BÖLÜM 7 REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ VE MOLEKÜLER KLONLAMA

Transkript

1 BÖLÜM 7 REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ VE MOLEKÜLER KLONLAMA 1

2 Rekombinant DNA Teknolojisi ve Moleküler Klonlama yılları arasında lamda fajı üzerinde yapılan çalışmaların sonuçları Rekombinant DNA teknolojisi başlığı altında birleştirilmiştir. Değişik orjinlerden gelen iki DNA nın birleştirilmesiyle Rekombinant DNA oluşur. Krossing over gibi genetik işlemlerde Rekombinat DNA yı meydana getirmesine rağmen bu tabir genel olarak iki farklı kaynaktan gelen DNA moleküllerin birleştirilmesinde kullanılır. Lambda fajı 1962 yılında Allan Campbell, bakteriyofaj λ nın liner olan genomunun konak bakteri hücresine girdiğinde dairesel hale geldiğini belirtmiştir. Daha sonra ise kırılma ve yeniden ekleme olayı ile faj DNA konak kromozomuna entegre olmaktadır. 2

3 Daha sonraki ileri düzeydeki çalışmalar gösterdiki lambda fajının liner genomunun her iki ucunda kısa ve tek zincirli DNA bölgelerinin bulunduğunun ve bu bölgelerin baz dizilerinin komplementer olduğunu göstermişitr. Tek zincirli olan bu bölgeler yapışkan ( cos ) bölgeler olarak adlandırılır. Bu bölgeler komplementer baz eşleşmesi yapması liner faj genomunu konak bakteride dairesel hale gelmesini sağlar. Lizogenik replikasyon fazında faj DNA sı Att bölgelerinden konak genomuna yerleşmekte ve Konak DNA nın bir parçası gibi replike olmaktadır. Konak hücrenin mutajenik kimyasallara yada UV radyasyonuna maruz kalması gibi belirili koşullar altında ise bu rekombinasyon olayının tersi gerçekleşmekte ve faj DNA sı konak genomundan kesilerek çıkarılması esnasında enderde olsa farklı bölgelerden gerçekleşen kesimler lamda fajının bakteriyel genleri almasını sağlar. Yaşam döngüsünün Litik fazında ise lamda fajları hücreyi parçalayıp ortama salınır. Restriksiyon ve modifikasyon : 1962 yılında Werner Arber ve arkadaşları restriksiyon ve modifikasyonun moleküler esasını ortaya koymuştur. Arber ve arkadaşlarının yayınladığı makale de bir bakteri suşundan bir enzimin ayrıştırılmasını ve enzimin viral DNA yı, özgül nükleotit dizilerinden kesmek için kullanıldığını tanımlar. Bu moleküllere de Restriksiyon endonükleazlar kısaca restriksiyon enzimleri denir. 3

4 Böylece bu enzimlerin istilacı nükleik asitleri parçalayarak viral enfeksiyonu sınırladıkları ve engelledikleri sonucu ortaya çıkmışıtır Modifikasyon sistemi ; Arber ve arkadaşları modifikasyonun DNA üzerinde bulunan ve rektriksiyon endonüklazlarının saldırısına duyarlı olan bölgelere metil grubu eklenmesinden ibaret olduğunu göstermeyi başarmışlardır. E coli de adenin metilasyonundan ziyade sitozin metilasyonu daha yaygındır. Metilleme metilazlar tarafından yapılır. Yani metillenen zincir RE ler tarafından kırılmazken metillenmemiş zincir kırılır. 4

5 Restriksiyon endonükleazların keşifi üzerine Herbert Boyer, Paul Berg ve arkadaşları 1970 lerde Rekombinant DNA teknolojisinin çağını başlatmışlardır. DNA nın Kesilmesi Ve Eklenmesi DNA izolasyonu ve Rekombinant DNA yapımında iki ana enzim oldukça önemli rol oynarlar. Bu enzimler restriksiyon endonükleazlar ve DNA ligazlardır. Restriksiyon endonükleazlar, çift zincirli DNA molekülü üzerinde oldukça kısa ve özgül olan baz dizilerini tanırlar ve enzimin tipine bağlı olarak DNA yı restriksiyon bölgesi olarak adlandırılan bölgelerden kırarlar. DNA ligazlar ise fosfodiester bağları oluşturarak iki DNA parçasını birbirine ekler. 5

6 Restriksiyon endonüklezların ana sınıfları Restriksiyon endonükleazların 3 büyük ana sınıfı vardır. Bu sınıflandırma yapılırken tanıdıkları dizilerin türü, DNA yı kesme biçimleri ve Enzimlerin yapısı dikkate alınır. Tip I ve Tip III restriksiyon endonükleazlar DNA yı tanıdıkları bölgelerin dışından da kesmeleri ve bunun sonucu tesadüfü kesme motifleri oluşturduklarından dolayı gen klonlama çalışmaları için kullanışlı değillerdir. Bunun aksine tip II restriksiyon endonükleazlar özgül dizileri sadece bu dizilerden kesim yaptıkları için haritalama ve in vitro DNA inşasında kullanılır. İsimlendirmede önce enzimin elde edildiği bakteri cinsinin ilk harfi, daha sonra bakteri türünün ilk iki harfi ve son olarak da soya ait bir harf ile ilk izolasyondan başlayarak Romen rakamı ile enzimin izolasyon sırası belirtilir. EcoR I E = genus Escherichia co = species coli R = strain RY 13 I = first RE to be isolated from this species 6

7 Tip II restriksiyon endonükleazlar homodimer oluşturan 2 özdeş polipeptit alt birimden meydana gelir. bu homodimerler 4-8 bp meydana gelen kısa ve simetrik DNA dizilerini tanırlar. Moleküler biyoloji araştırmalarında Tip II endonükleazların en çok kullanılanı 6 baz çifti kesenlerdir. Genelikle bir zincirin 5 3 yönündeki dizi okunması ile komplementer zincirin 5 3 dizi okuması aynıdır her iki yönden de aynı okunan diziler palindrom olarak adlandırılır. EcoRI gibi bazı enzimler asimetrik ( zigzaglı) kesim yaparlar. Asimetrik kesimin oluşturdukarı tek zincirli komplementer uçlar ise hidrojen bağı ile bağlanabildikleri için yapışkan yada kohesif uç oluşturular SmaI gibi diğer Tip II enzimler ise DNA nın her iki zincirinide aynı pozizyondan keser. Bunun sonucunda DNA nın kesilen uçlarında eşleşmemiş nükleotitler bulunmadığından Küt Uç oluşumuna yol açar 7

8 8

9 Bir restriksiyon endonükleazın tanıma bölgesindeki bir baz çifitinin değişimi Enzimatik aktivitenin tamamını ortadan kaldırmaktadır. RE NİN DNA BAĞLANMASI RE, özgül olmayan bir şekilde DNA YA bağlanır. Daha sonra DNA üzerinde kayma denilen bir işlemle doğrusal bir şekilde ilerler. Özgül olmayan bağlanma genellikle bazlarla etkileşimi içermez sadece DNA nın şeker fosfat omurgası ile etkileşimi içerir. RE gevşek bağlanırlar ve bu enzimlerin katalitik merkezleri fosfodiester omurgadan güvenli bir mesafede tutulur. Özgül olmayan bağlanma ise hedef bölgeye ulaşım verimliliği için bir ön şarttır. Kayma DNA oluğu boyunca 50 bp den daha kısa mesafelerde sarmal bir hareketle gerçekleşmektedir. Hedef restriksiyon bölgesinin belirlendiği tanıma işlemi, enzimin ve DNA NIN Konformasyonunda değişikliğe neden olur. Bu değişiklik katalitik merkezin aktivasyonuna yol açar ve ürün salınır. ÖZET OLARAK : Özgül olmayan bağlanma >>> kayma hareketiyle özgül bağlanma >>> Konformasyon değişikliği >>> kataliz etkisi >>> ürün salınımı 9

10 10

11 11

12 SINIF YAYGINLĞI TANIMA BÖLGESİ İÇERİĞİ Rekombi nant DNA Arş. Kul. Tip I Tip II den daha az yaygın Tanıma bölgesinin 1000 bp uzağında özgül olmayan bölgelerden her 2 zinciri keser Üç alt birmli, Bireysel tanıma, endonükleaz ve metilaz aktivetelerine sahip Kullanışlı Değildir Tip II En yaygını Özgül tanıma bölgesinden her 2 zinciri keser Tek alt birimli endonükleaz ve metilaz aktiveteleri ayrıdır Kullanışlı dır. Tip III Nadir Tanıma bölgesinin 3 ucunun yaklaşık bp aşağısından zincirlerden sadece birini keser. endonükleaz ve metilaz aktiveteleri bir alt birimi ortak olan 2 alt-birimli komplekstir. Kullanışlı Değildir 12

13 DNA Ligaz, lineer DNA parçalarını birleştirir. Bir DNA fragmentindeki bir nükleotitin 5 fosfat ucu ile ile diğer bir DNA fragmentinin 3 hidroksi ucu arasında fosfodiester bağlarının oluşumunu katalizler. Lineer DNA fragmentlerinin bu şekilde kovalent bağlarla birbirine eklenmesi işlemine ligasyon adı verilir. DNA ligazlar kofaktör olarak ATP ye ihtiyaç duyarlar. Laboratuarlarda en yaygın kullanılan DNA ligazın kaynağını bakteriyofaj T4 oluşturur. Birbirine komplementer (tamamlayıcı) olan yapışkan uçlu DNA fragmentlerinin ligasyonu kesik uçlu DNA fragmentlerinin ligasyonuna göre daha etkin şekilde gerçekleştirilir. Bu yüzden verimliliği artırmak için araştırmacılar küt uçları modifiye eden terminal deosinükleotidil transferaz kullanırlar. Örneğin DNA fragmentlerine tek zincir Poli A kuyrugu eklenir ve Diğer bir kaynaktan elde edilen DNA fragmentinede PoliT kuyruğu eklenirse komplementer olan bu kuyruklar hidrojen bağı oluşturabilir. Daha sonra ise DNA ligazla muamele edilerek kovalent olarak birbirine bağlanırlar. 13

14 MOLEKÜLER KLONLAMA Moleküler klonlama bir seri basamaktan oluşur. Bu basamaklar : 1- RE ler kullanılarak klonlanacak DNA fragmenti üretilir 2-Üretilen fragment, vektör olarak işlev görecek diğer bir DNA molekülüne eklenir. 3- Rekombinant DNA molekülü konak bir hücreye transfer edilir. DNA replike olarak düzinlerce özdeş kopya üretir. Konak hücreler çoğaldıkça rekombinant DNA da yeni oluşan döllere geçer ve böylece klonlanmış dizileri taşıyan özdeş hücrelerin meydana getirdiği bir populasyon oluşur. 4-Klonlanan DNA segmenti konak hücreden izole edilerek çeşitli yollarla analiz edilebiir. Vektör seçimi: Klonlama vektörleri taşıyıcı DNA molekülleridir. Tüm klonlama vektörlerin sahip olduğu dört önemli özellik vardır: 1- Kendilerini ve taşıdıkları yabancı DNA segmentleri bağımsız olarak replike ederler. 2-Vektör üzerinde her birinden bir adet olan çeşitli sayıda restriksiyon endonükleaz bölgeleri bulunur. 3- Genellikle konak hücrede bulunmayan markör ( seçilebilir belirteç ) taşırlar. 4- Vektörleri konak hücreden geri almak nispeten daha kolaydır. 14

15 Klasik kolanlama vektörleri plazmidtler, fajlar ve kozmidlerdir. Bunların barındırabileceği insört boyutu sınırlıdır. Ve sırası ile 10, 20 ve 45 kb a kadardır. Yapay kromozomal vektörler ise bakteriyel yapay kromozomları (BAC), maya yapay kromozomları (YAC) ve memeli yapay kromozomları (MAC) oluşturmaktadır. Kozmidler; lambda fajının cos bölgesini taşıyan bir plazmittir. Fajlar gibi konak bakteriyi enfekte ederler. Fakat plazmidler gibi replike olmakta ve konağı lizize uğratmamaktadır. Plazmid DNA; Plazmidler; bir replikasyon orjinine sahip, çift zincirli dairesel yapıdaki ekstrakromozomal DNA molekülleridir yılında pbr322 plazmit vektörü ilk plazmidlerden birisi olarak kullanılmaya başlamıştır. İlk vektörler genellikle düşük kopya sayısına sahiptirler. puc 18 ise pbr322 türevi olup daha yüksek kopya sayılı bir plazmidtir ve kopya sayısı 500 den fazladır. Plazmidlerde özel bir antibiyotik geni ve MCS ( çoklu klonlama bölgesi ) bulunur MCS Bölgesinde restrksiyon enzimi için çok sayıda tanıma bölgesi vardır. İnsört ( yabancı DNA molekülü) ile tanıma bölgesi aynı RE ile kesilir ve ligasyon reaksiyonuyla vektöre eklenir. 15

16 16

17 Plazmid DNA nın bakteriyel bir konağa aktarımı : Plazmid DNA ; transformasyon adı verilen bir prosedör ile bakteri hücresine aktarılır. Geleneksel yöntemde ise; bakteri hücresinin membran geçirgenliğinin sızıntı oluşturması için yüksek kalsiyum tuz solüsyonunda inkübe edilir. Kalsiyum iyonları ile fosfolipit membrandaki fosfatlar etkileşime girerek geçici porlar oluşturulur. Böylece kompetent hücreler DNA ile karıştırılarak DNA nın bakteri içerisine girmesi sağlanır. Alternatif olarak elektroporasyon yöntemi de kullanılabilir. Bakteri türleri uygun bir motifde metillenmemiş olan plazmitlerde dahil olmak üzere yabancı DNA ları parçalayan bir restriksiyon modifikasyon sistemi kullandıklarından şu soru aklımıza gelir. Transforme bakteri yabancı DNA yı neden parçalamaz. Moleküler biyologlar yaygın laboratuvar suşu olan E. Coli DH5α gibi restriksiyon hemde modifikasyon sistemi kusurlu olan bir mutant bakteri suşlarını kullanarak, bu savunma sisteminin üstesinden akıllıca gelmişlerdir. 17

18 Başarılı bir şekilde transforme olmuş bakteriler ya rekombinant ya da rekombinant olmayan plazmit DNA taşıyacaklardır. Plazmit DNA ların çoğalması ise transforme edilmiş her bakteride gerçekleşecektir. Aktarıldıktan sonra bakteri gerekli besinleri içeren agarlı besiyeri gibi katı besiyerinde çoğalarak koloni oluşturur. Konak hücre bölündükçe plazmit vektörde yeni oluşan oğul hücrelere geçmekte ve burada da replikasyona devam etmektedirler. Transforme olmuş tek bakteri hücresinin bir çok kez bölünmesi sonucunda tek ebeveynli üremiş hücre klonları oluşur. Bu hücre klonları da agarlı besiyeri yüzeyinde görünür olan koloniyi meydana getirir. Bu basamak klonlama işlemine adını veren aşamadır. 18

19 19

20 Rekombinat seçimi: Rekombinat plazmidlerin taşıdığı direnç genleri sayesinde ayırt edilebilir. Örneğin rekombinant plazmid taşıdığı direnç geni ( amfisilin gibi ) sayesinde antbiyotik içeren agar besiyerinde büyüyebilirken, rekombinant olmayan plazmidler büyüyemezler. Mavi beyaz taraması: puc18 gibi vektörler, amfisilin yada X-Gal olarak adlandırılan renksiz bir kromojenik birleşen içeren seçici besiyerinde büyütülürler. X-gal, yabancı DNA taşıyan plasmidleri bulunduran bakterilerin tanınmasını sağlar. X- gal in β-galaktozidaz ile hidrolizi sonucu mavi ürün meydana gelir. Bozulmamış β- galaktozidaz genlerini içeren plasmidleri taşıyan bakteriler mavi olur. Eğer plasmid yabancı DNA yı lacz geni içerisine yerleştirmişse, β-galaktozidaz üretemeyeceklerinden beyaz görülür. Kısaca, yabancı DNA yı taşıyanlar besiyerinde beyaz koloniler olarak gözlenir. 20

21 21

22 22

23 DNA NIN çoğaltılması ve saflaştırılması: Rekombinant plazmid DNA yı içeren pozitif bir koloni aseptik koşullarda sıvı bir besiyerine transfer edildiğinde hücreler çoğalmaya devam edeceklerdir. Moleküler klonlamanın son basmağı ise DNA NIN tekrar elde edilmesi olayıdır. Plazmid DNA; nükleik asitleri uygun koşullarda bağlayan fakat protein ve karbonhidratların uzaklaştırılmasına izin veren silika jel veya değiş-tokuş reçinesinin kullanıldığı kromatografik (sıvı kromatografisi) yöntemler ile ham hücre lizatlarından saflaştırılabilir. Saflaştırılan plazmid kolondan elüe edilir ve etanol çökeltmesi ile geri kazanılır. Bakteriyofaj lambda vektörü: 1974 yılında ilk viral klonlama vektörü olarak tasarlanmıştır. Plazmid vektörlerin aldığı DNA parçasından daha büyük parçayı alabildiklerinden dolayı genomik kütüphanenin oluşturulmasında oldukça kullanışlıdırlar. 23

24 λ faj vektöründeki merkezi gen kümesi çıkarılabilir ve yabancı DNA bu genler yerine kollar arasına yerleştirilebilir. Oluşan Rekombinant viral partikül transdüksiyon ile agar besiyeri üzerindeki konak bakteri hücresine enfekte edilebilir. Bakteri kısa bir süre içerisinde viriüs partikülleri ile dolar ve hücre parçalanır. Virüs partikülleri agar üzerinde plaklar halinde görülür. 24

25 Yapay kromozom vektörleri : BAC ( bakteriyel yapay kromozomları ), YAC ( maya yapay kromozomları ) kromozomları, kompleks ökaryotik genomların haritalanması ve analizi için kullanılan önemli araçlardır. 300 kb dan daha büyük yabancı DNA taşıyabilmeleri nedeniyle Genom projesi ve diğer genom dizileme projelerinin çoğunda kullanılır. BAC, F faktörünü kodlar. Tasarlanmış BAC vektörleri 7.4 kb boyutlarında olup yapısında bir replikasyon orjini, klonlama bölgeleri, ve seçici belirteçler bulunmaktadır. Böylece büyük bir yabancı insört DNA yı barındırabilirler. MAC (memeli yapay kromozomu), İlk prototip MAC 1997 yılında tanımlanmıştır. MAC ların geliştirilmesi iki temel nedenden dolayı çok önemlidir. Bu nedenler : 1- Büyük genlerin ifade sisteminde kullanmak 2- Memeli hücreler içerisinde otonom olarak replike olabilmeleri ve ayrı tutunabilmelerinden dolayı önemlidir. 25

26 YAC, E. Coli de çoğalan küçük plazmidlerdir. YAC lar ökaryotik kromozomun minyatür sürümleridir. Replikasyon orjini, seçilebilir markör, iki telomer, iki hücreye ayrılmasını mümkün kılan bir sentromere sahiptir. Kırmızı- Beyaz seçimi : Rekombinat YAC lar kırmızı beyaz seçimi ile tarannmaktadır. Kırmızı olanlar YAC vektör DNA larınıı taşırken beyaz koloniler rekombinat olmayan YAC vektör DNA larını taşırlar. Böyle olmasının nedeni ise çoklu klonlama bölgesindeki SUP4 geninden kaynaklanmaktadır.. Rekombinat olmayan YAC vektörleri SUP4 ü muhafaza ederken Rekombinat YAC lar muhafaza etmez. 26

27 27

28 Klonlanacak DNA kaynakları: klonlanacak DNA kaynağı araştırmacının nihai amacına göre belirli bir geni veya genin bir kısmını temsil eden DNA fragmeti veya bir organizmanın tüm sekansı olabilir. Tipik insörtler ise genomik DNA, cdna ve PCR ürünleridir DNA Kütüphanelerinin oluşturulması: Çeşitli organizmaların genomlarından izole edilen DNA fragmentlerinin kütüphanelerini oluşturmak için vektörler kullanılır. DNA LAR özgül restriksiyon endonüleazlarla ( re ) kesilerek vektörlere eklenir ve rekombinant molekül konak hücreler transfer edilir. Bütün DNA moleküllerinin tamamı kütüphaneyi oluşturur. Genomik DNA kütüphanesi : Bir organizmanın tüm genomunu temsil eden DNA fragmentlerini içerir. genomik kütüphane oluşturmanın 3 adımı vardır: 1- RE larka kesim yaparak DNA yı uygun parçalara ayırmak 2-Santrifükasyon teknikleri yada jel elektroforezin de optimal büyüklükteki fragmentlerin saflaştırılması 3-DNA fragmentlerinin uygun bir vektör içerisine yerleştirilmesidir. 28

29 cdna kütüphanesi : Özgül bir doku, hücre tipi veya gelişim basamaklarından (embriyonal ) mrna popülasyonunun izole edilmesidir. mrna izole edilebilirse genomdaki bütün genlerin küçük bir takımı araştırılabilir. mrna doğrudan klonlanmadığından cdna kopyası klonlanır. Kütüphanede sadece ifade edilen genlerin bölgeleri bulunurken intronlar bulunmaz. 29

30 Kütüphanenin taranması ve problar Klonlanmış özgül bir DNA dizisinin bir kütüphane içinde araştırılmasına kütüphanenin taranması adı verilir. Kütüphane taranırken bir geni tanımlamak için gereken anahtar elementlerden biri probtur. Prob terimi genellikler bir nükleik asiti ( DNA ) işaret etmektedir. Pob DNA ; ilgilenilen gen veya dizisinin komplementeri olup hibridizazyonu sağlar. DNA Ve RNA prob tipleri: Hibridizasyon DNA- DNA, DNA- RNA, RNA- RNA arasında meydana gelebilir. Komplementer baz eşleşmesi prensibine bağlı olarak 3 ana tip prob geliştirilmiştir. 1- Oligonükleotit problar: Kimyasal olarak sentezlenir 2- DNA Proplar : Klonlanmış DNA dan oluşurlar 3- RNA Problar: DNA kalıplarından in vitro transkripsiyonla üretilirler. 30

31 Bu 3 probun iki ana tipi bulunur bu ana tipler : heterolog ve homolog tipleridir. Heterolog prop ; hedef nükleik asit dizisiyle benzer fakat tamamıyla aynı olmayan bir diziye sahiptir.( yakın türler ) Homolog prop: hedef nükleotit dizisine birebir komplementer olan probtur. Problar radyoaktif ( radyoizotoplarla ) veya radyoaktif olmayan (digoksigenin ile) etiketlenme yöntemi ile etiketlenebilir. Digoksigenin nükleotitlere konjuge olabilir. DNA, RNA ve Oligonükleotoit problarına yerleşebilir. Digoksigenini tanıyan antikorlar kullanılarak belirlenebilir. Kütüphanelerin taranması 31

32 Kolonilerin DNA bağlayıcı membrana transferi İlk adımda tüm kütüphaneyi temsil eden insörtleri içeren rekombinant vektörleri barındıran bakteriyel hücreler yüzlerce veya binlerce koloni oluşturacak şekilde nutrient agarlı petri kaplarında büyütülür. Kolonilerin üzerine yerleştirilen nitroselüloz veya naylon membrana nazikçe bastırarak bazı hücrelerin membrana geçmesi sağlanır. Daha sonra membrana tutunmuş bakteri hücreleri liziz edilir ve alkali ve proteazla muamele edilerek DNA saflaştırılır. Saf DNA yı tek zincirli hale getirmek için denatüre edilir ve ısı muamelesiyle yada UV le ile membrana sabitlenir. DNA nın membrana kovalent bağlanması ise onun şeker-fosfat omurgası aracılığıyla gerçekleşir ve DNA tek zincirdeki eşleşmemiş bazlar komplementer baz eşleşmesine maruz bırakılır. Koloni hibridizasyonu : Kütüphane taranmasının sonraki adımında radyoaktif etiketli tek zincirli bir DNA probu kullanılır. hibridizasyon adımı probun baz dizisine benzer dizileri içeren her kolona bağlanmasını garantiliyecek bir sıcaklıkta gerçekleşir. Bazı özgül olmayan bağlanmalardaki probları ise bir seri yıkama yapılarak uzaklaştırılır. 32

33 Hibrid dubleksin yada heterodubleks in kararlılığı; bazlar arasındaki hidrojen bağlarının sayısı ve iki zinciri bir arada tutan hidrofobik etkileşimlerle oluşan baz istiflerinden etkilenir. Uygun hibridizasyon derecesi GC içeriğine ve hedef diziye olan homolojisinin yüzdesine bağlıdır. Pozitif kolonilerin belirlenmesi :Kütüphanenin taranmasının son fazında mebranın üzerine bir X- ışını filmi konur ve bu film yıkama sonrası komplementer dizilere özgül olarak bağlı halde membran üzerinde kalmış probların ışımasını sağlar. İfade (ekspresyon) kütüphaneleri: Gen ifadesi için gerekli olan düzenleyici elementleri taşıyan klonlama vektörleriyle yapılır. Nükleik asit hibiridizasyonuna benzer bir teknik kullanarak radyoaktif etiketli bir antikor bağlanması esasına dayanır. 33

34 Restriksiyon haritalama ve RFLP analizi: İlgilenilen klon izole edildikten sonra analizin ilk aşaması restriksiyon haritasının çıkarılmasıdır. Bu haritalama RE kesim bölgelerinin sayısı, sırası, kesim bölgeleri arası mesafe hakkında bilgi sağlar. Restriksiyon haritalama ve RFLP analizi, DNA nın karakterize edilmesinde, genlerin haritalanması ve genetik hastalık testlerinde önemli bir role sahiptir. Restriksiyon haritalama: Klonlanmış DNA fragmenti RE lerle kesilir elektroforez için agaroz jele yüklenir. DNA fragmetlerin uzunlukları; uzunluğu bilinen şahit DNA ların uzunlukları ile karşılaştırılarak bulunur. RFLP ANALİZİ: 1980 yılında insan genomunun restriksiyon fragment uzunluk polimorfizm (RFLP) haritası oluşturuldu. Bir RFLP, birbirinden farklı büyüklüklerdeki restriksiyon fragmentleriyle ilişkili olan alternatif allellerin varlığı tarafından belirlenir. RFLP analizi farklı bireylerden elde edilen DNA ların RE lerle kesilip ve büyüklüklerine göre jel elektroforezinde ayrılmasından sonra Southern blotlama yapılması ve incelenen lokusun belirlenebilmesi için işaretli problarla hibridizasyonun gerçekleştirilmesi esasına dayanır. 34

35 RFLP LER genetik hastalıkların belirteci olarak hizmet verebilir. En basit RFLP ler, tek-baz çifti değişiminin neden olduklarıdır. Bununla birlikte transpozıbl elementler gibi genetik materyalin sokulmasıyla, yada ardışık duplikasyonlar, delesyonlar, translokasyonlar veya diğer kromozomal yeniden düzenlemelerlede üretilebilir. Bağlantı analizlerinde, bireyleri genetik hastalık taşıma riski altında bulunan aileler belirlenir. Bu duruma uygun olarak, belirli bir hastalıkla ilişkili otozomal resesif mutasyon bakımından her iki ebeveynin de heterozigot olduğu bir aileyi örnek olarak ele alalım. ailenin çeşitli üyelerinden alınan DNA örnekleri hastalığa sebep olan mutant allellerin hangi frekansta özgül RFLP belirteçleriyle beraber ayrıldığını bulmak için analiz edilebilir. Bu frekans mutant olduğu belirlenen lokus ile markörlerin arasındaki mesafenin bir ölçüsüdür. 35

36 Genellikle fragmentlerdeki büyüklük farklılıkların meydana gelmesi sadece hastalık durumunun kendisi tarafından yeni bir restriksiyon bölgesinin oluşturulması veya var olan bir bölgenin bozulmasıyla değil, daha çok genin yer aldığı bölgenin hemen yanıbaşında meydana gelen nükleotit dizi farklılığı nedeniyledir. Hastalık oluşturan bir gene yakın bulunan belirli bir polimorfizm formu mayozda gerçekleşen krosing over sırasında gene yakın durma eğilimindedir. Krosing overde ise göreceli olarak kromozomların daha büyük segmentleri rol almaktadır. Bu nedenlede belirli bir kromozomda birbirine yakın olan belirteçlerin birlikte aktarılma (rekombinasyon sırasında birbirlerinden ayrılmadan) ihtimali, birbirinden oldukça uzakta bulunan belirteçlerin birlikte aktarılma ihtimalinden çok daha yüksektir. Böylelikle bağlanma mayoz aracılığıyla bir belirtecin diğeriyle birlikte aktarılma ihtimalini ifade etmektedir. Sıkça birlikte aktarılan belirteçlerin ise yakından bağlı oldukları söylenir. böylelikle RFLP ler hastalık geninin içinde olmasalar dahi hastalıkların belirteçleri olarak görev yaparlar. RFLP ler kistik fibrozis, huntington hastalığı ve hemofili gibi genetik hastalıkların tanısında kullanışlıdırlar. 36

37 PCR ın keşfine kadar DNA varyasyonlarının belirlenmesi amacıyla gerçekleştirilen bağlantı analizlerinde RFLP ler yaygın olarak kullanılmıştır. PCR temelli protokollere göre RFLP nin en önemli avantajı ise sekans bilgisine ilişkin bir ön bilgiye veya oligonükleotit sentezine ihtiyaç duymamasıdır. Bununla birlikte belirli bir lokusun tiplendirilmesi için bir PCR protokolü geliştirildiğinde genellikle RFLP analizine tercih edilir. Bazı durumlarda analiz için PCR ve RFLP kombinasyonu kullanılır. 37

38 RESTRİKSİYON HARİTALAMA 38

39 39

40 RFLP ANALİZİ İLE HASTALIK TEŞHİSİ 40

41 DNA DİZİLEME 1977 yılında DNA daki bazların dizisini belirlemek oldukça emek isteyen bir işti ve t-rna nın kalıp bölgesi gibi çok kısa dizilere uygulanabiliyordu. DNA sekanslama tekniklerinin gelişmesiyle DNA bazlarının sıraları sıradan bir iş haline geldi. DNA Dizileme : 1- Genlerin tanımlanmasında 2- Promotör dizilerin ve genlerin ifadesi kontrol eden düzenleyici DNA elementlerinin belirlenmesinde 3- cdna nın PCR ürünlerinin doğrulanmasında 4- bir genin veya cdna amino asit diziliminin DNA dizisinden çıkarılmasında kullanılır. DNA dizileme tekniklerinin gelişmesiyle birlikte genomun evrimi hakkında bilgilerin çoğalması genetik hastalıklara sebep olan mutasyonların tanımlanması gibi önemli veriler sunmuştur. 41

42 Sanger dideoksi DNA Metodu ile manuel DNA Dizileme DNA dizileme de en çok kullanılan metoddur. Bu metodda tek zincirli DNA, DNA polimerazın DNA sentezinin başlatabilmesi için gerekli olan primerle karıştırılır. Daha sonra 4 eşit parçaya bölünerek ; içerisinde yüksek derişimde dntp ve DNA polimeraz ve düşük derişimde zincir sonlandırıcı ( replikasyon terminatörü) bulunan tüplere aktarılır. Sekanslama karışımı denatüre edici poliakrilamid jelde ayrı kuyucuklara yüklenir ve DNA fragmentleri ayrılır. Radyoaktif primer her bir DNA molekülünün 5 ucundadır. En alttan en üste doğru okunduğunda 5-3 yönünde DNA molekülünün sekansını verir. Bu teknik çok zahmetidir ve dizinin elle okunması gerekir. Bu teknikteki DNA polimeraz ise faj T7 polimerazıdır. 42

43 43

44 OTOMATİK DNA DİZİLEME 1986 yılında Leroy HOOD ; Sanger metodunu otomatize etmiştir. Bu teknikte radyoaktif etiketinin yerine flororesans etiketler kullanılmıştır. Poliakrilamid jel ve jelin sonunu doğru bir lazer ( boya moleküllerin uyarılması için ) ve bir de bilgisayar kullanılır. Günde baz okuyabiliyordu. 44

45 YENİ NESİL DNA DİZİLEME Yeni nesil DNA dizilerinden birisi 454 pirodizilemdir. DNA zincirine eklenen nükleotitirin tanınması için ışık üreten lusiferaz enzimi kullanılır. Boncuk ve Adaptörler DNA Fragmentlerine eklenir yapılır. Enülsiyon PCR yapılır. Daha sonra dizileme makinasının kuyucuklarında depolanır.lusiferaz yardımıyla okunur. 45