DNA Teknolojisi ve Genomikler

Transkript

1 DNA eknolojisi ve enomikler PowerPoint Lectures for Biology, Seventh Edition Neil Campbell and Jane Reece Lectures by Chris Romero

2 enel Bakış: enomların anlaşılması ve manüple edilmesi Modern bilimin en büyük başarılarından birisi İnsan genomunun sekansının çıkarılması (büyük oranda tespit edilmiştir) DNA dizileme başarıları DNA teknolojisi alanındaki tüm başarılar, rekombinant DNA nın tespiti ile elde edilen ivmeye dayanmaktadır

3 DNA teknolojisi biyoteknoloji alanında büyük bir devrim yaratmıştır Faydalı ürünler elde etmek için organizmanın veya onun genetik bileşenlerinin manüple edilmesi DNA teknolojisine ilişkin verilebilecek en güzel örneklerden bir tanesi «mikroarray» dir. Binlerce gen arasından ilgilenilen gen bölgesinin ifadesinin ölçülmesi

4 Figure 20.1

5 DNA klonlama deneyleri, spesifik bir gen bölgesinin veya DNA segmentinin çoklu kopyalarının oluşturulmasına izin verir Doğrudan spesifik genlerle çalışabilmek için gen klonlanması olarak bilinen bir süreç geliştirmişlerdir

6 DNA klonlama ve uygulamaları (genel bakış) DNA klonlamaya ilişkin denemelerin çoğu laboratuvarlarda gerçekleştirilir Bu amaçla genellikle bakteriler veya bunların plazmitleri kullanılır

7 Bakteriyel plazmit kullanılarak yapılan bir gen klonlama denemesi (genel bakış) Bacterium 1 ene inserted into plasmid Cell containing gene of interest Bacterial chromosome Plasmid Recombinant DNA (plasmid) 2 ene of interest Plasmid put into bacterial cell DNA of chromosome Recombinate bacterium ene of interest Copies of gene 3 Host cell grown in culture, to form a clone of cells containing the cloned gene of interest Protein expressed by gene of interest Protein harvested Basic research on gene 4 Basic research and various applications Basic research on protein Figure 20.2 ene for pest resistance inserted into plants ene used to alter bacteria for cleaning up toxic waste Protein dissolves blood clots in heart attack therapy Human growth hormone treats stunted growth

8 Rekombinant DNA yapımı için restriksiyon enzimlerin kullanımı Bakteriyal restriksiyon enzimleri Restriksiyon bölgeleri adı verilen sınırlı sayıda spesifik DNA dizilerinden DNA yı keserler

9 Bir restriksiyon enzimi çoğunlukla DNA molekülünde birçok kesim gerçekleştirir Çok sayıda restriksiyon fragmenti oluşturur En yaygın kullanılan restriksiyon enzimler DNA yı aşamaları bir şekilde keserler Yapışkan uçlar meydana getirerek, molekülün diğer yapışkan uçlara bağlanmasına olanak tanırlar DNA ligaz enzimi Restriksiyon fragmentlerini birbirine bağlar

10 Rekombinant DNA yapmak için restriksiyon enzim ve DNA ligazın kullanılması Restriksiyon bölgesi DNA 5ʹ 3ʹ A A C C A A 3ʹ 5ʹ 1 Restriksiyon enzimler şeker-fosfat bağlarını keser C A A A A C 2 Başka bir kaynaktan DNA fragmenti eklenir. Yapışkan uçların eşleşmeleri çeşitli kombinasyonlar üretir. Sticky end A A C A A C A A C C A A C A A Muhtemel kombinasyon 3 DNA ligaz zincirleri bağlar. C A A Aynı enzim ile kesilen ve farklı bir kaynaktan gelen DNA molekülü Figure 20.3 Rekombinant DNA molekülü

11 Bakteriyal plazmit içine ökaryotik genin klonlanması en klonlama işleminde kullanılan plazmide klonlama vektörü adı verilir Plazmit, hücre içinde (genellikle bakterilerde) bulunan, hücrenin kendi genetik materyalinden bağımsız replike olabilen, ekstra-kromozomal ve halkasal DNA molekülüdür

12 UYULAMA EKNİK Klonlama, gen dizilimini tespit etmek, kodlanan proteinin üretimi, gen terapisi ve temel araştırmalar için hedef gen bölgesinin çoklu kopyalarının oluşturulmasıdır. Bu örnekte, bir insan geni bir E. coli plazmidine aktarılmıştır. Plazmit, amp R geni taşımaktadır. Bu gen, bakteri hücrelerini ampisilin e karşı dirençli hale getirmektedir. Plazmit ayrıca lacz geni de taşımaktadır. Bu gen ise β-galactosidase enzimini kodlamaktadır. Bu enzim, laktozun moleküler analoğu olan X-al i hidroliz ederek mavi renkli bir ürün oluşturur. Burada yalnızca üç plazmit ve üç DNA fragmenti (insana ait) gösterilmiştir. Fakat plazmit DNA sının milyonlarca kopyası ve milyonlarca farklı insan DNA fragment karışımı bu süreç içinde işlenebilmektedir. 1 Plazmit DNA sının ve insan DNA sının izole edilmesi Bakteri hücresi lacz geni (lactose yıkımı) İnsan hücresi 2 Her iki DNA örneğinin de aynı restriksiyon enzim ile kesimi 3 DNA ların karıştırılması; baz eşleşmeleri yoluyla biraraya gelme, rekombinant plazmitlerin oluşumu amp R geni (ampisilin dirençlilik) Bakteriyal plazmit Restriksiyon bölgesi Yapışkan uçlar Hedef gen İnsan DNA fragmentleri Figure 20.4 Recombinant DNA plasmids

13 4 Yabancı DNA yı ve lacz mutasyonunu içeren plazmitlerin hücre içine alınması. Rekombinant bakteri 5 Ampisilin ve ve X-gal içeren besi ortamında bakterilerin gelişime bırakılması. Rekombinant olmayan plazmitleri içeren koloni (lacz geni sağlam) Rekombinant plazmitleri içeren koloni lacz geni hasarlı) Bakteriyal klon SONUÇLAR Yalnızca ampisiline dirençlilik geni içeren plazmitleri alan hücreler koloni oluşturabileceklerdir. Rekombinant olmayan plazmitleri içeren koloniler mavi olacaktır, çünkü bu hücreler X-gal i hidroliz edebilmektedir. Rekombinant plazmit içeren kolonilerde lacz geni bozulmuştur. Dolayısıyla beyaz kalacaklardır. Çünkü bu hücreler X-gal i hidrolize edemeyeceklerdir. Nükleik asit probları ile beyaz koloniler taranarak araştırmacılar hedef geni taşıyan bakteriyal hücreleri tespit edebilmektedir.

14 Hedef geni taşıyan klonların tespiti Hedef geni taşıyan bir klon Radyoaktif etiketlenmiş bir nükleik asit probu kullanılarak teşhis edilebilir. Bu prob, hedef gene komplementer olan bir DNA dizisidir. Bu sürece nükleik asit hibridizasyonu adı verilir

15 Nükleik asit prob hibridizasyonu UYULAMA Nükleik asit probları, bir DNA molekülü karışımı içerisinde bulunan spesifik bir DNA parçasının teşhis edilmesini sağlar. Bu örnekte, bir bakteriyal koloni koleksiyonu taranmakta ve hedef geni taşıyan plazmit ve bunu içeren bakteriyal hücreler tespit edilmeye çalışılmaktadır. EKNİK Her bir koloniden hücre örnekleri agar içeren yeni besi ortamlarına alınır ve görünür koloniler oluşturuncaya kadar üremeleri sağlanır. Bu besi ortamına «master plak» adı verilir. Master plak Prob içeren solüsyon Prob DNA Radyoaktif tek zincirli DNA Hedef gen Master plak Hedef geni içeren koloniler Filtre Filtre kaldırılır ve ters çevrilir Bakteriyal hücredeki tek zincirli DNA Film Filtre üzerinde hibridizasyon 1 2 Filtre üzerindeki hücrelerin 3 4 Master plak üzerine özel parçalanması ve içerdikleri Filtre fotoğraf filmi altına Film ters çevrildiğinde, film bir filtre bastırılır. Böylece DNA nın denatüre edilmesi sağlanır. yerleştirilerek, filme yansıyan üzerindeki işaretli bölgelerin hücreler kağıdın alt kısmına Oluşan tek zincirli DNA molekülleri radyoaktif bölgeler tespit edilir. rehberliğinde master plak transfer edilir. filtre üzerine yapıştırılır. (otoradyografi) üzerindeki koloniler tespit edilir.. RESULS Figure 20.5 Hedef geni içeren koloniler, nükleik asit hibridizasyonu ile tespit edilir. Problar ile tespit edilen hücreler sıvı besi ortamı içeren büyük tanklarda büyümeye alınır. Hedef geni içeren çok sayıda DNA molekülü bu kültürler yoluyla izole edilebilir. Farklı nükleotit dizilerine sahip problar kullanılarak farklı genlere sahip bakteriyel hücreler tespit edilebilir.

16 Klonlanan genlerin DNA kütüphanelerinde saklanması Bakteriler kullanılarak genomik kütüphaneler hazırlanabilir Bu işlem, tüm bir genomdan türevlenen DNA fragmentlerinin klonlanması yoluyla üretilen rekombinant vektör klonlarının koleksiyonunun yapılmasıdır Restriksiyon enzim ile kesilmiş yabancı genom or Bakteriyal klonlar Rekombinant plazmitler Rekombinant faj DNA Faj kolonileri Figure 20.6 (a) Plasmid kütüphanesi (b) Faj kütüphanesi

17 Bakteriyofajlar kullanılarak yapılmış bir genomik kütüphane Faj klonları olarak saklanabilir

18 Bir komplementer DNA (cdna) kütüphaneleri; Herhangi bir hücre tarafından üretilen tüm mrna ların in vitro ortamda revers transkripsiyonu ile elde edilen DNA kopyalarından oluşur

19 Bakteriyal ekspresyon sistemleri eknik zorluklardan birisi; Konak bakteri hücresinde klonlanmış ökaryotik genin ifadesinin engellenmesidir Promotörler ve diğer DNA kontrol dizilerinden kaynaklanan farklılıkların önüne geçebilmek için Araştırmacılar genellikle ekspresyon vektörleri kullanırlar. Bu vektörler oldukça aktif prokaryotik promotörler içerirler.

20 Ökaryotik klonlama ve ekspresyon sistemleri Kültürdeki ökaryotik hücrelerini konak olarak ve maya yapay kromozomlarını da (YACs) vektör olarak kullanmak enin ifadesi sırasında karşılaşılan problemlerin en aza indirilmesini sağlar

21 DNA nın in vitro amplifiye edilmesi: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Polimeraz Zincir Reaksiyonu, PCR DNA nın spesifik bir bölgesinin çok sayıda kopyasını üretir Hedef diziye uygun primerleri kullanır Isıya dirençli DNA polimeraz ları kullanır

22 PCR protokolü UYULAMA PCR ile herhangi bir DNA örneğinin içindeki spesifik bir bölgenin in vitro ortamda çok sayıda kopyası oluşturulabilir. EKNİK PCR için başlangıç materyali, kopyalanacak hedef nükleotit dizisini içeren çift zincirli DNA molekülü, ısıya dayanıklı DNA polimeraz, dört çeşit nükleotidin hepsi ve primer olarak görev yapacak iki kısa tek zincirli DNA molekülüdür. Primerlerden her biri, her iki zincirin de kendilerine spesifik olan uç kısmına komplementerdir. Döngü 1 2 Molekül üretilir enomik DNA 1 Denatürasyon: 5ʹ DNA zincirlerinin ayrılması için kısa süreli ısıtma 3ʹ 2 Ayrılma: Primerlerin bağlanması için soğutma işlemi 3 Uzama: DNA polimeraz Her bir primerin 3ʹ ucuna nükleotidleri ekler 5ʹ 3ʹ 3ʹ 5ʹ Primerler Yeni nükleotidler Hedef dizi 3ʹ 5ʹ SONUÇLAR PCR döngüsü boyunca, hedef DNA dizisi iki katına çıkar. Üçüncü döngünün sonunda 1 e karşılık 4 zincir sentezi gerçekleştirilmiş olur. 20 ya da daha fazla döngü sonucunda hedef nükleotid dizisinin milyarlarca katı oranında kopyası çıkarılmış olur. Döngü 2 4 Molekül üretilir Döngü 3 8 Molekül üretilir; Figure 20.7

23 Restriksiyon fragment analizi kesim bölgelerini belirleyen DNA farklılıklarını tespit eder. Restriksiyon fragment analizi DNA dizileri hakkında hızlı ve faydalı bilgiler sağlar

24 Jel Elektroforezi ve Southern Blotting Jel elektroforezi Farklı uzunluktaki DNA restriksiyon fragmentlerini ayırır UYULAMA Jel elektroforezi, farklı büyüklüklere, elektriksel yüklere ve diğer fiziksel özelliklere sahip nükleik asitleri veya proteinleri ayırmak için kullanılır. Katot Farklı büyüklüklerdeki DNA molekülleri karışımı EKNİK 1 Her biri karışım halinde bulunan DNA örnekleri, jelin başlangıç kısmıdaki ayrı kuyucuklara yerleştirilir. Jel, cam plaklarla desteklenir ve sulu bir solüsyon içerisine yerleştirilir. Her iki uca da elektrodlar yerleştirilir. 2 Elektrik akımı verildiğinde negatif yüklü DNA molekülleri pozitif elektroda doğru hareket etmeye başlar. Bu sırada küçük fragmentler daha hızlı hareket ederken, daha büyük veya uzun olanlar daha yavaş hareket edecektir. Burada bantlar mavi renkte gösterilmiştir. Fakat gerçek jel üzerinde DNA bantları, DNA molekülüne bağlanabilen boyalar uygulanmadığı sürece görünür durumda değildir. Jel elektroforezi, makromolekülleri, bir elektriksel alanda yürüme hızları esasına göre ayırır. Her molekül, kendi ağırlığı ile ters orantılı bir mesafede konumlanır. enellikle restriksiyon enzimleri tarafından meydana getirilen DNA fragmentleri bu teknik ile bantlara ayrılır. Her bir bant, aynı uzunlukta binlerce molekülü içermektedir. üç kaynağı Anot Jel Cam plaklar Daha uzun moleküller Daha kısa moleküller SONUÇLAR Elektrik akımı kapatıldığında, DA ya bağlanabilme özelliğine sahip bir boya eklenir. Bu boya UV ışık altında bantların bulunduğu bölgelerde floresan pembe bir renk verir. erçek jel üzerinde bu bölgeler elektroforez ile ayrılmış farklı uzunluklardaki DNA fragmentlerine karşılık gelir. Eğer başlangıçta tüm örnekler aynı restriksiyon enzimi ile kesilmiş olsaydı, bu durumda oluşabilecek farklı bantların, farklı kaynaklardan geldiği söylenebilirdi.

25 Restriksiyon Fragment Analizi Bir genin allelleri gibi iki farklı DNA molekülünün karşılaştırılmasında faydalı bir tekniktir Normal β -globin alleli 175 bp 201 bp Large fragment DdeI DdeI DdeI DdeI Orak hücre mutant β-globin alleli (a) 376 bp Large fragment DdeI DdeI DdeI β-globin geninin normal ve orak hücre allellerindeki DdeI restriksiyon kesim bölgeleri. Normal allel Orak hücre alleli Büyük fragment 376 bp 201 bp 175 bp (b) Normal ve orak hücre allellerinin restriksiyon fragment elektroforezi.

26 Spesifik DNA fragmentleri Southern blotting yoluyla analiz edilebilir Jel üzerine tutuklanmış DNA ile hibrit oluşturabilecek etiketli problar kullanılır.

27 Southern blotting UYULAMA Araştırıcılar bu metod ile herhangi bir DNA örneği içindeki spesifik nükleotit dizilerini tespit edebilirler. Özellikle bu teknik, farklı genomik DNA örneklerinden üretilen restriksiyon fragmentlerinin karşılaştırılmasında oldukça fardalıdır. EKNİK Bu örnekte, 3 farklı bireyin genomik DNA örneklerini karşılaştırmaktayız: normal β-globin alleli açısından homozigot (I), Mutant orak hücre alleli açısından homozigot (II) ve heterozigot (III). DNA + restriksiyon enzim Restriksiyon fragmentler I II III Nitrosellüloz kağıt (blot) Ağırlık Jel Sünger I Normal β-globin alleli II Orak hücre alleli III Heterozigot Alkalin solüsyon 1 Restriksiyon fragmentlerinin hazırlanması. 2 Jel elektroforezi. 3 Blotting. Kağıt havlular

28 Plastik bir torba içerisinde bulunan solüsyona β-globin geni için radyoaktif olarak etiketlenmiş prob eklenir I II III Prob, normal veya mutant β-globin içeren fragmentlere hidrojen bağları ile bağlanır Orak hücre β-globin allel fragmenti I II III Kağıt blot üzerindeki film tabakası Normal β-globin Kağıt blot Allel fragmenti 1 Radyoaktif prob ile hibridizasyon. 2 Otoradyografi. SONUÇLAR Bu üç örneğe ait bant oluşumu bariz bir farklılık gösterdiğinden, bu metod orak hücre alleli açısından taşıyıcı bireyleri, mutant allele sahip hastalıklı olanları ve normal allele sahip etkilenmemiş bireyleri tespit etmede oldukça faydalıdır. Kolon (I) de normal ve kolon (II) de mutant allelere ilişkin bantlar görülürken, kolon (III) de I ve II nin karışımı olan heterozigot allellere ait bantlar görülmektedir.

29 Restriksiyon fragment uzunluk farklılıklarının genetik marker olarak kullanılması Restriksiyon fragment uzunluk polimorfizmi (RFLPs) Farklı uzunluktaki restriksiyon fragmentlerin oluşumu ile sonuçlanan, homolog kromozomlar üzerinde bulunan, DNA dizilerindeki farklılıklardır

30 Spesifik fragmentler Southern blotting ile teşhis ve analiz edilebilir Ökaryotik DNA da binlerce RFLPs bulunmaktadır Bunlar genetik marker lar olarak kullanılabilir

31 enomun tamamı DNA düzeyinde haritalanabilir İnsan enom Projesi İnsan genomunun dizisini belirlemiştir Araştırmacılar ayrıca diğer organizmaların da genomik dizilerini belirlemişlerdir

32 enetik (Linkaj) Haritalama Büyük bir genomun haritalanması için başlangıç noktası Her bir kromozom boyunca dağılmış olan binlerce genetik marker in linkaj haritalarını oluşturmaktır Sitogenetik harita Floresan in situ hibridizasyon (FISH) yoluyla belirlenen kromozom bant profili ve Spesifik genlerin konumları FISH tekniği ile konumlandırılan genler Kromozom bantları 1 enetik (linkaj) haritalama RFLPs, basit DNA dizileri ve diğer polimorfizmler gibi genetik marker lerin sırasının belirlenmesi enetik marker lar 2 Fiziksel haritalama YAC ve BAC vektörlerine klonlanan ve üst üste binen Büyük fragmentlerin sırasının Belirlenmesi. Bu işlemi, faj veya Üst üste binen plazmit vektörlere klonlanan daha fragmentler küçük fragmentlerin sıraya dizilmesi izler 3 DNA dizileme ACCACACAAC üm genom dizisinin tespiti için her bir fragmentin dizisinin belirlenerek sonuçların birleştirilmesi

33 Böylesi bir haritada marker lerin sırası ve birbirleri arasındaki göreceli uzaklık Rekombinasyon frekanslarına dayalı bir bilgidir

34 Fiziksel Haritalama: DNA Fragmentlerinin Sıralanması Fiziksel bir harita Herhangi bir DNA molekülünü çok sayıda kısa fragmente ayırıp bu fragmentleri üst üste binen bölgelere göre sıraya dizmek esasına dayanır Marker ler arasındaki uzaklığı baz çifti olarak gerçek ölçülerle verir

35 DNA Dizileme Kısa DNA fragmentleri Dideoksi- zincir sonlanma yöntemi ile dizilenebilir

36 DNA dizileme için Dideoksi zincir sonlanma DNA (kalıp zincir) 3ʹ 5ʹ yöntemi dap UYULAMA EKNİK 800 baz çifti uzunluğuna kadar olan herhangi bir klonlanmış DNA fragmenti içindeki nükleotidlerin dizisi özelleşmiş makinalarla hızlı bir şekilde belirlenebilir. Bu cihazlar dizileme reaksiyonları gerçekleştirerek uzunluk esasına göre etiketlenmiş reaksiyon ürünlerini ayırabilirler. Bu metod, orijinal DNA fragmentine komplementer olan içiçe geçmiş DNA setleri sentezler. Her zincir aynı primer ile başlar ve modifiye bir nükleotid olan bir dideoksiribonükleotid (ddnp) ile sonlanır. Zincire bir ddnp girişi DNA zincirinin sonlanmasına yol açar çünkü bu nükleotidde 3 OH grubu bulunmaz. Sentezlenen standart setleri içerisinde, orijinal dizi boyunca her bir nükleotidin pozisyonu komplementer ddn ile sonlanan zincirlerle temsil edilir. Çünkü her bir ddnp tipi farklı bir floresan boya ile etiketlenmiştir yeni sentezlenen zincirlerin son nükleotitleri renk açısından birbirinden ayırt edilebilir. Böylelikle tüm orijinal dizi belirlenebilir. 5ʹ 3ʹ 3ʹ C A C C A C A A C A C C A C A A ddc Zincirlerin hareket yönü Primer Deoksiribonükleotidler Dideoksiribonükleotidler (floresans etiketli) 5ʹ DNA polimeraz DNA (kalıp zincir) dd C dda C dcp dp dp P P P OH Etiketli zincirler dda A C dd A A C dd A A C ddc A A C ddap ddcp ddp ddp P P P dda C A A C H dd A C A A C 3ʹ SONUÇLAR Her bir zincir üzerindeki floresan boya rengi son nükleotidin ne olduğu hakkında bilgi verir. Sonuçlar, spektrogram şeklinde çıkarılabilir ve böylelikle kalıp zincire komplementer olan dizi yukarıdan başlanmak suretiyle okunabilir. (Not: Orijinal dizinin primerden sonra başladığını unutmamak gerekir.) Lazer A C A A C Dedektör

37 Linkaj haritalama, fiziksel haritalama ve DNA dizileme İnsan genom projesinin kapsamlı bir stratejisidir üm genomun sekansının çıkarılmasına ilişkin bir başka altenatif yaklaşım da rastgele DNA fragmentlerinn dizisinin belirlenmesidir Bu işlem için oldukça güçlü bilgisayar programları, kısa zincirli çok sayıda molekülün üst üste binen kısımlarını sıraya dizerek tek bir zincir haline getirebilir

38 1 Dizileme için yeterli olabilecek sayıda ve üst üste binebilecek dizilere sahip fragmentler oluşturulur. 2 Fragmentler plazmit veya faj vektörlerine aktarılır 3 Her bir fragmentin dizisi tespit edilir ACAAC 4 Bilgisayar yazılımları ile tüm dizi doğru bir sıra halinde tespit edilir. CCCACA ACCCAACA ACAAC ACCCACACCCAACAACCAA

39 enom sekansları önemli biyolojik sorular hakkında ipuçları verir enomik araştırmalarda Araştırıcılar tüm gen setleriyle ve bunların birbirleri arasındaki etkileşimlerle çalışırlar

40 DNA dizilerindeki protein kodlayan genlerin belirlenmesi enom dizilerin bilgisayar analizleri Araştırıcılara, proteinlerin kodlanmasından sorumlu dizileri tespit etme konusunda yardımcı olur

41 Bugünkü tahminlerimize göre insan genomu yaklaşık 25,000 gen içermektedir. Fakat mevcut protein sayısı, bu gen sayısından oldukça yüksektir

42 Yeni genlere ilişkin dizilerin diğer türlerdeki bilinen genlerle karşılaştırılması bu genlerin aydınlatılmasında önemlidir

43 en Fonksiyonunun Belirlenmesi Fonksiyonu bilinmeyen bir genin fonksiyonunu tespit etmek için enin deneysel inaktivasyonu ve sonuçta ortaya çıkan fenotipik değişimin gözlemlenmesi, o genin fonksiyonuna ilişkin önemli ipuçları verir

44 Birbirleriyle etkileşimde bulunan gen gruplarının ifadelerinin incelenmesi DNA mikroarray analizleri araştırmacılara gen ifadesi modellerinin karşılaştırılması konusunda yardımcı olur Farklı dokularda, farklı zamanlarda, farklı koşullar altında

45 en ifade düzeyinin belirlenmesi için DNA mikroarray yönteminin kullanılması UYULAMA Bu yöntem ile, araştırıcılar aynı anda binlerce geni test ederek belirli bir dokuda, farklı çevresel koşullar altında, bazı hastalıkların çeşitli aşamalarında veya farklı gelişme safhalarında hangilerinin ifade edildiğini belirleyebilirler. Doku örneği EKNİK mrna molekülleri 1 mrna izole edilir Revers transkripsiyon ile etiketli nükleotidler kullanılarak cdna elde edilir. cdna karışımı mikroarray üzerine uygulanır. Bunun üzerine de bazı gen bölgelerine özellikle araştırılan gen bölgelerine) komplementer olan tek zincirli DNA fragmentlerinin bulunduğu mikroskop slaytları yerleştirilir. Burada her bir nokta farklı bir geni göstermektedir. cdna, mikroarray üzerinde komplementer DNA fragmentleri ile hibritleşir. cdna nın fazlası uzaklaştırılır; mikroarray plak floresan ışıma bölgelerinin belirlenmesi için taranır. Her floresan nokta (sarı) dokuda ifade edilen bir gene karşılık gelir. Etiketli cdna molekülleri (tek zincirli) DNA mikroarray SONUÇ her bir nokta üzerindeki floresan ışığın yoğunluğu doku örneğinde o noktaya karşılık gelen genin ifadesinin bir ölçüsüdür. enellikle, her bir örnekten hazırlanan ve farklı floresan boya etiketleri kullanılan cdna lar etiketlenerek iki farklı örnek bir arada test edilir. Sonuçta ortaya çıkan renk yoğunlukları, her iki örnekte de genin ifade düzeyinin karşılaştırılmasına imkan tanır. üm maya genlerini içeren gerçek bir DNA mikroarray görüntüsü (6,400 nokta)

46 Farklı türlere ait genomların karşılaştırılması Akraba ya da akraba olmayan türler arasındaki genomların karşılaştırılması çalışmaları Biyolojinin pek çok alanında faydalı bilgiler sağlamaktadır

47 enomik araştırmaları gelecekteki eğilimler nelerdir? enomikler üm genoma ilişkin çalışmalardır Proteomikler enom tarafından kodlanan proteinlerin tamamına ilişkin sistematik çalışmalardır ek nükleotid polimorfizmi (SNPs) İnsanlardaki genetik varyasyonları çalışmak için kullanışlı marker lar sağlar

48 DNA teknolojisinin pratikteki uygulamaları yaşantımızı pek çok farklı şekilde etkiler Pek çok alan DNA teknolojisinden ve genetik mühendislik tekniklerinden faydalanmaktadır

49 ıbbi Uygulamalar DNA teknolojisinin en önemli faydası enetik hastalıklarda rol oynayan insan genlerindeki mutasyonların teşhisidir

50 Hastalıkların eşhisi ıbbi araştırmacılar günümüzde yüzlerce farklı genetik hastalığı teşhis edebilmektedir Klonlanmış hastalık genleri ve bunlara karşılık gelen primerler kullanılarak hastalıkların oluşumundan sorumlu gen ürünleri çoğaltılabilir

51 Herhangi bir gen bölgesi henüz klonlanmamış olsa bile Anormal allelin mevcudiyeti, eğer bununla yakından ilişkili bir RFLP marker i bulunabilir ise yüksek doğruluk oranıyla tespit edilebilir DNA RFLP marker Restriksiyon bölgeleri Hastalığa yol açan allel Normal allel

52 İnsan en erapisi en terapisi Hasta bireylerin genlerinin değiştirilmesidir ek bir mutant genin değiştirilmesinin gerektiği durumlarda etkili bir tedavi yöntemi olabilmektedir enlerin hücreler aktırabilmesi için çeşitli vektörler kullanılır

53 en terapisinde retroviral vektörler kullanılır Klonlanmış gen (normal allel, Hastanın hücrelerinde bulunmaz) 1 Normal allelin RNA versiyonu retrovirüs içerisine yerleştirilir. Viral RNA Retrovirüs kapsidi 2 Retrovirüs, hastadan alınan ve kültürde yetiştirilen kemik iliği hücrelerini enfekte eder. 3 Normal alleli taşıyan viral DNA kromozomlara entegre olur. Hastadan alınan kemik iliği hücresi Rekombinant hücrelerin hastaya tekrar verilmesi. 4

54 Farmasotik Ürünler DNA teknolojisi uygulamaları şunları içerir edavi edici kullanımları olan insan hormonlarının ve diğer proteinlerin geniş ölçekte üretimi Daha güvenilir aşıların üretimi

55 Adli ıp Kanıtları DNA fingerprints, suç sahasında bulunan doku veya vücut sıvılarının analizi sonucunda elde edilir Şüpheli şahsın gerçekten suçlu olup olmadığına ilişkin kesin kanıtlar sunar

56 DNA fingerprint Jel üzerinde RFLP marker lerine ilişkin spesifik bant profilleri oluşturur Sanığın kanı (D) Sanığın elbiselerinden Kurbanın kanı (V) alınan kan 4 µg 8 µg D Pantolon -shirt V

57 DNA fingerprinting Ayrıca babalık testlerinde de kullanılır

58 Çevresel emizlik enetik mühendislik mikroorganizmaların metanolizmasını modifiye etmek için kullanılabilir Böylelikle, minerallerin çevresel ortamdan izolasyonu veya bazı toksik atık minerallerin yıkımı mümkün olabilmektedir

59 arımsal Uygulamalar DNA teknolojisi arımsal üretimi ve besin kalitesini artırmak için kullanılabilmektedir

60 Hayvancılık ve Eczacı Hayvanlar ransgenik hayvanlar Diğer organizmaların genlerini içermektedir

61 «Farmasotik fabrikalar» olarak dizayn edilmişlerdir

62 Bitkilerde enetik Mühendislik arım araştırmacıları Çok sayıda bitki türüne istenilen bazı özelliklere ait gen bölgelerini aktarmışlardır

63 i plazmidi Yeni genlerin bitkilere aktarılması için kullanılan en yaygın vektördür UYULAMA EKNİK Faydalı özellikleri kodlayan genler (örn; pestisitlere dirençlilik, herbisitlere dirençlilik, olgunlaşmanın geciktirilmesi, besinsel değerin artırılması) herhangi bir bitki varyetesi ya da türünden i plazmidini vektör olarak kullanmak suretiyle başka bir türe aktarılabilir. 1 i plazmidi Agrobacterium tumefaciens den izole edilir. Konak hücre genomuna entegre olan plazmit segmentine DNA adı verilir. Agrobacterium tumefaciens i plazmidi Restriksiyon enzimi kesim bölgesi Hedef geni içeren DNA DNA 2 İzole edilen plazmitler ve hedef geni içeren yabancı DNA molekülü, DNA yı ortasından kesebilecek bir restriksiyon enzim ile birlikte inkübe edilir. Plazmitler ve yabancı DNA nın yapışkan uçları arasında baz eşleşmeleri meydana geldikten sonra DNA ligaz eklenir. Sonuçta elde edilen plazmitlerden bazıları hedef geni içeren rekombinant plazmitlerdir. Rekombinant i plazmidi 3 Rekombinant plazmitler, kültürdeki bitki hücrelerine elektroporasyon yoluyla aktarılabilir veya tekrar Agrobacterium içine aktarılarak bu bakterinin bitki hücresini enfekte etmesi sağlanır. Plazmit bitki hücresine girdikten sonra bu plazmidin DNA sı hücrenin kromozomal DNA sına entegre olur. SONUÇLAR Hedef geni içeren transforme hücreler rejenere olarak yeni kazandırılan özelliğe sahip bir bitkiyi meydana getirebilir. Yeni özelliğe sahip bitki

64 DNA teknolojisinin gündeme getirdiği güvenlik ve etik sorunlar enetik mühendisliğin potansiyel yararları İinsan ya da çevreye zararlı ar-ge süreçlerinin ortaya çıkması ihtimaline karşı dikkatlice değerlendirilmelidir

65 ünümüzde, kamuoyunun üzerinde en fazla odaklandığı potansiyel tehlike enetiği değiştirilmiş organizmaların (M) besin olarak kullanılmasıdır