Hüseyin Erdinç BEŞİKCİOĞLU YÜKSEK LİSANS TEZİ HİSTOLOJİ - EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1

2 CYCLOPHOSPHAMIDE İLE İNDÜKLENMİŞ OVARYUM HASARINDA KEMİK İLİĞİ KÖKENLİ MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERİN VE OVARIAN STROMAL KÖK HÜCRELERİN FOLLİKÜL MATURASYONUNDAKİ ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ Hüseyin Erdinç BEŞİKCİOĞLU YÜKSEK LİSANS TEZİ HİSTOLOJİ - EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ AĞUSTOS 2015

3 ... tarafından hazırlanan..... adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından OY BİRLİĞİ / OY ÇOKLUĞU ile Gazi Üniversitesi... Anabilim Dalında YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Unvanı Adı SOYADI Anabilim Dalı, Üniversite Adı Bu tezin, kapsam ve kalite olarak Yüksek Lisans Tezi olduğunu onaylıyorum/onaylamıyorum... Başkan : Unvanı Adı SOYADI Anabilim Dalı, Üniversite Adı Bu tezin, kapsam ve kalite olarak Yüksek Lisans Tezi olduğunu onaylıyorum/onaylamıyorum... Üye : Unvanı Adı SOYADI Anabilim Dalı, Üniversite Adı Bu tezin, kapsam ve kalite olarak Yüksek Lisans Tezi olduğunu onaylıyorum/onaylamıyorum... Tez Savunma Tarihi:.../. / Jüri tarafından kabul edilen bu tezin Yüksek Lisans Tezi olması için gerekli şartları yerine getirdiğini onaylıyorum. Doç. Dr. Ufuk KOCA ÇALIŞKAN Sağlık Bilimleri Enstitüsü Müdürü

4 ETİK BEYAN Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tez Yazım Kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; Tez içinde sunduğum verileri, bilgileri ve dokümanları akademik ve etik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, Tüm bilgi, belge, değerlendirme ve sonuçları bilimsel etik ve ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, Tez çalışmasında yararlandığım eserlerin tümüne uygun atıfta bulunarak kaynak gösterdiğimi, Kullanılan verilerde herhangi bir değişiklik yapmadığımı, Bu tezde sunduğum çalışmanın özgün olduğunu, bildirir, aksi bir durumda aleyhime doğabilecek tüm hak kayıplarını kabullendiğimi beyan ederim. Hüseyin Erdinç BEŞİKCİOĞLU 13/08/2015

5 iv CYCLOPHOSPHAMIDE İLE İNDÜKLENMİŞ OVARYUM HASARINDA KEMİK İLİĞİ KÖKENLİ MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERİN VE OVARIAN STROMAL KÖK HÜCRELERİN FOLLİKÜL MATURASYONUNDAKİ ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ (Yüksek Lisans Tezi) Hüseyin Erdinç BEŞİKCİOĞLU GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Ağustos 2015 ÖZET Kanser tedavisinin uzun süreli yan etkilerinden biri de gonadal disfonksiyondur. Kemoterapik ajanların gonadotoksik etkisiyle oluşan infertilite ve erken menapoz, genç kadın hastaların yaşam kalitesini önemli ölçüde etkilemektedir. Cyclophosphamide kanser tedavisinde kullanılan alkilleyici bir ajandır. Kök hücrelerin kendini yenileme özellikleri ve farklanma potansiyelleri infertilitede yeni tedavilerin geliştirilmesi açısından umut kaynağı olabilir Bu çalışmada kemoterapi ile indüklenmiş ovaryum hasarında kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücrelerin (KİKMKH) ve ovarian stromal kök hücrelerin (OSMKH) follikül maturasyonu üzerine etkileri histomorfolojik (H&E) ve moleküler (p34cdc2, BMP-6, BMP-15, connexin-43) düzeyde incelendi. 36 adet wistar albino cinsi dişi sıçan; 3 gruba ayrıldı. I. cyc grubu, II. cyc+kikmkh grubu ve III.cyc+OSKH grubu. Cyclophosphamide uygulaması histomorfolojik ve moleküler düzeyde hasar oluşturdu. Kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücre uygulaması bu hasarı kısmen önledi ancak ovaryum kökenli mezenkimal kök hücre grubu cyclophosphamide uygulamasından en az etkilenen gruptu. Bilim Kodu : 1033 Anahtar Kelimeler : Follikül maturasyonu, Siklofosfamid, KİKMKH, OSKH Sayfa Adedi : 109 Danışman : Prof. Dr. Candan ÖZOĞUL

6 v DETERMINATION OF THE EFFECTS ON FOLLICULAR MATURATION OF BONE MARROW DERIVED STEM CELLS AND OVARIAN STROMAL STEM CELLS ON CYCLOPHOSPHAMIDE INDUCED OVARIAN FAILURE (M. Sc. Thesis) Hüseyin Erdinç BEŞİKCİOĞLU GAZI UNIVERSITY INSTITUTE OF HEALTH SCIENCES August 2015 ABSTRACT One of the long term side effect of the cancer theraphy is gonadal dysfunction. Infertility and early menapause which were caused by the gonodotoxicity of the chemotherapotic agents, effect the quality of life of the young women. Cyclophosphamide is one of the alkylating agent used in cancer theraphy. The self-renewal and differentiation capacity of the stem cell may give hope for new therapies on infertility. In this study the effects of the Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) and Ovarian stromal stem cells (O-SSCs) on the chemotheraphy induced ovarian damage was evaluated by histomorphological (H&E) and molecular ( p34cdc2, BMP-6, BMP-15, connexin-43) methods. 36 Wistar albino rats divided into three groups. 1st Group is Cyclophosphamide administered group, 2nd group is Cyclophosphamide + Bone marrow-derived mesenchymal stem cell administered group, 3rd group is Cyclophosphamide + Ovarian stromal stem cell administered group. Cyclophosphamide administration caused histomorphological and molecular damages. Bone marrow derived mesenchymal stem cell administration partially prevented this damage, but Ovarian stromal stem cell administered group was the group which effected at least by cyclophosphamide. Science Code : 1033 Key Words : Follicle maturation, Cyclophosphamide, BMMSCs, OSSCs Page Number : 109 Advisor : Prof. Dr. Candan ÖZOĞUL

7 vi TEŞEKKÜR Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Başkanımız ve Danışmanım Sayın Prof. Dr. Candan ÖZOĞUL a yüksek lisans öğrenimim süresince hoşgörüsü ve desteği ile her zaman yanımda olduğu için ve yedi gün yirmi dört saat sabırla bana yardımcı olduğu için sonsuz teşekkürler. Anabilim dalımızda görev yapan saygı değer hocalarım Prof. Dr. Deniz ERDOĞAN, Prof. Dr. Celal ILGAZ, Prof. Dr. Suna ÖMEROĞLU, Prof. Dr. Çiğdem Elmas, Prof. Dr. Gülnur Take Kaplanoğlu na, Uzm. Dr. Seda Nur AKYOL a, başta herzaman yardımıma koşan Sayın Arş. Gör. Gülistan Sanem SARIBAŞ olmak üzere tüm araştırma görevlisi arkadaşlarıma ve Teknisyen Recep ORHAN a yürekten teşekkürler. Tez çalışmam sırasında yardımlarını esirgemeyen Uzm. Dr. Ferda Alpaslan PINARLI, Uzm. Bio. Meral TİRYAKİ ve Yıldırım Beyazıt Dışkapı Eğitim Araştırma Hastanesi Kök Hücre ve Genetik Tanı Merkezi çalışanlarına çok teşekkürler. Son olarak arkadaşlarıma, her zaman desteğini hissettiğim aileme ve dünyanın daha güzel bir yer olmasını sağlayan sevgili eşim Burcu Çimen BEŞİKCİOĞLU na sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

8 vii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... ABSTRACT... TEŞEKKÜR... İÇİNDEKİLER... ÇİZELGELERİN LİSTESİ... ŞEKİLLERİN LİSTESİ... RESİMLERİN LİSTESİ... SİMGELER VE KISALTMALAR... iv v vi vii ix x xi xii 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Ovaryum Gelişimi Ovaryum Histolojisi Ovaryum Fizyolojisi Kanser Tedavisi ve Ovaryuma Etkileri İnfertilitede Kök Hücre Kullanımı Anti-Müllerian Hormon (AMH) p34cdc2 (CDK1) Follikül Maturasyon Faktörleri GEREÇ VE YÖNTEM Deney Hayvanları ve Gruplandırma KİKMKH eldesi OSKH eldesi Mezenkimal kök hücre adiposit farklilaştirma metodu... 31

9 viii Sayfa Mezenkimal kök hücre osteosit farklilaştirma metodu Mezenkimal kök hücre kondrosit farklilaştirma metodu Kök hücrelerin BrdU ile etiketlenmesi Işik Mikroskobik Takip Prosedürü İmmunohistokimyasal Prosedür AMH Prosedürü İstatistiksel Prosedür BULGULAR Brdu Etiketli Kök Hücrelerin Yerleşimi Ağirliklarin İstatistiksel Olarak Değerlendirilmesi AMH Bulguları Histomorfolojik Bulgular p34cdc2 Bulguları Connexin-43 Bulguları BMP-6 Bulguları BMP-15 Bulguları TARTIŞMA SONUÇ ve ÖNERİLER KAYNAKLAR EKLER EK-1. Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu Kararı EK-2 Deney Hayvanları Uygulama ve Etik Kursu Katılım Sertifikası ÖZGEÇMİŞ

10 ix ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Çizelge 2.1. KİKMKH'ler tarafından ifadelenen hücre yüzey belirteçleri... Çizelge 4.1 Gruplara ait AMH seviyeleri ortalama ve ortanca değerleri... Sayfa 17 37

11 x ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Şekil 2.1.Ovaryum enine kesitinin şematik gösterimi... Şekil 2.2. MKH'nin klinik kullanımında izlenen yöntemler... Şekil 4.1.Gruplara ait pre ve post-opere ağırlık farkı ortalamaları... Sayfa

12 xi RESİMLERİN LİSTESİ Resim Resim 4.1. Grup I - BrdU İşaretli kök hücrelerin lokalizasyonu X Resim 4.2. Grup II BrdU İşaretli kök hücrelerin lokalizasyonu X Resim 4.3. Grup III - BrdU İşaretli kök hücrelerin lokalizasyonu X200 - X Resim 4.4. Grup I H&E Boyama X Resim 4.5. Grup II H&E Boyama X Resim 4.6. Grup III H&E Boyama X Resim 4.7. Grup I p34cdc2 Tutulumu X Resim 4.8. Grup II p34cdc2 Tutulmu X400 - X Resim 4.9. Grup III p34cdc2 Tutulumu X Sayfa Resim Grup I Negatif connexin-43 Tutulumu X Resim Grup I Connexin-43 Tutulumu X Resim Grup II Negatif connexin-43 Tutulumu X Resim Grup II Connexin-43 Tutulumu X Resim Grup III Connexin-43 Tutulumu X Resim Grup I Negatif BMP-6 Tutulumu-1 X Resim Grup I Negatif BMP-6 Tutulumu-2 X Resim Grup II BMP-6 Tutulumu-1 X Resim Grup II BMP-6 Tutulumu-2 X Resim Grup III BMP-6 Tutulumu X Resim Grup I BMP-15 Tutulumu X100 - X Resim Grup II BMP-15 Tutulumu X100 - X Resim Grup III BMP-15 Tutulumu X

13 xii SİMGELER VE KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Simgeler Açıklama C Santigrat cm Santimetre dk Dakika g Gram kd Kilodalton mg/kg Miligram / kilogram ml Mililitre mm Milimetre mmol/l Milimol / litre ng/ml Nanogram / mililitre rpm Bir dakidaki dönüş μm Mikrometre Kısaltmalar Açıklama AMH Anti-müllerian hormon BMP Kemik morfogenik protein BMP-RII Kemik morfogenik protein reseptörü 2 CDK Siklin bağımlı kinaz CFU-F Koloni şekillendirici birim fibroblast CYC Cyclophosphamide DAB Diaminobenzedin substratı DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium ecg At koryonik gonadotropin ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FSH Follikül uyarıcı hormon GDF Büyüme ve farklılaştırma faktörü GnRH Gonadotropin serbestleştirici hormon GnRHa Gonadotropin serbestleştirici hormon agonisti H&E Hematoksilen eozin

14 xiii hcg İnsan koryonik gonadotropin HGF Hepatosit büyüme faktörü HSD 3β- hidroksisteroid dehidrojenaz IDS DNA-bağlanma proteinleri inhibitörlerinin IGF-1 İnsülin benzeri büyüme faktörü - 1 IP İntra-peritoneal ISCT International society of cellular therapy KİKMKH Kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücre LH Lüteinleştirici hormon MAPK Mitojen aktifleştirilmiş protein kinaz MIS Müllerian inhibe edici madde MKH Mezenkimal kök hücre MPF Olgunlaşmayı ilerletici faktör MSC Multipotent mezenkimal stromal hücre MTX Methotrexate OKH Ovaryum kök hücresi OMI Oosit maturasyon inhibitörü OSKH Ovarian stromal kök hücre PAS Periyodik asit shiff PCNA Proliferatif hücre çekirdek antijeni PCR Polimeraz zincir reaksiyonu POF Prematür ovarian yetmezlik QPCR Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu RT-PCR Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu S1P Sfingozin 1 fosfat SRY Sex-determining region on Y StAR Sterodijenik akut düzenleyici protein TGF-β Transforme edici büyüme faktörü -β VEGF Vasküler endotelyal büyüme faktörü

15

16 1 1. GİRİŞ Dünya Sağlık Örgütü Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı'nın yayınladığı GLOBOCAN-2012 verilerine göre; 2012 yılında dünyada 14,1 milyon yeni kanser vakası olduğu ve 8,2 milyon kansere bağlı ölüm gerçekleştiği rapor edilmiştir. Kemoterapi stratejilerinin geliştirilmesi, görüntüleme tekniklerinin ilerlemesi ve erken teşhis çoğu kanser türü için sağ kalım oranını önemli ölçüde yükseltmektedir [1, 2]. Ne yazık ki hastalarda, kanser tedavisinin (cerrahi müdaheleler, radyoterapi ve kemoterapi) ciddi yan etkileri ile karşılaşılmaktadır. Ovaryum hasarı radyoterapi yada kemoterapi sırasında, tedavinin tamamlanmasından kısa süre sonra veya yıllar sonra meydana gelebillir. Tedavinin ovaryum dokusuna verdiği hasar gonadal fonksiyonda geçici yada kalıcı bozukluklar oluşturmaktadır. Prematür over yetmezliği yada erken menopoz, kanser tedavisi sonrası düzenli menstrual siklusları takiben 40 yaşından daha önce ovaryum fonksiyonunun kaybıyla kendini gösterir [3-5]. Turan V. ve Oktay K yılında kemoterapi alan hastalarda kanser tedavisinin uzun süreli yan etkileri olarak gonadal fonksiyonda geçici yada kalıcı bozukluklarla karşılaşıldığını, gonadotoksisitenin erken menopoz ve infertiliteye neden olarak yaşam kalitesini düşürdüğünü rapor etmişlerdir [2]. Follikül gelişimi devam ederken oosit immature follikül içinde mayoz bölünme safhasında tutulmaktadır. Kemoterapatik ilaçlar mitotik hücrelerde etkili olmak üzere tasarlandığı için, öncelikli hedeflerinin ovarian siklus sırasında yüksek proliferasyon gösteren hücreler (granüloza hücreleri gibi) olabileceği düşünülmektedir [6]. Kanser tedavisi gören hastaların yaşam kalitesinin artırılabilmesi ve tedavi sonrası fertilitenin kazanılabilmesi için kullanılan; tedaviye başlanmadan önce embriyo ve oosit dondurma işlemleri standart tekniklerdir. Fakat, bu iki teknik için de gerekli olan 2 haftalık ovarian stimulasyon ve yüksek seviyede östrodiol uygulaması göğüs kanseri gibi hormon bağımlı tümörlerde kontrendikasyona neden olmaktadır. Ovaryum dokusunun dondurulması ise iskemiye bağlı follikül kaybı ve kanserli hücrelerin tekrar nakledilmesi riski nedeniyle halen deneysel bir teknik olarak görülmektedir. Bu tekniklere alternatif

17 2 olarak, anti-oksidan tedavisi, GnRHa uygulamaları ve kök hücre uygulamaları gibi farklı tekniklerin, kullanılabilirliği hakkındaki araştırmaların sayısı gün geçtikçe artmaktadır [2, 7-9]. Mezenkimal kök hücreler (MKH), kemik, kıkırdak, kas, ligament, tendon ve yağ doku gibi mezenkimal dokulara farklanabilen ve bu dokuların yenilenmesine katkıda bulunabilen hematopoetik olmayan stromal hücrelerdir. Günümüzde mezenkimal kök hücreler birçok memeli türünde yetişkin, fetüs ve yenidoğana ait çeşitli doku ve organlardan elde edilebilir. Kemik iliği aspiratlarında 1/ / oranda bulunan mezenkimal kök hücreler yoğunluk gradient santrifügasyon yöntemi ile elde edilebilmektedir. İlk ayrıştırılan mezenkimal kök hücre olarak kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreler (KİKMKH), hakkında oldukça fazla bilgiye sahip olunması ve klinik alanda yaygın olarak kullanılması nedeniyle üzerinde en çok araştırma yapılan ve klinik olarak en çok denenen hücrelerdir. Klinikte kullanımları henüz yeni sayılsada, farklı hayvan türlerinde gerçekleştirilmiş çok sayıda deney MKH'lerin otolog ve allojenik olarak birçok hastalığın tedavisinde kullanılabilir olduğu konusunda umut vericidir. MKH istenen doku tipine farklılaştırılarak yada yeterli hücre sayısına ulaşıldığında farklılaştırımadan hasta ağırlığına göre kg başına 1-2 milyon hücre olarak vücuda verilebilir [10]. Embriyonik gelişim sırasında ovaryuma göç eden ve kölom epiteli içerisinde çoğalan primordial germ hücreleri ovaryum kök hücreleri (OKH) olarak kabul edilmektedir. Bu hücreler hormonların ve ait oldukları nişteki immün sistem kökenli hücrelerin etkisiyle oogonyumların kökenini oluştururlar. Fötal dönemde OKH'leri geçirdikleri değişikliklerle oogoniumların ve granüloza hücrelerini oluşturur. Yenidoğanlarda ise ileri farklanan OKH'ler fibroblast benzeri hücrelere dönüşerek tunika albugineanın oluşumuna katılırlar. Erişkin dönemdeki OKH'lerinin karşılığı olan bu hücreler in-vitro ortamda yeni hücrelere farklılaşabilirler.

18 3 Ovaryum gelişimi sırasında, ovaryumun yüzey epitelindeki hücreler kriptalar yada hücre kordonları şeklinde kortekse doğru girintiler yapar. Bu hücre kordonları primordial folliküllerin yakınında parçalara ayrılarak nişler oluşturur. Bu hücreler OKH ile benzer özellikler göstermektedir. Bukovsky ve arkadaşlarının çalışmaları kriptalarda bulunan ve embriyodaki yapısını kısmen koruyan bu epitel hücrelerinin granüloza hücrelerine kaynak oluşturduğunu belirtmektedir. Yine aynı grubun çalışmaları tunika albugineada bulunan hücrelerin erişkin ovaryumunda mezenkim-epitel geçişiyle epitel benzeri OKH'lere dönüştüğünü göstermektedir. Yakın zamanda yayınlanan çalışmalar fötal dönemde ortaya çıkan OKH'lerin erişkin dönemde yeni oosit ve granüloza hücrelerine dönüşebileceği konusunda bilgiler vermektedir. Bu yeni görüşe göre fötal dönemde oluşan ve epitel-mezenkim geçişi ile mezenkim benzeri hücrelere dönüşerek tunika albuginea içerisine yerleşen OKH'leri pubertede başlayan üreme dönemiyle birlikte mezenkim-epitel geçişiyle tekrar OKH'lere dönüşürler. Bu OKH'ler hem granüloza hücrelerini hemde yeni germ hücrelerini oluştururlar. Oluşan bu germ hücreleri granüloza hücreleri arasından geçerek damar içine girer ve beraberindeki yeni granüloza hücreleri ile birlikte korteksin derinliklerine ilerler. Korteksin derinliklerine ulaşan bu hücreler damar üzerinde cepler oluşturur ve dolaşımdaki granüloza hücreleri ile birlikte yeni primordial follikülleri şekillendirir [11-15]. Farklı kaynaklardan elde edilen kök hücrelerin transplantasyonu sonrası kemoterapi ile oluşturulmuş hasarlı ovaryum dokusunda meydana gelen değişiklikleri inceleyen araştırmaların sayısı gün geçtikçe artmaktadır. Bu çalışmada ise pubertede cyclophosphamide ile indüklenmiş ovaryum hasarına karşı kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücre (KİKMKH) ve ovarian stromal kök hücrelerin (OSKH) ovaryum dokusu ve follikül gelişimi üzerine olası koruyucu etkileri incelenmiştir. Bu amaçla cyclophosphamide uygulamasıyla birlikte IP olarak verilen KİKMKH ve OSKH uygulamasının, follikül maturasyonu için önemli olan Connexin- 43, BMP-6, BMP- 15 ve p34cdc2 moleküllerinin dağılımı immünohistokimyasal olarak incelenmiştir. Ayrıca follikül rezervinin belirteci olarak kliniktede kullanılan serum anti-müllerian hormon değerleri ELISA yöntemiyle ölçülerek değerlendirilmiştir.

19 4 Bu çalışma sonucunda kemoterapinin neden olduğu gonadotoksik etkiye karşı farklı kaynaklardan elde edilen kök hücrelerin etkilerini ve bu hücrelerin davranış özelliklerini belirlemek literatüre katkı sağlamayı hedeflenmiştir. Ayrıca bu çalışmanın, kemoterapi uygulamasından önce hastalardan alınan oosit, embriyo ve ovaryum doku örneğinin dondurulması gibi pahallı ve birçok farklı dezavantajları olan işlemlere alternatif bir yöntemin geliştirilmesine katkıda bulunacağı düşünülmüştür.

20 5 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Ovaryum Gelişimi Kromozomal cinsiyetin fertilizasyon sırasında belirlenmiş olmasına rağmen; karın arka duvarını örten mezodermal epitel, altta uzanan mezenşim ve primordiyal germ hücrelerinden gelişen gonadlar gelişimin 7. haftasına kadar erkeğe veya dişiye ait morfolojik özelliklere sahip değildirler. Y kromozomunun kısa kolu üzerinde Yp11.32 de bulunan SRY (sex-determining region on Y) geninin varlığı, fetusun cinsiyetinin erkek; yokluğu, dişilik yönünde gelişmesine neden olmaktadır [16-18]. Gonadlar, gelişimin 5. haftası sırasında mezonefrozun medial tarafında kölom epitelinin proliferasyonu ve altındaki mezenşimin yoğunlaşmasıyla bir çift uzunlamasına genital veya gonadal sırt halinde ortaya çıkarlar. Germ hücreleri gelişimin 6. haftasına kadar genital sırtlar içinde bulunmaz. Genital sırttaki kölom epiteli hücreleri, primordiyal germ hücreler primitif gonadlara ulaşmadan önce ve ulaştıkları sırada, prolifere olarak altlarındaki mezenşimin içine gömülürler ve primitif cinsiyet kordonları denilen düzensiz kordonları oluştururlar. Farklanmamış gonad olarak adlandırılan bu evrede gonadlar erkek veya dişi gonad olarak ayırt edilemez [17, 18]. Epiblasttan köken alan primordiyal germ hücreleri, primitif çizgi boyunca göç ederek 3. haftada vitellus kesesinin allantoise yakın duvarındaki endoderm hücrelerinin arasına yerleşirler. Dördüncü haftada son bağırsağın dorsal mezenteri boyunca ameboid hareketlerle ilerleyerek 5. haftanın başında primitif gonadlara ulaşırlar. 6. haftada gonadal kordonlara (primitif cinsiyet kordonları) katılırlar [17, 18]. XX cinsiyet kromozomu taşıyan embriyolarda primitif cinsiyet kordonları, primitif germ hücresi grupları içeren düzensiz hücre kümelerine ayrılır. Çoğunlukla ovaryumun medullar bölgesinde yerleşmiş olan bu kümeler zamanla kaybolarak yerini ovarian medullaya bırakırlar. 7. haftada dişi gonadın yüzey epiteli prolifere olmaya devam ederek alttaki mezenşime doğru ilerler ve kortikal kordonları oluştururlar. Yüzeye yakın yerleşim gösteren bu kordonlar 4. ayda izole hücre kümlerine ayrılırlar. Prolifere olmaya devam eden bu hücreler her bir primordial germ hücresini (oogonium) tek sıra halinde dizilerek çevreler [18].

21 6 Genetik olarak dişi gonada ulaşan primordiyal germ hücreleri, oogoniumlara farklanırlar. Mitoz bölünme ile çoğalan oogoniumlar 3. ayın sonunda yassı epitel hücreleri ile çevrelenir ve kümeler oluştururlar. Bu kümelerin içerisindeki oogoniumlar, muhtemelen ovaryumun yüzey epitelinden köken alan ve follikül hücreleri olarak bilinen hücrelerden oluşurlar. Oogoniumlar mitoz bölünme gerçekleştirirken, bir kısmı mayoz bölünmeye başlar ve 1. mayoz bölünmenin profaz aşamasında bölünmeyi durdurarak primer oosite dönüşürler. Ovaryum içindeki germ hücresi sayısı 5. ayda 7 milyon civarına ulaşır. Bu sırada başlayan hücre ölümüyle birlikte çok sayıda oogonium ve primer oosit atreziye uğrar. Atreziye uğramayan primer oositler, birinci mayoz bölünmenin profaz evresine girer ve yassı folliküler epitel hücreleriyle sarılırlar. Bir primer oosit ve etrafındaki yassı follikül hücrelerinden oluşan bu yapıya primordial follikül denir. Yenidoğan ovaryumunda tümü birinci mayoz bölünmenin profaz evresini tamamlamış yaklaşık 2 milyon primer oosit bulunur. Puberteye ulaşıldığında bu sayı 40000'e kadar geriler. Primer oosit 1. mayoz bölünmeyi ovulasyondan hemen önce tamamlar. 1. mayoz bölünmenin sonunda oluşan sekonder oosit 2. mayoz bölünmeye girer. Ancak bir sperm tarafından dölleninceye kadar, 2. mayoz bölünmenin metafaz evresinde kalır. Puberteye ulaşıldığında civarında olan primer oositlerin sadece yaklaşık 400 tanesi olgunlaşır ve ovulasyonla atılır [17, 18] Ovaryum Histolojisi Ekzokrin ve endokrin salgı üreten, 4 cm uzunluğunda, 2 cm genişliğinde ve 1 cm kalınlığında, badem şeklinde bir çift bez olan ovaryumların serbest yüzü gençlerde tek katlı yassı, erişkinlerde tek katlı kübik epitel olan germinal epitel (epithelium superficialegerminativum) ile kaplıdır. Germinal epitel olarak bilinen bu katman, mesovarium'u kaplayan mezotel ile devam eder. Germinal epitel tabakasının altında kan damarlarından yoksun düzensiz sıkı bağ dokudan oluşan tunica albuginea tabakası bulunur. Bu tabaka ovaryuma açık renkli bir görünüm verir. Ovaryum aralarında kesin bir sınır bulunmayan korteks ve medulla bölgelerinden oluşur. Korteks medullanın etrafını sarar ve tunica albuginea'nın hemen altında bulunur. İğ şekilli bağ dokusu hücreleri, kollagen lifler, elastik lifler ve retiküler lif ağlarından oluşan stroma ve bu stroma içerisine gömülü farklı gelişim evrelerinde çok sayıda follikülden oluşur. Korteks, stromasında düz kas lifleri de görülmektedir. Ovaryumun merkezinde bulunan medulla ise; kan damarları, lenf

22 7 damarları, sinir demetleri, hilum'a yakın bölgelerde düz kas hücreleri ve bunların etrafını saran gevşek bağ dokudan oluşmaktadır [19-22]. Ovaryum follikülleri bir primer oosit ve onun etrafını saracak şekilde tek katlı yada çok katlı folliküler hücrelerden oluşur ve korteks stroması içerisinde yer alır [22]. Gelişim evresine göre ovaryum follikülleri histolojik olarak; primordial folliküller, gelişmekte olan folliküller ve olgun (Graaf) folliküller olmak üzere üç gruba ayrılır. Gelişmekte olan folliküller ise kendi içinde; unilaminar primer follikül, multilaminar primer follikül ve sekonder (antral) follikül olmak üzere üçe ayrılır [21]. Şekil 2.1. Bir ovaryum kesitinin şematik çizimi [21] Merkezde bir primer oosit ve onun etrafını saran tek sıra yassı follikül hücrelerinden oluşan primordial folliküller, ovaryum korteksinin en dış katmanında tunica albuginea'nın hemen altında yer alırlar. Büyük ökromatik yapıda ve eksantrik bir çekirdeğe sahip olan oosit yaklaşık μm büyüklüğündedir. Follikül hücreleri etrafını saran bazal lamina ile stromadan ayrılır. Organeller çekirdeğe yakın yerleşim gösterme eğilimindedirler. Organel açısından zengin olan oosit elektron mikroskobik olarak incelendiğinde bol miktarda Golgi

23 8 kompleksi, endoplazmik retikulum, mitokondriyon, lizozom ve annuler lameller içerdiği görülmektedir. Bu organeller sitoplazmada yoğunlaşarak Balbiani Cisimciği adı verilen yapıları oluşturmaktadır. Fötal ovaryumda gelişen primordial folliküller, menarşa kadar bir dinlenme evresine girerler. Puberteyle birlikte her ovarian siklusta yaklaşık adet primordial follikül gelişim evresine girer [20-24]. Primer oosit, folliküler hücreler ve stromal dokudaki değişiklikler primordial folliküllerin primer folliküllere gelişmesine neden olur. Germinal vezikül olarak da adlandırılan büyük bir çekirdeğe sahip olan primer oositin boyutları μm ye ulaşır. Granüllü endoplazmik retikulum ve ribozom açısından zenginleşir, serbest ribozom miktarı artar, birkaç Golgi kompleksi ve çok sayıda mitokondri oosit içerisinde dağınık şekilde yerleşim gösterir. Follikül hücreleri tek katlı yassıdan kübik hücrelere dönüşür ve unilaminer primer follikülü oluşturur. Büyük bir hızla prolifere olan follikül hücreleri çok katlı bir yapı oluşturur ve multilaminer primer follikül yada preantral follikül adını alır. Primer oosit tarafından üretilen bir sinyal molekülü olan aktivin granüloza hücrelerinin proliferatif aktivitesinden sorumludur. Çok katlı folliküler hücrelerden oluşan bu tabaka granüloza tabakası (st. granulosum) ve folliküler hücrelerde granüloza hücreleri olarak adlandırılır. Oluklu bağlantıların (gap junction) rolü follikül gelişiminde çok önemlidir. Besin ve küçük haberci makromoleküllerin taşınması oosit ve follikül için hayati rol oynamaktadır. Sitoplazmik uzantılar gönderen follikül hücreleri oositin mikrovilluslarıyla temas ederek oluklu bağlantılar oluştururlar. Oosit ve granüloza hücreleri arasındaki besin ve sinyal moleküllerinin geçişi bu sayede sağlanır. Gelişen oosit ekstraselüler bir kılıf olan ve oosit ile oositle bağlantı kuran folliküler hücreler arasında yer alan zona pellusida'yı oluşturmak için gerekli olan sülfatlı, asidik zona pellusida proteinlerini (ZP1, ZP2, ZP3 ve ZP4) salgılar. Önemli bir görev üstlenen ZP3 spermatozoa'nın bağlanabilmesi için reseptör işlevi görür ve ZP4 ile birlikte akrozom reaksiyonunu indükler. ZP2'nin sekonder SBP (sperm binding protein) olduğu düşünülmektedir. ZP1'in işlevi henüz tam olarak aydınlatılamamış olsa da zona pellusidanın bütünlüğünü sağlamak için ZP2 ve ZP3 heterodimerleri arasında çapraz bağlar oluşturduğu düşünülmektedir [20-22]. Multilaminar primer follikül etrafındaki stromal hücreler, yüksek oranda vaskülarizasyon gösteren iç katman olan teka interna ve daha çok fibröz bağ dokudan oluşan dış katman teka eksterna'yı oluşturmak üzere follikülün etrafını sararak teka follikülünü oluşturur. Steroid üreten hücrelerin karakteristik özelliklerini (bol miktarda lipid damlacıkları ve düz

24 9 endoplazmik retikulum) taşıyan teka interna hücreleri çok sayıda lüteinleştirici hormon (LH) reseptörü taşır. Teka interna hücreleri aynı zamanda östrojen öncüsü olan androjenlerin üretiminden ve salgılanmasından da sorumludur. Teka interna salgı yapan hücrelerine ek olarak; fibroblastlar, kollagen demetler ve zengin kapiller ağı içerir. Teka eksterna ise bağ doku hücreleri, düz kas hücreleri ve kollagen lif demetlerinden oluşmaktadır. Teka interna hücreleri ile granüloza hücreleri arasında kalın bazal lamina bulunmaktadır [20-22]. Multilaminar primer follikülün granüloza tabakasının kalınlığı 6-12 hücre katmanı olacak şekilde, boyutu yaklaşık 200μm ye ulaşıncaya kadar büyümeye devam eder. Granüloza hücreleri arasında birkaç boşluk oluşur ve bu boşluklar follikül sıvısı adı verilen sıvı ile dolmaya başlar. Bu sıvı progesteron,inhibin, follistatin, aktivin gibi hormonlar ile granüloza hücreleri tarafından salınan, glikozaminoglikanlar, proteoglikanlar ve steroid bağlayıcı proteinler içerir. Bu boşluklar büyüyerek birbirine doğru yaklaşır ve nihayet antrum adı verilen hilal şekilli yapı oluşur. Multilaminer primer follikül içinde follikül sıvısı görülmeye başlandığında sekonder follikül olarak adlandırılır. Erken sekonder follikül evresinde follikül çapı 0,2 mm civarında iken, olgun follikül evresinde 10 mm ye ulaşır. Bu aşamada eksantrik yerleşimli primer oositin büyüklüğü de 125 μm 'ye ulaşır ve oositin büyümesi baskılanır. Oositin büyümesi granüloza hücreleri tarafından antral sıvıya salınan küçük bir peptit olan Oosit Maturasyon İnhibitörü (OMI) tarafından durdurulur. Sekonder follikül boyutu ile OMI arasında negatif bir ilişki vardır. Küçük folliküllerde OMI miktarı en yüksekken, büyük folliküllerde en düşük seviyededir. Follikül gelişimiyle birlikte genişleyen antrumun çevresinde yerleşmiş olan granüloza hücre katmanı tüm follikül duvarında eşit kalınlıktadır. Ancak eksantrik yerleşim gösteren oosit ile bağlantılı kutupta, oosit çevresinde daha yoğun bir şekilde biriken granüloza hücreleri antruma doğru uzanarak kumulus ooforus denilen bir hücre katmanı oluştururlar. Kumulus ooforus hücreleri oositin etrafını sararlar ve ovulasyonda oosit ile birlikte atılırlar. Oositin etrafını çeviren en içteki kumulus hücre katmanının oluşturduğu yapıya korona radiata adı verilir. Korona radiata hücrelerinin mikrovillusları zona pellusida içinden geçerek oositin mikrovillusları ile oluklu bağlantılar kurarlar. Follikül gelişimi sırasında, granüloza hücreleri yüzeyindeki mikrovillus sayısı antral yüzdeki LH reseptörü sayısı ile doğru orantılıdr. Granüloza hücreleri tarafından salınan hiyalüran ve proteoglikanlardan oluşan ve Call-Exner Cisimciği adı verilen, yoğun olarak PAS

25 10 (Periyodik Asit Shiff) pozitif boyanan cisimcikler de granüloza hücreleri arasında görülebilir [21, 22]. Boyutları 20 mm büyüklüğe ulaşabilen olgun folliküller, ovaryum korteksi ile aynı kalınlığa ulaşabilir. Olgun follikül maksimum büyüklüğe ulaşınca granüloza hücrelerinin mitotik aktivitesi azalır ve antrumun hacmi artar. Granüloza tabakası incelir. Follikül duvarından ayrılan kumulus ooforus, antrumda follikül sıvısı içerisinde serbest halde yüzer duruma geçer. Bu sırada maturasyonunu tamamlayan oosit I. Mayoz bölünmeyi tamamlar. Oluşan sekonder oosit ovaryumdan atılmaya hazır duruma gelir. Steroid sentezleyen hücrelerin genel görünümüne benzeyen teka interna hücrelerinin sitoplazmasında yağ damlacıkları görülmeye başlar. LH tarafından uyarılan teka interna hücreleri androjen salgılar. Granüloza hücrelerinin düz endoplazmik retikulumuna taşınan androjenler, FSH ın etkisi ve aromataz enzimi katalizörlüğüyle östrojene çevrilir [20-23, 25]. Ovaryum korteksinde gelişimin her evresinde atreziye uğrayan folliküller bulunur. Yalnızca bir follikül olgunlaşmayı tamamlarken (dominant follikül), olgunlaşmayacak olan folliküller atreziye uğrar. Atrezi sırasında ilk olarak oosit, onu takiben de granüloza hücreleri dejenere olurlar. Granüloza hücrelerinde apoptozis başlamadan önce mitoz durur, granüloza hücreleri bazal laminadan ayrılır ve oosit dejenere olur. Granüloza hücreleri endonükleazların ve bazı hidrolitik enzimlerin üretimine başlar. Granüloza tabakası nötrofiller ve makrofajlar tarafından istila edilir. Oluşan apoptotik cisimcikler fagosite edilirler. Teka interna hücreleri hipertrofiye uğrar ve follikül boşluğu bağ doku ile dolar. Teka hücreleri ve granüloza hücreleri arasındaki bazal membranın kalınlığı artar ve camsı membran olarak adlandırılan dalgalı hyalinize bir bant oluşturabilir. Parçalanan zona pellusida makrofajlar tarafından fagosite edilir [20-23, 25]. Olgun follikülün yırtılarak sekonder oositin, tuba uterinanın fimbriyalarının yakınında periton boşluğuna atılma işlemine ovulasyon denir. 28 günlük menstrual siklusun 14. gününde olaylanan ovulasyon, gelişmekte olan folliküllerden salınan dolaşımdaki yüksek östrojen seviyesine yanıt olarak, hipofizin anterior lobundan salınan LH seviyesindeki ani artışın etkisiyle başlar. Bu artış follikülde progesteron ve prostoglandinlerin sentezini uyarır. Proteolitik enzimlerin aktive olmasıyla birlikte follikül duvarı yırtılır ve kumulus

26 11 hücreleri ile sekonder oosit periton boşluğuna atılır. Tuba uterina içerisinde uterusa doğru ilerleyen sekonder oosit spermiyum tarafından döllenirse (fertilizasyon), II. mayoz bölünme tamamlanır ve zigot oluşur. Eğer fertilizasyon gerçekleşmezse sekonder oosit saat içinde dejenere olur. Normalde insanda her döngüde bir oosit serbest bırakılır, fakat bazen hiç oosit atılmayabilir yada birden fazla oosit serbest bırakılabilir [19-23]. Ovulasyondan sonra follikülden geriye kalan granüloza ve teka interna hücreleri, ovaryum korteksinde korpus luteum (sarı cisim) adı verilen geçici bir iç salgı bezi oluşturur. Ovulasyon sonrası follikül içerisindeki iç basınç düşmesi ile birlikte teka internadaki kapillerlerden sızan kan follikül içine dolar ve pıhtılaşarak korpus (kırmızı cisim) oluşturur. Daha sonra bu kan pıhtısının yerini alan bağ dokusu ve kan pıhtısı artıkları korpus luteumun iç kısmını oluşturur. Korpus luteumun merkezinde yerleşim gösteren ve yaklaşık %80 ini oluşturan granüloza hücreleri yaklaşık 30-50μm büyüklüğe ulaşırlar. Mikrovillusları uzar ve steroid sentezlemek için gerekli olan düz endoplazmik retikulum, granüllü endoplazmik retikulum, mitokondri gibi organellerinin sayısı artar. Stoplazmalarında dağınık halde lipid damlacıkları da görülen bu hücreler granüloza lutein hücreleri adını alır. Granüloza lutein hücreleri progesteron üretiminden ve teka-lutein hücreleri tarafından üretilen androjenlerin östrojene dönüştürülmesinden sorumludur. Korpus luteumun periferinde yerleşim gösteren ve luteal hücrelerin yaklaşık %20 sini oluşturan teka interna hücreleri hormon üretimi için modifiye olarak teka lutein hücreleri adını alırlar. Teka lutein hücreleri az miktada östrojen, androjen ve progesteron üretiminden sorumludurlar. Eğer döllenme gerçekleşirse korpus luteum hücreleri büyüyerek gebelik korpus luteumunu (korpus luteum pregnansi) oluşturur. Gebeliğin aylarına kadar işlev gören korpus luteum pregnansi daha sonra görevini plasentaya devreder. Eğer döllenme gerçekleşmezse korpus luteum 14 gün aktif kalan menstruasyon korpus luteumu olarak isimlendirilir. Daha sonra hücreler küçülür, damarlanma azalır, bağ dokusunda hyalinizasyon gelişir ve korpus albikans olarak adlandırılan beyaz skar dokusu oluşur [19-23, 25] Ovaryum Fizyolojisi Ovaryum fonksiyonları üç merkezin kontrolü altındadır. Bu kontrol hipotalamustan GnRH salınımı, hipofiz bezinin anterior lobunun pars distalisinden salınan gonadotropinler (FSH

27 12 ve LH) ve ovaryumdan salınan östrojen ve progesteron aracılığıyla sağlanır. Pubertede β- endorfin, serotonin, norepinefrin ve dopaminin etkisiyle hipotalamustan pulsatil olarak salınan GnRH ön hipofizden FSH ve LH hormonlarının salgılanmasını uyarır. Bu döneme kadar inaktif olan ovaryumlarda FSH ve LH ın etkisiyle follikül gelişimi başlar. Ovarian siklus menstruasyonun ilk gününden başlayıp ovulasyona kadar süren folliküler dönem ve ovulasyondan sonra başlayıp korpus luteumun yıkımına kadar süren luteal dönemden oluşur. Folliküler dönemde adet primordial follikül gelişmeye başlar ve bir yada birkaç adet olgun follikül oluşur. Bu dönemde granüloza hücrelerinden östrojen salınımı yapılır. Ovulasyondan sonra oluşan korpus luteuma östrojen ve progesteron üretiminden sorumludur. Erken folliküler dönemde FSH seviyesinde artış gözlenir. Bu dönemde LH salınım oranı ise sabittir. Granüloza hücrelerine etki eden FSH hücre çoğalmasını ve östrojen üretimini indüklerken antrumun genişlemesine de yardımcı olur. Östrojen aynı zamanda granüloza hücrelerinin çoğalmasını uyararak östrojen üretimini daha da artırır. Teka hücrelerine etki eden LH teka hücrelerinin çoğalmasını ve bu hücrelerden androjen sentezini uyarır. Difüzyonla granüloza hücreleri içerisine giren androjenler aromataz enzimi katalizörlüğünde östrojene dönüştürülür. İkinci haftanın başlangıcında kandaki FSH seviyesinin azalmasıyla gelişmekte olan folliküller dejenere olurken içlerinden bir follikül dominant hale gelir. FSH atrezinin önlenmesi ve folliküllerin canlılığı için önemli bir faktördür. Dominant follikülün granüloza hücrelerinde artan FSH ve LH reseptörleri dominant follikülün canlılığını sürdürebilmesini sağlamaktadır. Dominant follikülde daha fazla salgılanan östrojen, gonadotropin salgılanması üzerine negatif geri bildirim yaparak ön hipofizden FSH ve LH salınımını azaltılır. Granüloza hücrelerinin salgıladığı inhibin FSH sekresyonunu baskılar ve FSH seviyesinin LH dan daha fazla azalmasına neden olur. Plazma östrojen seviyesinin bir veya iki gün boyunca yüksek seviyede olması, geç folliküler dönemde östrojenin pozitif geri bildirim mekanizması olarak hipotalamustan GnRH salgısının uyarılmasına ve hipofiz bezinin LH salınımı mekanizmalarının GnRH a

28 13 duyarlılığının artmasına yol açar. Hızla yükselen östrojen seviyesi LH seviyesinin döngü ortasında artmasına neden olur. LH seviyesindeki bu ani artış ovulasyonu indükler. Yükselen LH seviyesinin etkisiyle primer oosit I. mayoz bölünmeyi tamamlar. Granüloza hücrelerinde enzim ve prostoglandinlerin sentezi artar. Antrum büyüklüğü ve folliküle gelen kan miktarı artar. Antrum genişler. Folikül-ovaryum membranları yıkılmaya başlar. Sekonder oosit kumulus hücreleri ile birlikte zayıflayan stigmadan pelvik boşluğa bırakılır. LH seviyesindeki bu yükselme follikülden geriye kalan granüloza ve teka hücrelerinin korpus luteuma dönüşümünü tetikler. Fertilizasyon gerçekleşmemesi durumunda oluşan menstruasyon korpus luteumunun işlevi az miktarda LH'un etkisiyle devam eder. Menstruasyon korpus luteumundan bol miktarda progesteron, östrojen ve inhibin salgılanır. Progesteron luteal evrenin başlarında yüksek östrojen seviyesine rağmen büyük LH dalgalarının oluşmasına engel olur. Luteal evrede FSH salınımı inhibin konsantrasyonundaki artış ile baskılanır. Döngünün luteal evresinde görülen gonadotropin seviyeleri bu sebepten oldukça düşüktür. Gonadotropin salınımında artış olmaması korpus luteumun ömrünü azaltır ve gebelik meydana gelmediği takdirde, korpus luteum iki hafta içerisinde dejenere olur. Plazma östrojen ve progesteron seviyeleri korpus luteumun dejenerasyonu ile birlikte düşer. Östrojen ve progesteronun inhibitör etkisinin ortadan kalkmasıyla hipofizden FSH ve LH hormonlarının salınımı artarak yeni bir döngü başlar [26-28] Kanser Tedavisi ve Ovaryuma Etkileri Kanser hastalarını tedavi etmek ve yaşam sürelerini uzatmak için yapılan çalışmalar her geçen gün biraz daha umut vermektedir. Görüntüleme tekniklerindeki gelişmeler, erken teşhis ve kemoterapi uygulamaları çoğu kanser türü için hastaların yaşam süresini uzatmaktadır. Ne yazık ki hastalarda, kanser tedavisinin (cerrahi müdaheleler, radyoterapi ve kemoterapi) ciddi yan etkileri ile karşılaşılmaktadır. Ovaryum hasarı radyoterapi yada kemoterapi sırasında, tedavinin tamamlanmasından kısa süre sonra veya yıllar sonra meydana gelebillir. Tedavinin ovaryum dokusuna verdiği hasar gonadal fonksiyonda geçici yada kalıcı bozukluklar oluşturmaktadır. Prematür over yetmezliği yada erken menopoz, kanser

29 14 tedavisi sonrası düzenli menstrual siklusları takiben 40 yaşından daha önce ovaryum fonksiyonunun kaybıyla kendini gösterir [3-5]. Prematür over yetmezliği mönarş'ın hiç gerçekleşmemesi ile karakterize primer ovaryum hasarı (primer amonerea) yada ovaryum folliküllerinin erken azalması veya follikülogenezisin 40 yaşından önce durması (sekonder amenorea) olarak tanımlanabilir [29-31]. Hastalarda kemoterapi sonrası ovaryum hasarının klinik işaretleri hemen görülmesede, kemoterapinin etkileri primordial follikül havuzundaki azalmaya bağlı olarak yıllar sonra ortaya çıkabilmektedir. Meirow D. ve arkadaşları kemoterapinin ovaryum ve primordial folliküller üzerine doza bağlı etkisini incelemiştir. Aynı yaştaki Balb/c farelere farklı dozlarda cyclophosphamide uygulamasını takiben deneklerin her iki ovaryumundaki toplam primordial follikül sayıları değerlendirilmiş. Kemoterapinin ovaryuma etkisinin ya hep ya hiç olgusunda olmadığını, toplam primordial follikül sayısının cyclophosphamide uygulamasındaki doz artışı ile doğru orantılı şekilde azaldığını bildirmişlerdir. Genç kadınlarda follikül rezervinin daha fazla olması nedeniyle; primordial follikül sayısındaki bu azalma ani bir ovaryum yetmezliğini işaret etmez. Kemoterapi büyük miktarda follikül kaybına neden olsada, ovaryumda kalan folliküller ovaryum fonksiyonunun sınırılı bir süre için düzgün olarak devam etmesini sağlar. Fakat primordial follikül sayısının genç yaşta ve doğal olmayan bir şekilde ovaryum fonksiyonu için gerekli olan minumum seviyenin altına düşmesi prematür over yetmezliği ile sonuçlanmaktadır [32]. Turan V. ve Oktay K yılında kemoterapi alan hastalarda kanser tedavisinin uzun süreli yan etkileri olarak gonadal fonksiyonda geçici yada kalıcı bozukluklarla karşılaşıldığını, gonadotoksisitenin erken menopoz ve infertiliteye neden olarak yaşam kalitesini düşürdüğünü rapor etmişlerdir [2]. Kemoterapinin gonadotoksik etkisi hastanın yaşı, tedavi süresi, kemoterapik ajanın türü ve dozuna göre değişiklik gösterir. Yaşa bağlı etkisindeki değişiklik yaşlanmayla birlikte meydana gelen primordial folikül sayısındaki azalmadır. 40 yaşın altındaki hastalarda amenorrhea riski %61 iken 40 yaş üstü hastalarda bu risk %95 e yükselmektedir [2, 6, 33, 34].

30 15 Follikül gelişimi devam ederken oosit immature follikül içinde mayoz bölünme safhasında tutulmaktadır. Kemoterapatik ilaçlar mitotik hücrelerde etkili olmak üzere tasarlandığı için, öncelikli hedeflerinin ovarian siklus sırasında yüksek proliferasyon gösteren hücreler (granüloza hücreleri gibi) olabileceği düşünülmektedir [6] yılında Meirow D. ve ark. yaptıkları retrospektif bir çalışmada yılları arasında kemoterapi görmüş 168 kadın hastayı değerlendirmiş ve bu hastaların 57 'sinde (%34) kemoterapi sonrası ovarian hasar olduğu belirlenmiş. Hastalar kullanılan kemoterapik ajana göre 5 gruba ayrıldığında gonadotoksik etkisi en yüksek grubun alkilleyici ajanlar (%42.4 ) olduğu görülmüştür [2]. Cyclophosphamide; malign lenfoma, miyeloma, lösem, nöroblastom, retinoblastoma, göğüs kanseri tedavisinde kemoterapik olarak ve organ transplantasyonu ile oto-immün hastalıkların tedavisinde immün-supressor olarak sıklıkla kullanılmaktadır [3]. Mustard gazının periferik kanda lenfosit miktarının azalmasına yol açtığının gözlenmesi nitrojen-mustard türevlerinin sitotoksik etkisinin farkedilmesini sağlamıştır. Bir oksazofosforin halkasına bağlı nitrojen-mustard türevi olan cyclophosphamide 1958'de anti-tümör ajanı olarak tanımlanmıştır. Cyclophosphamide inaktif bir prodrugtır ve sitostatik aktivitesini göstermek için enzimatik biyoaktivasyona ihtiyaç duyar. Cyclophosphamide, fosforamid mustard aktivasyonu ve şekillenmesini takiben bifonksiyonel alkilleyici ajan olarak hareket eder [35]. S.Morgan ve Arkadaşlarının PubMed ve GoogleScholar veri tabanlarındaki çalışmaları sistematik olarak inceleyerek derledikleri raporda; cyclophosphamide'in DNA'da interstrand ve intra-strand çapraz bağlanmalara neden olarak hücre bölünmesini engellediğini, pro-apoptotik bax proteini ifadelenmesini arttırdığını, Bax proteininin de hücre ölümü sırasında mitokondri içine girerek mitokondrial membran potansiyelini değiştirdiği ve apoptotik kaskadları aktive ettiğini rapor etmişlerdir. Cyclophosphamide'in yine bir alkilleyici ajan olan doxorubucin ile birlikte kullanımında; mitokondrial transmembran potansiyelini değiştirdiği ve sitozolde sitokrom-c birikimine neden olarak caspase ailesini harekete geçirerek apoptoza neden olduğunu bildirilmişlerdir [6].

31 16 Soleimani ve ark. kadın hastalardan alınan insan ovaryum dokusu ile farelerde xenograft bir model oluşturmuş. Modellere cyclophosphamide gibi alkilleyici bir ajan olan doxorubicin uygulamış. Doxorubucin uygulanan çift DNA zinciri kırığı belirteci olan γh2ax protein miktarının arttığını ve en yüksek artışın primordial folliküllerde olduğunu immünohistokimyasal olarak göstermiştir [36]. Kanser tedavisi gören hastaların yaşam kalitesinin artırılabilmesi ve tedavi sonrası fertilitenin kazanılabilmesi için kullanılan; tedaviye başlanmadan önce embriyo ve oosit dondurma işlemleri standart tekniklerdir. Fakat, bu iki teknik için de gerekli olan 2 haftalık ovarian stimulasyon ve yüksek seviyede östrodiol uygulaması göğüs kanseri gibi hormon bağımlı tümörlerde kontrendikasyona neden olmaktadır. Ovaryum dokusunun dondurulması ise iskemiye bağlı follikül kaybı ve kanserli hücrelerin tekrar nakledilmesi riski nedeniyle halen deneysel bir teknik olarak görülmektedir. Bu tekniklere alternatif olarak, anti-oksidan tedavisi, GnRHa uygulamaları ve kök hücre uygulamaları gibi farklı tekniklerin, kullanılabilirliği hakkındaki araştırmaların sayısı gün geçtikçe artmaktadır [2, 7-9] İnfertilitede Kök Hücre Kullanımı Mezenkimal kök hücreler (MKH), kemik, kıkırdak, kas, ligament, tendon ve yağ doku gibi mezenkimal dokulara farklanabilen ve bu dokuların yenilenmesine katkıda bulunabilen hematopoetik olmayan stromal hücrelerdir. MKH tüm doku çeşitlerinde özellikle kan damarlarının periferinde bulunan perisitlerin özelleşmiş populasyonları olarak görülebilir. Kemik iliğinde hematopoetik olmayan kök hücrelerin varlığı ilk olarak Alman Patolog Cohnheim tarafından 1867 yılında gözlenmiştir. Cohnheim'ın çalışması kemik iliğinin fibroblastların kaynağı olabileceğine ışık tutmuştur. Alexander Friedenstein ve ark ve 70'lerde yaptıkları bir dizi deneyde kemik iliğinde osteoblast ve bağ dokuya farklanma yeteneğine sahip hematopoetik olmayan hücrelerin varlığını göstermiştir. Araştırıcılar, hemapoietik olmayan kemik iliği hücrelerinin düşük yoğunlukta kültüre edilmesiyle; kültür kabına yapışmış, uzantılara sahip fibroblast benzeri hücrelerin koloniler oluşturduğunu gözlemlemişlerdir. Tek bir hücreden köken alan her bir koloniyi koloni şekillendirici birim-fibroblast (colony-forming unit-fibroblasts/cfu-f) olarak isimlendirmişlerdir. Freidenstein ve arkadaşlarının tanımladığı bu hücrelerin multipotent olduğu ve osteoblastlara, kondroblast ve adipositlere farklanabildiği yıllar boyunca yapılan

32 17 çalışmalarla doğrulanmış ve ilk defa 1991 yılında Arnold Caplan tarafından mezenkimal kök hücre olarak adlandırılmıştır. Günümüzde farklı isimlendirmelerinde kullanıldığı MKH'in adlandırılmasında karışıklıklığa sebebiyet verilmemesi için International Society of Cellular Therapy (ISCT) "multipotent mezenkimal stromal hücre" (MSC) isminin kullanımını önermektedir. Bir hücrenin MKH olarak adlandırılabilmesi için ISCT tarafından bazı tanımlama kriterleri belirlenmiştir. Bu kriterlere göre hücreler; kültür ortamında kültür kabına yapışma özelliği göstermeli, non-spesifik yüzey belirteçleri olan CD105, CD73 ve CD90 pozitif, hemtapoetik belirteçler olan CD45, CD34, CD14 veya CD11b, CD79α veya CD19 negatif işaretlenmeli ve in-vitro olarak osteoblast, kondroblast ve adipositlere farklanabilmelidir. Günümüzde mezenkimal kök hücreler birçok memeli türünde yetişkin, fetüs ve yenidoğana ait çeşitli doku ve organlardan elde edilebilir. Kemik iliği aspiratlarında 1/ / oranda bulunan mezenkimal kök hücreler yoğunluk gradient santrifügasyon yöntemi ile elde edilebilmektedir. İlk ayrıştırılan mezenkimal kök hücre olarak kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreler (KİKMKH), hakkında oldukça fazla bilgiye sahip olunması ve klinik alanda yaygın olarak kullanılması nedeniyle üzerinde en çok araştırma yapılan ve klinik olarak en çok denenen hücrelerdir. KİKMKH'lerin izolasyonu ve tanımlanması da temel olarak kültür kabına yapışma kapasitelerine, immünfenotipine ve uygun in-vitro koşullaraltında osteoblast, adiposit ve kondrositlere farklanmalarına dayanır. KİKMKH'lerin immün-fenotipleri söz konusu olduğunda, kültür ortamındaki hücreler ISCT kriterleri kapsamındaki non-spesifik yüzey belirteçleri olan CD44, CD73, CD90, CD105, CD146 ve daha birçok yüzey belirteçlerini eksprese etmektedir. Hematopoetik belirteçler olan CD11b, CD14, CD45 ve CD34 ekspresyonunu ise gerçekleştirememektedir. KİKMKH tarafından kültür ortamında ve doğal ortamlarında ifadelenen yüzey belirteçleri çizelge 2.1'de gösterilmiştir [10, 37-48].

33 18 Çizelge 2.1. KİKMKH'ler tarafından ifadelenen hücre yüzey belirteçleri [39, 43, 44, 49, 50] Yüzey Belirteci Özelliği Kültür Edilmiş MKH Doğal/Yerel Stro-1 Bilinmeyen antijen + + GD2 Ganliozid + + SSEA4 Evreye özgü embriyonik antijen + + CD11b ITGAM (integrin αm) - - CD14 LPS Reseptörü - CD29 İntegrin β 1 zinciri + CD34 Sialoportein - + CD44 Hiyalüronan reseptörü + CD45 Pan-lökosit reseptörü - - CD49a İntegrin α 1 zinciri + + CD49b İntegrin α 2 zinciri + CD49c İntegrin α 3 zinciri + CD49d İntegrin α 4 zinciri - CD49e İntegrin α 5 zinciri + CD51 İntegrin av zinciri + CD73 Ekto 5 endonükleaz + + CD90 Thy CD105 TGF-βRIII (transforme edici büyüme faktörü reseptörü III) MKH + + CD106 VCAM-1 ( Vasküler hücre adezyon molekülü-1) + + CD133 AG133 (prominin) - + CD140B PDGF-Rβ (platellet kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β) + + CD146 Mel-CAM (melanom hücre adezyon molekülü) + + CD166 ALCAM (aktif lemfosit hücre adezyon molekülü) + + CD200 OX CD271 NGFR (nöral büyüme faktörü reseptörü) - + MKH'ler sistemik bir şekilde vücuda verildiğinde hedef bölgeye yönelmekte ve yerleşmektedir. MKH'lerin in-vivo ortamda farklılaşabildiğinin kanıtı olarak osteogenezis imperfecta hastası çocuklara transplantasyonu sonrası olgun hücrelere farklanabilmesi gösterilebilir. MKH'ler vücut içerisinde farklılaşmasının yanı sıra, salgıladıkları uyarıcı

34 19 veya engelleyici maddeler ile de parakrin etki göstererek düzenleyici ve tedavi edici etki göstermektedir. Dokuda bulunan aktif MKH'ler MKH'ler parakrin etkilerine ek olarak hasarlı bölgeye monositleri çağıran monosit kemoatraktan protein-1 gibi birçok kemoatraktan madde de salgılamaktadır. MKH'lerin immün sistem tarafından tanınmayarak immün yanıtı engellediğini gösteren çalışmalar nedeniyle bu hücrelerin allojenik nakillerde doku onarımında red tepkimesine neden olmayacağıda varsayılmaktadır [10, 51-54]. Klinikte kullanımları henüz yeni sayılsada, farklı hayvan türlerinde gerçekleştirilmiş çok sayıda deney MKH'lerin otolog ve allojenik olarak birçok hastalığın tedavisinde kullanılabilir olduğu konusunda umut vericidir. MKH istenen doku tipine farklılaştırılarak yada yeterli hücre sayısına ulaşıldığında farklılaştırımadan hasta ağırlığına göre kg başına 1-2 milyon hücre olarak vücuda verilebilir [10]. Şekil 2.2. MKH'nin klinik kullanımında izlenen yöntemler [10] Farklı kaynaklardan elde edilen kök hücrelerin transplantasyonu sonrası kemoterapi ile oluşturulmuş hasarlı ovaryum dokusunda meydana gelen değişiklikleri inceleyen araştırmaların sayısı gün geçtikçe artmaktadır.

35 20 Takehhara Y. ve ark. 7-8 haftalık wistar cinsi sıçanlara, intra-peritoneal olarak cyclophosphamide uygulayarak ovaryum hasarı oluşturdukları deney modelinde adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin onarıcı etkilerini incelemişler. Adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin teka hücre katmanı içerisine yerleştiğini fakat follikül içerisine giremediğini gözlemişler. Araştırıcılar, cyclophosphamide uygulanan deneklerde adipoz kökenli mezenkimal kök hücre transplantasyonu sonrası VEGF, IGF-1 ve HGF ifadelenmesinde artış olduğunu real-time PCR ve immünohistokimyasal yöntemlerle göstermişler [55]. Xiao G. Y. ve ark yılında yaptıkları çalışmada; green fluoresan protein ekspresyonu yapabilen transgenik farelerden elde ettikleri amniyon sıvısı kök hücrelerini, kemoterapi ile ovaryum hasarı oluşturulmuş farelere transplante etmişler. Amniyon sıvısından elde edilen kök hücrelerin kemoterapi uygulanmış fare ovaryumlarında follikül atrezisini engellediğini fakat in-vivo olarak granüloza hücrelerine yada germ hücrelerine farklanmadığını bildirmişler [56]. Kılıç S. ve ark. tarafından 2014 yılında yayınlanan çalışmada, pubertede cyclophosphamide ile indüklenmiş ovaryum hasarında kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücrelerin koruyucu etkisi incelenmiş. Kemoterapi sonrası KİKMKH uygulanan grupta follikül sayısının anlamlı derecede arttığı; in-vivo transplantasyonu yapılan KİKMKH'lerin hasarlı follikülere göç ettiği ve programlı hücre ölümünü azaltarak ovaryum dokusunu tamir ettiği gösterilmiştir [57]. Embriyonik gelişim sırasında ovaryuma göç eden ve kölom epiteli içerisinde çoğalan primordial germ hücreleri ovaryum kök hücreleri (OKH) olarak kabul edilmektedir. Bu hücreler hormonların ve ait oldukları nişteki immün sistem kökenli hücrelerin etkisiyle oogonyumların kökenini oluştururlar. Fötal dönemde OKH'leri geçirdikleri değişikliklerle oogoniumların ve granüloza hücrelerini oluşturur. Yenidoğanlarda ise ileri farklanan OKH'ler fibroblast benzeri hücrelere dönüşerek tunika albugineanın oluşumuna katılırlar. Erişkin dönemdeki OKH'lerinin karşılığı olan bu hücreler in-vitro ortamda yeni hücrelere farklılaşabilirler.

36 21 Ovaryum gelişimi sırasında, ovaryumun yüzey epitelindeki hücreler kriptalar yada hücre kordonları şeklinde kortekse doğru girintiler yapar. Bu hücre kordonları primordial folliküllerin yakınında parçalara ayrılarak nişler oluşturur. Bu hücreler OKH ile benzer özellikler göstermektedir. Bukovsky ve arkadaşlarının çalışmaları kriptalarda bulunan ve embriyodaki yapısını kısmen koruyan bu epitel hücrelerinin granüloza hücrelerine kaynak oluşturduğunu belirtmektedir. Yine aynı grubun çalışmaları tunika albugineada bulunan hücrelerin erişkin ovaryumunda mezenkim-epitel geçişiyle epitel benzeri OKH'lere dönüştüğünü göstermektedir. Yakın zamanda yayınlanan çalışmalar fötal dönemde ortaya çıkan OKH'lerin erişkin dönemde yeni oosit ve granüloza hücrelerine dönüşebileceği konusunda bilgiler vermektedir. Bu yeni görüşe göre fötal dönemde oluşan ve epitel-mezenkim geçişi ile mezenkim benzeri hücrelere dönüşerek tunika albuginea içerisine yerleşen OKH'leri pubertede başlayan üreme dönemiyle birlikte mezenkim-epitel geçişiyle tekrar OKH'lere dönüşürler. Bu OKH'ler hem granüloza hücrelerini hemde yeni germ hücrelerini oluştururlar. Oluşan bu germ hücreleri granüloza hücreleri arasından geçerek damar içine girer ve beraberindeki yeni granüloza hücreleri ile birlikte korteksin derinliklerine ilerler. Korteksin derinliklerine ulaşan bu hücreler damar üzerinde cepler oluşturur ve dolaşımdaki granüloza hücreleri ile birlikte yeni primordial follikülleri şekillendirir [11-15]. 2.6 Anti-Müllerian Hormon (AMH) Müllerian inhibe edici madde (MIS) adıyla da bilinen ve TGF-β ailesine ait bir glikoprotein olan anti-müllerian hormon (AMH), embriyonik gelişim sırasında fötal sertoli hücrelerinden salınarak müller kanalının gerilemesini indükler ve wolf kanalının erkek üreme kanallarnı oluşturmasına yol açar. AMH yokluğunda ise embriyoda müller kanalından vajina, uterus ve tuba uterinalar gelişir [58]. Fötal yaşamdan sonra AMH, dişide granüloza hücreleri tarafından salgılanmaktadır. Ovaryumda primordial folliküllerin farklılaşmaya başlamasıyla başlayan AMH ekspresyonu, multilaminer primer ve küçük sekonder folliküllerde en yüksek düzeye ulaşır. Dominant follikül oluşumuna doğru ilerlerken follikül çapı yaklaşık 10 mm'ye ulaştığında AMH ifadelenmesinin durma noktasına geldiği yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Primordial follikül havuzunun büyüklüğü küçük sekonder follikül sayısı ile

37 22 doğru orantılıdır. Yaşla birlikte sekonder follikül sayısındaki azalma AMH üretiminin azalmasına neden olmaktadır. Pubertede en yüksek seviyede olan serum AMH miktarı doğumda tespit edilemeyecek kadar azdır. İlerleyen yaşlarda menopozla birlikte tekrar tespit edilemeyecek ölçüde azalır [59-62]. Oktem Ö. ve Oktay K. insan fötal ovaryum dokusu ile farelerde bir xenograft model oluşturmuş ve modellere 200mg/kg Cyclophosphamide uygulayarak 12, 24, 48 ve 72 saat sonraki etkilerini incelemiştir. Cyclophosphamide uygulamasından 48 saat sonra primordial follikül sayısında %93 azalma olduğunu belirlemişlerdir [63]. Serum AMH konsantrasyonu, kalan primordial folliküllerin miktarını gösteren, sekonder follikül havuzunun büyüklüğünü doğru bir şekilde yansıtmaktadır ve sekonder follikül sayısı primordial follikül miktarıyla orantılı olarak ilişkilidir. AMH, ovaryum yaşlanmasının menstrual siklusa bağlı ve primordial follikül havuzunun azalmasının nispeten geç belirteçleri olan inhibin B, östradiol ve FSH'nin aksine klinik açıdan kullanımı kolay bir belirteçtir. AMH seviyesi, ovarian fonksiyon bozukluğu, gonadotoksik kanser tedavisi veya ovaryum ameliyatlarının üremeye olan etkisini tahmin etmede yardımcı olur [58, 64] p34cdc2 (CDK1) 1971 yılında birbirinden bağımsız olarak gerçekleştirilen araştırmalarda hormonla uyarılmış oositlerden alınan sitoplazmanın, hücre döngüsünün G2 fazında bekleyen oositlere mikroenjeksiyon ile verilmesiyle bu oositlerin G2 fazından M fazına geçtiği gösterilmiştir. Bu sayede hormonla uyarılmış oositlerde üretilen sitoplazmik bir faktörün G2 fazından M fazına geçişi uyardığı belirlenmiştir. Daha sonraki çalışmalar, olgunlaşmayı ilerletici faktör (MPF) olarak adlandırılan bu sitoplazmik faktörün somatik hücrelerde de etkili olduğunu göstermiştir. Somatik hücrelerdede mitotik döngünün G2 fazından M fazına geçişini düzenlediği belirlenen MPF mitoz teşvik eden faktör olarak da adlandırılmaktadır. Heterodimerik bir protein olan MPF, mitotik bir siklin ve siklin bağımlı kinazdan (CDK) oluşur. MPF çok sayıda proteini fosforile ederek hücrenin M evresine girişini tetikler [65-67].

38 23 MPF düzenleyici alt birim olan siklin-b ve bir protein kinaz olan Cdc2'den (CDK1) oluşmaktadır. Hücre döngüsünün S evresinde üretimi başlayan siklin-b birikerek S ve G2 evreleri boyunca Cdc2 ile beraber bir kompleks oluşturur. Kompleks oluşumundan sonra Cdc2 treonin-161 üzerinden fosforillenir. Daha sonra bir protein kinaz olan Wee1 'in katalizörlüğünde Tirozin-15 üzerinden fosforillenir. Tirozin-15'e komşu olan treonin-14'te fosforillenir. Tirozin-15'in fosforilasyonu Cdc2 aktivitesini baskılar ve S-G2 evrelerinde cdc2/siklin-b kompleksinin birikmesine yol açar. Cdc25C protein fosfatazı tarafından treonin-14 ve tirozin-15'in defosforillenmesi Cdc2/siklin-B kompleksinin aktive olmasını sağlar. Aktive olan Cdc2 bir grup proteini fosfatlayarak M evresinin başlamasına neden olur. Cdc2 aktivitesi siklin-b'nin proteolizler ile yıkımına neden olur. Siklin-B'nin proteolitik yıkımı Cdc2'yi inaktive eder. Hücre mitozdan çıkar ve sitokineze uğrayarak interfaza döner [67, 68]. Chesnel F. ve Eppig J. J yılında Mayoz bölünmede tutulmuş gelişmekte olan fare oositlerinde, MPF alt birimleri olan p34cdc2 ve siklinb içeriği açısından eksik olduğu hipotezini test etmişler. Araştırıcılar bu iki MPF bileşeninin birikiminin asenkronize olduğunu belirtmişler. Mayoz bölünmenin devam etmesi için ilk belirtecin germinal vezikül dağılmadan önce oositlerde siklinb birikiminin maksimum seviyeye ulaştığını bildirmişler ve bu nedenle siklinb'nin germinal vezikülün dağılmasında sınırlayıcı faktör olmadığını belirtmişlerdir. Buna karşın oositte germinal vezikül dağılımı olana kadar p34cdc2 sentezi ve birkiminin arttığını bildirmişler. Benzer şekilde in-vitro ortamda granüloza hücreleri yokluğunda kültüre edilen oositlerde p34cdc2 miktarının arttığını fakat bu oositlerde germinal vezikülün dağılmadığını belirtmişler. Bu nedenle fare oositlerinde p34cdc2 birikiminin folliküler somatik hücrelerden bağımsız olduğunu ve bu birikimin germinal vezikülün dağılmasında tek başına yeterli olmadığını bildirmişlerdir [69]. Anguita B. ve ark yılında yaptıkları çalışmada 1-2 aylık pre-pubertal keçilerde p34cdc2 mrna, RNA ve protein miktarları ile oosit büyüklüğü arasındaki ilişkiyi incelemişlerdir. Araştırıcılar elde ettikleri oositleri, oosit çaplarına göre <110, , , 135 μm olarak gruplara ayırmış. Oositleri toplandıktan hemen sonra ve 27 saat boyunca in-vitro maturasyon sonrası p34cdc2 ifadelenmesi değerlendirilmiş. Oostilerin hepsinde p34cdc2 mrna varlığı görülmüş. Mayoz bölünmeyi tamamlamış ve tamamlayamamış oositlerde p34cdc2 RNA'sının olduğu belirlenmiş. İn-vitro maturasyon

39 24 öncesi değerlendirmelerde p34cdc2 mrna miktarının μm çapındaki oositlerde diğerlerine göre anlamlı derecede yüksek olduğu fakat in-vitro maturasyon sonrası bu farklılığın olmadığı görülmüş. Oosit çapı arttıkça p34cdc2 protein miktarının da arttığı tespit edilmiş [70]. Quetglas M. D. ve arkadaşları 2010 yılında yaptıkları çalışmada; siklin bağımlı kinaz (CDK) inhibisyonunun p34cdc2, siklinb1 ve MAPK üzerine etkisini değerlendirmişlerdir. Sığırlardan elde ettikleri oositleri kontrol grubu ve CDK inhibisyonu yapılan grup olarak ikiye ayırmışlardır. Kontrol grubu oositler aspirasyondan hemen sonra olgunlaşmamış ve in-vitro maturasyondan sonra olgunlaşmış olarak iki gruba ayrılmış. CDK inhibitörü uygulanan oositerin ise bir kısmı in-vitro maturasyon kültürüne alınmış. Real-time PCR analiz sonuçlarına göre p34cdc2 ve MAPK transkripsiyonunun, CDK inhibisyonu yapılmış ve olgunlaşmamış oositlerde belirlenirken, in-vitro maturasyon sonrası CDK inhibisyonundan bağımsız olarak azalma olduğu gözlenmiş. SiklinB1 seviyesinin tüm gruplarda benzer olduğu görülmüş. Western-Blot analiz sonuçlarına göre p34cdc2 ve MAPK protein seviyelerinin tüm oositlerde aynı, siklinb1 proteinin ise sadece olgun oositlerde var olduğu belirlenmiş. İmmünfloresan incelemelerde p34cdc2'nin olgunlaşmamış ve CDK inhibisyonu yapılmış oositlerin nükleuslarında yoğun olmakla birlikte sitoplazmalarında lokalize olduğu, olgunlaşma sonrasında ise sitoplazma genelinde yayılmış olarak bulunduğu bildirilmiştir [71] Follikül Maturasyon Faktörleri 35'ten fazla proteinden oluşan TGF-β süper ailesi üyeleri fötal ve erişkin dönemde hücre büyümesi ve farklılaşmasının kontrolünde çok önemli görevler üstlenirler. Bu proteinler activin/inhibin, GDF ve BMP alt aileleri ile anti-müllerian hormondan (AMH) oluşmaktadır [72-75]. BMP alt ailesi üyeleri, memelilerde dişi fertilitesinde önemli roller üstlenmektedir. Ovaryumdan eksprese edilen BMP-15, GDF-9, BMP-7 ve BMP-6 erken lüteinizasyonu engelleyerek follikül gelişimini korumaktadır. Granüloza hücrelerinden salınan aktivin ve BMP-6 otokrin ve parakrin etki ile, oositlerden salınan GDF-9, BMP-15 ve BMP-6 ise otokrin etki ile granüloza hücre proliferasyonunu teşvik ettmekte ve FSH bağımlı follikül fonksiyonlarını düzenlemektedir [76, 77].

40 25 Oosit tarafından üretilen TGF-β süper ailesi üyeleri GDF-9, BMP-15 ve BMP-6'nın granüloza hücrelerinde bulunan çeşitli tip-i ve tip-ii reseptörlerin ligandı olması, bu sinyal molekülleri için granüloza hücrelerinin potansiyel hedef olduğunu göstermektedir. BMP- 15'in bağlanması için gerekli olan tip-i (ALK-6) ve tip-ii (BMP-RII) reseptörleri, primordial-primer follikül geçişinden itibaren BMP-15'in oluşturduğu yanıtla uyumlu olarak granüloza hücreleri tarafından ifadelenmektedir [77-79]. Çoğu türde BMP-6 mrna ve proteinleri, antral folliküllerdeki oositlerde ve granüloza hücrelerinde bulunmaktadır. BMP-6 nın mrna ifadelenmesi ilk olarak oosit ve granüloza hücrelerinde gözlenmiş fakat primordial ve primer folliküllerde görülmemiştir. Ayrıca sıçanlarda dominant follikül granüloza hücrelerinde BMP-6 nın mrna ifadelenmesi görülmemiştir, BMP-6 ifadelenmesinin azalmasının dominant follikül seçimi ve korunmasında potansiyel bir rolü olduğu düşünülmüştür [80-82]. İnsan ve çoğu memeli türünün gelişmekte olan ovaryumunda BMP-6 duyarlılığı olan reseptörler; oosit, granüloza hücreleri ve teka hücrelerinde bulunmaktadır. Ancak, sıçanda teka hücrelerinde tip-ii reseptöre rastlanılmamıştır [73]. Shi J. ve ark. tarafından 2009 yılında yayınlanan çalışmada, araştırmacılar BMP-6 'nın insan ovaryumdaki lokalizasyonunu immünohistokimyasal olarak araştırmıştır. Elde edilen bulgulara göre primordial ve primer folliküllerin oositlerinde BMP-6 ifadelenmesi açıkça görülmüştür. Granüloza hücrelerinde BMP-6 ifadelenmesi primordial folliküllerde yoğun olarak görülürken, primer ve sekonder folliküllerde daha az olduğu gösterilmiştir. Sağlıklı antral folliküllerin granüloza hücrelerinde yüksek miktarda BMP-6 tutulum görülürken, atretik folliküllerin granüloza hücrelerinde çok zayıf bir tutulum görülmüştür [83]. Ogura-Nose S. ve arkadaşları 2012 yılında yaptıkları çalışmada granüloza hücrelerinde AMH üretiminin hangi faktörler tarafından düzenlendiğini araştırmak için in-vitro fertilizasyon için oositleri toplanan 28 kadın hastanın granüloza hücrelerini kullanmışlar. Araştırmacılar, kültür ortamına alınan granüloza hücrelerini BMP-2, -6, -7, -15, activin-a ve GDF9 ile uyarmışlar. AMH mrna miktarın RTPCR ve QPCR ile değerlendirmişler. Kültür süpernatanındaki AMH proteini miktarını ise enzim immünoassay ile ölçmüşler.

41 26 Araştırmacılar bu çalışma ile; BMP-2, -6, -7 ve -15 'in granüloza hücrelerinde AMH mrna ve protein seviyelerini anlamlı derecede yükselttiğini, FSH reseptör mrna'sını artırdığını ve sterodijenik akut düzenleyici protein (StAR) mrna seviyesini ise azalttığını göstermişlerdir [84]. Jose R.V. Silva ve ark yılında keçide gelişmekte olan ovaryum folliküllerinde BMP- 6 ifadelenmesini polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve immünohistokimyasal yöntemle incelemişler. İn-vitro kültüre edilmiş sekonder folliküllerde BMP-6 'nın follikül büyüklüğü, antrum şekillenmesi, BMP-6 ve FSH reseptörü ifadelenmesi üzerine etkisini araştırmışlar. BMP-6 ifadelenmesinin primer ve sekonder folliküllerde primordial folliküllere göre daha fazla olduğunu gözlemlemişler. Büyük ve küçük antral folliküllerde kümülus-oosit kompleksinde, granüloza ve teka hücrelerinde aynı seviyede BMP-6 mrna miktarı olduğunu göstermişler. Her aşamadaki folliküllerin oositinde ve sekonder folliküllerin granüloza hücrelerinde BMP-6 ekspresyonu olduğu belirlenmiş. Kültür ortamına BMP-6 eklenmesi sekonder follikülde boyut artışına ve antrum genişlemesine katkısı olmuş. Kültüre eklenen FSH BMP-6 mrna seviyesinde artışa sebep olmuş. FSH ve BMP-6 eklenmesinin FSH reseptörü sayısını arttırdığı görülmüş. Sonuç olarak keçi ovaryumunda BMP-6 mrna seviyesinin primordial-primer-skonder follikül geçişinde arttığı, özellikle sekonder follikül gelişimini desteklediği bulunmuştur [85]. GDF9B olarakta bilinen BMP-15, oositte X kromozomunda bulunan bir gen tarafından ifadelenir. İlk olarak primer folliküllerin oositleri tarafından ifadelenen BMP-15 granüloza hücrelerinin proliferasyonunu uyarır [86, 87]. Rekombinant insan BMP-15 proteininin kullanıldığı in-vitro çalışmalar, BMP-15'in farklanmamış sıçan granüloza hücrelerinde proliferasyonu, FSH'tan bağımsız olarak uyardığını göstermiştir. Fakat BMP-15 granüloza hücrelerinde FSH reseptörü ifadelenmesini baskılayarak FSH'ın etkinliğini de kısıtlayabilmektedir [86, 88, 89]. BMP-15'in erken follikül gelişimi üzerine etkisi türlere göre farklılık göstermektedir. BMP-15, poli-ovulatuvar olan kemirgenlerde fertilizasyon için çok büyük önem taşımazken, insan ve koyun gibi mono-ovulatuvar türler için kritik önem taşımaktadır [77, 88].

42 27 BMP-15, granüloza hücrelerinde FSH'ın indüklemesiyle üretilen; steroidojenik akut düzenleyici protein (StAR), Cyp11a1, 3β- hidroksisteroid dehidrojenaz (HSD), LH reseptörü ve inhibin/aktivin alt ünitelerinin ifadelenmesini baskılar [88, 89]. Oosit tarafından üretilen BMP-15 granüloza hücrelerinde kit ligand üretimini uyarır. C-kit aracılığıyla oosite sinyal gönderen kit ligand daha fazla BMP-15 üretmesini engelleyerek bir negatif feedback mekanizması oluşturur. Kit ligand ifadelenmesinin artması ve BMP- 15 ifadelenmesinin azalmasından sonra FSH aktivitesinin engellemesini sağlayan bu kombinasyon, granüloza hücre proliferasyonunun etkin biçimde uyarılmasını sağlar [88, 90]. Dominant folliküllerde çok miktarda üretilen follistatin, BMP-15'e bağlanarak aktivitesini durdurur. FSH reseptörü ifadelenmesini engelleyen BMP-15 aktivitesinin follistatin tarafından düzenlenmesi, granüloza hücrelerinin FSH yanıt verebilmesinde önemli olduğu söylenebilir [88, 91]. Kumulus hücrelerinin büyümesi için gerekli olan BMP-15, aynı zamanda bu hücrelerde apoptozisin düzenlenmesinde de etkili olabilir. Sığır ovaryumundan elde edilen kumulusoosit kompleksinden oositin çıkarılması kumulus hücrelerini apoptoza sürüklediği görülürken, ortama BMP-15 eklenmesiyle kumulus hücrelerinde apopotozun engellendiği görülmüştür [88, 92, 93]. Oluklu bağlantılar (neksus, gap junction), iki hücre membranı arasında yayılarak iletişimi sağlayan hücreler arası kanallardır. Komşu hücrenin sitoplazmasına bir bağlantı oluşturarak hücreler arasında iyonların, metabolitlerin, ikincil mesajcıların ve yaklaşık 1,8 kd büyüklüğündeki peptitlerin geçişini sağlar. Hücre membranı içerisine gömülü halde bulunan ve komşu hücrelerde birbiri karşısında hizalanmış konnekson adı verilen iki yarım kanaldan oluşmaktadır. Her konnekson connexin adı verilen 6 proteinden oluşmaktadır. Her bir connexin proteini sitoplazmik amino ve karboksil uca, dört membrana gömülü bölge, iki hücre dışı ilmek ve bir sitoplazmik ilmekten oluşur. Connexinler doku yada hücre türüne özgü sentezlenir. Çoğu organ ve hücre birden fazla tipte connexin üretir [21, 94-98].

43 28 Oluklu bağlantılar dişi üreme sisteminde önemli görevler üstlenmektedir. Bu bağlantılar aracılığıyla gerçekleştirilen hücre-hücre iletişimi, ovaryum fonksiyonlarının düzenlenmesi, oosit maturasyonu, korpus luteumun şekillenmesi, uterusun implantasyon için hazırlanması, trofoblast invazyonunun düzenlenmesi ve plasenta fonksiyonlarında gibi önemli roller üstlendiği yapılan çalışmalarda gösterilmiştir [95, ]. Connexin-43, önemli bir oluklu bağlantı proteinidir. Perez-Armendariz ve ark. connexin- 43 ün, farelerde embriyogenezisin erken evrelerinde (11,5. gün) farklanmamış gonadların somatik hücreleri arasında ve ilerleyen evrelerde ise somatik hücreler ile germ hücreleri arasında bulunduğunu bildirmişlerdir. Connexin-43 miktarının postnatal 1. günde folliküller şekillenmeye başladıktan sonra ve follikül gelişiminin ilerleyen evrelerinde granüloza hücre populasyonuyla birlikte arttığı belirtilmektedir. Connexin-43 yokluğunda follikül gelişiminin pre-antral fazda kaldığı yapılan çalışmalar ile belirlenmiştir. Oosit ve granüloza hücreleri arasında hangi connexin proteininin etkin olduğu henüz tam olarak aydınlatılamamış olsa da sıçanlarda oosit gelişiminin farklı evrelerinde connexin-43 mrna 'sının varlığı gösterilmiştir [ ]. Yapılan çalışmalar, kemirgenlerde connexin-43 ifadelenmesinin LH ve FSH tarafından kontrol edildiğini göstermektedir. FSH granüloza hücrelerinde connexin-43 ifadelenmesinin artışına sebep olmakta, LH ise ovaryum folliküllerinde connexin-43 üretimini inhibe edici etki göstermektedir. Oluklu bağlantılardan madde geçişi connexin fosforilasyonu ile düzenlenmektedir. LH'nin connexin-43 fosforilizasyonu üzerine etkisi olduğu bilinmektedir [95, ].

44 29 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Deney Hayvanları ve Gruplandırma Araştırmada 36 Adet, g ağırlığında, 8 haftalık wistar albino cinsi dişi sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar rastgele 12 şerli 3 gruba ayrıldı. Deneklere 200mg/kg cyclophosphamide (Endoxan-Eczacıbaşı Baxter, Türkiye) ve 4x10 6 BrdU etiketli kök hücre ugulaması aşağıda tarif edildiği şekilde yapıldı: Grup I. (n=12) Cyc : PBS ile çözülmüş 200mg/kg cyclophophamide 1. ve 8. Günde intraperitoneal olarak uygulandı. Grup II. (n=12) Cyc + BrdU ile işaretlenen Kİ-MKH: PBS ile çözülmüş 200mg/kg cyclophophamide 1. ve 8. Günde ve 4x10 6 BrdU etiketli Kİ-MKH 2.ve 9. günlerde intraperitoneal olarak uygulandı. Grup III. (n=12) Cyc + BrdU ile işaretlenen OSKH: PBS ile çözülmüş 200mg/kg cyclophophamide 1. ve 8. günde ve 4x10 6 BrdU etiketli OSKH 2.ve 9. günlerde intraperitoneal olarak uygulandı. 10. günde sıçanlar sakrifiye edildi ve ovayumları çıkarıldı. Elde edilen ovaryum doku örnekleri histolojik ve immünohistokimyasal analizler için alışılmış doku takibine alındı. Cyclophophamide uygulanan tüm gruplardaki denekler uygulamadan sonra 5cc gavaj ile ve 5cc subkutan olarak hidratize edildi. Denekler çalışmanın çalışmanın başında ve 10.günde tartılarak ağırlıkları arasındaki farklar istatsitiksel olarakdeğerlendirildi. Ayrıca aynı günlerde kan örnekleri alınarak anti müllerian hormon (AMH) değerleri karşılaştırıldı ve istatistiksel olarak değerlendirildi.

45 Kök Hücrelerin Hazırlanması KİKMKH eldesi Ketamin hidroklorid (60 mg/kg) ve ksilazin (10mg/kg) ile uyutulan erkek sıçanların femur ve tibia kemikleri çıkarıldı. Heparin ile yıkanmış Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Lonza, Belçika) solüsyonu ile kemik iliği materyali 15 lik falkonlara toplandı. Fikol 1077 solüsyonu ile birebir olarak kemik iliği materyali gradient yöntemi ile ayrıştırılmak üzere 1200 rpm de 25 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrasında elde edilen bulutsu tabaka ayrı bir tüpe alındı. Üzerine DMEM eklendi ve tekrar santrifüj edildi. Süpernatant kısmı atılarak pelet karıştırıldı. Üzerine MKH besiyeri(%20 Fetal Bowine Serum, Lonza, Belçika), %2 L-Glutamine (Lonza, Belçika), % 1 Pensilin Streptomisin Ampoterisin B (Lonza, Belçika) ve %77 DMEM (Lonza, Belçika)) eklendi. Hücre gelişimi takip edildi, 3 günde bir besiyeri değişimi yapıldı. İkinci pasaj sonunda elde edilen hücreler flow sitometri (FACSC ARIA III, Becton, Dickinson and Company, Vancouver, Canada) cihazı ile yüzey belirteçlerine [CD45 (-), CD11b/c (-), CD90 (+), CD44 (+),CD49 (+)] göre tanımlandı. İkinci pasaj sonrasındaki hücreler farklılaşma yöntemleriyle adiposit, osteosit, kondrosit hücrelerine farklılaştırıldı. Countess, Automated Cell Counter (İnvitrogen,USA) cihazında hücrelerin hem sayısına hem de canlılığına bakıldı OSKH eldesi Ketamin hidroklorid (60 mg/kg) ve ksilazin (10mg/kg) ile uyutulan 1 adet Wistar Albino dişi sıçanın batın bölgesi traşlanıp temizlendi. Cilt ve cilt-altı açıldı. Over dokusu belirlendi ve çıkarıldı. Over materyali Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Lonza, Belçika) solüsyonu içine alındı. Explant yöntemi ile küçük parçalara ayrıldı. Küçük parçalar halinde T25 flasklara yerleştirildi. %5CO2 li inkübatörde 15 dakika bekletildi. %20 Fetal bovine serum (Lonza, Belçika), %2 L-Glutamine (Lonza, Belçika),%1 Penicilin, Streptomycin, Amphotericin (Biological Industries, İsrail) ve %77 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Lonza, Belçika) içeren besiyeri eklendi. Üç günde bir besiyeri değişimi yapıldı. Hücrelerin gelişimi invert mikroskop (Leica, Almanya) ile gözemlendi. 15 gün sonra hücrelerin gelişimi de göz önünde bulundurularak pasaj işlemi yapıldı. İkinci pasaj sonunda hücreler CD11b/c(BD, USA), CD29(BD, USA), CD44(BD, USA), CD45(BD, USA) yüzey belirteçlerine göre flow sitometri cihazında

46 31 (FACSAria III, USA) tanımlandı. İkinci pasaj sonrasındaki hücreler farklılaşma yöntemleriyle adiposit, osteosit, kondrosit hücrelerine farklılaştırıldı. Hücrelerin Countess Automated Cell Counter(İnvitrogen, USA) cihazında hem sayısına hem de canlılığına bakıldı Mezenkimal kök hücre adiposit farklilaştirma metodu Adiposit farklılaşma için Adiposit Diferansiyasyon Basal Mediumu ve suplementi (Gibco, USA) kullanıldı. İkinci pasaja gelen hücreler adiposit besiyeri ile üç günde bir besiyeri değişikliği yapılarak üçüncü hafta sonunda Oil Red (Diagnostıc BioSystem, USA) ile boyama işlemi gerçekleştirildi. Yağ hücreleri Leica invert mikroskobu ile görüntülendi ve belirlendi Mezenkimal kök hücre osteosit farklilaştirma metodu Osteosit farklılaşma için Osteosit Differansiyasyon Basal Mediumu ve suplenent mediumu (Gibco, USA) kullanıldı. İkinci pasaja gelen hücreler osteosit besiyeri ile üç günde bir besiyeri değişikliği yapıldı. Üçüncü hafta sonunda Von Kossa (Diagnostıc BioSystem, USA) ile boyama işlemi gerçekleştirildi. Osteosit hücreleri Leica invert mikroskobu ile görüntülendi ve belirlendi Mezenkimal kök hücre kondrosit farklilaştirma metodu Kondrosit farklılaşma için Kondrosit Differansiyasyon Basal Mediumu ve suplement mediumu (Gibco, USA) kullanıldı. İkinci pasaja gelen hücreler kondrosit besiyeri ile üç günde bir besiyeri değişikliği yapıldı. Üçüncü hafta sonunda Alcian Blue (Diagnostıc BioSystem, USA) ile boyama işlemi gerçekleştirildi. Kondrosit hücreleri Leica invert mikroskobu ile görüntülendi ve belirlendi Kök hücrelerin BrdU ile etiketlenmesi Uygulama öncesinde hücre sayımı yapılarak 1mlt de 2 milyon hücreyi geçmemek üzere 1 mlt için 10 µlt BrdU (1mM BrdU in 1X Dulbecco s PBS, BD Pharmingen, San Jose, CA) solüsyonu eklendi. 2 saat 37 derece %5 CO2 li inkübatörde inkübe edildi. İki saat sonra

47 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Süpernatant atıldı. Pelet karıştırıldı üzerine Fosfat Buffer Solüsyonu (PBS) (Lonza, Belçika) eklendi. 1 ml içinde 2 x 10 6 hücre olacak şekilde sıçanlara intraperitoneal olarak uygulandı Işik Mikroskobik Takip Prosedürü Deneklerden alınan ovaryum doku örnekleri 72 saat boyunca %10 nötral formaldehit içerisinde bekletilerek tespit edildi. 24 saat akarsuda yıkanan dokular alışılagelmiş ışık mikrokobu takip işlemlerinden geçirilerek prarfin bloklara gömüldü. Lam üzerine alınan 4μm kalınlığındaki örnekler deparafinize edildikten sonra alkol serisinden geçirilerek hematoksilen eozin (H&E) boyama yapıldı. H&E boyaması yapılan örnekler histomorfolojik açıdan değerlendirildi İmmunohistokimyasal Prosedür Polilizin kaplı lamlara alınan 4μm kalınlığındaki örnekler 1 gece 37 C sıcaklıktaki etüvde bekletildi. Daha sonra 57 C etüvde 2 saat boyunca bekletilen örnekler 2 defa 15'er dakika ksilol içerisinde bekletildi. Ksilolden çıkarılan örnekler sırasıyla %100, %96, %90, %80 ve % 70 konsantrasyondaki etil alkol çözeltilerinde 10'ar dakika bekletildi. 2 kez 5 dakika distile su içerisinde bekletilerek rehidrate edilen dokular, tespit çözeltisi tarafından kapanan reseptör bölgelerini açığa çıkartmak için 1mM sodyum sitrat çözeltisi (ph: 6,0) içerisinde mikrodalga fırında retrieval işlemi uygulandı. Soğuyup oda sıcaklığına ulaşan örnekler 2kez 5 dakika boyunca distile suda bekletildi. Nemli ortamda immünohistokimya barına dizilen dokuların etrafı PAP-Pen ile çizilerek 3'er dakika boyunca 3 kez PBS (Phosphate Buffer Saline, ph: 7,4) ile yıkandı. Özgün olmayan bağlanmayı engeleyebilmek için 10 dakika serum blocking solution (Cat: , Lot: , Acustain mause+rabbit HRP kit, Genemed Biotechnologies, USA) uygulanan örnekler Cdc2 p34 ( Cat: sc-954, Lot:H1611, Santa Cruz Biotechnology Inc., Europe), BMP-6 (Cat: ab15640, Lot: , Santa Cruz Biotechnology Inc., Europe), Anti-BMP-15 (Cat: ab198226, Lot: GR , Abcam) primer antikorları ile +4 C de 1 gece, p- connexin- 43 (Cat: sc , Lot: K2613, Santa Cruz Biotechnology Inc., Europe) ve BrdU (Cat: , BD Pharmingen) antikoru ile de oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası PBS ile yıkanan örneklere endojen peroksidaz aktivitesini engellemek için 15 dakika boyunca %3 hidrojen peroksit çözeltisi uygulandı. Örneklere

48 33 PBS ile yıkandıktan sonra biotinli sekonder antikor (Cat: , Lot: , Acustain mause+rabbit HRP kit, Genemed Biotechnologies, USA) damlatılarak primer antikora bağlanabilmesi için 10 dakika bekletildi. Örnekler tekrar PBS ile yıkanarak 10 dakika straptavidin enzim kompleksi (Cat: , Lot: , Acu-stain mause+rabbit HRP kit, Genemed Biotechnologies, USA) uygulandı. Yine 3 kez 3 er dakika PBS ile yıkanan örneklere diaminobenzedin (DAB) substratı içeren kromojen (Cat: DABS-125, Lot: HD25395, Thermo Fisher Sci., CA) uygulanarak gözle görülebilir immün tepkime oluşana kadar bekletildi. PBS ile yıkanan örnekelre Zemin boyası olarak Mayer'in Hematoksileni kullanıldı. Alkol serisinden geçirilerek dehidrate edilen örnekler, ksilolde bekletildikten sonra entellan kullanlarak lamel ile kapatıldı. Tüm örnekler Leica DM4000 (Germany) bilgisayar destekli görüntüleme sistemi yardımıyla, Leica Q Vin 3 programında fotoğrafları çekilerek değerlendirildi AMH Prosedürü Deneklerden deneyin başlangıcında ve sonunda alınan kan örneklerinden elde edilen serumularda AMH seviyesi ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) yöntemiyle hazır kit (Shanghai Sunred Biological Technology Rat (AMH) ELISA Kit ) kullanılarak çalışıldı. Serum örnekleri 2500 rpm de 20 dk. santrifüj edildi ve supernatantları alınarak -80 C de saklandı ve test günü oda sıcaklığında çözüldü. Kitin sensitivitesi 0,101 ng/ml idi. Numuneler kitin prosedürüne göre çalışıldı. Sonuçlar standart eğrisine göre hesaplandı ve ng/ml olarak verildi İstatistiksel Prosedür Değişkenlerin normal dağılıma uygunluğu grafiksel olarak ve Shapiro-Wilk testi ile incelendi. Normal dağılım şartını sağlayan değişkenleri tanımlamak için ortalama ± standart sapma değeri kullanıldı. Parametrik test varsayımlarını sağlayan ağırlık seviyelerini tedavi gruplarına göre karşılaştırmak için Independent Samples T Testi; bağımlı değişkenleri (preoperepostepere) karşılaştırmak için ise Paired Sample t testi testi kullanıldı.

49 34 Parametrik test varsayımlarını sağlamayan AMH seviyelerini nonparametrik olarak gruplararası karşılaştırmak için Bonferroni düzeltmeli Mann-Whitney testi; bağımlı değişkenleri (preopere-postepere) karşılaştırmak için ise Friedman analizi kullanıldı. İstatistiksel analiz ve hesaplamalar IBM SPSS Statistics 21 (IBM Corp, NA, USA) ve MS- Excel 2013 ile yapıldı. İstatistiksel kararlarda p 0.05 anlamlı farklılığın göstergesi olarak kabul edildi.

50 35 4. BULGULAR 4.1. Brdu Etiketli Kök Hücrelerin Yerleşimi BrdU ile işaretlenen kök hücrelerin ovaryum dokusuna ulaşıp ulaşmadığı kontrol edildi ve fotoğraflandı. Kök hücre uygulamasının yapıldığı her iki grupta da işaretli hücrelerin hem stromada hem de follikül duvarında varlığı belirlendi. (Resim 4.1, 4.2, 4.3) Resim 4.1. BrdU işaretli kök hücre verilmeyen yalın cyclophosphamide grubu, X200 Resim.4.2..BrdU işaretli kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücrelerin ovaryum dokusunda follikül hücreleri arasında ve teka katmanında yer aldığı görüldü, BrdU işaretli hücreler ( ) X400

51 36 Resim 4.3..BrdU işaretli ovarian stromal kök hücrelerin ovaryum stromasına ( ) ve teka katmanına ( ) yerleştiği gözlendi X200; X Ağirliklarin İstatistiksel Olarak Değerlendirilmesi Yapılan değerlendirmelerde deneklerin deney öncesi ve deney sonrası ağırlık ortalamaları alındı. Başlangıç ağırlıklarına bakıldığında grup I, II ve III için ağırlık düzeyleri ortalamaları sırasıyla 162,8±2,7 ; 154,8±2,4 ; 158,5±3,6 olarak saptandı. Deney sonu ağırlıkları ise grup I, II ve III için için ağırlık düzeyleri ortalamaları sırasıyla 154,9±5,1 ; 134,5±3,4 ; 157,1±4,8 olarak saptandı. (Şekil 4.1) Şekil 4.1.Gruplara ait pre ve post-opere ağırlık farkı ortalamaları

52 37 Gruplar arası preoperatif ve postoperatif ağırlık farklarını istatistik olarak ortaya koymak için Independent Samples T Test uygulandı. p<0.05 ten küçük olan değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. İstatistiksel olarak yapılan değerlendirmede grup I, II ve III için ağırlıkların sırasıyla 7,9; 20,4; 1,4 azaldığı belirlendi. İstatistiksel olarak grup I ile II ve grup I ile III kıyaslandığında aralarındaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (p=0,520; p=0,230). Grup II ile III kıyaslandığında ise aralarında fark anlamlıydı (p=0,001). Her grubun kendi içinde pre ve postoperatif ağırlık ortalamalarının farkını istatistiksel olarak ortaya koymak için Paired-Samples T Test uygulandı. p<0.05 ten küçük olan değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Grup I ve III kendi içerisinde karşılaştırıldığında preopere-postopere ağırlıkları arasındaki farklar istatistiksel olarak anlamsız iken (p=0,106; p=0,642); grup II kendi içinde karşılaştırıldığında ortaya çıkan fark istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,001) 4.3. AMH Bulguları Yapılan değerlendirmelerde ratların deney öncesi ve deney sonrası serum AMH değerleri istatistiksel olarak değerlendirildi. Buna göre; Preopere AMH seviyelerine bakıldığında grup I, II ve III için serum AMH ortanca (çeyrekler arası genişlik) değerleri sırasıyla 0,91 (0,23); 0,95 (0,93); 1,65 (5,72) olarak saptandı. Postopere serum AMH seviyeleri ise grup I, II ve III için sırasıyla 0,82 (0,24); 0,77 (0,32); 1,08 (0,47) olarak saptandı. (Çizelge 4.1) Çizelge 4. 1 Gruplara ait pre ve post-opere AMH seviyeleri ortalama ve ortanca değerleri Pre-opere AMH Ortalama±Sta ndart sapma Post-opere AMH Ortalama±Sta ndart sapma Pre-opere AMH Ortanca (Çeyrekler arası genişlik) Post-opere AMH Ortanca (Çeyrekler arası genişlik) Grup I 0,96±0,07 0,93±0,12 0,91 (0,23) 0,82 (0,24) Grup II 1,40±0,50 0,81±0,06 0,95 (0,93) 0,77 (0,32) Grup III 3,54±0,90 1,12±0,12 1,65 (5,72) 1,08 (0,47)

53 38 Gruplar arası preoperatif ve postoperatif serum AMH farklarını istatistik olarak ortaya koymak için Mann-Whitney testi uygulandı. p<0.05 ten küçük olan değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. İstatistiksel olarak yapılan değerlendirmede grup I, II ve III için serum AMH seviyelerinin sırasıyla 0,03; 0,59; 2,42 ng/ml azaldığı belirlendi. Gruplar ikili karşılaştırıldığında, grup I ile II, grup I ile III ve grup II ile III arasında istatistiksel fark görülmedi.(p=0,478; p=0,101; p=0,332). Her grubun kendi içinde pre ve postoperatif serum AMH farklılıklarını istatistiksel olarak ortaya koymak için Friedman testi uygulandı. p<0.05 ten küçük olan değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Grup II ve III kendi içerisinde karşılaştırıldığında preoperepostopere serum AMH seviyeleri arasındaki farklar istatistiksel olarak anlamsız iken (p=0,336; p=0,132); Grup I kendi içinde karşılaştırıldığında ortaya çıkan fark istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,035) 4.4. Histomorfolojik Bulgular Çalışmada kullanılan ratlardan elde edilen ovaryum doku örneklerinden hazırlanan praparatlar H&E ile boyanmış ve yapılan histomorfolojik değerlendirmelerde; Grup I de primordial folliküllerdeki oositlerde sitoplazmik kayıp, vakuolizasyonlar dikkati çekti. Erken multilaminer primer follikül hücreleri arasında junctional dejenerasyonlar ve follikül hücresi-oosit bileşkesinde dejenerasyonlar gözlendi (Resim 4.4).

54 Resim 4.4..Cyclophosphamide grubunda primordial folliküllerdeki oositlerde sitoplazmik kayıp ve vakuolizasyonlar ( ),erken multilaminer primer folliküllerde follikül hücreleri arasında junctional dejenerasyonlar ( ) ve follikül hücresi-oosit bileşkesinde dejenerasyonlar ( ) X400 39

55 40 Grup II de primordial ve erken multilaminer folliküllerde yer alan oositlerin sitoplazmasında vakuolizasyonlar ve özellikle primer folliküllerdeki granüloza hücreleri arasında junctional dejenerasyonlar kontrol grubuna gore kısmen azalmış olarak gözlendi (Resim 4.5). Resim 4.5. Grup II de primordial ( ) ve erken multilaminer folliküllerde ( ) yer alan.oositlerin sitoplazmasında vakuolizasyonlar, primer folliküllerdeki granüloza.hücreleri arasında junctional dejenerasyonlar ( ) X400

56 41 Grup III 'te ise primordial folliküllerde yer alan oositler ve follikül hücreleri-oosit bileşkesi diğer iki gruba göre normal yapıda gözlenirken çeşitli evrelerdeki erken primer folliküllerde ise granüloza hücreleri arasındaki bağlantılarda ve follikül hücreleri ile oosit bileşkesinde bütünlük dikkati çekti. Ancak bazı oositlerde diğer iki gruba göre daha az olmak üzere sitoplazmik vakuolizasyonlar gözlendi (Resim 4.6). Resim 4.6. Grup III de primordial folliküllerde yer alan oositler ve follikül hücreleri-oosit bileşkesi normal yapıda ( ), çeşitli evrelerdeki erken primer folliküllerde granüloza hücreleri arasındaki bağlantılarda ( ) ve follikül hücreleri ile oosit bileşkesinde bütünlük gözleniyor ( ) X400

57 p34cdc2 Bulguları Grup I de Primordial folliküllerde ve çeşitli aşamalardaki primer folliküllerde ve primerden antral folliküle geçiş evresindeki folliküllerde yer alan oositlerde p34cdc2 tutulumu orta derecedeydi (Resim 4.7). Resim 4.7. Grup I de antral folliküllrde yer alan oositte, ganüloza hücrelerinde ve teka.katmanında.orta derecede p34cdc2 tutulumu X400

58 43 Grup II de unilaminer primer folliküllerde yer alan oositlerde p34cdc2 tutulumu zayıfken (Resim 4.8 küçük resim) erken ve geç multilaminer folliküllerdeki oositlerde tutulum kontrol grubundaki gibi orta derecedeydi (Resim 4.8 büyük resim). Resim 4.8. Grup II de erken primer follikülde oosit ve granüloza hücreleri zayıf pozitif.(küçük resim) X400 geç primer folliküllerde yer alan oosit ve granüloza.hücrelerinde orta derecede tutulum (büyük resim) X100

59 44 Grup III de multilaminer primer folliküllerde yer alan oositlerde ve granüloza hücrelerinde kuvvetli (Resim 4.9 küçük resim), erken primer folliküllerde orta derecede ve antral folliküllerde ise kuvvetli p34cdc2 tutulumu gözlendi (Resim 4.9 büyük resim). Resim 4.9. Grup III de multilaminer primer follikülde yer alan oositlerde ve granüloza.hücrelerinde kuvvetli (küçük resim) X400; erken primer orta derecede ve.antral folliküllerde ise kuvvetli p34cdc2 tutulumu (büyük resim) X400

60 Connexin-43 Bulguları Grup I de connexin-43 tutulumu primordial follikülden gelişmekte olan follikül aşamalarında yani primer folliküller ve antral folliküllerde gözlenmedi (Resim4.10). Resim Grup I de primordial, erken primer, geç primer ve antral folliküllerde granüloza hücreleri connexin-43 negatifti X400

61 46 Grup I de graff follikülünde yer alan follikül hücreleri arasında belirgin connexin-43 tutulumu vardı (Resim 4.11). Resim Grup I de graaf follikülünde granüloza hücreleri arasında pozitif connexin-43 tutulumu ( ) X400

62 47 Grup II de cyclophosphamide grubunda olduğu gibi primordial follikülden itibaren gelişen folliküldeki granüloza hücreleri arasında connexin-43 tutulumu gözlenmezken (Resim4.12) Graaf follikülüne dönüşmekte olan geç antral follikülde tutulum pozitifti (Resim4.13). Resim Grup II de primordial, erken primer, geç primer ve antral folliküllerde granüloza hücreleri connexin-43 negatifti X400

63 48 Resim Grup II de geç antralden graff follikülüne geçiş aşamasındaki folliküllerde.granüloza hücreleri arasında pozitif connexin-43 tutulumu ( ) X400

64 49 Grup III de ise primordial folliküllerde connexin-43 varlığı belirlenemezken, unilaminerden multilaminer primer folliküle geçiş aşamasındaki folliküllerde belirgin olarak gözlendi (Resim4.14a), diğer iki gruptan farklı olarak erken ve geç antral folliküllerde (Resim4.14a,b,c) ve graaf folliküllerinde belirgin connexin-43 tutulumu vardı (Resim 4.14d). Resim Grup III de erken primer follikül ve antral follikülde pozitif (a), çeşitli.evrelerdeki seconder folliküllerde pozitif (b), multilaminer ve antral.follikülde pozitif (c) ve graaf follikülünde pozitif connexin-43 tutulumu (d).x400

65 BMP-6 Bulguları Cyclophosphamide grubunda BMP-6 tutulumu primordial folliküllerde (Resim 4.15) unilaminer ve multilaminer primer folliküllerde yer alan oositlerde negatifti (Resim 4.16). Resim Grup I de primordial ve çeşitli aşamalardaki primer folliküllerde yer alan.oositlerde negatif BMP-6 tutulumu X400

66 Resim Grup I de erken ve geç primer folliküllerde yer alan oositlerde negatif BMP-6 tutulumu X400 51

67 52 Grup II de primordial ve primer folliküllerde yer alan oositlerde zayıf BMP-6 tutulumu gözlendi (Resim 4.17). Antral folliküllerde ise tutulum orta derecede gözlendi (Resim 4.18). Resim Grup II de erken primer follikülde yer alan oositlerde zayıf derecede BMP-6.tutulumu X400

68 Resim Grup II de antral follikülde yer alan oositlerde orta derecede BMP-6 tutulumu X400 53

69 54 Grup III de ise primordial folliküllerde (Resim 4.19 küçük resim), primer ve antral folliküllerde yer alan oositlerde BMP-6 tutulumu orta derecedeydi (Resim 4.19 büyük resim). Resim Grup III de primordial follikülde yer alan oositte orta derecede (küçük resim) X400; erken primer ve antral folliküllerde yer alan oositlerde de orta derecede BMP-6 tutulumu (büyük resim) X400

70 BMP-15 Bulguları Cyclophosphamide grubunda primordial folliküllerde yer alan oositlerde ve follikül hücrelerinde BMP-15 tutulumu negatifken (Resim 4.20 küçük resim) unilaminer ve multilaminer folliküllerin granüloza hücrelerinde bazı hücrelerin pozitif reaksiyon gösterdiği belirlendi. Bu folliküllerde yer alan oositlerde ise BMP-15 tutlumu yoktu (Resim 4.20 büyük resim). Resim Grup I de primordial follikülerde BMP-15 tutulumu negatif (küçük resim).x100; çeşitli aşamalardaki primer folliküllerde yer alan oositlerde ise negatif.tutulum varken bu aşamadaki folliküllerin granüloza hücrelerinde izelenen.pozitif reaksiyon (büyük resim) X400

71 56 Grup II de primordialden primere geçiş aşamasındaki follikülde yer alan oositlerde ve follikül hücrelerinde negatif BMP-15 tutulumu belirlenirken (Resim 4.21 küçük resim), primer ve antral folliküllerde yer alan oositlerde ve granüloza hücrelerinde orta derecede BMP-15 tutulumu gözlendi (Resim 4.21 büyük resim). Resim Grup II de primordialden primere geçiş aşamasındaki follikülde yer alan.oositlerde ve follikül hücrelerinde negatif BMP-15 tutulumu (küçük resim).x100; primer ve antral folliküllerde yer alan oositlerde ve granüloza.hücrelerinde orta derecede BMP-15 tutulumu (büyük resim) X400

72 57 Grup III de primordial folliküllerde yer alan oositlerde ve granüloza hücrelerinde orta derecede BMP-15 tutulumu gözlenirken (Resim 4.22 küçük resim), Çeşitli aşamalardaki primer folliküllerde ve antral follikülde yer alan oositlerde ve granüloza hücrelerinde kuvvetli BMP-15 tutulumu belirlendi (Resim 4.22 büyük resim). Resim Grup III de primordial folliküllerde yer alan oositlerde ve granüloza hücrelerinde orta derecede BMP-15 tutulumu (küçük resim) X400, çeşitli aşamalardaki primer folliküllerde ve antral follikülde yer alan oositlerde ve granüloza hücrelerinde kuvvetli BMP-15 tutulumu (büyük resim) X400

73 58

74 59 5. TARTIŞMA Dünya Sağlık Örgütü Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı'nın yayınladığı GLOBOCAN-2012 verilerine göre; 2012 yılında dünyada 14,1 milyon yeni kanser vakası olduğu ve 8,2 milyon kansere bağlı ölüm gerçekleştiği rapor edilmiştir. Kemoterapi stratejilerinin geliştirilmesi, görüntüleme tekniklerinin ilerlemesi ve erken teşhis çoğu kanser türü için sağ kalım oranını önemli ölçüde yükseltmektedir [1, 2]. Ne yazık ki, kanser tedavisinin gonadotoksik etkisi hastalarda follikül havuzunun azalmasına ve erken menopoza yol açarak uzun dönemde infertilite ve cinsel fonksiyon bozukluğuna neden olmaktadır. Kemoterapinin gonadotoksik etkisi hastanın yaşı, tedavi süresi, kemoterapik ajanın türü ve dozuna göre değişiklik göstermektedir. Tedavi öncesi embriyo ve oosit dondurma işlemleri, fertilitenin kazanılabilmesi için kullanılan standart tekniklerdir. Fakat, bu iki teknik için de gerekli olan 2 haftalık ovarian stimulasyon ve yüksek seviyede östrodiol uygulaması, göğüs kanseri gibi hormon bağımlı tümörlerde kontrendikasyona neden olmaktadır. Ovaryum dokusunun dondurulması ise iskemiye bağlı follikül kaybı ve kanserli hücrelerin tekrar nakledilmesi riski nedeniyle halen deneysel bir teknik olarak görülmektedir. Bu tekniklere alternatif olarak; anti-oksidan tedavisi, GnRHa uygulamaları ve kök hücre uygulamaları gibi farklı tekniklerin, kullanılabilirliği hakkındaki araştırmaların sayısı gün geçtikçe artmaktadır [1, 2, 7-9]. Hastalarda kemoterapi sonrası ovaryum hasarının klinik işaretleri hemen görülmese de, kemoterapinin etkileri primordial follikül havuzundaki azalmaya bağlı olarak yıllar sonra ortaya çıkabilmektedir. Meirow D. ve arkadaşları 1999 yılında kemoterapinin ovaryum ve primordial folliküller üzerine doza bağlı etkisini incelemek amacıyla, aynı yaştaki Balb/c farelere farklı dozlarda cyclophosphamide uygulamış. Cyclophosphmide uygulamasını takiben, deneklerin her iki ovaryumundaki toplam primordial follikül sayılarını değerlendirmiştir. Kemoterapinin ovaryuma etkisinin ya hep ya hiç olgusunda olmadığını, toplam primordial follikül sayısının cyclophosphamide uygulamasındaki doz artışı ile doğru orantılı şekilde azaldığını bildirmişlerdir [32]. Genç kadınlarda follikül rezervinin daha fazla olması nedeniyle; primordial follikül sayısındaki bu azalma ani bir ovaryum yetmezliğini işaret etmez. Kemoterapi büyük

75 60 miktarda follikül kaybına neden olsa da, ovaryumda kalan folliküller ovaryum fonksiyonunun sınırılı bir süre için düzgün olarak devam etmesini sağlar. Fakat primordial follikül sayısının genç yaşta ve doğal olmayan bir şekilde ovaryum fonksiyonu için gerekli olan minumum seviyenin altına düşmesi prematür over yetmezliği ile sonuçlanmaktadır [32]. Byrrne J. ve arkadaşları 1992 yılında alkilleyici ajanlarla tedavi edilen 20 yaşın altındaki kadın hastaları değerlendirdikleri çalışmada hastalarda erken menopoz görülme riskinin kontrol grubu hastalara göre 9 kat daha fazla olduğunu belirtmişler [113] yılında Meirow D. ve ark. yaptıkları retrospektif bir çalışmada yılları arasında kemoterapi görmüş 168 kadın hastayı değerlendirmiş ve bu hastaların 57 'sinde (%34) kemoterapi sonrası ovarian hasar olduğu belirlemişlerdir. Kemoterapik ajanlar 5 gruba ayrıldığında gonadotoksik etkisi en yüksek grubun alkilleyici ajanlar olduğu (%42.4) ve çoktan aza doğru sırasıyla cisplatin, bitkisel alkaloidler, antimetabolitler ve antibiyotikler şeklinde sıralandığı belirtilmiştir [3]. Bir alkilleyici ajan olan Cyclophosphamide'in malign lenfoma, miyeloma, lösemi, nöroblastom, retinoblastoma, göğüs kanseri tedavisinde kemoterapik olarak ve organ transplantasyonu ile oto-immün hastalıkların tedavisinde immün-supressor olarak kullanımı yaygındır [2]. Patti F., Messina S. ve ark yılında cyclophosphamide ile tedavi edilmiş, yaşları arasındaki multipl skleroz hastası 105 kadının hamilelik durumlarını inceleyen retrospektif bir çalışma yapmışlar. 105 hastanın 11'inin (%10,4) başarılı şekilde hamile kaldığını, 5 hastanın erken doğum gerçekleştirdiğini ve 1 çocukta gelişim geriliği olduğunu rapor etmişler [114]. Topel H. ve arkadaşları cyclophosphamide'in ovaryum dokusunda oluşturduğu hasara Rosiglitazon'un etkilerini incelemek için yaptıkları deneyde denekleri 3 gruba ayırmış. Kontrol grubuna hiçbir uygulamada bulunulmamış, 1.grup olan kemoterapi grubuna 100mg/kg cyclophosphamide IP olarak uygulanmış, 2.grup olan rosiglitazon grubuna ise IP 100mg/kg cyclophosphamide uygulanmış. Elde edilen örnekler elektron mikrokobunda değerlendirilmiş. Kontrol grubunda ovaryum dokusu normal olarak gözlenmiş. Kemoterapi

76 61 grubunda zona pellusidayla bağlantılı makrofajlar ve oosit sitoplazmasında miyelinizasyon olduğu görülmüş. Granuloza hücre katmanında apoptotik hücrelerin ve makrofajların varlığı gözlenmiş. Rosiglitazone grubunda, oosit ve granüloza hücrelerinin normal olduğu belirtilmiş. Cyclophosphamide +NaCl uygulanan grupta granüloza hücre katmanında mitotik aktivitenin bütün gruplardan fazla olduğu ve bu artışın cyclophosphamide'in kanserojenik etkisinden kaynaklanabileceği belirtilmiş [115]. Bizim çalışmamızda ise Grup I 'de cyclophosphamide uygulamasının etkisi sonucu histomorfolojik olarak; primordial ve çeşitli aşamalardaki primer folliküllerde yer alan oositlerde vakuolizasyonlar ve sitoplazmik içerik kaybı gözlendi. Ayrıca bu folliküllerde follikül hücresi-oosit bileşkesinde yer yer ayrılmalar ve özellikle oosite yakın hücreler arasında hücreler arası aralığın genişlediği belirlendi. MKH'ler sistemik bir şekilde vücuda verildiğinde hedef bölgeye yönelmekte ve yerleşmektedir. Vücut içerisinde farklılaşmasının yanı sıra, salgıladıkları uyarıcı veya engelleyici maddeler ile de parakrin etki göstererek düzenleyici ve tedavi edici etki yapmaktadır. Klinikte kullanımları henüz yeni sayılsa da, farklı hayvan türlerinde gerçekleştirilmiş çok sayıda deney MKH'lerin otolog ve allojenik olarak birçok hastalığın tedavisinde kullanılabilir olduğu konusunda umut vericidir [10, 51] Hübner K. ve ark yılında yaptıkları çalışamada green fluoresan protein işaretli embriyonik kök hücrelerden, uygun in-vitro ortamda germ hücreleri elde ettiklerini bildirmiştir. Araştırmacılar elde ettikleri oosit benzeri bu hücrelerin primordial germ hücrelerinin belirteci olan c-kit, MVH ve Scp3 proteinlerini eksprese ettiğini ve etrafında zona pellusida benzeri bir kılıf bulunduğunu gözlemiştir. İlerleyen kültürlerde follikül benzeri yapıların oluştuğunu ve östrojen sentezinin görüldüğünü bildirmişlerdir [116]. Woods D. C. ve arkadaşları 2013 yılında germ hücrelerine özgü Pou5f1 geni protmotörlüğünde green fluoresan protein sentezleyen ve granüloza hücrelerine özgü Foxl2 geni promotörlüğünde kırmızı fluoresan protein (DsRed) sentezleyen embriyonik kök hücreleri uygun in-vitro şartlar altında geliştirmişler. Araştırıcılar ilk olarak DsRed pozitif hücreler ile etrafı çevrelenmiş, green fluoresan protein pozitif hücrelerden oluşan follikül benzeri yapıların varlığını gözlemişler. DsRed pozitif hücreleri izole ederek granuloza

77 62 hücrelerine özgü Foxl2, follistatin, AMH, ve FSH reseptörü mrnalarının pozitif olduğunu belirlemişlerdir [117]. Kabul edilen klasik görüşe göre, yetişkin insan ovaryumunda yeni follikül oluşumu gerçekleşmemektedir. Fakat son yıllarda yayınlanan çalışmalar fötal dönemde ortaya çıkan OKH'lerin erişkin dönemde yeni oosit ve granüloza hücrelerine dönüşebileceği konusunda bilgiler vermektedir. Bu yeni görüşe göre fötal dönemde oluşan ve epitel-mezenkim geçişi ile mezenkim benzeri hücrelere dönüşerek tunika albuginea içerisine yerleşen OKH'ler pubertede başlayan üreme dönemiyle birlikte mezenkim-epitel geçişiyle tekrar OKH'lere dönüşürler. Bu OKH'ler hem granüloza hücrelerini hem de yeni germ hücrelerini oluştururlar. Oluşan bu germ hücreleri granüloza hücreleri arasından geçerek damar içine girer ve beraberindeki yeni granüloza hücreleri ile birlikte korteksin derinliklerine ilerler. Korteksin derinliklerine ulaşan bu hücreler damar üzerinde cepler oluşturur ve dolaşımdaki granüloza hücreleri ile birlikte yeni primordial follikülleri şekillendirir [11-15] Farklı kaynaklardan elde edilen kök hücrelerin kemoterapi uygulanmış ovaryum dokusu üzerine etkilerini inceleyen araştırmaların sayısı gün geçtikçe artmaktadır. Takehhara Y. ve ark. 7-8 haftalık wistar cinsi sıçanlara, intra-peritoneal olarak cyclophosphamide uygulayarak ovaryum hasarı oluşturdukları deney modelinde adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin onarıcı etkilerini incelemişler. Adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin teka hücre katmanı içerisine yerleştiğini fakat follikül içerisine giremediğini gözlemişler [55]. Xiao G. Y. ve ark yılında yaptıkları çalışmada; green fluoresan protein ekspresyonu yapabilen transgenik farelerden elde ettikleri amniyon sıvısı kök hücrelerini, kemoterapi ile ovaryum hasarı oluşturulmuş farelere transplante etmişler. Yeşil flouresan işaretli kök hücrelerin folliküllerden çok ovaryum intersitisyumunda yerleştiğini gözlemlemişler. Amniyon sıvısından elde edilen kök hücrelerin kemoterapi uygulanmış fare ovaryumlarında follikül atrezisini engellediğini fakat in-vivo olarak granüloza hücrelerine yada germ hücrelerine farklanmadığını bildirmişler [56]. Kılıç S. ve ark. tarafından 2014 yılında yayınlanan çalışmada, pubertede cyclophosphamide ile indüklenmiş ovaryum hasarında kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücrelerin koruyucu etkisi incelenmiş. Kemoterapi sonrası KİKMKH uygulanan grupta

78 63 follikül sayısının anlamlı derecede arttığı; in-vivo transplantasyonu yapılan KİKMKH'lerin hasarlı follikülere göç ettiği gösterilmiştir [57]. Afifia N. M. ve Reyad O. N yılında yayınladıkları çalışmada KİKMKH'lerin kemoterapi ile indüklenmiş ovaryum hasarına etkisini incelemişler. Kemoterapiyi takiben KİKMKH uygulamasının ardından birçok primordial follikül, sekonder follikül ve korpera lutea olduğunu gözlemlemişler. Yüzey epitelinde, yüzeye yakın folliküllerin ve primordial folliküllerin oositlerinde PCNA immün reaktivitesinin pozitif olduğunu belirlemişlerdir [118]. Bizim çalışmamızda da BrdU işaretli kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücrelerin ovaryum stromasında, teka hücre katmanında ve antruma yakın follikül hücrelerinde olarak yer aldığı belirlendi. Ayrıca ovarian stromal kökenli mezenkimal kök hücrelerin de teka hücre katmanında ve stromada yerleştikleri gözlendi. Mezenkimal kök hücre uygulaması yapılan gruplar histomorfolojik olarak değerlendirdiğimizde Cyclophosphamide uygulanarak kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücre verilen grup II 'de; primordial ve erken multilaminer folliküllerde yer alan oositlerin sitoplazmasında vakuolizasyonlar ve özellikle primer folliküllerdeki granüloza hücreleri arasında junctional dejenerasyonlar grup I'e göre kısmen azalmış olarak gözlendi. Cyclophosphamide uygulanarak ovarian stromal kök hücre verilen grup III 'te ise primordial folliküllerde yer alan oositler ve follikül hücreleri-oosit bileşkesi diğer iki gruba göre normal yapıda gözlendi. Çeşitli evrelerdeki erken primer folliküllerde, granüloza hücreleri arasındaki bağlantılarda ve follikül hücreleri ile oosit bileşkesinde de bütünlük korunmuştu. Ayrıca bazı oositlerde diğer iki gruba göre daha az sitoplazmik vakuolizasyonlar gözlendi. Kaya H. ve ark yılında yaptıkları çalışmada hücre canlılığını desteklediği bilinen sfingozin-1 fosfat'ın (S1P) cyclophosphamide ve radyasyonla oluşturulmuş ovaryum hasarına olan etkisini incelemişler ve grupların vücut ağırlıkları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığını rapor etmişlerdir. [117]. Bizim çalışmamızda da grup I ve grup III deki deneklerin pre ve postoperatif ağırlık ortalamaları değerlendirildiğinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı. Grup II de

79 64 ise pre ve postoperatif gruplardaki deneklerin ağırlık ortalamaları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olduğu belirlendi. Postoperatif deneklerde kilo kaybı fazlaydı. Bu farkın bu gruptaki bazı deneklerin cyclophosphamide uygulamasından sonra yeteri kadar rehidrate olamamalarından kaynaklandığı düşünüldü. Oktem Ö. ve Oktay K. insan fötal ovaryum dokusu ile farelerde bir xenograft model oluşturmuş ve modellere 200mg/kg Cyclophosphamide uygulayarak 12, 24, 48 ve 72 saat sonraki etkilerini incelemiştir. Cyclophosphamide uygulamasından 48 saat sonra primordial follikül sayısında %93 azalma olduğunu belirlemişlerdir [63]. Meirow D. ve arkadaşları 1999 yılında yaptıkları çalışmada kemoterapi uygulamasının primordial follikül havuzundaki azalmaya olan etkisini ölçmüş ve kemoterapi nedeniyle primordial follikül sayısındaki azalma sonrası üreme akıbetini değerlendirilmiş. 5-6 hafatlık Balb/c farelere 20, 50 ve 100 mg/kg cyclophosphamide, kontrol grubu deneklere ise IP olarak steril su uygulanmış. Uygulama sonrası 7. günde deneklerin ovaryumları incelenmek üzere alınmış. Uygulanan tüm dozların primordial follikül sayısında azalmaya neden olduğu ve bu azalmanın doz artışına paralel olduğu görülmüş. Primordial follikül havuzunun %50 azalmasına neden olan 75mg/kg cyclophosphamide uygulanan gruptaki deneklerin ovulasyon, çiftleşme ve hamilelik oranları değerlendirilmiş. Elde edilen sonuçlar kontrol grubu ile karşılaştırıldığında primordial follikül sayısındaki anlamlı azalmaya rağmen üreme potansiyelinin bu durumdan etkilenmediği belirtilmiş. Üreme performansının ovaryum hasarının değerlendirilmesinde doğru bir parametre olamayacağı, primordial follikül sayısının kemoterapi ile indüklenen ovaryum hasarını doğrudan yansıttığı belirtilmiş [119]. Fötal yaşamdan sonra AMH, dişide granüloza hücreleri tarafından salgılanmaktadır. Ovaryumda primordial folliküllerin farklılaşmaya başlamasıyla birlikte AMH ekspresyonu, multilaminar primer ve küçük sekonder folliküllerde en yüksek düzeye ulaşır [59, 60, 62]. Serum AMH konsantrasyonu, kalan primordial folliküllerin miktarını gösteren, sekonder follikül havuzunun büyüklüğünü doğru bir şekilde yansıtmaktadır ve sekonder follikül sayısı primordial follikül miktarıyla orantılı olarak ilişkilidir. AMH, ovaryum yaşlanmasının menstrual siklusa bağlı ve primordial follikül havuzunun azalmasının nispeten geç belirteçleri olan inhibin B, östradiol ve FSH'ın aksine klinik açıdan kullanımı

80 65 kolay bir belirteçtir. AMH seviyesi, ovarian fonksiyon bozukluğu, gonadotoksik kanser tedavisi veya ovaryum ameliyatlarının üremeye olan etkisini tahmin etmede yardımcı olur [58, 64]. Detti L. ve ark. puberte öncesi cyclophosphamide uygulanan dişi farelerde yetişkin dönemde follikül rezerv belirteci olarak AMH 'yi test etmişlerdir. AMH miktarının ovaryum fonksiyonunun kantitatif belirteci olduğunu iddia eden araştırıcılar, çalışmada 18 günlük dişi farelere placebo ve IP cyclophosphamide (120mg/kg) uygulamışlar. Serum AMH seviyeleri fareler 43, 56 ve 95 günlükken ELISA yöntemi ile değerlendirilmiş. Cyclophosphamide'e maruz kalan tüm denekelerde 1 mm 2 'deki follikül sayısı ve serum AMH seviyesinde anlamlı bir azalma olduğu belirlenmiş. Kontrol grubunda AMH seviyesinde eş zamanlı bir azalma belirlenememiş [120]. Uluğ P. ve Öner G yılında yayınladıkları çalışmalarında ektopik gebeliklerin tedavisinde kullanılan bir folik asit antagonisti olan methotrexate (MTX) uygulamasının ve salpingectomy uygulamasının ovarian rezerve olan etkisini incelemek için wistar albino cinsi dişi sıçanları kullanmışlar. Elde ettikleri bulgularda follikül sayısına paralel olarak serum AMH seviyelerinin tek doz ve çoklu doz MTX uygulanan gruplar ile salpingectomy uygulanan grupta kontrol grubuna göre anlamlı derecede azalma olduğunu bildirmişlerdir [121]. Özcan P. ve ark. sıçanlarda oluşturdukları oksidatif strese bağlı ovaryum hasarı modelinde antioksidan olan resveratrolün koruyucu etkisini araştırmışlar. Yalın cisplatin uygulanan gruptaki Serum AMH miktarının resveratrol ile birlikte uygulanan cisplatin grubuna göre anlamlı derecede düşük olduğu belirlenmiş. Follikül sayıları değerlendirildiğinde gruplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı ve serum AMH seviyeleri ile pozitif ilişkili olduğu gözlenmiş. Sonuç olarak oksidatif stresin ovaryum yaşlanmasında önemli bir rolü olduğu resveratrolün oksidatif strese karşı etkili bir seçenek olabileceği düşünülmüştür [122]. Fong S. L. ve ark. gonadotoksik ajanlar ile tedavi edilen hastalarda, sub-klinik ovaryum hasarını değerlendirmek için serum AMH düzeylerini ölçmüştür. Çalışmada hematopoetik malignitesi olan 25 hastanın, serum AMH konsantrasyonları kanser tedavisi öncesi ve sonrasında ölçülmüş ve normo-ovulatuar kontrolleri ile karşılaştırılmış. Kontrol grubu

81 66 olarak kanser geçmişi bulunmayan ve menstrual döngüsü düzenli olan 42 kadın değerlendirmeye alınmış. Tüm hastalarda tedaviden önceki AMH konsantrasyonları, kontrol grubuna göre daha düşük bulunmuştur. 13 hastaya çoklu ilaç uygulamasıyla kemoterapi yapılmış. Kemoterapi sonrası hastaların ovarian siklusları tekrar düzelse de ortalama serum AMH miktarı kontrol grubuna göre daha az olduğu belirlenmiş. Kemik iliği transplantasyonu öncesinde yüksek dozlarda kemoterapi uygulamasına bağlı olarak, bu yöntemin klinikte kullanılmaya başlandığı 1970'li yıllardan beri hastaların çok azında gebelik görülmektedir. Radyoterapi sonrası kök hücre transplantasyonu yapılan 12 hastada da tedavi sonrası prematür ovarian yetmezlik görülmüş ve AMH seviyeleri belirlenemeyecek kadar düşük bulunmuş. Bu nedenle, bu hastalarda fertilitenin korunmasının dikkate alınması gerektiği önerilmiş. Kemoterapi ile tedavi edilen hastalarda, ovaryum rezervinin de tehlikede olduğu belirtilmiş [119, 123, 124]. Bizim çalışmamızda da tüm gruplardaki preoperatif denekler ile postoperatif denekler arasında serum AMH değerleri karşılaştırıldığında postoperatif serum AMH seviyelerinin düşük olduğu belirlendi. Bu azalma istatistiksel olarak sadece yalın cyclophosphamide uygulanan grup I de anlamlı diğer iki grupta az anlamlıydı. Heterodimerik bir protein olan MPF, mitotik bir siklin ve siklin bağımlı kinazdan (CDK) oluşur. MPF çok sayıda proteini fosforile ederek hücrenin G2 evresinden M evresine geçişini tetikler. MPF düzenleyici alt birim olan siklin-b ve bir protein kinaz olan Cdc2'den (CDK1) oluşmaktadır [67]. Chesnel F. ve Eppig J. J yılında Mayoz bölünmede tutulmuş gelişmekte olan fare oositlerinde, MPF alt birimleri olan p34cdc2 ve siklinb içeriği açısından eksik olduğu hipotezini test etmişler. Araştırıcılar bu iki MPF bileşeninin birikiminin asenkronize olduğunu belirtmişler. Mayoz bölünmenin devam etmesi için ilk belirtecin germinal vezikül dağılmadan önce oositlerde siklinb birikiminin maksimum seviyeye ulaştığını bildirmişler ve bu nedenle siklinb'nin germinal vezikülün dağılmasında sınırlayıcı faktör olmadığını belirtmişlerdir. Buna karşın oositte germinal vezikül dağılımı olana kadar p34cdc2 sentezi ve birikiminin arttığını bildirmişler. Benzer şekilde in-vitro ortamda granüloza hücreleri yokluğunda kültüre edilen oositlerde p34cdc2 miktarının arttığını fakat bu oositlerde germinal vezikülün dağılmadığını belirtmişler. Bu nedenle fare oositlerinde p34cdc2 birikiminin folliküler somatik hücrelerden bağımsız olduğunu ve bu

82 67 birikimin germinal vezikülün dağılmasında tek başına yeterli olmadığını bildirmişlerdir [69]. Anguita B. ve ark yılında yaptıkları çalışmada 1-2 aylık pre-pubertal keçilerde p34cdc2 mrna, RNA ve protein miktarları ile oosit büyüklüğü arasındaki ilişkiyi incelemişlerdir. Oositlerin hepsinde p34cdc2 mrna varlığı görülmüş. Mayoz bölünmeyi tamamlamış ve tamamlayamamış oositlerde p34cdc2 RNA'sının olduğu belirlenmiş. İnvitro maturasyon öncesi değerlendirmelerde p34cdc2 mrna miktarının μm çapındaki oositlerde diğerlerine göre anlamlı derecede yüksek olduğu fakat in-vitro maturasyon sonrası bu farklılığın olmadığı görülmüş. Oosit çapı arttıkça p34cdc2 protein miktarının da arttığı tespit edilmiş [70]. Quetglas M. D. ve arkadaşları 2010 yılında yaptıkları çalışmada; siklin bağımlı kinaz (CDK) inhibisyonunun p34cdc2, siklinb1 ve MAPK üzerine etkisini değerlendirmişlerdir. Sığırlardan elde ettikleri oositleri kontrol grubu ve CDK inhibisyonu yapılan grup olarak ikiye ayırmışlardır. Kontrol grubu oositler aspirasyondan hemen sonra olgunlaşmamış ve in-vitro maturasyondan sonra olgunlaşmış olarak iki gruba ayrılmış. CDK inhibitörü uygulanan oositerin ise bir kısmı in-vitro maturasyon kültürüne alınmış. Real-time PCR analiz sonuçlarına göre p34cdc2 ve MAPK transkripsiyonunun, CDK inhibisyonu yapılmış ve olgunlaşmamış oositlerde belirlenirken, in-vitro maturasyon sonrası CDK inhibisyonundan bağımsız olarak azalma olduğu gözlenmiş. SiklinB1 seviyesinin tüm gruplarda benzer olduğu görülmüş. Western-Blot analiz sonuçlarına göre p34cdc2 ve MAPK protein seviyelerinin tüm oositlerde aynı, siklinb1 proteinin ise sadece olgun oositlerde var olduğu belirlenmiş. İmmünfloresan incelemelerde p34cdc2'nin olgunlaşmamış ve CDK inhibisyonu yapılmış oositlerin nükleuslarında yoğun olmakla birlikte sitoplazmalarında lokalize olduğu, olgunlaşma sonrasında ise sitoplazma genelinde yayılmış olarak bulunduğu bildirilmiştir [71]. Soleimani R. ve ark. kadın hastalardan alınan insan ovaryum dokusu ile farelerde xenograft bir model oluşturmuş ve deneklere bir alkilleyici ajan olan doxorubicin uygulamışlardır. Doxorubucin uygulanan deneklerde çift DNA zinciri kırığı belirteci olan γh2ax protein miktarının arttığını ve en yüksek artışın primordial folliküllerde olduğunu immünohistokimyasal olarak göstermişlerdir [36].

83 68 S.Morgan ve Arkadaşlarının PubMed ve GoogleScholar veri tabanlarındaki çalışmaları sistematik olarak inceleyerek derledikleri raporda; cyclophosphamide'in DNA'da interstrand ve intra-strand çapraz bağlanmalara neden olarak hücre bölünmesini engellediğini, pro-apoptotik bax proteini ifadelenmesini arttırdığını, Bax proteininin de hücre ölümü sırasında mitokondri içine girerek mitokondrial membran potansiyelini değiştirdiği ve apoptotik kaskadları aktive ettiğini rapor etmişlerdir. Cyclophosphamide'in yine bir alkilleyici ajan olan doxorubucin ile birlikte kullanımında; mitokondrial transmembran potansiyelini değiştirdiği ve sitozolde sitokrom-c birikimine neden olarak caspase ailesini harekete geçirerek apoptoza neden olduğunu bildirmişlerdir [6]. Kaya H. ve ark yılında yaptıkları çalışmada Cyclophosphamide ve radyasyonun ovaryum hasarına olan etkisini incelemişler. Cyclophosphamide ve radyasyon uygulaması yapılan gruplarda primordial ve sekonder folliküllerde (özellikle granüloza hücrelerinde) apoptozis miktarında artış olduğu TUNEL testi ve caspase-3 işaretlemeleriyle belirlenmiş [125]. X Fu ve ark yılında yayınladıkları çalışmada kemoterapi ile indüklenmiş ovaryum hasarında KİKMKH transplantasyonunun ovaryum üzerine olan etkilerini incelenmişler. Kemoterapi sonrası KİKMKH uygulanan grupta, sadece kemoterapi uygulanan gruba göre toplam follikül sayısının daha fazla olduğu ve apoptoz belirteci olan TUNEL pozitif hücrelerin daha az olduğu anti-apoptotik Bcl-2 protein ifadelenmesinin de daha fazla olduğu gösterilmiştir [126]. Bu çalışmada literatüre koşut olarak Cyclophosphamide uygulaması sonucu normal hücre döngüsünün gerçekleşemediği görülmüştür. KİKMKH uygulamasının bu hasarı kısmen önlediği ancak ovarian stromal kök hücre uygulamasının daha da koruyucu olduğu belirlendi. Hücre döngüsü düzenleyici bir molekül olan p34cdc2 grup I 'de primordial folliküllerde, çeşitli aşamalardaki primer folliküllerde ve primerden antral folliküle geçiş evresindeki folliküllerde bulunan oositlerde orta derecede tutulum gösterdi, grup II 'de unilaminer primer folliküllerde yer alan oositlerde zayıfken, erken ve geç multilaminer folliküllerdeki oositlerde grup I deki gibi orta derecedeydi. Grup III te ise unilaminer folliküllerde yer alan oositlerde p34cdc2 tutulumu orta derecedeyken, multilaminer folliküle geçiş evresinde ve erken antral folliküllerde kuvvetli tutulum gözlendi.

84 69 Follikül gelişiminin intraovarian düzenleyicileri olarak ovaryumun stromal hücrelerinden ve oositten sentezlenen büyüme faktörlerinin çoğu transforme edici büyüme faktörü β (TGF- β) süper ailesine aittir. Granüloza ve teka hücreleri tarafından eksprese edilen TGFβ süper ailesi üyelerinden BMP-4 ve BMP-7 (kemik morfogenik protein), primordial follikülden primer follikül gelişimi sırasında pozitif düzenleyicilerdir. Granüloza hücrelerinden salınan anti-müllerian hormon (AMH) primordial - primer follikül geçişinde negatif düzenleyici etki gösterirken, antral faza geçişte kilit görev görmektedir. Erken dönemde oosit tarafından üretilen TGF- β süper ailesi üyeleri GDF-9 (büyüme ve farklılaşma faktörü-9) ve BMP-15 primer follikül gelişiminde uyarıcı etkiye sahiptir. Granüloza hücresi kaynaklı aktivin, BMP-2, BMP-5, BMP-6 teka hücresi kaynaklı BMP- 2, BMP-4, BMP-7 ve oosit kaynaklı GDF9, BMP-15 ve BMP-6 follikül gelişiminin ileri evrelerinde granüloza hücre proliferasyonu için uyarıcı etkiye sahiptir [77]. BMP alt ailesi üyeleri, memelilerde dişi fertilitesinde önemli roller üstlenmektedir. Ovaryumdan eksprese edilen BMP-15, GDF-9, BMP-7 ve BMP-6 erken lüteinizasyonu engelleyerek follikül gelişimini korumaktadır. Granüloza hücrelerinden salınan aktivin ve BMP-6 otokrin ve parakrin etki ile, oositlerden salınan GDF-9, BMP-15 ve BMP-6 ise otokrin etki ile granüloza hücre proliferasyonunu teşvik ettmekte ve FSH bağımlı follikül fonksiyonlarını düzenlemektedir [76, 77]. BMP-6 anjiyogenezin düzenlenmesinde potansiyel bir role sahiptir ve DNA-bağlanma proteinleri inhibitörlerinin (IDS) ekspresyonunu düzenler. IDS follikül seçiminin kontrolü, zamanlaması ve granüloza hücre farklılaşması için gerekli bir proteinlerdir. Özellikle Id-1 BMP-6 'nın iyi tanımlanmış hedeflerindendir. Park S.S. ve ark yılında yaptıkları çalışmada fare modelinde süper ovulasyon işlemi sırasında BMP-6 uygulamasının oosit kalitesine, Id-1 ve vasküler endoteliyal büyüme faktör (VEGF) ifadelenmesine olan etkisini incelemişler. BMP-6 uygulamasının ovulasyonla atılan ve blastokist oluşturabilen oosit sayısında anlamlı bir artışa neden olduğu görülmüş. Id-1 ve VEGF ifadelenmesinde de kontrol gruplarına göre artış olduğu gözlenmiş. Araştırmacılar bu sonuçlara dayanarak BMP-6 'nın ovulasyonun indüklenmesi sırasında ovaryumda Id-1 ve VEGF ifadelenmesini düzenleyerek oosit kalitesinin artışında etkili olabileceğini düşünmüşlerdir [127]. Ogura-Nose S. ve arkadaşları 2012 yılında yaptıkları çalışmada granüloza hücrelerinde AMH üretiminin hangi faktörler tarafından düzenlendiğini araştırmak için in-vitro

85 70 fertilizasyon için oositleri toplanan 28 kadın hastanın granüloza hücrelerini kullanmışlar. Araştırmacılar bu çalışma ile; BMP-2, -6, -7 ve -15 'in granüloza hücrelerinde AMH mrna ve protein seviyelerini anlamlı derecede yükselttiğini, FSH reseptör mrna'sını artırdığını ve sterodijenik akut düzenleyici protein (StAR) mrna seviyesini ise azalttığını göstermişlerdir [84]. Jose R.V. Silva ve ark yılında keçide gelişmekte olan ovaryum folliküllerinde BMP- 6 ifadelenmesini polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve immünohistokimyasal yöntemle incelemişler. BMP-6 ifadelenmesinin primer ve sekonder folliküllerde primordial folliküllere göre daha fazla olduğunu gözlemlemişler. Büyük ve küçük antral folliküllerde kümülus-oosit kompleksinde, granüloza ve teka hücrelerinde aynı seviyede BMP-6 mrna miktarı olduğunu göstermişler. Her aşamadaki folliküllerin oositinde ve sekonder folliküllerin granüloza hücrelerinde BMP-6 ekspresyonu olduğu belirlenmiş. Kültür ortamına BMP-6 eklenmesi sekonder follikülde boyut artışına ve antrum genişlemesine katkısı olmuş. Kültüre eklenen FSH BMP-6 mrna seviyesinde artışa sebep olmuş. FSH ve BMP-6 eklenmesinin FSH reseptörü sayısını arttırdığı görülmüş. Sonuç olarak keçi ovaryumunda BMP-6 mrna seviyesinin primordial-primer-skonder follikül geçişinde arttığı, özellikle sekonder follikül gelişimini desteklediği bulunmuştur [85]. Shi J. ve ark. tarafından 2009 yılında yayınlanan çalışmada, araştırmacılar BMP-6 'nın insan ovaryumdaki lokalizasyonunu immünohistokimyasal olarak araştırmıştır. Elde edilen bulgulara göre primordial ve primer folliküllerin oositlerinde BMP-6 ifadelenmesi açıkça görülmüştür. Granüloza hücrelerinde BMP-6 ifadelenmesi primordial folliküllerde yoğun olarak görülürken, primer ve sekonder folliküllerde daha az olduğu gösterilmiştir. Sağlıklı antral folliküllerin granüloza hücrelerinde yüksek miktarda BMP-6 tutulum görülürken, atretik folliküllerin granüloza hücrelerinde çok zayıf bir tutulum görülmüştür [83]. Bizim çalışmamızda da follikül maturasyon faktörlerinden BMP-6 değerlendirilmiştir. Cyclophophamide uygulamasının primordial folliküllerde, unilaminer ve multilaminer primer folliküllerde yer alan oositlerde yani gelişen folliküllerde ifadelenmediği görüldü oysa KİKMKH uygulamasının primordial ve primer folliküllerde yer alan oositlerde zayıf, antral folliküllerdeki oositlerde ise orta derecede eksprese edildiği gözlendi. OSKH uygulanan grupta ise primordial folliküllerde, primer ve antral folliküllerde yani gelişim aşamalarındaki tüm folliküllerde BMP 6 nın orta derecede ifadelendiği belirlendi.

86 71 Silva J. R. V. ve ark yılında yaptıkları çalışmada GDF9 ve BMP-15 proteinleri ile BMP reseptörleri olan BMPR2, BMPR1A ve BMPR1B 'nin keçi ovaryumunda varlığını ve dağılımını incelemişler. GDF-9 ve BMP-15 proteinlerinin ovaryumdaki yerleşimi immüno histokimyasal olarak incelediklerinde; bu iki proteinin tüm follikül tiplerinin oositlerinde bulunduğunu görmüşler. GDF-9 ve BMP-15'in primordial folliküller haricinde tüm follikül türlerinde granüloza hücrelerinde bulunduğunu belirlemişler. Tüm folliküllerin oosit ve granüloza hücrelerinde GDF-9, BMP-15, BMPR2, BMPR1A, ve BMPR1B mrna'larının varlığı görülmüş, korpera lutea'da ise BMPR2, BMPR1A, BMPR1B ve GDF-9 proteinin mrna'ları bulunduğu bildirilmiştir. Araştırmacılar elde edilen bugulara göre; GDF9 ve BMP-15 mrna ve proteinleri ile BMP reseptör mrna'larının keçi ovaryumunda gelişimin her evresindeki folliküllerde ifadelendiği ve bu proteinlerin follikülogenezis sırasında intrafolliküler düzenleyici sistem oluşturdukları sonucuna vamışlardır. GDF-9 mrna ve proteininin korpus luteumda bulunmasının, bu proteinin korpus luteum fonksiyonunda görev aldığının bir işareti olduğunu da belirtmişlerdir [128]. Hosoe M. ve arkadaşları 2011 yılında 9-11 aylık buzağı ve 4-6 yıllık inek ovaryumunda BMP-15 ve GDF-9 mikatranı ve buzağılardaki düşük oosit gelişimi ile ilişkisini araştırmışlar. Araştırmacılar, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (QPCR) sonuçlarına göre; GDF-9 ve BMP-15 genlerinin ifadelenmesinin yetişkin ineklerin kumulus hücrelerinde buzağılara göre anlamlı dercede yüksek olduğunu, GDF-9 geninin ise buzağı oositlerinde yetişkin ineklerin oositlerine göre anlamlı dercede fazla ifadelendiğini gözlemlemişler. Oositlerde BMP-15 geninin ifadelenmesinde, buzağı ve inekler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı görülmüş. Araştırmacılar aynı zamanda bu proteinlerin ovaryumdaki yerleşimlerini incelemişlerdir. Buzağı antral folliküllerinde bu genlerin mrna'ları oositte daha fazla olduğu, yetişkin antral folliküllerinde ise kumulus hücrelerinde daha fazla olduğu belirtilmiştir. BMP-15 ve GDF- 9 proteinlerinin buzağı ve yetişkin ineklerin tüm folliküllerinde oosit ve kumulus hücrelerinde yer aldığı immünohistokimyasal olarak gösterilmiş. Araştırmacılar buzağı oositlerinin yetişkinlere göre daha az gelişmesinin, BMP-15 ve GDF-9 proteinlerinin oosit ve kumulus hücrelerinde farklı miktarlarda ifadelenmesinden kaynaklanabileceğini belirtmişlerdir [129].

87 72 Otsuka F. ve arkadaşları 2000 yılında yaptıkları çalışmada o yıllarda yeni keşfedilmiş oosite özgü bir büyüme faktörü olan BMP-15'in ifadelenmesini ve biyoaktivitesini incelemek için sıçan granüloza hücrelerini in-vitro olarak incelemişler. Araştırmacılar BMP-15'in FSH'tan bağımsız olarak granüloza hücrelerinin proliferasyonunu uyaran mitojenik etkiye sahip olduğunu göstermişler. Ayrıca; BMP-15'in FSH uyarımı ile gerçekleşen progestron üretiminde belirli bir azalmaya neden olurken östradiol üretimine etkisinin olmadığını gözlemlemişler. Araştırmacılar bu sonuca dayanarak BMP-15'in FSH aktivitesinde düzenleyici olarak rol aldığını belirtmişler. In-situ hibridizasyon deneyleri sonucunda oosit haricindeki hücrelerde BMP-15 mrna sinyali bulunmadığını görmüşler. BMP-15 mrna ifadelenmesinin follikülogenezis boyunca değişimini incelediklerinde primordial follikül oositlerinin %99'unda sinyal görülmemiş. Oosit etrafı granüloza hücrelerinden oluşan tek bir katmanla sarıldığın zayıf bir sinyal oluşmaya başlarken sekonder folliküllerde oositlerin %97'sinde güçlü şekilde sinyal olduğu belirlenmiş. Granüloza hücre katmanı arttıkça hibridizasyon sinyalinin güçlendiği ve sağlıklı olgun folliküllerin oositlerinin tümünde BMP-15 mrna varlığı belirlenmiş. Araştırmacılar sıçan ovaryumunda BMP-15 protein üretimini immünohistokimyasal olarak incelediklerinde; bu proteinin oositte immünpozitif olduğunu gözlemlemiş. Primordial folliküllerin oositlerinde %71 tutulum görülmezken %29'unda çok zayıf bir tutulum olduğu görülmüş. Primer folliküllerin oositlerinde %55 oranında tutulum gözlenirken, granüloza hücre sayısı arttıkça tutulumun daha güçlü olduğu belirtilmiş. Follikül sekonder evreye ulaştığında ise oositlerin tümünde BMP-15 proteini varlığı gösterilirken olgun follikülelrin tüm oositlerinde göreceli olarak güçlü bir tutulum olduğu bildirilmiş. Araştırmacılar bulguları değerlendirdiklerinde BMP-15 ifadelenmesinin follikül gelişimi boyunca arttığı ve BMP-15'in granüloza hücre proliferasyonu ve farklanması üzerinde düzenleyici etkisi olabileceği sonucuna varmışlardır [86]. Bizde çalışmamızda follikül gelişinde etkili moleküllerden biri olan BMP 15 ekspreyonu değerlendirilmiştir. BMP-15 'in cyclophosphamide uygulanan grupta primordial folliküllerde yer alan oositlerde negatif olduğu görüldü. Unilaminer ve multilaminer folliküllerin bazı follikül hücrelerinde pozitif olduğu gözlenirken bu folliküllerde yer alan oositlerde ise BMP-15 ifadelenmesi gözlenmedi. KİKMKH uygulanan Grup II 'de ise primordialden primere geçiş aşamasındaki folliküllerde yer alan oositlerde ve follikül hücrelerinde negatif olarak belirlenirken, primer ve antral folliküllerde yer alan oositlerde ve granüloza hücrelerinde orta derecede ekspreyonu gözlendi. Grup III 'te ise BMP-15

88 73 primordial folliküllerde yer alan oositlerde orta derecede immünreaktivite gösterirken, çeşitli aşamalardaki primer folliküllerde ve antral folliküllerde yer alan oositlerde ve follikül hücrelerinde kuvvetli immünreaktivite göstermekteydi. Oluklu bağlantılar (neksus, gap junction), iki hücre membranı arasında yayılarak iletişimi sağlayan hücreler arası kanallardır. Komşu hücrenin sitoplazmasına bir bağlantı oluşturarak hücreler arasında iyonların, metabolitlerin, ikincil mesajcıların ve yaklaşık 1,8 kd büyüklüğündeki peptitlerin geçişini sağlar. Hücre membranı içerisine gömülü halde bulunan ve komşu hücrelerde birbiri karşısında hizalanmış konnekson adı verilen iki yarım kanaldan oluşmaktadır. Her connexin adı verilen 6 proteinden oluşmaktadır. Her bir connexin proteini sitoplazmik amino ve karboksil uca, dört membrana gömülü bölge, iki hücre dışı ilmek ve bir sitoplazmik ilmekten oluşur. Connexinler doku yada hücre türüne özgü sentezlenir. Çoğu organ ve hücre birden fazla tipte connexin üretir [21, 94-98]. Dişi üreme sisteminde önemli görevler üstlenen oluklu bağlantılar aracılığıyla gerçekleştirilen hücre-hücre iletişimi, ovaryum fonksiyonlarının düzenlenmesi, oosit maturasyonu, korpus luteumun şekillenmesi, uterusun implantasyon için hazırlanması, trofoblast invazyonunun düzenlenmesi ve plasenta fonksiyonlarında önemli roller üstlendiği bilinmektedir [95, ]. Connexin-43, önemli bir oluklu bağlantı proteinidir. Ackert C. L. ve ark yaptıkları çalışmada connexin-43 knockout ve normal (yabanıl tip ya da heterozigot) gelişimin geç evresindeki fetus ve yeni doğan farelerden elde ettikleri ovaryumları, yetişkin farelerin böbrek kapsülü altına transplante ederek 3 hafta boyunca gelişimlerine izin vermişler ve nakledilen ovaryumları alınmışlar. Bu süreç sonunda normal farelerden nakledilen ovaryumlarda olgun folliküllerin geliştiği gözlenmiş. Connexin-43 knockout ovaryumlarda ise çoğu follikülün multilaminer yapı oluşturmadığı belirlenmiş. Yapılan boya transfer deneylerinde ise connexin-43 yokluğunda granüloza hücreleri arasındaki bağlantının azaldığı fakat tamamen yok olmadığı sonucuna varılmış. Oosit çapı ölçümlerine göre follikül gelişiminin durmasına rağmen, oosit gelişminin connexin-43 knockout ovaryumlarda yavaşladığı fakat tamemen durmadığı görülmüş. Connexin-43 knockout fare folliküllerinde zona pellusidanın az geliştiği, oosit ve granüloza hücrelerinin stoplazmalarında vakuolizasyon olduğu ve oosit sitoplazmasında kortikal granüllerin olmadığı belirlenmiş. 3 haftalık gelişim sonucu connexin-43 knockout ovaryumlardan elde

89 74 edilen oositlerin in-vitro ortamda mayoz bölünmeyi tamamlayamadığı belirlenirken normal ovaryumlardan elde edilen oositlerin fertilizasyonu başarılı bir şekilde gerçekleşmiş. Çalışma sonucunda araştırıcılar connexin-43 'ün granüloza hücre populasyonunun artışı için follikül gelişminin erken evresi boyunca gerekli olduğunu ve granüloza hücre katmanında oluşan hasarın oosit gelişimini de kısmen etkileyeceğini belirtmişler [109]. Bizim çalışmamızda da ccyclophosphamide uygulamasının connexin 43 ifadelenmesini engellenmesi nedeniyle Connexin-43 knockout farelerdeki bulgulara benzer değişikliklerin olduğu belirlendi. Primordial ve çeşitli aşamalardaki primer folliküllerde yer alan oositlerde vakuolizasyonlar ve sitoplazmik içerik kaybı gözlendi. Ayrıca bu folliküllerde follikül hücresi-oosit bileşkesinde yer yer ayrılmalar ve özellikle oosite yakın hücreler arasında hücreler arası aralığın genişlediği belirlendi. Gittens J. E. I. ve arkadaşaları ovaryumda bulunan diğer connexin ler ile connexin-43 'ün önemini karşılaştırmak için gerçekleştirdikleri deneyde; normal ve connexin-43 knockout farelerden elde ettikleri ovaryumları overektomize yetişkin farelerin böbrek kapsülleri altına transplante etmişler. Transplantasyondan gün sonra geri aldıkları ovaryumlarda gerçekleştirdikleri boya enjeksiyon deneyleri sonucunda connexin-43 knockout folliküllerde granüloza hücrelerinin eşleşmediği görülmüş. Yapılan elektron mikroskobik incelemelerde connexin-43 knockout farelerde granüloza hücrelerinde oluklu bağlantıların çok az olduğu belirlenmiş. Ön yükleme boyama deneylerinde ise knockout farelerde granüloza hücrelerinin normal tip granüloza hücreleri ile eşleşme yaptığı görülmüş. Sonuç olarak connexin-43 'ün granüloza hücrelerinde üretilen tek connexin olmadığı fakat hücreler arası bağlantı için önemli katkıları olduğu belirtilmiş [130]. Teilmann S. C. ve arkadaşları 2005 yılında follikül gelişiminin farklı evrelerinde connexin- 43'ün fare ovaryumundaki yerleşimini immünohistokimyasal olarak araştırmışlar. Araştırmacılar, follikül tipi ne olursa olsun teka hücreleri ve oositlerde connexin-43 tutulumu görülmediğini bildirmişlerdir. Connexin-43 tutulumunun; primordial folliküllerin granüloza hücrelerinde çok az, unilaminar primer folliküllerden itibaren follikül büyüklüğü ile doğru orantılı şekilde granüloza hücre zarında noktalar halinde tutulum olduğunu bildirmişlerdir [131].

90 75 Perez-Armendariz ve ark. connexin-43 ün, farelerde embriyogenezisin erken evrelerinde (11,5. gün) farklanmamış gonadların somatik hücreleri arasında ve ilerleyen evrelerde ise somatik hücreler ile germ hücreleri arasında bulunduğunu bildirmişlerdir [106]. Bizim çalışmamızda da gap junction proteinlerinden connexin-43 ifadelenmesi değerlendirilmiştir. Cyclophosphamide uygulaması yapılan grupta connexin 43 primordial follikülden çeşitli evrelerdeki primer ve antral folliküllerde ifadelenmezken, graff follikülünde eksprese edildiği gözlendi. KİKMKH uygulanan grupta, connexin-43 ekspreyonunun graff follikülüne dönüşmekte olan geç antral follikülde gözlendiği, OSKH uygulanan grupta ise connexin-43 ifadelenmesi unilaminerden multilaminer primer folliküle geçiş aşamasındaki folliküllerde, erken ve geç antral folliküllerde ve graff folliküllerinde belirgin olarak gözlendi.

91 76

92 77 6. SONUÇ VE ÖNERİLER Bu çalışmada kısa dönemde follikül maturasyon faktörlerinin, mitozu tetikleyen mekanizmaların ve hücre-hücre ilişkilerini düzenleyen mekanizmaların cyclophosphamide uygulamasından dolayı hasarlandığı belirlenmiştir. Kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücre uygulaması cyclophosphamide hasarını kısmen önlemiş ancak ovarian stromal kök hücre uygulamasının daha etkin olduğu görülmüştür. Bu bulgular kemoterapinin neden olduğu/olabileceği infertilite olgularında son yıllarda klinikte yer almaya başlayan kök hücre uygulamalarına ışık tutabilir ve farklı kök hücre tiplerinin etkisini değerlendirebilme imkanı sağlayabilir. Hastalarda klinik etkileri uzun dönemde ortaya çıkan cyclophosphamide uygulamasını ve kök hücrelerin buna etkisini değerlendirmek ve kısa dönem etkileri ile karşılaştırmak literatüre önemli bilgiler sağlayacaktır.

93 78

94 79 KAYNAKLAR 1. Siegel, R. Naishadham, D. ve Jemal, A. (2013). Cancer statistics, CA: A Cancer Journal for Clinicians, 63, Turan, V. ve Oktay, K. (2014). Sexual and fertility adverse effects associated with chemotherapy treatment in women. Expert Opinion on Drug Safety, 13, Meirow, D. (2000). Reproduction post-chemotherapy in young cancer patients. Molecular and Cellular Endocrinology, 169, Molina, J.R. Barton, D.L. ve Loprinzi, C.L. (2005). Chemotherapy-induced ovarian failure. Drug Safety, 28, Stroud, J.S. Mutch, D. Rader, J. Powell, M. Thaker, P.H. ve Grigsby, P.W. (2009). Effects of cancer treatment on ovarian function. Fertility and Sterility, 92, Morgan, S. Anderson, R.A. Gourley, C. Wallace, W.H. ve Spears, N. (2012). How do chemotherapeutic agents damage the ovary? Human Reproduction Update, 18, Bedoschi, G. ve Oktay, K. (2013). Current approach to fertility preservation by embryo cryopreservation. Fertility and Sterility, 99, Howard-Anderson, J. Ganz, P.A. Bower, J.E. ve Stanton, A.L. (2012). Quality of life, fertility concerns, and behavioral health outcomes in younger breast cancer survivors: a systematic review. Journal of the National Cancer Institute, 104, The Practice Committees of the American Society for Reproductive Medicine and the Society for Assisted Reproductive Technology, (2013). Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertility and Sterility, 99, Can, A., (2014). Ko k Hu cre Biyolojisi Tu rleri ve Tedavide Kullanımları. Ankara. Akademisyen Tıp Kitabevi, Bukovsky, A. (2011). Ovarian stem cell niche and follicular renewal in mammals. Anatomical Rrecord (Hoboken, N.J. : 2007), 294, Bukovsky, A. Caudle, M.R. Svetlikova, M. ve Upadhyaya, N.B. (2004). Origin of germ cells and formation of new primary follicles in adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology, 2, Bukovský, A. Keenan, J.A. Caudle, M.R. Wimalasena, J. Upadhyaya, N.B. ve Meter, S.E. (1995). Immunohistochemical studies of the adult human ovary: possible contribution of immune and epithelial factors to folliculogenesis. American Journal of Reproductive Immunology, 33,

95 Motta, P. Blerkom, J.v. ve Makabe, S. (1980). Changes in the surface morphology of ovarian germinal epithelium during the reproductive cycle and in some pathological conditions: a correlative 3-dimensional analysis by transmission electron microscopy, scanning electron microscopy and high voltage electron microscopy. Journal of Submicroscopic Cytology, 12, Can, A., (2014). Ko k Hu cre Biyolojisi Tu rleri ve Tedavide Kullanımları. Ankara. Akademisyen Tıp Kitabevi, Eberghard, P., (2000). Renkli Genetik Atlası. (Çev. S.M. Lüleci G., Alper Ö.). Nobel Tıp Kitabevleri,.(Eserin orjinali 1994'te yayımlandı), , 17. MooreKeith L., Persaud T.V.N.,Embriyoloji ve Dog um Defektlerinin Temelleri (P.Atilla, S.Müftüoğlu, F. Kaymaz). Güneş Tıp Kitabevleri. (Eserin orjinali 2009'da yayımlandı), Sadler,T. W. (2011). Langman s Medikal Embriyoloji. (Çev. A.Can Başaklar) Palme Yayınları, (Eserin orjinali 2009'da yayımlandı), Erdoğan, D. Hatipoğlu, M.T. Görgün, M. ve Ilgaz, C. (2007). O zel Histoloji, (2. Baskı). Ankara: Hatipoğlu Yayınevi, Junqueira, L.C. and Carniero, J. Temel Histoloji, (Çev. S.Solakoğlu ve Y.Aytekin, Y.) Ross, M.H. and Pawlina,W. (2011). Histology A Text and Atlas, (6.Edition). Lippincot Williams & Wilkins, Gartner,L.P. and Hiatt, J.L. (2007) Color Textbook of Histology, (3. Edition). USA: Elsevier's, Kierszenbaum, A.L. Histoloji ve Hu cre Biyolojisi Patolojiye Giris, (Çev. Ramazan Demir) Palme Yayınları Tanyolaç, A. (1999). O zel Histoloji. Ankara: Yorum Basımevi, Köse, E., (2011). Kadın Genital Organları. Ö. Çelik (editörler). Yardımcı U reme Teknikleri. Adana. Nobel Tıp Kitabevi, Widmaier,E.P, Raff,H. and Strang K.T. (2010). Vander I nsan Fizyolojisi.(Çev. S. Demirgören) (10.Baskı). Güven Kitabevi, Ganong F.W. (2002). Tıbbi Fizyoloji. (20. Baskı). Nobel Tıp Kitabevi, Guyton AC, Hall, E.J. (2000). Medical Physiology. (10th Edition). WB. Saunders company, Beck-Peccoz, P. ve Persani, L. (2006). Premature ovarian failure. Orphanet Journal of Rare Diseases, 1, 9.

96 Santoro, N.(2008). Mechanisms of premature ovarian failure. Annual Endocrinology, Timmreck, L.S. ve Reindollar, R.H. (2003). Contemporary issues in primary amenorrhea. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America, 30, Meirow, D. (1999). Ovarian injury and modern options to preserve fertility in female cancer patients treated with high dose radio-chemotherapy for hematooncological neoplasias and other cancers. Leukemia & Lymphoma, 33, González, C. Boada, M. Devesa, M. ve Veiga, A. (2012). Concise review: fertility preservation: an update. Stem Cells Translational Medicine, 1, Rose, D. ve Davis, T. (1977). Ovarian function in patients receiving adjuvant chemotherapy for breast cancer. The Lancet, 309, De Jonge, M.E. Huitema, A.D. Rodenhuis, S. ve Beijnen, J.H. (2005). Clinical pharmacokinetics of cyclophosphamide. Clinical Pharmacokinetics, 44, Soleimani, R. Heytens, E. Darzynkiewicz, Z. ve Oktay, K. (2011). Mechanisms of chemotherapy-induced human ovarian aging: double strand DNA breaks and microvascular compromise. Aging (Albany NY), 3, Chamberlain, G. Fox, J. Ashton, B. ve Middleton, J. (2007). Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells, 25, Dominici, M. Le Blanc, K. Mueller, I. Slaper-Cortenbach, I. Marini, F. Krause, D. Deans, R. Keating, A. Prockop, D. ve Horwitz, E. (2006). Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 8, Pontikoglou, C. Deschaseaux, F. Sensebe, L. ve Papadaki, H.A. (2011). Bone marrow mesenchymal stem cells: biological properties and their role in hematopoiesis and hematopoietic stem cell transplantation. Stem Cell Reviews and Reports, 7, Bianco, P. Robey, P.G. ve Simmons, P.J. (2008). Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell, 2, Caplan, A.I. (1991). Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research, 9, Colter, D.C. Class, R. DiGirolamo, C.M. ve Prockop, D.J. (2000). Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proceedings of the National Academy of Sciences, 97,

97 da Silva Meirelles, L. Caplan, A.I. ve Nardi, N.B. (2008). In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem Cells, 26, Deschaseaux, F. Pontikoglou, C. ve Sense be, L. (2010). Bone regeneration: the stem/progenitor cells point of view. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 14, Friedenstein, A. Chailakhjan, R. ve Lalykina, K. (1970). The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea pig bone marrow and spleen cells. Cell Proliferation, 3, Friedenstein, A.J., (1990). Osteogenic stem cells in Bone Marrow. H.J.N.M.K.J. A. (editörler). Bone and Mineral Research. Amsterdam. Elsevier, Kastrinaki, M.-C. Andreakou, I. Charbord, P. ve Papadaki, H.A. (2008). Isolation of human bone marrow mesenchymal stem cells using different membrane markers: comparison of colony/cloning efficiency, differentiation potential, and molecular profile. Tissue Engineering Part C: Methods, 14, Pittenger, M.F. Mackay, A.M. Beck, S.C. Jaiswal, R.K. Douglas, R. Mosca, J.D. Moorman, M.A. Simonetti, D.W. Craig, S. ve Marshak, D.R. (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 284, Delorme, B. Ringe, J. Gallay, N. Le Vern, Y. Kerboeuf, D. Jorgensen, C. Rosset, P. Sensebe, L. Layrolle, P. ve Häupl, T. (2008). Specific plasma membrane protein phenotype of culture-amplified and native human bone marrow mesenchymal stem cells. Blood, 111, Pontikoglou, C. Delorme, B. ve Charbord, P. (2008). Human bone marrow native mesenchymal stem cells. Regenerative Medicine, 3/5, Devine, S.M. Cobbs, C. Jennings, M. Bartholomew, A. ve Hoffman, R. (2003). Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into nonhuman primates. Blood, 101, Fujiyama, S. Amano, K. Uehira, K. Yoshida, M. Nishiwaki, Y. Nozawa, Y. Jin, D. Takai, S. Miyazaki, M. ve Egashira, K. (2003). Bone marrow monocyte lineage cells adhere on injured endothelium in a monocyte chemoattractant protein- 1 dependent manner and accelerate reendothelialization as endothelial progenitor cells. Circulation Research, 93, Horwitz, E.M. Prockop, D.J. Fitzpatrick, L.A. Koo, W.W. Gordon, P.L. Neel, M. Sussman, M. Orchard, P. Marx, J.C. ve Pyeritz, R.E. (1999). Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nature Medicine, 5,

98 Kinnaird, T. Stabile, E. Burnett, M. Shou, M. Lee, C. Barr, S. Fuchs, S. ve Epstein, S. (2004). Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation, 109, Takehara, Y. Yabuuchi, A. Ezoe, K. Kuroda, T. Yamadera, R. Sano, C. Murata, N. Aida, T. Nakama, K. Aono, F. Aoyama, N. Kato, K. ve Kato, O. (2013). The restorative effects of adipose-derived mesenchymal stem cells on damaged ovarian function. Laboratory I nvestigation, 93, Xiao, G.Y. Liu, I.H. Cheng, C.C. Chang, C.C. Lee, Y.H. Cheng, W.T. ve Wu, S.C. (2014). Amniotic fluid stem cells prevent follicle atresia and rescue fertility of mice with premature ovarian failure induced by chemotherapy. PLoS One, 9, e Kilic, S. Pinarli, F. Ozogul, C. Tasdemir, N. Naz Sarac, G. ve Delibasi, T. (2014). Protection from cyclophosphamide-induced ovarian damage with bone marrow-derived mesenchymal stem cells during puberty. Gynecological Endocrinology, 30, Broer, S.L. Broekmans, F.J. Laven, J.S. ve Fauser, B.C. (2014). Anti-Müllerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update, Çitil, İ. ve Oral, E., (2011). Ovulasyon İndüksiyonunda Zayıf (Poor-responder) Yanıt Veren Hastaların Yönetimi. Ö. Çelik (Editörler). Yardımcı U reme Teknikleri. Adana. Nobel Tıp Kitabevi, de Vet, A. Laven, J.S. de Jong, F.H. Themmen, A.P. ve Fauser, B.C. (2002). Antimüllerian hormone serum levels: a putative marker for ovarian aging. Fertility and Sterility, 77, Fanchin, R. Schonäuer, L.M. Righini, C. Frydman, N. Frydman, R. ve Taieb, J. (2003). Serum anti Müllerian hormone dynamics during controlled ovarian hyperstimulation. Human Reproduction, 18, Weenen, C. Laven, J.S. von Bergh, A.R. Cranfield, M. Groome, N.P. Visser, J.A. Kramer, P. Fauser, B.C. ve Themmen, A.P. (2004). Anti Müllerian hormone expression pattern in the human ovary: potential implications for initial and cyclic follicle recruitment. Molecular Human Reproduction, 10, Oktem, O. ve Oktay, K. (2007). A novel ovarian xenografting model to characterize the impact of chemotherapy agents on human primordial follicle reserve. Cancer Research, 67, Gougeon, A. (1984). Caracteres qualitatifs et quantitatifs de la population folliculaire dans l'ovaire humain adulte. Contraception Fertilité Sexualité, 12,

99 Masui, Y. ve Markert, C.L. (1971). Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. Journal of Experimental Zoology, 177, Smith, L.D. ve Ecker, R. (1971). The interaction of steroids with Rana pipiens oocytes in the induction of maturation. Developmental Biology, 25, Cooper,G.M. and Hausman,R.E., Hu cre Moleku ler Yaklas ım, (Çev. M. Sakızlı ve N. Atabey). Nobel Tıp Kitabevleri., Pages Lodish,H., Berk,A., Kaiser,C.A., Krieger,M., Scott,M.P., Bretscher,A., Ploegh,H., Matsudaira,P. Moleku ler Hu cre Biyolojisi (Çev. H. Geçkil, M. Özmen ve Ö. Yeşilada), Chesnel, F. ve Eppig, J.J. (1995). Synthesis and accumulation of p34cdc2 and cyclin B in mouse oocytes during acquisition of competence to resume meiosis. Molecular Reproduction and Development, 40, Anguita, B. Jimenez-Macedo, A.R. Izquierdo, D. Mogas, T. ve Paramio, M.-T. (2007). Effect of oocyte diameter on meiotic competence, embryo development, p34 (cdc2) expression and MPF activity in prepubertal goat oocytes. Theriogenology, 67, Quetglas, M.D. Adona, P.R. de Bem, T.H. Pires, P.R. ve Leal, C.L. (2010). Effect of cyclin-dependent kinase (CDK) inhibition on expression, localization and activity of maturation promoting factor (MPF) and mitogen activated protein kinase (MAPK) in bovine oocytes. Reproduction in Domestic Animals, 45, Chang, H. Brown, C.W. ve Matzuk, M.M. (2013). Genetic analysis of the mammalian transforming growth factor-β superfamily. Endocrine Reviews. 73. Juengel, J. ve McNatty, K. (2005). The role of proteins of the transforming growth factor-β superfamily in the intraovarian regulation of follicular development. Human Reproduction Update, 11, ten Dijke, P. Miyazono, K. ve Heldin, C.-H. (2000). Signaling inputs converge on nuclear effectors in TGF-β signaling. Trends in Biochemical Sciences, 25, Heldin, C.-H. Miyazono, K. ve Ten Dijke, P. (1997). TGF-β signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature, 390, Shimasaki, S. Moore, R.K. Otsuka, F. ve Erickson, G.F. (2004). The bone morphogenetic protein system in mammalian reproduction. Endocrine Reviews, 25, Knight, P.G. ve Glister, C. (2006). TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction, 132,

100 Moore, R.K. Otsuka, F. ve Shimasaki, S. (2003). Molecular basis of bone morphogenetic protein-15 signaling in granulosa cells. Journal of Biological Chemistry, 278, Kenneth, P. Susan, M. Theresa, W. Peter, S. Norma, L. Anne, O. Adrian, H. Derek, A. George, H. ve James, P. (2005). Physiological effects of major genes affecting ovulation rate in sheep. Genetics Selection Evolution, 37, S25-S Glister, C. Kemp, C.F. ve Knight, P.G. (2004). Bone morphogenetic protein (BMP) ligands and receptors in bovine ovarian follicle cells: actions of BMP-4,-6 and-7 on granulosa cells and differential modulation of Smad-1 phosphorylation by follistatin. Reproduction, 127, Campbell, B. K., Souza, C. J. H., Skinner, A. J., Webb, R., & Baird, D. T. (2006). Enhanced response of granulosa and theca cells from sheep carriers of the FecB mutation in vitro to gonadotropins and bone morphogenic protein-2,-4, and-6. Endocrinology, 147(4), Erickson, G.F. ve Shimasaki, S. (2003). The spatiotemporal expression pattern of the bone morphogenetic protein family in rat ovary cell types during the estrous cycle. Reproductive Biology and Endocrinology, 1, Shi, J. Yoshino, O. Osuga, Y. Koga, K. Hirota, Y. Hirata, T. Yano, T. Nishii, O. ve Taketani, Y. (2009). Bone morphogenetic protein-6 stimulates gene expression of follicle-stimulating hormone receptor, inhibin/activin beta subunits, and anti-mullerian hormone in human granulosa cells. Fertility and Sterility, 92, Ogura-Nose, S. Yoshino, O. Osuga, Y. Shi, J. Hiroi, H. Yano, T. ve Taketani, Y. (2012). Anti-Mullerian hormone (AMH) is induced by bone morphogenetic protein (BMP) cytokines in human granulosa cells. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 164, Frota, I. Leitão, C.C. Costa, J.J. van den Hurk, R. Saraiva, M.V. Figueiredo, J.R. ve Silva, J.R. (2013). Levels of BMP-6 mrna in goat ovarian follicles and in vitro effects of BMP-6 on secondary follicle development. Zygote, 21, Otsuka, F. Yao, Z. Lee, T.-h. Yamamoto, S. Erickson, G.F. ve Shimasaki, S. (2000). Bone morphogenetic protein-15 Identification of target cells and biological functions. Journal of Biological Chemistry, 275, Çelik, Ö. ve Yıldırım, A., (2011). Folikülogenezisin Moleküler Temelleri. Ö. Çelik (editörler). Yardımcı U reme Teknikleri. Adana. Nobel Kitabevi, Otsuka, F. McTavish, K.J. ve Shimasaki, S. (2011). Integral role of GDF-9 and BMP-15 in ovarian function. Molecular Reproduction and Development, 78, Otsuka, F. Yamamoto, S. Erickson, G.F. ve Shimasaki, S. (2001). Bone morphogenetic protein-15 inhibits follicle-stimulating hormone (FSH) action by

101 86 suppressing FSH receptor expression. Journal of Biological Chemistry, 276, Otsuka, F. ve Shimasaki, S. (2002). A negative feedback system between oocyte bone morphogenetic protein 15 and granulosa cell kit ligand: its role in regulating granulosa cell mitosis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 99, Otsuka, F. Moore, R.K. Iemura, S.-i. Ueno, N. ve Shimasaki, S. (2001). Follistatin inhibits the function of the oocyte-derived factor BMP-15. Biochemical and Biophysical Research Communications, 289, Hussein, T.S. Froiland, D.A. Amato, F. Thompson, J.G. ve Gilchrist, R.B. (2005). Oocytes prevent cumulus cell apoptosis by maintaining a morphogenic paracrine gradient of bone morphogenetic proteins. Journal of Cell Science, 118, Yoshino, O. McMahon, H.E. Sharma, S. ve Shimasaki, S. (2006). A unique preovulatory expression pattern plays a key role in the physiological functions of BMP-15 in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103, Neijssen, J. Herberts, C. Drijfhout, J.W. Reits, E. Janssen, L. ve Neefjes, J. (2005). Cross-presentation by intercellular peptide transfer through gap junctions. Nature, 434, Gershon, E. Plaks, V. ve Dekel, N. (2008). Gap junctions in the ovary: expression, localization and function. Molecular and Cellular Endocrinology, 282, Goldberg, G.S. Valiunas, V. ve Brink, P.R. (2004). Selective permeability of gap junction channels. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1662, Sosinsky, G.E. ve Nicholson, B.J. (2005). Structural organization of gap junction channels. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1711, Unger, V.M. Kumar, N.M. Gilula, N.B. ve Yeager, M. (1999). Threedimensional structure of a recombinant gap junction membrane channel. Science, 283, Kibschull, M. Nassiry, M. Dunk, C. Gellhaus, A. Quinn, J.A. Rossant, J. Lye, S.J. ve Winterhager, E. (2004). Connexin31-deficient trophoblast stem cells: a model to analyze the role of gap junction communication in mouse placental development. Developmental Biology, 273, Kibschull, M. Magin, T.M. Traub, O. ve Winterhager, E. (2005). Cx31 and Cx43 double deficient mice reveal independent functions in murine placental and skin development. Developmental Dynamics, 233,

102 Grümmer, R. Hewitt, S. Traub, O. Korach, K. ve Winterhager, E. (2004). Different regulatory pathways of endometrial connexin expression: preimplantation hormonal-mediated pathway versus embryo implantation-initiated pathway. Biology of Reproduction, 71, Sela-Abramovich, S. Edry, I. Galiani, D. Nevo, N. ve Dekel, N. (2006). Disruption of gap junctional communication within the ovarian follicle induces oocyte maturation. Endocrinology, 147, Reynolds, L. ve Redmer, D. (1998). Growth and development of the corpus luteum. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement, 54, Valdimarsson, G. De Sousa, P.A. ve Kidder, G.M. (1993). Coexpression of gap junction proteins in the cumulus oocyte complex. Molecular Reproduction and Development, 36, Granot, I. Bechor, E. Barash, A. ve Dekel, N. (2002). Connexin43 in rat oocytes: developmental modulation of its phosphorylation. Biology of Reproduction, 66, Pe rez Armendariz, E.M. Sáez, J.C. Bravo Moreno, J. López Olmos, V. Enders, G.C. ve Villalpando, I. (2003). Connexin43 is expressed in mouse fetal ovary. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology, 271, Juneja, S.C. Barr, K.J. Enders, G.C. ve Kidder, G.M. (1999). Defects in the germ line and gonads of mice lacking connexin43. Biology of reproduction, 60, Kidder, G.M. ve Mhawi, A.A. (2002). Gap junctions and ovarian folliculogenesis. Reproduction, 123, Ackert, C.L. Gittens, J.E. O'Brien, M.J. Eppig, J.J. ve Kidder, G.M. (2001). Intercellular communication via connexin43 gap junctions is required for ovarian folliculogenesis in the mouse. Developmental Biology, 233, Sommersberg, B. Bulling, A. Salzer, U. Fröhlich, U. Garfield, R.E. Amsterdam, A. ve Mayerhofer, A. (2000). Gap junction communication and connexin 43 gene expression in a rat granulosa cell line: regulation by follicle-stimulating hormone. Biology of Reproduction, 63, Kalma, Y. Granot, I. Galiani, D. Barash, A. ve Dekel, N. (2004). Luteinizing hormone-induced connexin 43 down-regulation: inhibition of translation. Endocrinology, 145, Granot, I. ve Dekel, N. (1994). Phosphorylation and expression of connexin-43 ovarian gap junction protein are regulated by luteinizing hormone. Journal of Biological Chemistry, 269,

103 Byrne, J. Fears, T.R. Gail, M.H. Pee, D. Connelly, R.R. Austin, D.F. Holmes, G.F. Holmes, F.F. Latourette, H.B. ve Meigs, J.W. (1992). Early menopause in long-term survivors of cancer during adolescence. American Journal of Obstetrics and Gynecology, 166, Patti, F. Messina, S. D'Amico, E. Lo Fermo, S. ve Zappia, M. (2014). Pregnancy outcomes in multiple sclerosis patients previously treated with cyclophosphamide. Acta Neurologica Scandinavica, 130, e Topel,H., Bağrıyanık,A., Şeref,N., Batur,A. ve Özoğul,C. (2012). The Effects Of Rosiglitazone On Ovary Of Female Rats Exposed To Chemotherapy, Presented in 20. National Electron Microscopy Congress Hübner, K. Fuhrmann, G. Christenson, L.K. Kehler, J. Reinbold, R. De La Fuente, R. Wood, J. Strauss, J.F. Boiani, M. ve Schöler, H.R. (2003). Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science, 300, Woods, D.C. White, Y.A. Niikura, Y. Kiatpongsan, S. Lee, H.J. ve Tilly, J.L. (2013). Embryonic stem cell-derived granulosa cells participate in ovarian follicle formation in vitro and in vivo. Reproductive Sciences, 20, Afifi, N.M. ve Reyad, O.N. (2013). Role of mesenchymal stem cell therapy in restoring ovarian function in a rat model of chemotherapy-induced ovarian failure. The Egyptian Journal of Histology, 36, Meirow, D. Lewis, H. Nugent, D. ve Epstein, M. (1999). Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool. Human Reproduction, 14, Detti, L. Uhlmann, R.A. Lu, M. Diamond, M.P. Saed, G.M. Fletcher, N.M. Zhang, J. ve Williams, L.J. (2013). Serum markers of ovarian reserve and ovarian histology in adult mice treated with cyclophosphamide in pre-pubertal age. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 30, Ulug, P. ve Oner, G. (2014). Evaluation of the effects of single or multiple dose methotrexate administration, salpingectomy on ovarian reserve of rat with the measurement of anti-müllerian hormone (AMH) levels and histological analysis. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 181, Özcan, P. Fıçıcıoğlu, C. Yıldırım, Ö.K. Özkan, F. Akkaya, H. ve Aslan, İ. (2015). Protective effect of resveratrol against oxidative damage to ovarian reserve in female sprague dawley rats. Reproductive BioMedicine Online Apperley, J. ve Reddy, N. (1995). Mechanism and management of treatmentrelated gonadal failure in recipients of high dose chemoradiotherapy. Blood Reviews, 9,

104 Fong, S.L. Lugtenburg, P. Schipper, I. Themmen, A. de Jong, F. Sonneveld, P. ve Laven, J. (2008). Anti-müllerian hormone as a marker of ovarian function in women after chemotherapy and radiotherapy for haematological malignancies. Human Reproduction, 23, Kaya, H. Desdicioglu, R. Sezik, M. Ulukaya, E. Ozkaya, O. Yilmaztepe, A. ve Demirci, M. (2008). Does sphingosine-1-phosphate have a protective effect on cyclophosphamide- and irradiation-induced ovarian damage in the rat model? Fertility and Sterility, 89, Fu, X.-f. He, Y.-l. Xie, C.-h. ve Liu, W. (2008). Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation improves ovarian function and structure in rats with chemotherapy-induced ovarian damage. Cytotherapy, 10, Park, S.S. Park, M.J. Joo, B.S. Joo, J.K. Son, J.B. ve Lee, K.S. (2012). Improvement of ovarian response and oocyte quality of aged female by administration of bone morphogenetic protein-6 in a mouse model. Reproductive Biology and Endocrinology, 10, Silva, J.R. van den Hurk, R. van Tol, H.T. Roelen, B.A. ve Figueiredo, J.R. (2005). Expression of growth differentiation factor 9 (GDF9), bone morphogenetic protein 15 (BMP15), and BMP receptors in the ovaries of goats. Molecular Reproduction and Development, 70, Hosoe, M. Kaneyama, K. Ushizawa, K. Hayashi, K.G. ve Takahashi, T. (2011). Quantitative analysis of bone morphogenetic protein 15 (BMP15) and growth differentiation factor 9 (GDF9) gene expression in calf and adult bovine ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology, 9, Gittens, J.E. Mhawi, A.A. Lidington, D. Ouellette, Y. ve Kidder, G.M. (2003). Functional analysis of gap junctions in ovarian granulosa cells: distinct role for connexin43 in early stages of folliculogenesis. American Journal of Physiology- Cell Physiology, 284, C880-C Teilmann, S.C. (2005). Differential expression and localisation of connexin-37 and connexin-43 in follicles of different stages in the 4-week-old mouse ovary. Molecular and Cellular Endocrinology, 234,

105 90

106 EKLER 91

107 EK-1. Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu Kararı 92

108 EK-2. Deney Hayvanları Uygulama ve Etik Kursu Katılım Sertifikası 93

109 94 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Soyadı, adı : BEŞİKCİOĞLU Hüseyin Erdinç Uyruğu : T.C. Doğum tarihi ve yeri : Ankara Medeni hali : Evli Telefon : erdincbesikcioglu@gmail.com Eğitim Derece Eğitim Birimi Mezuniyet tarihi Yüksek Lisans Gazi Üniversitesi/Histoloji-Embriyoloji Devam ediyor Lisans Ankara Üniversitesi/Biyoloji 2010 Lise Süleyman Demirel Anadolu Lisesi 2004 İş Deneyimi Yıl Yer Görev 2013 Gazi Üniversitesi Araştırma Görevlisi 2012 BMT Calsis Sağ. Tekn. A.Ş. Üretim Personeli Yabancı Dil İngilizce

110 GAZİ GELECEKTİR... 92