiģtir. ġekil 4.5. Toz haline gelmiģ mantarların su ile ekstrakte edilmiģ hali Mantarların metanol ve etanol ile ekstraktlarının hazırlanması Ekstraksiyon yapılırken ilk önce beher içerisine toz mantarlar ve 250 ml metanol/etanol konularak 25-37ºC sıcaklıkta 1 saat ultrasonikasyona tabii tutulmuģlardır. Ultrasonikasyon sonrasında sıvı ekstrakt falkonlara eģit olacak Ģekilde ayarlanarak 8500 rpm de 15 dk santrifüj edilmiģtir. Santrifüj sonrasında süpernant kısım baģka bir ĢiĢeye alınmıģtır. Pelletler toplanarak üzerine tekrar 200mL metanol/etanol konulmuģ ve 8500 rpm de 15 dk santrifüj edilmiģtir. Süpernatant kısım alınmıģtır. Pellet üzerine 150 ml metanol/etanol ilave edilerek 1 saat daha ultrasonikatör ile parçalanması sağlanmıģtır. Parçalama bittikten sonra son kez 15 dk daha santrifüj edilmiģtir (ġekil. 4.6). Protokol sırasında örneklerdeki fitokimyasalların sıcaklıktan

51 42 dolayı bozulmasını önlemek amacıyla sıcaklığın 40 ºC'nin altında tutulmasına özellikle dikkat edilmiģtir. ġekil 4.6. Mantarların metanol ve etanol ile ekstrakte edilmiģ halleri 4.4. Mantarların Metanol ve Etanol Ekstraktlarının Evaporatör ile Uçurulması Metanol ve etanol ekstraktları rotary evaporatorde (IKA RV10) o C de rpm ayarlanılarak çözücüler tamamen uçurulmuģtur (ġekil.4.7). ġekil 4.7. Mantar ekstraktlarının evaporasyon iģlemi

52 Mantar Ekstraktlarının Liyofilizasyonu Mantar ekstraktları filtre yardımıyla süzüldükten sonra +4 o C de saklanmıģtır. Daha önceden -80 o C de (NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC-U410 premium) dondurulmuģ olan ekstraktlar, hücrelere uygulama aģamasında toz halinde kullanılacağı için liyofilizasyon cihazı (SCANVAC) ile -110 ºC de 2 gün boyunca bekletilerek kurutulmuģtur (ġekil 4.8). Liyofilize edilen ekstraktlar 4 o C de saklanmıģtır. ġekil 4.8. Mantar ekstraktının liyofilize iģlemi 4.6. Mantar Ekstraktlarında Fenolik BileĢiklerin HPLC (High Performance Liquid Chromotography) Ġle Belirlenmesi Bu aģamada ekstraktların içerdiği önemli fenolik bileģiklerin analizi için Yüksek Performans Sıvı Kromotografisi (HPLC) ile (Shimadzu DGU-20A3E), C18 (Perkin Elmer) kolonu (5µm, 150 4,6 mm) ve SPD-20A UV-VIS dedektörü ile belirlenmiģtir. KateĢin, 4- hidroksibenzoik asit, p-kumarik asit, sinnamik asit, vanilik asit, benzoik asit, siringik asit, gallik asit, rutin trihidrat, protokateģik asit, kuersetin dihidrat standartları kullanılmıģtır. Standartlar ve metanolik ekstraktlar 30 C de, UV-VIS dedektörü ile belirli dalga boylarında, akıģ oranı 0.5mL/min, mobil faz olarak su (H 2 O) ve metanol (MeOH) (TFAc(100:0,02)) ile analiz gerçekleģtirilmiģtir (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1. Fenolik bileģen standartları ve dalga boyları Fenolik BileĢen Standartları Gallik asit Analiz Yapılan Max. Dalga Boyu (nm) 254 nm KateĢin 254 nm Siringic asit 254 nm P-Kumarik asit 254 nm Benzoik asit 280 nm

53 44 Sinnamik asit P-OH Benzoik asit Vanillic asit Rutin ProtokateĢik asit Kuarsetin 254 nm 280 nm 280 nm 280 nm 280 nm 280 nm 4.7. Hücre hatları, Kültür Ortamı Meme kanserine model hücre hatlarından biri olan MCF-7 hücreleri, 69 yaģında beyaz ırk bir bayan hastanın meme epitel dokusundan elde edilmiģtir. Meme kanseri hücre hattı tek katmanlı büyüyen yapıģkan hücre hattıdır. ÇalıĢmada antikanser ilaçlara duyarlı MCF-7 hücre hattı ve daha önceki çalıģmalarda paklitaksel ve vinkristine dirençli hale getirilmiģ olan MCF-7 hücre hatları kullanılmıģtır (Kars ve ark., 2008, 2010). Hücrelerin kültür ortamı olarak %10 (v/v) fötal dana serumu (fetal bovine serum, FBS) 2 mm L-glutamin içeren RPMI 1640 kullanılmıģtır. Bakteri enfeksiyonunu önlemek için vasata gentamisin (1mg/mL) eklenerek, hücreler 37 C de, %5 lik CO 2 de, inkübatörde (Binder CB 53-UL ) üretilmiģtir (ġekil 4.9, 4.10). YapıĢkan hücreler, hücre kültür kabının %70 ini kapladığında ve çalıģmada kullanılacağı zaman tripsin-edta ile yeni kültür ortamına pasajlanmıģtır. Hücreler sırası ile 400 nm paklitaksele 150 kat (MCF-7/Pak) ve 120 nm vinkristine 30 kat (MCF-7/Vink) dirençli olup, P-gp proteinini ve ilgili geni (MDR1) aģırı ifade etmektedirler (Kars ve ark., 2008, 2010). ÇalıĢma sırasında fazla çoğalan ve deneyi yapılan hücreler sıvı nitrogen içinde dondurularak saklanmıģtır.

54 45 ġekil 4.9. Meme kanserine model hücre hatlarından biri olan MCF-7 hücrelerinin 10 X objektifte mikroskobik görüntüsü ġekil CO 2 inkübatöründe flasklarda üretilen hücreler 4.8. Sitotoksisite Testleri, IC 50 Değerlerinin Belirlenmesi Sitotoksisite analizlerinde 3-[4,5- Dimethylthiazol-2-yl] 1-2,5- diphenyltetrazolium bromide (XTT) kiti kullanılmıģtır. Mantar özütlerinin duyarlı ve dirençli hücre hatlarına sitotoksik etkisi 96 gözlü kültür kaplarında test edilmiģtir. Yapılan ön çalıģmalar sonucunda hücreleri yüksek oranda öldüren dozun 6mg/mL olduğu belirlenmiģtir. Bu nedenle uygulanacak olan en yüksek doz 6 mg/ml olmuģtur. Ekstraktlar 1/2 oranında yüksek dozdan düģük doza yatay olacak Ģekilde 10 seri dilüsyon yapılmıģtır. Mantar ekstraktından 12 mg tartılmıģ ve 500 μl ultra saf su ile çözdürülmüģtür (ġekil 4.11). Stok olarak hazırlanan ekstraktın konsantrasyonu 24 mg/ml olmuģtur. Ġlk dozun 6 mg/ml olması için stoktan 500 μl alınıp üzerine 1500 μl medium ilave edilmiģtir. 96 gözlü plakanın ilk kuyucuğa (1.kolon A-H arası) kontrol amacıyla 150 μl medium konulmuģtur. Ġkinci kolondan 12.ci kolona kadar (3.kolon hariç) 100 μl saf medium konulmuģtur. 3. kolona suda çözdürülmüģ mantar ekstraktı ve medium ilave edilmiģ karıģımdan 200 μl konulmuģtur. Daha sonra 3.cü kolondan 12'ye kadar ±100 μl seri dilüsyon yapılmıģtır. Vasat kontrolü gözleri hariç (2'den 12'ye kadar) her göze 50 μl olacak Ģekilde 1x10 5 hücre ektikten sonra 72 saat boyunca 37 ºC de CO 2 inkübatöründe inkübe edilmiģtir. Duyarlı kanser hücrelerinin haricinde normal hücre olarak kullanılan (Afrika YeĢil BaĢlı Maymun böbrek hücresi) Vero hücreleri ile aynı metod uygulanarak ve ilk doz 6 mg/ml olacak Ģekilde sitotoksisite deneyi yapılmıģtır. Kuyucuklara ekstraktlar ve

55 46 hücreler ilave edildikten sonra inkübasyona bırakılmıģtır. Ġnkübasyon süresi bittikten sonra her göze 50 μl XTT solüsyonu eklenerek canlı hücrelerin oluģturduğu formazan kristallerinin oluģması için 4 saat bekletilmiģtir. Hücre üremesindeki inhibisyon, kromojenik ürünün 490 nm dalga boyunda ELISA okuyucu (Biotek Epoch Elisa Reader) ile optik yoğunluğunun belirlenmesi ve IC 50 (hücrelerin %50 sinin yaģadığı kimyasal konsantrasyonu) değerlerinin hesaplanması ile belirlenmiģtir (ġekil 4.12). ġekil Sitotoksite testinde uygulanan doz miktarları ġekil Sitotoksisite testi uygulanan platelerin ELĠSA okuyucu ile optik yoğunluğunun belirlenmesi 4.9. Ġlaç Akümülasyon Analizleri ve Dirençliliğin Geri Çevrilmesi ÇalıĢma akım sitometri analiziyle de tekrar edilmiģtir. Duyarlı (MCF-7/S) ve dirençli (MCF-7/Vinc, MCF-7/Pac) hücre hatları tripsinizasyondan sonra 2x10 6 hücre/ml olacak Ģekilde serumsuz RPMI 1640 vasat solüsyonunda süspanse edilip, 0,5 ml alikotlar halinde 1,5 ml lik santrifüj tüplerine dağıtılmıģtır. Sitotoksisite

56 10 dk oda sıcaklığında bekletilir 37 o C 'de 20dk inkübe edilir 10 dk oda sıcaklığında bekletilir 37 o C 'de 20dk inkübe edilir 47 analizlerinde etkili olduğu görülen ekstraktların MDR geri çevirici etkileri (modülasyon etkisi) bu aģamada araģtırılmıģtır. Modülasyon etkisi test edilecek olan ekstraktlar ve kontrol grubu olarak verapamil hesaplanan miktarlarda tüplere eklenip 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilmiģtir. Modülatör etkisi belirlenecek olan ekstraktlar IC 50 değerlerinin altında dozlarda uygulanmıģtır. Daha sonra rhodamine 123 (P-gp substratı floresan boya) hücre içi ilaç birikimini belirlemek için (konsantrasyon 10 µm) 10µl olarak tüplere eklenip, 20 dakika 37 C de inkübe edilmiģtir. Hücreler 800rpm de 5 dakika çöktürülmüģ, iki defa 0,5 ml PBS (phosphate saline buffer) ile yıkandıktan sonra 0,5 ml PBS te tekrar süspanse edilmiģtir (Çizelge 4.2, 4.3). Hücre popülasyonundaki floresan aktivite akım sitometre (Flow Cytometry BD FACSAria III) ile FL-2 bölgesinde ölçülmüģtür (ġekil 4.13). Çizelge 4.2. Farklı konsantrasyonlarda MCF-7/Vinc hücrelerine uygulanan madde miktarları MCF-7/Vinc Mantar İsmi Kullanılacak miktar (µl) Rhodamine (5.2 µm stok) MCF-7/Vinc Negatif Kontrol - 10 μl 0.5 ml Verapamil (2.5mg/mL stok) 8 μl 10 μl 0.5 ml Phellinus igniarius (Metanol) 35 μl 10 μl 0.5 ml Fomes fomentarius (Su) 28 μl 10 μl 0.5 ml Fomes fomentarius (Metanol) 38 μl 10 μl 0.5 ml Fomes fomentarius (Etanol) 23 μl 10 μl 0.5 ml Terfezia boudieri (Etanol) 26 μl 10 μl 0.5 ml Tricholoma anatolicum (Etanol) 26 μl 10 μl 0.5 ml Çizelge 4.3. Farklı konsantrasyonlarda MCF-7/Pac hücrelerine uygulanan madde miktarları MCF-7/Pac Mantar İsmi Kullanılacak miktar (µl) Rhodamine (5.2 µm stok) MCF-7/Pac Negatif Kontrol - 10 μl 0.5 ml Verapamil (2.5mg/mL stok) 8 μl 10 μl 0.5 ml Phellinus igniarius (Metanol) 53 μl 10 μl 0.5 ml Fomes fomentarius (Su) 23 μl 10 μl 0.5 ml Fomes fomentarius (Metanol) 42 μl 10 μl 0.5 ml Fomes fomentarius (Etanol) 59 μl 10 μl 0.5 ml Terfezia boudieri (Etanol) 56 μl 10 μl 0.5 ml Tricholoma anatolicum (Etanol) 38 μl 10 μl 0.5 ml

57 48 ġekil Akım sitometre sistemi (FACS AriaIII) Modülatör uygulanmıģ hücre hatlarının floresan aktivitesi ile uygulanmamıģ olan hatların histogramları karģılaģtırılmıģtır. Modülatör uygulanmıģ hücrelerin floresan aktivitelerinin uygulanmamıģ hücrelere bölümü ile floresan aktivite oranı (Floresan activity ratio, FAR) bulunur. Denklemi; FAR= Mdr uygulanmıģ / Mdr kontrol (4.1) Parentel uygulanmıģ / Parental kontrol FAR değerleri verapamilden yüksek bulunan maddeler MDR modülatörü olarak önerilebilmektedir (Ugocsai, 2005).

58 49 5. ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA 5.1. Mantar Ekstraktı Üzerine Uygulanan Analizler Mantarların toz haline getirilmesi iģleminden sonra ultra saf su, metanol ve etanol solüsyonları ile ultrasonikatör cihazı kullanılarak ekstraktları yapılmıģtır. Genellikle katı ve yarı katı bileģenlerin ekstraksiyonu için Soxhlet cihazı ile ekstraksiyon yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak Soxhlet ile ekstraksiyon metodu yavaģ, oldukça fazla organik solvent kullanımı gerektiren ve bazen de ekstraksiyonda yetersizlikler gösteren bir yöntemdir. Aynı zamanda örnekler genellikle solventin kaynama noktasında uzun süre ekstrakte edildiği için içerisindeki bileģenlerin bozulmasına yol açabilir. Bu sınırlayıcı faktörleri ortadan kaldırmak için farklı ekstraksiyon teknikleri geliģtirilmiģtir (Çam ve HıĢıl, 2006). Soxhlet ile karģılaģtırıldığında ultrasonikatör cihazı kullanılarak yapılan ekstraksiyonlardan daha fazla verim elde edilmektedir. Belirli frekansta (20 khz frekans) ve aralıklarda ses dalgasıyla parçalama esasına dayandığı için maddenin içeriğini daha çok ortaya çıkarmaktadır. Ekstraksiyon sırasında ısı oluģmadığı için de ekstraktın sahip olduğu fitokimyasallarının bozulmasına yol açmamaktadır. Liyofilizatör cihazı yardımıyla toz haline getirilen mantarlarda en yüksek verimlilik hepsinde su ile yapılan ekstraktlarda olmuģtur. Metanol ve etanol gibi çözgenlerde evaporatör ile alkolü uzaklaģtırma olduğu için ekstraktların miktarlarında büyük miktarda azalma olmaktadır. Su ile yapılan ekstraktta ise bu iģlemler yapılmadan yoğunlaģtırarak toz haline getirildiği için verim daha fazla olmaktadır (Çizelge 5.1). Çizelge 5.1. Mantarların liyofilizatör sonrasındaki verimlilikleri Su (g) Etanol (g) Metanol (g) Fomes fomentarius Tricholoma anatolicum Terfezia boudieri Phellinus igniarius Mantar ekstraktları kullanılarak, içerdikleri fenolik bileģiklerin HPLC ile tayini, sitotoksite testleri ve IC 50 değerlerinin belirlenmesi, ilaç akümülasyon ve dirençliliğin geri çevrilmesi analizleri yapılmıģtır.

59 Mantar Ekstraktlarındaki Fenolik BileĢiklerin Miktarları Sebzelerde, meyvelerde ve gıdalarda farklı tiplerde pek çok fenolik bileģik bulunmaktadır. Fenolik bileģikler, antioksidan, antikanser, antiinflamatuvar, antibiyotik, antifungal, antiviral, antimikrobiyal, antialerjik vb. önemli tedavi edici etkilere sahiptir. Mantarlar da fenolik bileģikler bakımından oldukça zengindir. Bu yüzden içerdikleri fenolik bileģiklerin miktarları yüksek performanslı sıvı kromotografisi (HPLC) yöntemi ile belirlenmiģtir. Çizelge 5.2. Mantar ekstraktlarında bulunan fenolik bileģikler (LOD: Tespit edilebilecek en küçük miktar, LOQ: Tespit edilebilecek en güvenli miktar) Fenolik asitler (mg/g) (Ortalama ± Standart sapma) n=3 LOD (Limit of Detection) Algılama Sınırı LOQ (Limit of Quantitive Measurement) Kantitatif Ölçme Sınırı Fomes fomentarius Phellinus igniarius Terfezia boudieri Tricholoma anatolicum Gallik asit 0,023 0,070 20,10±0,16 11,20±0,12 0,71±0,25 5,28±0,30 KateĢin 0,326 0,987 2,43±0,20 10,68±0,91 Yok Yok Siringik asit 0,031 0,093 28,25±0,15 4,11±0,01 <LOQ 0,39±0,02 p-kumarik asit 0,044 0,133 22,65±0,20 17,57±0,15 <LOQ <LOQ Benzoik asit 0,049 0, ,13±0,36 19,63±0,21 <LOQ 0,23±0,02 Sinnamik asit 0,007 0,020 25,50±0,07 5,96±0,26 <LOQ 0,58±0,14 p-hidroksi Benzoik asit 0,029 0,086 1,16±0,08 1,23±0,01 <LOQ 0,19±0,01 Vanilik asit 0,032 0,098 5,71±0,14 13,05±0,03 Yok 0,22±0,02 Rutin 0,074 0,226 60,95±0,32 21,79±0,03 Yok 0,23±0,01 ProtokateĢik asit 0,031 0,093 36,72±0,21 25,38±0,10 Yok <LOQ Kuarsetin 0,054 0,164 57,98±0,17 7,81±0,19 <LOQ 0,18±0,19

60 gallic acid catechin p-oh benzoic acid vanilic acid syringic acid p-coumaric acid rutin protocatechuic acid benzoic acid quarcetin cinnamic acid gallic acid catechin p-oh benzoic acid vanilic acid syringic acid p-coumaric acid rutin protocatechuic acid benzoic acid quarcetin cinnamic acid 51 ġekil 5.1. Kullanılan standartlarının 254 ve 280 nm deki HPLC histogramı 10 mv Detector A Ch1:254nm min mv Detector A Ch2:280nm min ġekil 5.2. Fomes fomentarius mantarının metanol ekstraktının HPLC histogramı

61 gallic acid p-oh benzoic acid syringic acid quarcetin gallic acid p-oh benzoic acid vanilic acid p-coumaric acid rutin benzoic acid quarcetin cinnamic acid catechin p-oh benzoic acid vanilic acid syringic acid p-coumaric acid rutin protocatechuic acid benzoic acid quarcetin cinnamic acid gallic acid catechin p-oh benzoic acid vanilic acid syringic acid p-coumaric acid rutin protocatechuic acid benzoic acid quarcetin cinnamic acid mv Detector A Ch1:254nm min mv 10.0 Detector A Ch2:280nm min ġekil 5.3. Phellinus igniarus mantarının metanol ekstraktının HPLC histogramı 15 mv Detector A Ch1:254nm min mv Detector A Ch2:280nm min ġekil 5.4. Terfezia boudieri mantarının metanol ekstraktının HPLC histogramı

62 gallic acid p-oh benzoic acid vanilic acid syringic acid rutin p-coumaric acid protocatechuic acid benzoic acid quarcetin cinnamic acid gallic acid p-oh benzoic acid vanilic acid syringic acid p-coumaric acid rutin protocatechuic acid benzoic acid quarcetin cinnamic acid 53 mv Detector A Ch1:254nm min 7.5 mv Detector A Ch2:280nm min ġekil 5.5. Tricholoma anatolicum mantarının metanol ekstraktının HPLC histogramı HPLC analizi sonuçlarına göre, Fomes fomentarius ve Phellinus igniarius mantarlarında seçilen 11 fenolik bileģiğin tamamı tespit edilmiģtir. Benzoik asit ±0.36 mg/g ile yenmeyen mantar olan Fomes fomentarius' da en yüksek miktarda bulunmuģtur. Benzoik asit ve türevlerinin antifungal, antimikrobiyal, gıdalarda koruyucu özellikleri vardır. Phellinus igniarius'ta bu fenolik bileģiğin miktarı 19.63±0,21 mg/g, Tricholoma anatolicum' da 0.23±0.02 mg/g, Terfezia bodieri' de ise tespit edilen güvenli miktardan düģük olduğu bulunmuģtur. Rutin bileģiğinin antioksidan, antikanser ve antiiflamatuvar özellikleri vardır. Bu fenolik bileģik F. fomentarius' da diğer mantarlara göre yüksek değere sahiptir ve 60.95±0.32 mg/g olarak bulunmuģtur. P.igniarus' da 21.76±0.03 mg/g, T.anatolicum' da 0.23±0.01mg/g miktarında fakat T.boudieri' de ise varlığı tespit edilememiģtir. Gallik asit, kateģin, p- kumarik asit, kuarsetin ve protokateģik asit gibi fenoliklerin antikanser etki göstermesi analizi yapılan mantarların da antikanser etkiye sahip olduğunu anlamına gelmektedir. P.igniarus' da analizi yapılan bütün fenoliklerin varlığı belirlenmiģtir. T.anatolicum' da kateģin fenoliği hariç bütün bileģiklere sahip olduğu görülmüģtür. p-kumarik asit ve protokateģik asit güvenli miktardan düģük olarak hesaplanmıģtır. T.boudieri' de kateģin,

63 54 vanilik asit, rutin ve protokateģik asit tespit edilememiģtir. Diğer 7 fenolik bileģik ise kantitatif ölçme sınırından yüksek olduğu bulunmuģtur (Çizelge 5.2) (ġekil 5.1-5). Kondo ve ark. (2000) çalıģmalarında kateģinin antimikrobiyal, antikanser, antialerjik ve antioksidan aktiviteye sahip olduğunu belirlemiģlerdir. Metodiewa ve ark. (1997), rutin bileģiğinin doğal bir flavonoid olduğunu ve önemli antilipoperokzidant olarak görev yaptığını tespit etmiģlerdir. Aynı zamanda hidroksil ve süperoksit radikallerininde güçlü bir temizleyici olduğunu belirlemiģlerdir. Li ve ark. (2000) çalıģmalarında gallik asitin doğal antioksidan ve güçlü bir kenetleme maddesi olduğunu, Fe 3+ ile dayanıklı kompleksler oluģturduğunu tespit etmiģlerdir. Ayrıca gallik asitin antiinflamatuar, antitümör, antibakteriyel, antifungal faaliyetlere sahip olduğuda Kroes ve ark. (1992), Miki ve ark. (2001) ve Akiyama ve ark. (2001) tarafından bildirilmiģtir. Fresco ve ark. (2006), çalıģmalarında hidroksibenzoik asit ve türevlerinin, gallik asit ve diğer alkil esterlerinin ve protokateģik asitin insan kolon, meme, akciğer, mide, rahim ve kan kanseri üzerine etkisi olduğunu bulmuģlardır. Sinnamik asit ve türevlerinin kan kanseri, ağız kanser hücreleri ve rahim kanseri hücrelerine etkilerinin olduğunu belirtmiģlerdir. Ayrıca bu bileģiklerin antioksidan, apoptozun uyarılması, hücre döngüsünü durdurma, büyüme faktörü reseptörünün dolaylı yollarını baskılama ve NF- KB aktivasyonunu baskılanma gibi koruyucu mekanizmalara sahip olduğunu bulmuģlardır. KateĢin ve kuarsetinin prostat ve meme kanseri hücrelerine etkileri olduğu bulunmuģ, aynı zamanda antioksidan, antiinflamatuvar ve telomeraz inhibisyonu üzerine kemopreventif mekanizması olduğu açıklanmıģtır. Aynı Ģekilde kumarin ve türevlerininde kan kanseri, meme kanseri hücrelerine antioksidan ve antiinflamatuvar etkisi, hücre döngüsünü bloke etme özelliğini belirlemiģlerdir. Yaltırak ve ark. (2009) çalıģmalarında yenen mantar Russula delica Fr.' nın 19 farklı fenolik bileģiklerinin analizini yapmıģlardır. Bu fenoliklerden gallik asit 0.05 mg/l kateģin 5.33 mg/l, rutin 0.46 mg/l, kaffeik asit 0.11 mg/l olarak bulunmuģ fakat p-kumarik asit, kuersetin, ferulik asit, epikateģin, rosmarinik asit ve diğer fenolik bileģikler ise tespit edilememiģtir. T.boudieri ve T.anatolicum' da yenen mantarlardır ve p-kumarik asit, kuersetin mg/g olarak kantitatif ölçme sınırından düģüktür. Vaz ve ark. (2011) araģtırmalarında Portekize özgü yenen, yenmeyen ve kesinliği bilinmeyen 17 mantar türünde protokateģik asit, p-hidroksibenzoik asit, p-kumarik asit ve sinnamik asit gibi fenolik asitlerin analizini yapmıģlar ve Fistulina hepatica (Schaeff.) With., Tricholoma atrosquamosum Sacc., Hygrophorus agathosmus (Fr.) Fr. ve Suillus collinitus (Fr.) Kuntze gibi yenilebilir mantarlarda diğerlerine göre en yüksek fenolik

64 55 içeriğine sahip olduğunu belirlemiģlerdir. Palacios ve ark. (2011), yaptıkları çalıģmalarda 8 farklı yenilebilen mantar türünün HPLC metodu ile kaffeik asit, kateģin, klorogenik asit, p-kumarik asit, ferulik asit, gallik asit, gentisik asit, homogentisik asit, p-hidroksibenzoik asit, mirisetin, protokateģik asit ve pirogallol gibi fenolik bileģiklerinin analizini yapmıģlardır. Seçtikleri mantar türlerinde (Agaricus bisporus, Boletus edulis, Cantharellus cibarius Fr., Craterellus cornucopioides (L.) Pers., Calocybe gambosa (Fr.) Singer, Hygrophorus marzuolus (Fr.) Bres, Lactarius deliciosus (L.) Gray ve Pleurotus ostreatus) homogentisik asit oldukça fazla miktarlarda bulunmuģ, gallik asit ise mantarlarda bulunan fenolik asitlerin ikinci ana bileģeni olarak tespit edilmiģtir. ProtokateĢik asit ve p-hidroksibenzoik asit miktarları bütün mantar türleri arasında yaklaģık mg/g arasında bulunmuģtur. Yapılan analize göre protokateģik asit T.boudieri' de bulunmazken, p-hidroksibenzoik asit ve protokateģik asit ise T.anatolicum' da tespit edilmiģtir. Akyüz (2013) çalıģmasında Terfezia boudieri mantarının, myricetin, kaemferol, naringin, naringenin, rutin, kuersetin, kateģin, resveratrol, morin gibi fenolik bileģiklerinin analizini HPLC yöntemiyle incelemiģtir. HPLC analizine göre kateģin, quercetin ve rutin fenolik bileģiklerinin miktarları tespit edilememiģtir. Çizelge. 5.2.'de görüldüğü gibi T. boudieri'nin analizi sonucunda da rutin, kateģin ve kuarsetin gibi fenolik bileģiklerin miktarları bulunamamıģtır. Yenen mantarlardan olan Terfezia boudieri' nin fenolik bileģimi yapılan bazı çalıģmalarda belirlenmiģ olmasına rağmen Fomes fomentarius, Phellinus igniarius ve Tricholoma anatolicum' un fenolik bileģimlerinin analizi daha önce yapılmamıģtır. Seçilen fenolik bileģiklerden pek çoğununda (gallik asit, protokateģik asit, hidroksibenzoik asit, kateģin, kuarsetin, kumarin) meme kanseri gibi çeģitli kanser hücrelerine etki etmesi çalıģma açısından oldukça öneme sahiptir Sitotoksisite Testleri Sonuçları ve IC 50 Değerleri Mantarların su, metanol ve etanol ekstraktları kullanılarak MCF-7/S, kemoterapotik ilaç olan paklitaksel ve vinkristin ile uyarılmıģ MCF-7 hücre hatları olan MCF-7/Pac ve MCF-7/Vinc hücrelerinin sitotoksik etkileri belirlenmiģtir. MCF hücre hatlarına mantarlardan elde edilen toksik doz 6 mg/ml olarak belirlenmiģtir. Bu toksik değerin sağlıklı hücrelerde de aynı etkiyi yapıp yapmadığını belirlemek için Vero hücreleri kullanılarak sitotoksisite deneyi yapılmıģtır. Ġlk doz 6 mg/ml olarak yapılan testlerde mantar türlerinin Vero hücrelerine toksik etki

65 56 göstermediği belirlenmiģtir. Bu nedenle de diyet olarak kullanılan mantarların sağlıklı hücrelerde herhangi bir olumsuz etki göstermediği, sadece kanserli hücrelere etki ederek kanser hücrelerinin büyümesini durduğu ya da öldürdüğü söylenebilir. Mantar türlerinin kanser hücrelerine etki etmesi potansiyel olarak tedavi edici maddeler olarak kullanılmasını sağlayacaktır. Mantar ekstraktlarının IC 50 (mg/ml) (hücrelerin %50'sini öldüren toksik konsatrasyon) değerleri hesaplanmıģ ve her 4 mantarın da MCF-7/S hücre hattı üzerine toksik etki ettiği belirlenmiģtir (ġekil 5.6). MCF-7 hücreleri monolayer hücrelerdir ve geliģtikleri zaman hücreler uzamaya baģlarlar. Mantar ekstraktları hücrelere etki ettiği zaman hücrelerin Ģekilleri eliptik yapıdan yuvarlak hale dönmektedir (ġekil 5.7). MCF-7/S hücre hattında, sitotoksisite sonucunda mantar ekstraktlarının IC 50 değerlerinin 5.00 mg/ml' den az olması ekstraktların hücrelere etki ettiğini göstermektedir. Mantar türleri içerisinde MCF-7 hücre hatları üzerine en etkili olan mantarın Fomes fomentarius olduğu belirlenmiģtir. F. fomentarius'un IC 50 değerleri, su ekstraktında 0.76 mg/ml, metanol ekstraktında 0.35 mg/ml, etanol ekstraktında ise 1.08 mg/ml olarak hesaplanmıģtır. P.igniarius 'un etkili olan ekstraktı metanol ile yapılan ekstraktı olup IC 50 değeri 1.47 mg/ml olarak hesaplanmıģtır. T. boudieri ve T. anatolicum 'un etanol ekstraktlarının etki değerleri sırasıyla 1.90 mg/ml ve 2.22 mg/ml olarak bulunmuģtur (Çizelge 5.3) (ġekil 5.8). ġekil kuyucuklu plakada 1.kolon medium kontrol, 2. kolon hücre kontrol, kolon arası eģit miktarda hücre, medium ve yatay olarak azalan konsantrasyonlarda mantar ekstraktı, 72 saat sonucunda da XTT reaktifi ilave edilmiģ görüntü

66 ġekil 5.7. Mantar ekstraktlarının (ilk doz 6 mg/ml) 72 saatlik inkübasyon sonucunda MCF-7/S hücrelerine olan etkileri. (a) MCF-7/S hücre görüntüsü (b) F. fomentarius (c) P. igniarius (d) T. boudieri (e) T. anatolicum 57

67 58 Çizelge 5.3. Mantar ekstraktlarının MCF-7/S hücrelerindeki IC 50 değerleri MCF-7/S IC 50 (mg/ml) 1 2 Standart Ortalama hata (mg/ml) Su Phellinus Metanol igniarius Etanol Su Fomes fomentarius Metanol Etanol Su Terfezia boudieri Tricholoma anatolicum Metanol Etanol Su Metanol Etanol ġekil 5.8. P. igniarius, F. fomentarius, T. boudieri ve T. anatolicum 'un MCF-7/S hücre hattındaki IC 50 (mg/ml) değerleri MCF-7/S hücre hattı ile yapılan testte mantar ekstraktlarının IC 50 değerleri sonucunda hücreler üzerine en çok etkili olan ekstraktlar (5.00 mg/ml' den düģük) belirlendikten sonra MCF-7/Pac ve MCF-7/Vinc hücreleri ile sitotoksisite testi yapılmıģtır. Mantarların MCF-7/Vinc ile sitotoksisite deneyi sonucunda

68 59 mg/ml arasında değiģen IC 50 değerleri hesaplanmıģtır. MCF-7/Pac ile yapılan çalıģmada IC 50 değerleri mg/ml arasında tespit edilmiģtir. Bu sonuçlar seçilen mantar ekstraktlarının hücrelerin yarısının öldüğünü ya da kanser hücrelerinin büyümesini engellediğini göstermektedir (Çizelge 5.4) (ġekil 5.9). Çizelge 5.4. Mantar ekstraktlarının MCF-7/Pac ve MCF-7/Vinc hücrelerindeki IC 50 değerleri MCF-7/Pac (IC 50 (mg/ml)) ORTALAMA 1 2 Standart hata (mg/ml) Phellinus igniarius Metanol Fomes Su fomentarius Metanol Etanol Terfezia boudieri Etanol Tricholoma anatolicum Etanol MCF-7/Vinc (IC 50 (mg/ml)) ORTALAMA 1 2 Standart hata (mg/ml) Phellinus Metanol igniarius Fomes Su fomentarius Metanol Etanol Terfezia boudieri Etanol Tricholoma anatolicum Etanol ġekil 5.9. MCF-7 hücrelerine etkili olan mantar ekstraktlarının IC 50 değerleri ġekil 5.9 de görüldüğü gibi antikanser ilaçlara dirençli olan hücrelerde ektraktların antiproliferatif etkileri daha düģük seviyededir. Buradan da dirençli hücrelerin bu ektraklara karģı da direnç gösterdikleri söylenebilir.