TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ANKARA YÖRESİNDEKİ KÖPEKLERDE LEİSHMANİOSİSİN INDIREKT FLORESANS ANTİKOR TESTİ (IFAT) İLE SEROPREVALANSININ BELİRLENMESİ Asiye KOÇAK PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Ayşe Çakmak ANKARA

2

3 iii İÇİNDEKİLER İç Kapak i Kabul ve Onay ii İçindekiler iii Önsöz v Simgeler ve Kısaltmalar vii Şekiller ix Çizelgeler x 1. GİRİŞ Leishmaniosisin Tanımı ve Etkenlerinin Sınıflandırmadaki Yeri Leishmaniosis Etkenlerinin Morfolojik Özellikleri Amastigot Form Promastigot Form Leishmania Soyundaki Etkenlerin Hayat Döngüsü Leishmaniosisin Vektörü ve Vektörün Sınıflandırmaki Yeri Vektörün Morfolojik Özellikleri Vektörün Hayat Döngüsü Dünya da ve Türkiye de Phlebotomus Türleri Leishmaniosiste İmmunoloji Leishmaniosisin Epidemiyolojisi Dünya da Leishmaniosis Türkiye de Leishmaniosis Leishmaniosisin Patogenezi Leishmaniosisin Teşhisi Leishmaniosisin Klinik Teşhisi Leishmaniosiste Mikroskobik Teşhis Leishmaniosisin Serolojik Teşhisi Leishmaniosiste Moleküler Teşhis Leishmaniosiste Tedavi Leishmaniosiste Korunma ve Kontrol 33

4 iv 2. GEREÇ VE YÖNTEM Gereç Köpekler Cihaz ve Malzemeler Yöntem Köpek Sayısının Belirlenmesi Köpeklerin Klinik Muayenesi ve Anamnez Kan Örneklerinin Alınması, Serum Elde Edilmesi ve Saklanması İndirekt Floresan Antikor Test Antijen Hazırlanması Tampon ve Solüsyonlar İndirekt Floresan Antikor Testinin Uygulanması Sonuçların Değerlendirilmesi BULGULAR TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER 50 ÖZET 52 SUMMARY 53 KAYNAKLAR 54 ÖZGEÇMİŞ 65

5 v ÖNSÖZ Köpeklerin rezervuarlığını yaptığı vektörler ile nakledilen hastalıkların oldukça fazla sayıda olduğu bilinmektedir. Halk sağlığı açısından bu hastalıkların bir kısmı zoonotik özellik taşımaktadır. Bunlar arasında protozoa (Babesia vogeli, Leishmania infantum ve Trypanasoma cruzi), bakteriler (Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis, Borrelia burgdorferi) ve bazı helmintler (Dirofilaria immitis, Dirofilaria repens, Dipylidium caninum) bulunmaktadır. Bu hastalıkların insanlara nakledilmesinde bit, pire, sivrisinek, tabanid ve yakarca gibi artropodlar rol oynamaktadır. Halk sağlığı açısından bu hastalıkların etiyolojisinin, bulaşma yollarının, yaygınlığının, risk faktörlerinin, tanı, kontrol, tedavi ve halk sağlığı açısından önemlerinin belirlenmesi günümüzde giderek daha büyük bir önem kazanmaktadır (Dantas- Torres., 2008; Tabar ve ark, 2009; Megat Abd Rani ve ark, 2010; Otranto and Dantas-Torres, 2010). Leishmaniosis dünya geneline dağılım gösteren oldukça yaygın bir enfeksiyondur. 20. yüzyılın başlarında keşfedilen insan leishmaniosisi, Eski ve Yeni dünya da birçok odakta ve çeşitli formlarda tanımlanmıştır. Gerek çocuklar gerekse yetişkinler ile bağışıklık sistemi sorunları yaşayanlar hastalığa duyarlıdırlar. İnsan visceral leishmaniosisi (VL) ciddi bir hastalık olup, bazı bölgelerde epidemi ve yüksek mortaliteye neden olabilir (Dereure ve ark, 1999). Köpekler, Leishmania infantum tarafından oluşturulan insan VL nin en önemli rezervuarıdır. Hastalığın köpekten köpeğe ve köpekten insana bulaşmasında, enfekte ve subklinik köpeklerin rolü çok önemlidir (Vercammen ve ark, 1997). Doktora eğitimim ve tez çalışmalarımdaki özverili katkılarından dolayı danışman hocam Prof.Dr. Ayşe Çakmak a, doktora eğitimim boyunca desteğiyle her zaman yanımda olan Prof.Dr. Kadri Zafer Karaer e; tez izleme komitesi üyesi Prof.Dr. Günay Alçığır a; Parazitoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi, Prof.Dr. Serpil Nalbantoğlu na; bütün çalışmalarım sırasında bana inanan Dr. Ahmet Kiremitçi ye; Refik Saydam Hıfzısıhha Enstitüsü ünde yapmış olduğum çalışmalar sırasında bilimsel destek ve yardımlarını esirgemeyen Dr. Cahit Babür, Dr. Bekir Çelebi, Doç.Dr. Ayşegül Taylan Özkan, Doç.Dr. Selçuk Kılıç, Mesut Mungan a; örneklerin toplanması sırasında yardımcı olan Büyükşehir Belediyesi Evcil Hayvan Sağlık

6 vi Merkezi ve Fourvet Evcil Hayvan Hastanesi çalışanlarına; birlikte çalışmaktan mutluluk duyduğum Kemal Ekdal, Zübeyde Kılıç, Levent Yılmaz, Tahir Demir e; her zaman yanımda olan değerli dostlarım Esin Güven, Sırrı Kar, Ömer Orkun a çok teşekkür ederim. Hayatımın her döneminde olduğu gibi doktora eğitimim süresince de maddi ve manevi olarak hep yanımda olan ve bana güç veren canım annem Ayfer Koçak, sevgili babam Süreyya Koçak a; kardeşlerim, bir tanelerim Emine Koçak ve Çağrı Koçak a teşekkür ederim.

7 vii SİMGELER ve KISALTMALAR VL Visceral Leishmaniosis CL Cutaneous Leishmaniosis MCL Mucocutaneous Leishmaniosis DCL Diffuse Cutaneous Leishmaniosis CanL Canine Leishmaniosis ZCL Zoonotik Cutaneous Leishmaniosis RES Retikülo Endotelial Sistem µm Mikrometre DNA Deoksiribonükleik asit nm Nanometre m Metre mm Milimetre LPG Lipofosfoglikan gp Glikoprotein IFN-γ İnterferon gamma TNF-α Tumor necrosis factor alpha IL- 2 İnterleukin 2 Th 1 T helper 1 cell NO Nitrik Oksit IgG İmmunglobulin G MON Zymodeme (izoenzim ) PCR Polymerase Chain Reaktion (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) EF Exreting Factor SM Splenomegali LAP Lenfadenopati HSM Hepatosplenomegali ºC Degree Celcius (sıcaklık) IFAT İndirek Floresan Antikor Testi DAT Direkt Aglutinasyon Testi ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay NNN Nicole-Novy- Mac Neal Medium

8 viii i.v. i.m. gr ml dk rpm DTH AmpB DDT FCS PBS FITC lt İntravenöz İntramusküler Gram Mililitre Dakika Dakikadaki devir sayısı Delayed Type Hypersensitivity (Gecikmiş Tip Aşırı Duyarlılık) Amphotericine B Diklorodifenol trikloroethan Fötal culf serumu Fosfat Tampon Solüsyonu (Phosphate Buffer Solution) Fluorescein isothiocyanate Litre

9 ix ŞEKİLLER Şekil 1. Monosit hücreleri tarafından fagosite edilen promastigot 6 Şekil 2. Leishmaniosisin hayat döngüsü, Leishmania 7 promastigot ve amastigot formu Şekil 3. Leishmania nın vektörü olan Phlebotomus un 10 erkeği ve dişisi Şekil.4. Dünyada bazı Leishmania türlerinin coğrafik 17 dağılımı Şekil 5. Monosit hücreleri içerisindeki amastigotlar 24 Şekil 6. Ankara ili haritası 38 Şekil 7. Serum örneklerinin sulandırılması 44 Şekil 8. Antijen kaplı lamlar 44 Şekil 9. Seropozitif örnek 45 Şekil 10. Seronegatif örnek 45

10 x ÇİZELGELER Çizelge 1. Eski dünyadaki leishmaniosis vektörleri ve bölgeleri 12 Çizelge 2. Akdeniz ülkelerinde canine leishmaniosisin 16 seroprevalansı ve izoenzim türleri Çizelge 3. İlçelerdeki köpek ve kan örneği alınan köpek 37 sayıları

11 1 1. GİRİŞ Leishmania soyundaki protozoon parazitlerin neden olduğu hastalıklara genel olarak verilen isim leishmaniosisdir. Vektör Phelebotomus tarafından bulaştırılan etkenin meydana getirdiği klinik bulgular ve yerleştiği organlara göre leishmaniosis in dört ana formu bulunmaktadır (Goddard, 1999). Dalak, kemik iliği, karaciğer hücrelerini etkileyen visceral leishmaniosis (VL, kala azar); deride küçük, kenarları sınırlı ve yavaş iyileşen ülserlerin görüldüğü cutaneous leishmaniosis (CL, oriental sore, şark çıbanı, pianbois, alleppo button, jericho boil, pendinsk ulcer, chiclero s ulcer, alleppo boil); burun ve ağız mukozasında lezyonların bulunduğu mucocutaneous leishmaniosis (MCL, espundia) ve vücut yüzeyinin tamamında yaygın olarak görülen papül ve nodüllerin bulunduğu hastalık ise diffuse cutaneous leishmaniosis (DCL) olarak isimlendirilmektedir (Levine, 1985; Goddard, 1999; Anon, 2002a). Deri, karaciğer ve dalakta lezyona yol açan visceral leishmaniosis, kalaazar ın yanı sıra infantile ya da akdeniz leishmaniosisi olarak da isimlendirilmektedir (Taylor ve ark., 2007). Asya nın bir parçası olan Türkiye ve İran da 1833 yılından beri endemik cutaneous leishmaniosis (CL) vakaları bildirilmektedir yılında GATA ya Şark Çıbanı üzerine araştırma yapmak için getirilen Reinhart ile Dr. Servet Tevfik Bey 1910 yılında CL ile ilgili bir broşür hazırlamışlardır (Unat, 1981). Türkiye de ise kala-azar ın varlığını ilk bildiren Kristomonas dır. İlk visceral leishmaniosis olayı Trabzon dan bildirilmiştir (Unat, 1981). Birinci Dünya Savaşı sırasında Noyan tarafından Bağdat taki 11 Osmanlı askerinin dalak ve karaciğer biyopsilerinden Leishmania amastigotları tespit edilmiştir (Onul, 1974; Ok ve ark., 2002). Köpek leishmaniosisi ilk olarak İstanbul ve Bursa da 1950 lerin başında Yaşarol tarafından tespit edilmiş olmasına rağmen, Türkiye de bu hastalığın

12 2 epidemiyolojisine ilişkin bilgiler son derece sınırlıdır (Volf ve ark., 2000; Özensoy ve ark., 2005a) Leishmaniosisin Tanımı ve Etkenlerinin Sınıflandırmadaki Yeri Leishmaniosis, Leishmania soyundaki protozoonların neden olduğu, birçok vertebralı konakta obligat olarak makrofajlarda bulunan ve konaktan konağa, vektör kum sineklerinin kan emmesiyle bulaşan paraziter bir hastalıktır (Noli, 1999; Anon, 2002a; OIE, 2004). Bu hastalıkta köpekler ve kemirici en önemli kaynak olarak kabul edilmektedir. Leishmania etkenleri vektör kum sinekleri tarafından yayılmaktadır (Noli, 1999). Hastalık Orta Asya, Çin, Kuzey Afrika, İran, Akdeniz ülkeleri ile Orta ve Güney Amerika da yabani ve evcil hayvanlarla insanlarda görülmektedir. Hastalık özellikle karnivor ve kemiricilerde yaygın olup karıncayiyen, keseli hayvan, rakun, primat ve kertenkelede de bulunmaktadır (Yaşarol, 1981). Tenter ve Schnieder (2006) e göre leishmaniosis etkenlerinin sınıflandırılması aşağıda verilmiştir. Alem : Animalia Alem altı : Eukaryota Kök : Euglenozoa Kök altı : Kinetoplasta Sınıf : Trypanosomatidea Dizi : Trypanosomatida Aile : Trypanosomatidae Soy : Leishmania Türler : L. donovani, L. infantum, L. tropica, L. aethiopica L. major, L. chagasi, L. mexicana, L. braziliensis, L. enrietti, L. hertigi L. henrici, L. tarentolae, L. ceramodactyli, L. chamaelonis, L. hemidactyli L. agamae, L. adleri, L. deanei, L. aristidesi, L. garnhami, L. venezuelensis, L. forrantini, L. lainsoni, L. shawi, L. naiffi, L. colombiensis, L. equatorensis, L. peruviana

13 3 Leishmania lar 2-6 µ büyüklüğünde; omurgalıların doku ve kan hücreleri içinde kamçısız biçimde yaşayan, biyolojik vektör artropod vücudunda ve hücre kültürü ekimlerinde kamçılı ve hareketli olan tek hücreli canlılar olarak tanımlanırlar (Orhan ve Yaşarol, 1981) Leishmania Etkenlerinin Morfolojik Özellikleri Leishmania soyuna giren türlerin birincil özelliği evrimleri sırasında iki ayrı biçim değişikliği geçirmeleridir. Bu biçimlerden omurgalı konağın hücreleri içindeki döneme amastigot, vektör kum sineklerinin sindirim sisteminde geçen kısma ise promastigot, adı verilir (Orhan ve Yaşarol, 1981). Bu iki dönem yanında paramastigot adı verilen bir geçiş formundan da bahsedilmektedir (Yaşarol, 1981; Noli, 1999) Amastigot Form 2-4 m büyüklüğünde yuvarlak veya oval şekle sahip olarak ışık mikroskobu altında görülebilmektedir. Amastigotlar omurgalı konakta makrofajların fagolizozomları içinde çoğalmaktadır. Doğal olarak amastigotlar makrofajlarda hücre içi olarak bulunmasına rağmen dokulardan sürme preparat yapılırken makrofajlar yırtılır, bu yüzden amastigotlar hücre dışında serbest olarak bulunabilirler. Kamçısız ve hareketsizdirler. Giemsa ile boyanmış preparatlarda sitoplâzma soluk mavi boyanır, içinde Ramonowsky boyası ile pembe veya koyu kırmızı boyanan, arka uca yakın oldukça büyük bir çekirdek ve ona bitişik kinetoplast görülmektedir. Çekirdek yuvarlak veya oval, 1-1,2 m çapındadır. Çekirdekten daha yoğun olarak boyanan kinetoplast yuvarlak, oval, çubuk gibi değişik şekillerde olabilir, çubuk şeklinde olan kinetoplast 0,5-0,8 m boyunda ve 0,4-0,5 m genişlikte, yuvarlak olanın çapı ise 0,4-0,6 m olarak değişmektedir (Mimioğlu ve ark., 1968; Onul, 1974; Altıntaş, 1995; Roberts ve Janovy, 1996; Strauss-Ayali ve Baneth, 2001; Anon, 2002a).

14 4 Işık mikroskobik yapılarına bakılarak farklı Leishmania türlerinin birbirinden ayırt edilmesi mümkün değildir. Sadece L. enrietti fark edilir biçimde 6 4 m büyüklüğe ulaşabilir ve L. hertigi amastigotları da kese biçimli ve uzamış görünümleriyle morfolojik olarak ayırt edilebilirler (Orhan ve Yaşarol, 1981). Kinetoplastın içerdiği fibrillerin düzeni türe göre değişmekle beraber, 2,5 nm çapındaki genişliği değişmemektedir. Çekirdek ve kinetoplastın her ikisi de DNA içermektedir. Sitoplâzmada ayrıca mitokondri, vakouller, lizozom ve golgi cihazı da bulunmaktadır (Altıntaş, 1995 ) Promastigot Form Phlebotomus ların bağırsaklarında ve besi yerlerinde bulunan tipik hareketli formlardır m uzunlukta, 1,5-2,5 m genişlikte olup, mekik şeklinde vücudu ve yaklaşık aynı uzunlukta ön uçtan çıkan serbest bir kamçısı bulunmaktadır (Altıntaş, 1995). Serbest flagellumun, amastigottaki rudimenter rhizoplastından daha kuvvetli olarak görülmesi dışında, çekirdeğin, sitoplâzmasının flagellumun, terminal ve subterminal kinetoplastın genel boyanma özellikleri amastigotta anlatıldığı gibidir (Yaşarol, 1981). Kamçı karakteristik aksonemal yapıdadır. Aksonem ise 2 merkezi, 9 periferal fibril çifti içermektedir. Kamçının bağlantı noktasında kamçı paketi adı verilen ve sitostoma benzeyen bir invaginasyon vardır. Bazal cisimcik, kinetoplastın önünde, kamçının dip kısmındadır ve bir membran ile izole edilmiştir. Ön uçtan yaklaşık 2 m içeride yuvarlak veya at nalı şeklinde bir kinetoplasta sahiptir. Nükleus parazit sitoplâzmasının ortasında bulunur (Altıntaş, 1995). Üzerindeki 7 nm kalınlığındaki nüklear membranda nm çapında porlar bulunmaktadır. Merkezde 0,6-1 m çapında bir nukleolus vardır. Sitoplazma içinde endoplazmik retikulum ve golgi apareyi bulunmaktadır ve

15 5 ana nüklear membranın endoplazmik retikulum ile bağlantılı olduğu bildirilmiştir (Altıntaş, 1995) Leishmania Soyundaki Etkenlerin Hayat Döngüsü Dişi kum sineği hortumu ile kılcal damarı deler ve orada oluşturduğu kan gölcüğünde beslenir. Bu beslenme sırasında Phelebotomus un vücuduna etkenin girmesinden sonra sindirim kanalındaki gelişimleri başlamaktadır (Pearson ve ark., 2001). Leishmania ile enfekte konaktan kan emme sırasında alınan amastigotlar, şişmiş ve enfekte makrofajların parçalanmasıyla serbest kalır ve alınan kan besininin etrafı abdominal mide hücreleri tarafından salgılanan peritrofik membran ile çevrilir (Mehlhorn, 2001). Burada amastigotların bir kısmı sindirilirken bir kısmı 1-2 kez bölünmektedir (Altıntaş, 1995). Peritrofik membran içindeki amastigotların büyüklüğü arka midede artar, vücudun uzaması ve kamçı gelişimi ile amastigotlar promastigotlara dönüşürler; ayrıca torasik mideye geçen daha uzun ve ince yapıdaki promastigotlara ''Nektomonad'' adı verilmektedir (Pearson ve ark., 2001). Torasik midenin ön ucundaki stomadeal kapağa geldikleri zaman nektomonad promastigotlar, kamçıları ile bağırsak epitel hücrelerinin mikrovilluslarına tutunurlar ve bölünme devam eder (Altıntaş, 1995). Burada gelişen promastigotlar (Haptomonad), özel bir tropizm ya da kemotaksis etkisiyle ön tarafa göç ederek özefagus ve farinksteki kıvrım ve yarıklara kamçılarını sokarak kütikülar intimaya tutunurlar, lümeni tıkarlar (Altıntaş, 1995; Mehlhorn, 2001). Promastigot formlar özefagustan ayrılarak daha küçük ve uzun formlar halinde ağız parçalarına geçerler, bölünmezler, bağlanmazlar ve omurgalı yaşama adapte olabilirler. Phlebotomus un kan emmesinden sonra 7. günde hortum ve ağız parçalarında %20 oranında enfekte promastigotlar

16 6 bulunmakta ve bu oran 14. güne kadar gittikçe artmaktadır. Bu süre Leishmania türüne, çevre koşullarına ve sıcaklığa göre değişmektedir. Phlebotomus tarafından enfektif promastigotların memeli konağa verilmesinden sonra bazıları ilk saatlerde makrofajlar tarafından fagosite edilmektedirler (Şekil 1). Fakat kum sineklerinin tükürüğünde makrofajların öldürücü mekanizmasını inhibe eden ve etknin enfektifliği artıran faktörler bulunmaktadır (Altıntaş, 1995; Roberts ve Janovy, 1996; Pearson ve ark., 2001). Şekil 1. Monosit tarafından fagosite edilen promastigot (Scott, 2010) Makrofaja girerek parazitofor vakuol içinde amastigot forma dönüştükten sonra bölünmeye ve çoğalmaya devam eden parazit, sonunda hücreyi patlatmaktadır. Hücrenin parçalanması sonucunda serbest kalan amastigotlar yeniden makrofajları enfekte edebilmektedir (Şekil 2). Bu arada visceral leishmaniosiste parazitler dalak, karaciğer, kemik iliği, pankreas, lenf yumruları, böbrek, testisler ve göz gibi organlara dağılarak bu organlarda çeşitli patolojik hasarların oluşmasına, cutaneous leishmaniosiste ise parazitler deride girdiği yerde kalarak yayılmaz ve lokal lezyonlara sebep olurlar (Gülanber ve ark., 2001; Mehlhorn; 2001).

17 7 Şekil 2. Leishmaniosisin hayat döngüsü Leishmania promastigot ve amastigot formu (Anon, 2010) 1.3. Leishmaniosisin Vektörü ve Vektörün Sınıflandırmadaki Yeri Nematocera grubunda yer alan Phlebotomidae ailesi içinde bulunan Phlebotomus cinsi, eski dünyada olduğu gibi Türkiye de de Leishmania cinsi protozoonların biyolojik vektörlüğünü yapmaları sebebiyle tıbbi açıdan önem taşımaktadır (Daldal ve Özbel, 1997). Her ne kadar bütün kum sinekleri birbirine benzemekteyse de kuzey ve güney yarım kürede, eski ve yenidünyada farklı epidemiyolojik durumlarından kaynaklanan biyolojik farklılıkları da bulunmaktadır. Phlebotomus Yunanca da phleps kelimesine dayanmaktadır, Phlebos un anlamı kum sineklerinin kan emme alışkanlıklarından dolayı vein (damar) ve refers (kana ait) kelimelerinden gelmektedir (Anon 2002a).

18 8 Phlebotomidae ailesindeki altı cinsin içinde yaklaşık olarak 700 tür tanımlanmıştır (Daldal ve Özbel, 1997). Bu cins içerisindeki Phlebotomus kum sineklerinin dokuz türü bulunmaktadır ve bu türler köpek leishmaniosisin deneylerle ispat edilen vektörleridir (Killick-Kendrick ve Killick-Kendrick, 1999). Ayrıca Phlebotomus lar çeşitli bakteriyel, viral ve paraziter hastalıkları da taşıyabilirler (Anon, 2002b). Tenter ve Schnieder (2006) e göre Leishmania vektörünün sınıflandırılması aşağıda verilmiştir. Alem : Animalia Alem altı : Metazoa Kök : Arthropoda Kök altı : Mandibulata Sınıf : Crustacea (Diantennata, Krebse) Sınıf altı : Insecta (Insekten) Dizi : Diptera Aile : Phlebotomidae/ Psychoidae Soy : Phlebotomus Türler : P.ariasi, P.perniciosus, P.sergenti, P.papatasi, P.major, P.alexandri, P.tobbi, P.perfiliewi, P.simici, P. halepensis, P. longiductus, P. martini, P. alexandri, P. neglectus, P. langeroni, P.simirnovi, P. saevus, P. pedifer, P. longipes, P. salehi, P. duboscqi Vektörün Morfolojik Özellikleri Vektör deniz seviyesinin altında bulunan alanlarda görülebildiği gibi Afganistan gibi deniz seviyesinden 3300 m yukarıdaki rakımlarda da yaşayabilmektedir (Anon, 2002b). Leishmaniosisin özellikle Akdeniz havzasında yaygın olarak görülmesinin bir nedeni vektörün yaşaması için bu bölgenin oldukça elverişli olmasıdır (Naucke ve ark., 2009). Dünyada sandfly (kum sineği) adı verilen

19 9 Phlebotomus lar, Türkiye de yapyakan, gürpdüşen, çetisineği veya yakarca olarak adlandırılmaktadır (Daldal ve Özbel, 1997; Çiçek ve ark., 2005). Yumurta: Bırakılan yumurtalar, uçları oldukça yuvarlak µm uzunluğunda, µm genişliğinde olup bir tarafı konkav diğer tarafı düzdür (Daldal ve Özbel, 1997). Larva: Yumurtadan çıkan larva 2,5-3,5 mm uzunluğunda ve toplam 12 segmentli olup, pupaya dönüşmeden önce dört gömlek değiştirmektedir (Killick-Kendrick ve Killick-Kendrick, 1999). Larvaların başlangıçta çiğneyici ağız parçaları bulunmakta ve yaprak küfleri, böcek parçaları gibi organik maddelerle beslenebilmektedir (Daldal ve Özbel, 1997). Pupa: Pupa haline dönmeden önce dördüncü devre larva, mide içeriğini boşaltmakta, beslenmesini durdurmakta ve torasik bölgede şişlik oluşmaktadır. Karada yaşamalarına karşın larva ve pupalar kuruluğa duyarlıdır. Pupa evrimini tamamladıktan sonra sırt ve ön kısmında T şeklinde açılan yarıktan erişkin dışarı çıkmaktadır (Daldal ve Özbel, 1997) Erişkin: Uzunluğu yaklaşık 2-5 mm, uzun antenli, 5 segmentli sarkık palpleri olan, kahverengimsi, dar vücutlu, uzun bacaklı, bal peteği şeklindeki iri gözleri, vücudun üzerinde dik duran yaprak şeklinde kanatlı ve kanatları dâhil bütün vücudu tüylerle kaplı nematocer lerdir (Altıntaş, 1995) Phlebotomus larda kan emici diğer dişi sineklerde oldukça fonksiyonel olan ağız parçalarından mandibula, diğer türlere göre daha kısa olup, kan emmeyen erkeklerde ise bulunmamaktadır (Doğan, 1981). Vücuda oranla küçük olan baş, öne eğik, yandan ince uzun görünümde, arka ve ön kısımları dar olup gözlerin bulunduğu orta bölge daha geniş (Şekil 3) olarak görülmektedir (Daldal ve Özbel, 1997).

20 10 Şekil 3. Leishmania nın vektörü olan Phlebotomus un erkeği ve dişisi (Beckthиk, 2006) Vektörün Hayat Döngüsü Vektörün biyolojisinde dişi Phlebotomus lar alacakaranlıkta rüzgarın olmadığı ya da az olduğu zamanlarda kan emmekte, gündüzleri ise karanlık, kuytu yerlerde, taş ve tahta yarıklarında ayrıca bodrumlar ile kemirgen hayvan yuvalarında bulunmaktadır. Özellikle yaz sezonunda aktif olan dişi Phlebotomus lar 3 hafta, erkekler ise 2 hafta yaşarlar (Doğan, 1981; Altıntaş, 1995; Daldal ve Özbel, 1997; Killick-Kendrick ve Killick-Kendrick, 1999; Rossi ve ark., 2008; Otranto ve Dantas-Torres, 2010). Phlebotomus lar ormanlık alanlarda, sürüngen ve kemirgen yuvalarının bulunduğu kırsal alanlarda, yerleşim yeri çevresindeki enkazların olduğu yerlerde yaşamaktadır (Pearson ve ark., 2001). Dişi kum sineği larvalar için organik maddelerin fazlaca bulunduğu karanlık ve nemli alanlara yumurtalarını bırakmaktadır. Bunun için en uygun alanlar ise ağaç kovukları, hayvan yuvaları ve yere düşen yaprakların altıdır. Bu tür alanların bulunduğu bölgeler Phlebotomus lar için uygun yaşam alanlarını oluşturmaktadır (Goddard, 1999). Phlebotomus ve Lutzomyia ların kan emmeleri sırasında konağa enjekte edilen özel bir salgısı ortaya çıkarılmıştır. Buna göre bazı türlerin kan

21 11 emmesi oldukça ağrılı olmasına rağmen bazı türlerinki ise hissedilmemektedir. Nedeni ise salgıda lokal anesteziklerin bulunup bulunmamasına bağlıdır. Bu salgı kanın pıhtılaşmasını önleyici ve diğer bazı farmakolojik özelliklerde maddeleri içermektedir. Salgıda bulunan Maxidilan adı verilen peptit, kan emilimini kolaylaştırmak için vazodilatatör etki yaparak kanın göllenmesini sağlar ve delinmeyi kolaylaştırır. Ayrıca kum sineğinin bu salgısının immunsupresif özellikte olduğu deneysel olarak ispatlanmıştır (Killick-Kendrick ve Killick-Kendrick, 1999). Phlebotomus ların sadece Leishmania promastigotlarını enjekte eden bir mekanizmaya sahip olmadıkları, aynı zamanda salgıladığı tükürük ile parazite, yeni ortamına karşı ilk andaki adaptasyon sürecinde yardımcı olduğu görülmektedir. Beslenme sırasında dişi kum sineği tarafından inokule edilen tükürüğe karşı konakta yüksek düzeyde antikor üretimi yapılmaktadır. Buna karşın kum sineğinin ısırması sonucunda tavşan ve hamsterdan alınan kan serumlarında türe özel tükürük antijenleri bulunmaktadır. Bu antijenler Phlebotomus soyundaki üç türde (P. papatasi, P. perniciosus, P. halepensis) belirlenmiştir. Özellikle bu türlerin tükürük bezlerindeki antijen komponentlerinde önemli farklılıklar bulunmuştur (Daldal ve Özbel, 1997) Dünya da ve Türkiye de Phlebotomus Türleri Türkiye de Phlebotomus ların epidemiyolojisi üzerine yapılan çalışmalarda 19 Phlebotomus türü belirlenmiştir. Tespit edilen bu Phlebotomus türlerinden dokuzunun Eski Dünya leishmaniosisinin muhtemel vektörü oldukları kanıtlanmıştır (Çizelge 1)(Volf ve ark., 2000). Çoğunlukla Ege, Akdeniz ve Güney Doğu Anadolu bölgelerinde, az miktarda da İç Anadolu bölgesinde gerçekleştirilen bu çalışmalarda Phlebotomus ların genel yayılma alanları kısmen belirlenmiş olmasına rağmen bölgesel çalışmalar çok az olup, Türkiye faunasını aydınlatacak nitelikte değildir (Volf ve ark., 2000; Çiçek ve ark., 2005; Değer ve Yaman, 2005).

22 12 Çizelge 1. Eski dünyadaki leishmaniosis vektörleri ve bölgeleri ( Daldal ve Özbel, 1997). Akdeniz ülkelerinde L.infantum un vektörü P.ariasi ve P.perniciosus olduğu rapor edilmektedir. Fakat Türkiye de P.sergenti, P.papatasi, P.major, P.alexandri, P.tobbi, P.perfiliewi ve P.simici nin de L.infantum un muhtemel vektörü olabileceği hesaba katılmalıdır (Killick-Kendrick ve Killick- Kendrick,1999; Ok ve ark., 2002). İran da Leishmania etkeninin tespit edildiği vektör Phlebotomus türleri içerisinde en önemli tür Phlebotomus perfeliewi transcaucasicus olarak olarak tespit edilmiştir (Oshaghi ve ark., 2009) Leishmaniosiste İmmunoloji Köpeklerdeki Leishmania enfeksiyonlarında, etken makrofaj hücresine girer. Doğal savunma mekanizmasına rağmen yaşamına devam ederler. Hücreye

23 13 girerken kullanılan komplement reseptörleri, normal fagositoz da görülen oksidatif olayların başlamasını sağlarken, aynı zamanda toksik oksijen metabolitlerinin salınmasından korunmaya karşı yardımcı olur. Hücre zarı yapısında yer alan lipofosfoglikan (LPG) ve diğer bazı moleküller, oksidatif olayların inhibisyonunu sağlar. LPG yapı ve glikoprotein (gp) 63 (parazitin salgıladığı protease) enzimi konak hücrenin enzim aktivitelerine karşı dirençlidir ve etken için korunma sağlar. Konak hücre içinde etken parazitofor bir vakuol içerisinde bulunur. Amastigotlar normal başlayan lizozomal aktiviteden etraflarını çevreleyen bu fagolizozom sayesinde korunurlar (İça, 2007). Hücresel bağışıklıkta Leishmania türlerine karşı oluşan immunite duyarlı ve dirençli köpeklerde farklılıklar gösterir. Duyarlı ( semptomatik) köpeklerde meydana gelen immunolojik değişiklikler, genellikle T hücrelerinde oluşan reaksiyonlar ve sitokinlerle ilgilidir. Dirençli (asemptomatik) köpeklerde immun yanıt gamma interferon (IFN-γ) ve interleukin 2 nin (IL- 2) ve tumor necrosis faktor-alpha (TNF-α) üreten Th1 (T helper) hücrelerinin aktivasyonu ile ilgilidir. Bu maddelerin salınımı ile aktive edilen makrofajların ürettiği nitrik oksit (NO) ile hücre içi amastigotlar yok edilmektedir (Roberts ve Janovy, 1996; Strauss- Ayali ve Baneth, 2001; Chamizo ve ark., 2005; Day, 2007). Özellikle duyarlı (semptomatik) köpeklerde baskılanmış bir hücresel immunite, buna karşın oldukça kuvvetli bir humoral yanıt görülmektedir. Bu nedenle IgG seviyesi önemli bir indikatördür. Anti-Leishmania antikorlarından IgG1 duyarlı köpeklerde yüksek oranda görülürken, IgG2 dirençli köpeklerde görülmektedir (Day, 2007; İça, 2007) Leishmaniosisin Epidemiyolojisi Leishmaniosis evcil hayvanlar arasında en fazla köpeklerde görülür. Köpeklerdeki Leishmania enfeksiyonları özellikle tropikal, subtropikal ve ılıman

24 14 bölgelerde sıklıkla klinik semptoma neden olur. Hastalığın endemik olduğu bölgelerde bulunan köpeklerde oldukça yaygın olmakla birlikte, kedilerden de tespit edilmiştir. Kedilerde belirlenen hastalığın seroprevalansı düşük olmasına rağmen özellikle endemik bölgelerde dikkate alınması gerektiği bildirilmektedir (Strauss-Ayali ve Baneth, 2001; Nasareddin ve ark., 2008; Diakou ve ark., 2009; Ready, 2010 ). Eski dünyada köpek leishmaniosis hastalığı, Phlebotomus soyundaki kum sinekleri ile yeni dünyada ise Lutzomyia soyundaki vektörler ile nakledilmektedir (Strauss-Ayali ve Baneth, 2001). Dünyada visceral ve cutaneous leishmaniosise neden olan türlerin epidemiyolojisi önemli farklılıklar göstermektedir. Hastalığın yayılmasında yükseklik, bitki örtüsü, nem, sıcaklık gibi faktörlerin etkili olduğu bildirilmektedir. Epidemi süresince insanların da önemli bir rezervuar olacağı düşünülmektedir (Desjeux, 2002). Visceral leismaniosis için köpekler, zoonotik cutaneous leismaniosis (ZCL) için de kemiriciler ana rezervuardırlar (Ok ve ark., 2002). Bölgeden bölgeye değişen rezervuar genel olarak köpek, bunun dışında tilki ve çakallardır. Hastalığın kuluçka süresinin uzunluğu nedeniyle turistler, askeri personel ve göçmenler etkeni başka ülkelere taşıyabilirler (OIE, 2004). Köpek leishmaniosisi (CanL) özellikle kırsal bölgelerde rastlanan bir hastalık olmasına rağmen yoğun kentleşmenin görüldüğü bölgelerde de yaygınlık gösterdiği kabul edilmektedir (Dantas- Torres, 2009). Nadiren, L.donovani nin kan nakliyle ve konjenital olarak da bulaştığı bildirilmektedir (Değer ve Yaman, 2005). Özel önlem olarak küçük çocuklar ve immun sistemi zayıf kişilerin enfekte köpeklerden uzak durmaları bu sayılan nedenlerden ötürü önerilmektedir (Lopez-Velez, 2003).

25 15 Akdeniz havzasında insanlarda görülen leishmaniosis için köpekler esas enfeksiyon kaynağı olsa da, diğer bir Leishmania türü olan L. tropica söz konusu olduğunda, köpeklerin insanlar için enfeksiyon taşıyıcı olmak yerine daha çok bu hastalığın kurbanı olduğu görülmektedir (Dereure ve ark., 1999) Dünya da Leishmaniosis Leishmaniosis beş kıtada 88 ülkede (Şekil 4) endemiktir. Ayrıca toplamda 350 milyon insan da risk altındadır, VL ve CL in insanlardaki yıllık yeni vaka sayısının sırasıyla 500 bin ve 1,5 milyon olduğu tahmin edilmektedir (KIT, 2005). Endemik bölgelerde enfeksiyon oranı %40 a ulaşabilir. Enfeksiyon 40º Kuzey, 40º Güney paralelleri arasında Kuzey Afrika, Orta ve Güney Amerika, Güney Avrupa ve Asya da, özellikle de Akdeniz havzasında (Çizelge 2) bulunan ülkelerde endemiktir (Anon, 2002a). Yeni dünya olarak da adlandırılan Amerika kıtasında leishmaniosise L.braziliensis compleks (MCL ve CL), L.mexicana compleks (CL), L.peruviana (CL) ve L.chagasi (VL ve CL) türleri; Eski dünya olarak adlandırılan Avrupa, Asya ve Afrika kıtalarında ise L.donovani (VL), L.infantum (VL ve CL), L.tropica (CL), L.major (CL) ve L.aethiopica (CL) türleri neden olmaktadırlar (OIE, 2004; Assad, 2006). Hastalık, yaygın olarak görüldüğü alanların dışında endemik bölgelerden getirilen ve bu bölgeler arasında seyahat eden köpeklerde de görülmektedir. Portekiz ve Akdeniz kıyılarındaki ülkelere tatile götürülen köpeklerin %0.23 ünden fazlasının leishmaniosis ile döndüğü Hollanda dan rapor edilmektedir. Buna karşılık hastalık Avusturalya da görülmemiştir (Anon, 2002a).

26 16 Çizelge 2. Akdeniz ülkelerinde canine leishmaniosisin seroprevalansı ve izoenzim türleri (Dereure ve ark., 1999; Özensoy Töz ve ark., 2005c; Çanakçı, 2007) Ülke Seroprevalans İzoenzim türü (Zymodeme) % Cezayir 37,5 MON-1, MON-34, MON-77(L.infantum) Güney Kıbrıs 17 MON-1 (L.infantum) KKTC 3,6 - Mısır 7 MON-98 (L.infantum) Fransa MON-1, MON-108(L.infantum) Yunanistan 6,5-40 MON-1 (L.infantum) İsrail 14,6 - İtalya 4,6-12,4 MON-1, MON 27 (L.infantum) Lübnan 2 - Libya 1,4-1,7 - Malta 17 - Fas 4,2-23 MON-1 (L.infantum), MON-102, MON-113 (L.tropica) Portekiz 9,4-37,8 MON-1 (L.infantum) İspanya MON-1, MON-11, MON-77, MON-105 (L.infantum) Suriye 5/24 MON-1 (L.infantum), MON-76 (L.tropica) Tunus 1,6-6,2 MON-1 (L.infantum) Canine leishmaniosis Akdeniz Bölgesi ndeki köpek populasyonu içerisinde son derece yaygın bir hastalıktır (Özensoy ve ark., 2005a). Akdeniz ülkelerinde köpek VL in prevalansı konusunda bölgeden bölgeye büyük değişimler görüldüğü ve etkeni taşıyan köpeklerin oranının %1 ile %37 arasında olduğu tespit edilmiştir (Dereure ve ark., 1999; Özbel ve ark., 2000; Özensoy ve ark., 2005a).

27 17 Şekil 4. Dünya da bazı Leishmania türlerinin coğrafik dağılımı (Leishmania. org, 2006) Azerbaycan da leishmaniosis insanlarda sıtmadan sonra gelen en yaygın ikinci hastalık durumundadır yılları arasında ülkenin farklı bölgelerinde toplam 62 VL vakası bildirilmiştir (Bağırova ve ark., 2005). Köpeklerin rezervuar hayvan olması sebebiyle Brezilya da VL nin kontrolünde eskiden başıboş köpeklerin itlafı yapılmış, fakat köpek popülasyonu içerisinde elde edilen düşük enfeksiyon oranı korunamamıştır. Bu nedenle artık kullanılmamaktadır (Anon, 2002a). Son yıllarda kayıtlı olayların sayısında ciddi bir artış vardır ve 1994 yılları arasında Güney Sudan ın epidemik bölgelerinde 280 bin insandan yaklaşık 100 bin kişinin VL den dolayı öldüğü tahmin edilmektedir. Afganistan da CL in epidemisi insanlar arasında yüzlerce ve binlerce olayla devam etmektedir (Ok ve ark., 2002). Güneybatı ve orta Asya da görev yapan

28 18 Amerikalı askerlerde bile CL görülmüştür (CDC, 2006a) yılları arasında Afganistan a giden iki askeri personelde VL vakası bildirilmiştir (CDC, 2006b). İnsanlarda leishmaniosis, Dünya Sağlık Örgütü nün tanımladığı dünyanın pek çok bölgesinde halk sağlığını tehdit eden, 5-6 hastalıktan biridir. İnsanlarda rastlanan leishmaniosis olgularının 3/4 ü cutaneous, 1/4 ü ise visceral formdur (Desjeux, 2002). İtalya da bir bölgede yapılan araştırmada L. infantum ile enfekte asemptomatik köpekler incelendiğinde leishmaniosisin bölgede endemik olduğu görülmüştür (Otranto ve ark., 2009). Yine İtalya nın diğer bir bölgesinde enfeksiyon riskinin belirlenmesi ve kontrol önlemlerinin faydalı olup olmadığının değerlendirilmesi için yapılan çalışmada prevalans % 48,4 olarak tespit edilmiştir (Paradies ve ark., 2006) Türkiye de Leishmaniosis Türkiye, Asya ve Avrupa kıtaları arasında köprü durumunda olan Türkiye de leishmaniosisin epidemiyolojisinde önemli olan farklı ekolojik ve iklimsel durumların önemli olduğu gözlenmektedir (Ok ve ark, 2002). Bugüne kadar Türkiye de Aydın, Ankara, Bursa, Eskişehir, Karabük, Manisa ve Şanlıurfa illerine bağlı çeşitli yerleşim yerlerindeki köpeklerde %3,5 ile %20 arasında anti-leishmania antikorları saptanmış ve bu bölgelerdeki bazı köpeklerde klinik leishmaniosis olguları bildirilmiştir (Ok ve ark., 2002; Vatansever ve İça, 2005). Fakat insanlarda VL vakalarının bulunduğu Türkiye nin Batı bölgelerinde yapılan detaylı taramalarda, köpek populasyonu arasındaki seropozitivite oranı ortalaması %5,3 olarak tespit edilmiştir ve bu seropozitif köpeklerin %85 gibi çok belirgin bir oranı PCR incelemesi yapılarak tespit edilmiştir (Özbel ve ark., 2000; Özensoy ve ark., 2005a).

29 19 Ege bölgesinde İzmir/Selçuk, Aydın/Merkez Aydın/Kuşadası, Manisa/Turgutlu, Muğla /Bodrum, Muğla/Marmaris te IFA testi yapılan bir çalışmada seroprevalans %9 olarak belirlenmiştir (Atasoy ve ark., 2005). Sakarya ilinde yine IFAT ile yapılan çalışmada 69 sokak köpeğinden bir tanesi (%1,45) seropozitif bulunmuştur (Taylan Özkan ve ark., 2003). İstanbul sokak köpeklerinde visceral leishmaniosisin IFAT ile incelemesi yapılmış ve seropozitif köpek tespit edilmemiştir (Handemir ve ark., 2004). Çanakkale ili Ayvacık ilçesinde 27 köpek IFA testi ile incelemiş, bölgede bulunan Phlebotomus türleri belirlenmiş fakat seropozitifliğe rastlanmamıştır (Tok ve ark., 2009). Konya, Bursa ve İzmir yörelerinde yapılan çalışmada 278 köpek IFAT ile incelenmiş ve iki köpekte (%0,72) leishmania antikorları tespit edilmiştir ( Kamburgil ve Dik, 1998). Kocaeli sokak köpeklerinde visceral leishmaiosisin seroprevalansı çalışmasında ise 65 köpekten 3 tanesinde (%3,07) seropozitilik saptanmıştır ( Sönmez Tamer ve ark., 2008). Şanlıurfa yöresinde 80 sokak köpeği ile yapılan çalışmada, IFAT örneklerden hiçbirinde seropozitiflik belirlenmemiştir (Babür ve ark.,2007). Diyarbakır bölgesinde sokak köpeklerinde IFAT ile yapılan çalışmada ise 100 köpekten hiçbirinde leishmania antikorları saptanmamıştır ( İçen ve ark.,2010). Aslantaş ve ark. (2005) 116 sokak köpeği ile Ankara da yaptığı çalışmada, 3 köpeğin pozitif olduğu belirlenmiş ve seroprevalans %2,58 olarak saptanmıştır. Fakat yapılan bu çalışmada kan örneği alınan köpeklerin tamamı sokak köpeğidir ve kan örneklerinin hangi bölgelerden toplandığı belirtilmemektedir Leishmaniosisin Patogenezi Visceral leishmaniosiste omurgalı, enfekte vektör yakarca sinekleri tarafından sokulduğunda promastigot formdaki etken deri içerisine girer. Sokulan yere en yakında bulunan makrofajlarca fagosite edilen etken, amastigot forma dönüşür. Burada haftalarca hatta aylarca kalabilir. Zamanla kan akımına karışan makrofajlar içlerinde bulunan amastigotlar da dalak, kemik iliği, lenf nodülleri, intestinal lenfatik dokular, submukoza ve diğer mononüklear

30 20 fagositoz sistem organlarına taşınır (Ak ve ark., 1995; Roberts ve Janovy, 1996; Pearson ve ark., 2001; Anon, 2002a). İlk dikkati çeken bulgu patolojik olarak, dalak ve karaciğerde mononükleer fagositik hücrelerin artışına bağlı olarak organlarda progresif bir büyümenin oluşmasıdır. Dalakta lenfoid folüküllerde amastigotlu mononükleer hücreler artmakta, karaciğer Kupffer hücrelerinde amastigotlar çoğalmaktadır. Dalaktaki hipetrofiye bağlı olarak meydana gelen dalak büyümesi sonucunda eritrosit, granülosit ve trombositler kısa sürede yıkımlanmakta ve gelişen lökopeniye anemide eklenmektedir (Pearson ve ark., 2001; Anon, 2002a). İnce bağırsaklarda özellikle Peyer plaklarının etrafında bulunan submukozanın amastigotlar tarafından istila edilmesi sonucunda hastalarda malabsorbsiyon ve özellikle albümin kaybı olduğu gözlenir. Kalbin myokardında dejeneratif bozukluklar bulunur. Mononüklear fagositoz sistemdeki bu yoğun istila sonucunda immunglobulin G (IgG) fazla sentez edilir. Ancak sentez edilen IgG lerin koruyucu bir özelliğinin bulunmadığı ve hemen hepsinin otoantikor yapısında olduğu tespit edilmiştir. Fazla immun kompleksler patolojik değişikliklerin oluşmasına katkı sağlar. Özellikle böbreklere birikir (Anon; 2002a). Makrofajlara giren parazitin nasıl olup da fagositozla sindirilemediği cevaplanması gereken sorulardan biridir. Bilindiği gibi makrofajların içinde bulunan oksijen metabolizması ara ürünü olan hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ile lizozomal hidrolaz enzimleri, düşük ph ve katyonik bazı proteinleri ile, hücre içine alınan mikroorganizmaların sindirilmesini sağlamaktadır. Leishmania ların hücre içine alındıktan sonra tüm bu savunma mekanizmalarına karşı koyduğu gözlenmektedir. Leishmania etkenlerinin bu yeteneği ile ilgili bazı teorilerin varlığı bilinmektedir. Bunlardan biri, Leishmania parazitinin yüzeyinde bulunan lipofosfoglikan (LPG) yapısındaki moleküllerinin içerdikleri kuvvetli negatif yüke sahip olmaları onların fagozomal sindirimini önlediğini savunur. Ayrıca parazitin sıvı besi yeri ortamında salgıladıkları LPG

31 21 ve Excreting Factor (EF) nötralizan etki göstererek lizozomal enzimlerin etkisini ortadan kaldırdığı belirlenmiştir (Ak ve ark.,1995). Visceral leishmaniosise karşı şekillenen direnç, spesifik hücresel immuniteye bağlı olarak oluşmaktadır. Hücresel cevap yeterli olduğunda sadece karaciğerde kendiliğinden iyileşen granulom oluşurken cevap yetersiz olduğunda, optimal tedaviye rağmen %5-7 arasında ölüm oranı tespit edilmiştir (Pearson ve ark., 2001). Hastalık köpeklerdeki akut vakalarda yüksek ateş ve titremeyle birlikte ani ve şiddetli olarak başlar. Subakut ve kronik vakalarda, hepatosplenomegali (HSM) nedeniyle karında şişlikle ortaya çıkan sinsi bir başlangıcı vardır. Ayrıca ateşe ek olarak güçsüzlük, iştah kaybı, kilo kaybı olabilmektedir. Hastalığın semptomları haftalar hatta aylarca dikkati çekmeden devam edebilmektedir (Roberts ve Janovy, 1996). Ateşin yanında splenomegali (SM), lenfadenopati (LAP), malnütrisyon ve deri değişiklikleri önemli klinik bulgular olarak sayılmakta, yüksek ateşli ilk dönemi genellikle bir kaç gün süren ateşsiz bir periyot izler. Vakaların %80 inden fazlasında ateş gün içinde ºC e varan iki pik yapan ve bu açıdan Brucella yı andıran dalgalı şekilde seyreder. Dalaktaki büyüme hızlı olmadığı gibi dalağın boyutları da hastalık süresi ile ilişkili değildir. Pek çok vakada sert olarak palpe edilen ancak hassas olmayan dalak büyür. Ancak dalakta subkapsüler bir infarkt gelişirse hassasiyet tespit edilir. Dalağın büyümesi ilk olarak hemotolojik bir bozukluğu veya schistosomiasis i düşündürür. Hassas olmayan karaciğer ise vakaların %20 sinde palpe edilebilir ve dalaktan daha yavaş büyür (Ak ve ark., 1995).

32 Leishmaniosisin Teşhisi Leishmaniosisin Klinik Teşhisi Belirtilerin çeşitliliği ve bunların başka hastalıklarla karışması nedeniyle oldukça zordur. Kesin tanı parazitolojik muayene, seroloji ve moleküler tanı yöntemleri sayesinde kolaylıkla belirlenebilmektedir (Vatansever ve İça, 2005). Fakat klinik belirti göstermeyen köpeklerde leishmaniosis göz ardı edilmektedir (Dantas- Torres ve ark., 2006). Leishmaniosis dişi ve erkek fark etmeden her iki cinste, pek çok ırkta ve bütün yaş gruplarında görülebilir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda dokuz aylıktan on beş yaşına kadar hastalığın görülebildiği saptanmışsa da, ortalama beş yaşındaki köpeklerin enfekte olabildiği belirlenmiştir. Ayrıca teşhiste anamnez çok önemlidir. Endemik bölgelerde ya da vektörün bulunduğu alanlarla ilgili hikâyesi olan köpeklerde leishmaniosis düşünülmelidir. (Strauss- Ayali ve Beneth, 2001; Anon 2002a). Bazı köpeklerde klinik belirti gözlenmeyebilir, bazıları ise teşhis için gerekli olan klinik belirtilerden sadece birini ya da hepsini gösterebilirler. Vücut ısısı değişken olabilir, fakat çoğunlukla normaldir (Ferrer, 1999). Hasta hayvanların özellikle Akdeniz ülkelerindeki endemik bölgelerde bulunması oldukça önemlidir. Klinik belirtiler arasında dalak büyümesi, hafif ılımlı lenfadenopati, anemi, dermatit ve göz çevresinde tüy dökülmesi ve pullanma; ayaklar, kuyruk, kulakların uçları, göz kapağı, dudaklar ve özellikle burunu saran ülseratif nodüller, tırnak yapısında bozukluklar, göz lezyonları (keratitis, korneal ödem, glaucoma), epistaksis, aralıklı topallayan polyartiritis, kilo kaybı, pneumonia, renal yetmezlik, ishal, kronik kolitis ve sinirsel anomalilerdir (Ferrer, 1999; Strauss- Ayali ve Beneth, 2001; Anon, 2002a; OİE, 2004; Schallig ve ark., 2004). Hiperproteinemi, hiperglobulinemi ve hipoalbuminemi kan tablosunda görülen bulgulardır. Glomerulonefritis ve poliartiritis gibi böbrek ve eklem belirtilerinin immun kompleks birikimi ile ilgili olduğu bildirilmektedir. Bu

33 23 bulguların saptanmasının enfeksiyonun seyri ile ilişkili olduğu düşünülmektedir (Ferrer, 1999; Megat Abd Rani ve ark, 2010). Köpek leishmaniosiste klinik olarak, lenfadenopati %65-90, deri bulguları %81-89, solgun mukoz membranlar %58, gözde belirtiler %18, kaşeksi %10-47, dalak büyümesi %9-53, ateş %4-36, burun kanaması %6-10. eklem bozuklukları %3-4, asites %1-3 oranında karşılaşılan bulgulardandır. Deride görülen bulgulardan ise dermatitis %56-64, ülserasyonlar %34-40, tırnak yapısında bozulmalar %20-30, burunda hiperkeratoz %18, ayaklarda hiperkeratoz %14, nodüller %2-6 oranlarında görülmektedir (Strauss- Ayali ve Beneth, 2001). Ayrıca kalp kasında atrofi ve dejenerasyonun görülebileceği belirtilmiştir. Nadir görülen bir bulgu olmasına rağmen mononükleer hücre infiltrasyonunun bulunduğu miyokardit tespit edilebilmektedir (López- Peña ve ark., 2009). Bütün bu olguların birleştirilmesiyle enfekte köpeklerin %60- %90 ı belirlenebilmektedir (Anon, 2002a; Vatansever ve İça, 2005) Leishmaniosiste Mikroskobik Teşhis Tedavi görmemiş vakalarda Leishmania etkenleri kanda hemen her zaman görülebilir. Kandan hazırlanan yayma ve kalın damla kan preparatlarının %5 Giemsa ile boyanıp incelenmesi sonucunda monosit ve diğer lökositler içinde Leishmania etkenleri (Şekil 5) görülebilir. Kandan hazırlanan preparatlarda etkenler görülmediğinde kemik iliği, dalak, karaciğer veya lenf bezlerinden punksiyonla alınan materyal aynı şekilde mikroskopta incelenmektedir (Roberts ve Janovy, 1996; Özensoy ve ark., 1998; Güneş ve ark., 2004).

34 24 Şekil 5. Monosit hücreleri içerisindeki amastigotlar (CDC, 2010) Parazitolojik muayenede hastalıktan şüpheli hayvanların lenf yumrusu, dalak veya kemik iliği aspiratlarından hazırlanan sürme preparatların Giemsa ya da May-Grunwald ile boyanması gerekir. Çubuk biçimindeki kinetoplastı koyu boyanan ve kırmızıdan mora değişen renkte bir hücre çekirdeği bulunan, oval şekilli amastigotların belirlenmesiyle yapılabilir. Preparatlardaki amastigotlar makrofajların içerisinde makrofajların yırtılması sonucu serbest olarak görülebilirler (Strauss- Ayali ve Beneth, 2001; Anon, 2002a; Vatansever ve İça, 2005). Ayrıca, göz çevresindeki ya da diğer bölgelerdeki deri lezyonlarından hazırlanan preparatlarda da etken tespit edilebilmektedir (Strauss- Ayali ve Beneth, 2001; OİE, 2004; Vatansever ve İça, 2005). Bazı durumlarda serolojik yöntemler kullanılarak leishmaniosis tespit edildiğinde bile punksiyon ile alınan örneklerde etkene rastlanılmamaktadır (Hassan ve ark., 2009). Kemik iliği punksiyonu: Bu yöntem karaciğer punksiyonundan daha iyidir ve vakaların yaklaşık % inde pozitif sonuç verdiği bildirilmektedir. Sternum yerine tibia ve ikinci bel omurunun processus spinosus u gibi belirgin ve yüzlek

35 25 kemikler de kullanılabilmektedir. Ayrıca tedavi edilen vakalarda parazitler en son kemik iliğinden kaybolmaktadır (Altıntaş, 1995). Lenf bezi punksiyonu: Lenf bezi aspirasyonu veya biyopsisi ile tanı, ancak büyük nodüller varsa konulabilir. Koltuk altı, kasık ya da boyun lenf düğümlerinden steril ve kuru bir iğne ile materyal alınır (Assad, 2006). Karaciğer ve dalak ponksiyonu: Kuru bir enjektör ve iğne ile yapılan dalak punksiyonundan elde edilen preparatlarda %95-98 kadarında veya bu materyalle yapılan kültür üretiminin hemen hemen %100 ünde pozitif sonuç alındığı bildirilmektedir Karaciğer punksiyonu daha az tehlikeli olduğu için bazıları tarafından tercih edilmektedir. Bu yöntemle de vakaların %77 sinde olumlu sonuç alındığı bildirilmektedir (Altıntaş, 1995). Punksiyonla alınan materyal temiz bir lam üzerine yayılarak Giemsa yöntemi ya da Romanovski boyalarından biri ile boyanır ve immersiyon objektif ile mikroskopta incelenir (Altıntaş, 1995). Besi yerine ekim: Alınan punksiyon materyallerinin ya da kanın NNN (Nicole- Novy- Mac Neal) besi yerine ekiminin yapılmasıdır. Bu besi yeri agar, NaCl, ve distile su ile hazırlanmaktadır. Parazitin izolasyonu için yapılan inokulasyondan sonraki 2-3 gün sonra üreme kontrol edilmektedir ( Daldal ve ark., 1997; Güneş ve ark., 2004; Arcari ve ark., 2006). Leishmania promastigotları %10-20 Fetal buzağı serumu (FCS) ve antibiyotik eklenmiş bazı besi yerlerinde de üremektedir. Bunlar arasında RPMI 1640, Medium 199, ve Nutrient Broth sayılabilir ( Daldal ve ark. 1997; Güneş ve ark., 2004). Deney hayvanlarına inokulasyon Alınan punksiyon materyallerinin laboratuarda deney hayvanlarına inoküle edilmesi sonucunda, bunların iç organlarında Leishmania ları görmekle tanıya gidilebilirse de, bu yöntemle sonuç alınması uzun sürdüğünden pek fazla önerilen bir yöntem değildir.

36 26 Deney hayvanı olarak en çok hamster kullanılır (Altıntaş, 1995). Fakat leishmaniosisin teşhisi için özellikle hamsterlere yapılan inokulasyonun yanıt verebilmesi için haftalar ya da aylar geçmesi, besi yerinde kültüre edilmesi içinde 30 gün beklenmesi gerekmektedir (OİE, 2004). Bu yöntemler özellikle etken izolasyon ve identifikasyonu açısından önemli olmasına rağmen kullanımı uzun zaman almasından dolayı rutin teşhiste tercih edilmez (Strauss- Ayali ve Beneth, 2001; Vatansever ve İça, 2005). Etkenin in vitro olarak kültüre edilmesinde Nicole-Novy- Mac Neal medium ya da modifiye Schneider s Drodphila insect medium ile ekimi yapılarak promastigot formların üremesi beklenir. Bu yöntemler dışında elde edilen bütün aspiratlar in vivo ve in vitro olarak ekimleri yapılarak üretilebilirler (Strauss- Ayali ve Beneth, 2001; Anon, 2002a; OİE, 2004; Vatansever ve İça, 2005) Leishmaniosisin Serolojik Teşhisi Hastalığın serolojik teşhisinde spesifik anti-leishmania antikorlarını teşhis etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir (Altıntaş, 1995). Serolojik muayene de visceral leishmaniosis ile klinik ya da subklinik enfekte köpeklerin belirlenmesinde daima spesifik humoral yanıt belirlenerek hastalık teşhis edilmektedir. Bundan dolayıdır ki anti-leishmania antikorlarının belirlenmesi için İndirek Floresan Antikor Testi (IFAT), Direkt Aglutinasyon Assay (DAT), Enzyme- Linked İmmunosorbent Assay (ELİSA) gibi çeşitli serolojik yöntemler geliştirilmiştir (Strauss- Ayali ve Beneth, 2001). Klinik bulgular ve parazitin direkt tanımlanmasındaki zorluklar nedeniyle hastalığın prevalansı serolojik tanı yöntemleri ile belirlenmektedir (Vercammen ve ark, 1997, Gradoni, 1999). Avrupa da yılları arasında CanL in seroprevalansıyla ilgili yapılmış 43 çalışmanın 24 ünde IFAT kullanılmıştır (Gradoni, 1999).

37 27 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Yöntemi: Genel olarak serolojik testler içerisinde en spesifik ve hassas yöntem olma özelliğini kazanmış durumdadır. Promastigot veya amastigot formlardan hazırlanmış eriyik antijeni kullanılmaktadır (Ak, 1997; Roberts ve Janovy, 1996). Competitive- ELISA, Dot-ELISA; slide-elisa; iso-type spesific ELISA ve Western Blotting etken konak humoral yanıtının belirlenmesinde kullanılan diğer yöntemler olarak belirtilmektedir (Strauss- Ayali ve Beneth, 2001). İndirekt İmmuno Fluoresan Yöntemi: Uzun yıllardır kullanılmakta olup, leishmaniosis tanısında güvenilir yöntemlerden biridir. Antijenler NNN besiyerinden izole edilen Leishmania promastigotlarından hazırlanmaktadır. Besi yerinden alınan sıvı örneği parazit üremesi açısından kontrol edildikten sonra 3 kez santrifuj edilmektedir. Sediment 40 lık objektifte her sahada en az 5 promastigot olacak şekilde sulandırılmaktadır. Bu şekilde antijen lamların üzerine yayılarak, oda sıcaklığında kurutularak, kullanılıncaya kadar 20 o C de saklanmaktadır. Test antijen üzerine eklenen şüpheli serumda eğer anti- Leishmania antikoru var ise reaksiyona girmelerini sağlamaktır. Bu amaçla nemli ortam sağlanarak lamlar 37 o C de 30 dk bekletilmektedir. Etüvden çıkarılan lamlar PBS solüsyonu ile birkeç kez yıkandıktan sonra kurutulur. Tamamen kuruyan lam üzerine reaksiyona girmiş olan antijen-antikor kompleksini görünür kılacak olan konjugat eklenmektedir. Yine etüve alınan örneklere süre sonunda kapatma solüsyonu konularak lamel kapatılır ve floresan mikroskop altında değerlendirilmesi yapılır ( Özcel ve ark., 1997; Strauss- Ayali ve Beneth, 2001). Test yapılırken Leishmania antikorlarının sıtmalı hastalarla çapraz reaksiyon verebildiği bildirilmektedir. Kuvvetli pozitif hastalarda testin pozitif sulandırmasının 1: 800 dilüsyonu aştığı belirlenmiştir. Leishmaniosis tanısında zayıf pozitif durumlarda sonuçların diğer serolojik yöntemler ile desteklenmesi önerilmektedir (Özcel ve ark., 1997).

38 28 Bu yöntemle enfekte hastaların yaklaşık %90 ında Leishmania ya karşı oluşmuş antikorlar saptanabilmektedir. Özellikle ileri yaşlardaki köpeklerde etkenle karşılaşma oranı arttığından endemik bölgelerde IFA testinde seropozitiflik oranlarında artış görülmektedir (Altıntaş, 1995; Roberts ve Janovy, 1996; Strauss- Ayali ve Beneth, 2001). Leishmania nın Deri Testi (Montenegro Testi): İlk kez Montenegro tarafından formalinize edilmiş L. donovani kültür antijenlerinin (Promastigot formların) deri içine inoküle edilmesiyle uygulanmış bir alerjik deri testidir. Epidemiyolojik çalışmalar için değerleri olabileceği ancak aktif visceral leishmaniosisin tanısında değeri olmadığı bildirilmektedir. Çünkü bu testle Leishmania antikorları bulunsa bile titreleri tespit edilememektedir. Ayrıca hastalık iyi olmaya başladıktan sonra ve tedavi sonrası da pozitif sonuç alınabildiği belirtilmektedir (Altıntaş, 1995; OİE, 2004). İmmunokromatografik Dipstick Testi: Son yıllarda leishmaniosisin teşhisi için mevcuttur. Bu testte L.infantum ve L.donovani amastigotlarında baskın bir protein olan recombinant rk39 kullanılmaktadır. Oldukça hızlı ve duyarlı bir testtir (Reithinger ve ark., 2002; Mettler ve ark., 2005). Latex Aglutinasyon Testi: Visceral leishmaniosisli hastaların idrarında Leishmania antijeninin belirlenmesi için yeni geliştirilmiş bir yöntemdir (Attar ve ark., 2001). Kompleman Birleşmesi, Hemaglütinasyon ve Aglütinasyon Testleri: Bu testlerin her birinin antijen olarak kullanılan Leishmania türlerine ve antijenlerin hazırlanma yöntemlerine bağlı olarak değişen değerlendirmeleri vardır. Fakat bu testler Lepra, Chagas hastalığı, schistosomiasis ve cutaneous leishmaniosis ile çapraz reaksiyonlar verebilirler (Altıntaş, 1995). Gecikmiş tip Aşırı Duyarlılık Testi (Delayed Type Hypersensitivity =DTH): Kolaylıkla uygulanabilen bir deri testidir. Yapılan diğer testler ile kandaki Ig G1 ve Ig G2 spesifik humoral yanıtları ölçülebilirken DTH ile