Dirençli Bakteri Oluşumuna karşı Biyoteknolojik Mücadelede bir Deneme: Deterjan Atık Suyunun MYH Sisteminde Kullanılması

Transkript

1 Elektronik Mikrobiyoloji Dergisi TR Yıl: 2017 Cilt: 15; Sayı: 2; Sayfa: Dirençli Bakteri Oluşumuna karşı Biyoteknolojik Mücadelede bir Deneme: Deterjan Atık Suyunun MYH Sisteminde Kullanılması Şebnem Erenler 1*, Esra Ülke 1, Aygün Aliyeva 2 1 İnönü Üniversitesi Fen-Ed Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Biyoteknoloji AbD 2 İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya AbD Özet Okyanus derinliklerinden atmosferin her katmanında, uzaydan gelen meteorlarda ve insanların yaşayamayacağı ekstrem koşullarda yaşama kabiliyetine sahip olan bakterilerin, patojen soylarının insanoğlunun geleceği için ciddi bir tehdit olduğu açıktır. Antibiyotik kullanımında ki yanlış yaklaşımların dirençli bakteri soyları oluşturduğu ve yakın gelecekte bunlarla mücadelenin imkânsız bir hal alacağı öngörülmektedir. Deterjan içeren hijyen ürünleri grubunun kontrolsüz bir şekilde kanalizasyona karışmasının antibiyotiklerin hatalı kullanımında olduğu gibi yüksek tehdit içerdiği farkındalığı oldukça yakın bir zamanda oluşmaya başlamıştır. Kullandığımız konsantre halleriyle antimikrobiyel etki gösteren bu kimyasallar kanalizasyona karıştıklarında ki seyreltik halleriyle bakterileri adeta aşılamakta ve direnç geliştirmelerini sağlamaktadırlar. Bu sorunla mücadele etmek için bilim insanlarının geliştirebilecekleri çeşitli yollar vardır. Çalışmamızda seyreltik formdaki deterjan atıklarını Mikrobiyel Yakıt Hücrelerinde (MYH) substrat olarak kullanmak hedeflenmiştir. Bu amaçla oluşturduğumuz sistemde, MYH lerde etkin kullanımını önceki çalışmalarda tespit ettiğimiz Enterobacter aerogenes bakterisinin vgb rekombinantı E.a [puc8:15] kullanılmıştır. Substrat olarak ise çeşitli atıklar karşılaştırma amacı ile kullanılmıştır. Hedef substratımız olan deterjan atık suyunda üreme ve voltaj varlığı belirlenerek, ulaşılan en yüksek voltaj değeri V olarak ölçülmüştür. Bu sonuç bize çalışmamızın ileriki aşamalarında deterjan atık sularının, ileri optimizasyon çalışmaları ile MYH de etkin bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir. Anahtar kelimeler: Mikrobiyel yakıt hücresi, deterjan, dirençli bakteri, atık, arıtım. GİRİŞ Temizlik ve hijyen amaçlı olarak kullanılan ve pek çok maddenin kompleks bir karışımı olan deterjanlar, petrol ürünlerinden sentetik olarak elde edilen yüzey aktif maddelerdir. Deterjanlar, içerikleri nedeni ile konsantre halleriyle bakterilerin ölümüne neden olmakta iken seyreltik halde karıştıkları şehir kanalizasyon ve atık su ortamlarında ise dirençli bakteri oluşumuna neden olmaktadır [1]. Düşük doz yani seyreltilmiş temizlik mamulleri ile karşılaşan bakterilerin zaman içerisinde bu bileşiklere karşı direnç geliştirdikleri belirlenmiştir. Antibiyotik dirençliliğinin yani bakterilerin ilaçlara karşı duyarsız hale gelmesinin insanlık için ne kadar tehlikeli olabileceği bilinmekte ve bu konu ile mücadelede ortak bir bilinç oluşturulmak hedeflenmektedir. Deterjan atık sularının oluşturduğu tehdit ise bilinçsiz antibiyotik * Yazışmalardan sorumlu yazarın e-posta adresi : sebnem.erenler@inonu.edu.tr 6

2 kullanımından kaynaklanan direnç oluşumu riskine göre daha yaygın ve gizli bir tehdit oluşturmaktadır [1]. Her gün tükettiğimiz deterjanlardan kaynaklanan atık sular kanalizasyona karışmakta ve daha sonra kanalizasyon ve nehirlere akıtılan deterjan atık suları buradan da tarım alanlarına geçmektedir. Birmingham ve Warwick Üniversiteleri tarafından yapılan araştırmalarda kişisel ve evsel temizlik ürünlerinin kanalizasyon yolu ile nehirlere ve topraklara yayıldığı düşünülen bölgelerden alınan toprak örneklerinin, yüksek seviyede bakteri öldürücü kimyasallara direnç genleri olan bakterileri içerdiği rapor edilmiştir [1]. Bu durum direnç kazanan yeni bakteri soylarının ekosistemde ne kadar hızlı yayılabileceği düşünüldüğünde oldukça önemlidir. Deterjanlarda bulunan ve antimikrobiyel olarak kullanılan Kuaterner (Dördüncü) amonyum bileşikleri (QAC) her gün evlerden ve fabrikalardan kanalizasyonlara ve nehirlere boşaltılmaktadır. QAC bileşiğinin yüksek konsantrasyonu, bakteriler için öldürücüdür, ancak kanalizasyon suyunda bulunan bu kimyasallar seyreltilmiş formda bulunduklarından bakteriler için adeta aşı görevi görüyorlar. Aslında bakterilerin bir takım kimyasallara karşı direnç geliştirmesi doğal bir süreçtir. Bu durum için süreç şöyle: Diğer bakteriler öldüğünde, QAC bileşiğine karşı direnç geliştirenler hayatta kalmakta ve rekabet olmaksızın, sayıca çoğalmaktalar. Ayrıca bu kimyasallara karşı dirençli hale gelen DNA ları yoluyla, diğer bakterilere hem bu direnci hem de antibiyotiklere dirençli genleri geçirmektedirler [1]. Yani bilinçsiz evsel temizlik ürünleri kullanımı ile su boruları ve kanalizasyonlarımızda, kimyasallara karşı direnç geliştirmiş bakteriler için ideal bir ortam oluşturulmakta ve bunların toprağa karışarak besin zincirine girmesi ile vücudumuzda her tür hastalığa sebep olabilecek bir potansiyel oluşturmaktadır. Hijyen ürünleri ve antibiyotik ile yok edilemeyecek bir mikrobiyel çeşitliliğe yol açacak olan bu durumda, patojen bakterilerin yaratacağı tehdit tüm insanlığa ve tüm canlı türlerine karşı olacaktır. Bu durumda en basit bir enfeksiyon bile ölümcül sonuçlar doğurabilecektir. Tüm dünyada ve ülkemizde hızla gelişen teknoloji ile oluşan enerji ihtiyacındaki artış, son dönemde doğal enerji kaynaklarının hızla tükenmesine neden olmuş ve bu durum; alternatif enerji kaynakları arayışına neden olmuştur. Bu yeni enerji kaynaklarından biri de Mikrobiyel Yakıt Hücre leridir [2]. MYH; temel olarak, organik atıklardaki kimyasal enerjinin mikroorganizmalar yardımıyla elektrik enerjisine dönüştürüldüğü sistemlerdir [3]. Bir mikrobiyel yakıt hücresi; anot ve katot bölümlerinin artı yüklü bir membran ile ayrılmasından oluşmaktadır. Anot bölümünde bulunan elektrot yüzeyine tutunarak büyüyen mikroorganizmalar, organik maddeleri oksitleyerek elektron ve proton (hidrojen) açığa çıkartırlar. Anot bölmesindeki elektronlar, elektrot yüzeyinden bir devre ile katot bölmesine geçerler. Hidrojen ise difüzyon ile iyon değiştirici zardan geçerek katot bölmesine ulaşır ve burada oksijen ile birleşerek suyu oluştururlar. Kuvvetli bir elektron alıcısı olan O 2 nin varlığı ve pozitif elektrik yükü oluşturan H + lar sayesinde, anottaki elektronlar katoda doğru çekilir ki bu da hat üzerinde elektrik akımı meydana getirir [4-8]. Literatürde [4-8].; MYH lerde substrat olarak atık kullanımı rapor edilmiştir. Bu sayede hem atık giderimi yapılıp hem de düşük maliyetli enerji üretimi hedeflenmektedir. Bu amaçla; şeker endüstrisi atıkları (melas), zeytin endüstrisi atıkları (kara su), süt endüstrisi atıkları (peynir altı suyu) ile MYH den enerji üretimi gerçekleştirilmiştir. Çalışmamızda ise deterjan atık suyu kullanılmıştır. Çalışmamızda gram-negatif bir bakteri olan Enterobacter aerogenes bakterisinin Vitreoscilla hemoglobin geninin (vgb) aktarıldığı rekombinant suşu [puc8:15] kullanılmıştır. Bu bakteri grubu, fermentatif hidrojen üretiminde ve 7

3 buna bağlı olarak da alternatif enerji üretiminde en çok çalışılan türlerden biridir. Bunun en önemli nedeni; yüksek miktarda hidrojen üretmeleridir. Vitreoscilla Hemoglobini yani VHb; aktarıldığı hücrelerin büyük bir kısmına daha iyi bir oksijen alımı ve kullanım potansiyeli sağlayan bir proteindir ve hücre üreme ve çoğalması üzerine olan etkisi konusunda da farklı çalışmalar kaydedilmiştir [9]. Literatürde MYH lerin atık su arıtımı için kullanılabileceği ile ilgili ilk çalışma 1991 yılında yapılmıştır [3]. Çalışmamızda bakterilerin deterjan atık suyundaki kimyasalları parçalayarak, ürettikleri elektron ve protonlar sayesinde elektriksel güç oluşturmaları hedeflenmiştir. Sistemdeki proton kaynağı olan bakteriler ile fermantasyon yolu ile deterjan atık sularına yönelik arıtım ya da kimyasal madde giderimi yapıp aynı zamanda da düşük maliyetli enerji üretimi yapılabilecektir. Aynı zamanda bu yol ile oluşan dirençli bakterilerin yayılması, tarımsal alanlardan besin zincirine girişleri de önemli ölçüde engellenmiş olacaktır. Çalışmamızda önerdiğimiz sistemin uygulanabilir nitelik kazanması hastalık tedavisi ve yeni antibiyotik geliştirme amaçlı yapılan harcamalar açısından da ekonomik önem taşıyan ve aynı zamanda literatüre göre öncü bir çalışmadır. MATERYAL ve METOT Kullanılan Kimyasallar, Bakteri Suşları ve Kültür Koşulları Çalışmada, E.aerogenes (NRRL B-427) bakterisinin vgb rekombinantı E.a [puc8:15] kullanılmıştır. Bakteriler atıksulara inoküle edilmeden önce aşağıda belirtilen oranda hazırlanan Lauria Broth içerisinde gece kültürü yapılmıştır [Çizelge 1]. Çizelge 1. Lauria Broth (g/l) (ph 7.5) Pepton 10 NaCI 10 Maya özütü 5 Kullanılan Atık Sular Çalışmamızda esas hedef deterjan atık suları ile MYH aktivitesini belirlemektir. Ancak karşılaştırma yapmak amacı ile de melas ve peyniraltı suyu da kullanılmıştır. Çalışmamızda kullandığımız Deterjan atığı %1, melas %1 ve peyniraltı suyu ise %10 luk olarak hazırlanmıştır. İçerik ve optimum oran daha önceki çalışmalarımıza göre belirlenmiştir [10]. MYH sisteminde deneyler boyunca kullanılan çözeltiler ve içerikleri çizelge 2'de verilmiştir. Çizelge M Fosfat Tamponu (ph 7.0) Na 2 HPO g / 100 ml NaH 2 PO g / 100 ml Na 2 HPO 4 karışımından 38 ml alınır, NaH 2 PO 4 karışımından da 12 ml alınıp 50 ml lik tampon oluşturulur. [Çizelge 3 ve Çizelge 4] Çizelge 3. Metilen Mavisi Metilen mavisi g/ 25 ml 8

4 Çizelge M Potasyum Ferrisiyanid Çözeltisi Potasyum ferrisiyanid 0.65 g/100 ml Kullanılan Mikrobiyel Yakıt Pili Sistemi Çalışmamızda; anot + katot bölümü toplamı 10 ml olan bir mikrobiyel yakıt pili kullanılmıştır (Şekil 1). Deneylerimizde karbon elektrotlar kullanılmıştır. İyon değiştirici zar (membran) olarak da; "Nafıon 211 membrane cm" kullanılmıştır. Şekil 1. Çalışmamızda Kullanılan Mikrobiyel Yakıt Hücresi. Mikrobiyel Yakıt Pili Sistemi Bakteriler atık sulara inoküle edilip etüvde gece boyunca çoğalmaları sağlanmıştır. Anot Bölümü; - Potasyum fosfat tamponu (yaklaşık 1.2 ml) - Metilen mavisi (yaklaşık 1.2 ml) - Bakteri (deterjan atık su ortamında çoğaltılmış kültürden yaklaşık 2.3 ml) Katot Bölümü; - Potasyum ferrisiyanid çözeltisi (yaklaşık 4.5 ml) ilave edilerek toplam hacim yaklaşık 10 ml ye tamamlanmıştır. Açığa çıkan voltaj değerinin okunması MYH sistemi ile elde edilen elektrik miktarını ölçmek için veri toplama sistemi (Picotest Marka M3500A 61/2 Digit Multimeter) Şekil 2 kullanılmış ve 24 saat boyunca, her saat başı voltaj değerleri kaydedilip bu veriler "Excel" programıyla grafiğe dökülmüştür. 9

5 Şekil 2. Kullanılan Multimetre Sistemi BULGULAR VE TARTIŞMA Kullandığımız bakterilerin konsantre deterjan ortamında hayatta kalamazken, uygun konsantrasyonda (%1) hazırlandığımızda MYH Sistemi için yeterli düzeyde büyüme gösterdiği tespit edilmiş ve belirtilen bakterilerin deterjan atık sularının arıtımında kullanılabileceği saptanmıştır. MYH sistemleri ile ilgili temel prensip; atık arıtımına eşdeğer olarak enerji üretebilmek olduğundan, bu sistem ile elektrik üretilebileceği de gösterilmiştir. Deterjan atıksuyunun kullanıldığı MYH sisteminde (Şekil 3.) ulaşılan en yüksek voltaj miktarının V olduğu gözlemlenmiştir. Karşılaştırma amaçlı ölçüm yaptığımız ve substrat olarak %1 oranında Melas kullanılan MYH sisteminde (Şekil 4.) ulaşılan en yüksek voltaj miktarının V olduğu, zengin içeriği nedeni ile erken saatlerde elde edilen en yüksek voltaj değerinin giderek artan metabolit yoğunluğu ve ph artışı nedeni ile kısa sürede düşüşe geçtiği gözlemlenmiştir. %10 oranında Peyniraltı suyu kullanılan MYH sisteminde ise maksimum voltaj değeri 3. Saatte, V olarak ölçülmüştür. Deterjan Atık suyunun kullanıldığı MYH sisteminde ilk 12 saat süresince orantılı bir artış tespit edilmiş, belirli bir süre voltaj miktarının sabit kaldığı, son saatlere doğru ise voltaj veriminin düştüğü gözlemlenmiştir. Bu diğer atıksularda ölçülen voltaj oranları açısından farklılık arz eden bir durumdur. Melas ve peyniraltı suyunda erken saatlerde ölçülen en yüksek değer nispeten erken saatlerde değer kaybına uğramış, voltaj kaybı erken saatlerde gözlemlenmiştir. Bu durum bakterilerin, deterjanlarda bulunan ve antimikrobiyel etkisi olan kuaterner amonyum bileşikleri (QAC) varlığında baskılanan üremelerinin ilerleyen periyotlarda, etkin metabolizmaları ve ortam koşulları etkisi ile etkinliklerini yitiren bu bileşiklerin baskısından kurtulmaları ve bu koşullarda artan popülasyonlarının etkisi ile etkin voltaj aktivitesi sağlayabilmeleri ile açıklanabilir. 10

6 Şekil 3. Substratı Deterjan Atık Suyu Olan MYH Sisteminde 24 saat boyunca, saat başı okuma yapılan, voltaj-zaman grafiği Şekil 4. Substratı Melas Olan MYH Sisteminde 24 saat boyunca, saat başı okuma yapılan, voltaj-zaman grafiği SONUÇ VE TARTIŞMA Çalışmamızda; E. aerogenes in rekombinant suşunun deterjan atık suyunda üremesinin sağlayarak bu bakteri suşunun deterjan atık sularının arıtımında kullanılabileceğini ispatlamış olduk. Karşılaştırma amaçlı olarak sistemde kullandığımız melas ve peyniraltı suyu gibi zengin besin içeriğine sahip [10] atıklara yakın sayılabilecek değerde MYH verimi elde edilmiş olması, deterjan atık suyunun MYH sitemi için elverişli bir substrat olabileceğini göstermektedir. Bu veriyi MYH sistemi ile birlikte değerlendirdiğimizde çalışmamızda, hem atık giderimi yapılıp hem de enerji üretilebildiği ifade edilebilir. İlk saatlerde bakterilerin hızlı oksidasyonu ile voltajın giderek arttığı, son saatlere doğru ise ortamdaki bakterilerin letal faza girmeleri nedeniyle voltaj veriminin düştüğü gözlenmiştir. Ulaşılan en yüksek elektrik gerilimi V olarak belirlenmiştir. Planlanacak ileri düzey araştırmalar ve yapılacak optimizasyon çalışmaları ile bu değerin daha iyi bir düzeye gelebileceği açıktır. Yapılan deneylerle MYH sistemleri ile enerji üretiminde bakterilerin avantajlı canlılar olduğu gösterilmiştir. Literatür araştırmalarında; Geobacter [11], Enterobacter [12], Shewanella [13] ve Bacillus [14] türü bakterilerin MYH deki voltaj verimleri ile ilgili çalışmalar yapılmıştır. E.aerogenes in elektrik üretebildiği daha önceki çalışmalarla gösterilmiştir [10]. Ayrıca bu bakterinin kullandığımız vgb rekombinantı [puc8:15] in, yabanıl suşa oranla daha yüksek voltaj oluşturduğu tespit edilmiştir [10]. Bu veriler; vgb hemoglobin geninin entegre olduğu bakteri sistemine avantaj sağladığı dolayısıyla da üretilen voltaj miktarını artırdığını göstermektedir. Bakterilerin ısı ve ph gibi faktörlerden etkilendiği bilinmektedir. Çalışmamızda temel yaklaşım optimizasyon değil, voltaj varlığını tespit etmektir, sonraki çalışmalarda ileri optimizasyon işlemleri ile konu daha ileri noktalara taşınabilir. Sonuçları değerlendirdiğimizde deterjan atıklarında bulunan organik bileşikleri kullanan ve adaptasyon sağlayan ve bu yolla hijyen ürünlerine direnç geliştiren bakterilerin, MYH sistemine entegrasyonunun sağlanabileceğini kanıtladık. Detaylı ve karşılaştırmalı 11

7 optimizasyon çalışmaları ile konunun bilimsel literatüre ciddi katkılar sağlayabileceği açıktır. Şekil 5. Substratı Peyniraltı Suyu Olan MYH Sisteminde 24 saat boyunca, saat başı okuma yapılan, voltaj-zaman grafiği. Referanslar [1] Robin McKie, Shampoo in The Water Supply Triggers Growth of Deadly Drug- Resistant Bugs, guardian.co.uk, [2] Kılıç Arzu, Uysal Yağmur, Çınar Özer. Electricity Generation From Synthetic Wastewater in a Laboratory Scale Microbial Fuel Cell. Pamukkale Üniversitesi Mühendislik Bilimleri Dergisi Cilt 17, Sayı 1, 2011, Sayfa [3] Du, Z., Li, H. and Gu, T A state of art review on microbial fuel cells: A promisig technology for wastewater treatment and bioenergy. Biotechnology Advances. (25) [4] Min, B.; Cheng, S.; Logan, B. E. Electricity generation using membrane and salt bridge microbial fuel cells. Water Res. 2005, 39, [5] Aldrovandi Aba, Marsili Enrico, Stante Loredana, Paganin Patrizia, Tabacchioni Silvia, Giordano Andrea. Sustainable power production in a membrane-less and mediator-less synthetic wastewater microbial fuel cell. Bioresource Technology 100 (2009) [6] Guerrero A. Larrosa, Scott K., Head I.M., Mateo F., Ginesta A., Godinez C.. Effect of temperature on the performance of microbial fuel cells. Fuel 89 (2010) [7] Mohan Y., Kumar S. Manoj Muthu, Das D. Electricity generation using microbial fuel cells. Int J Hydrogen Energy 33 (2008) [8].Oh S, Min B, Logan BE. Cathode performance as a factor in electricity generation in microbial fuel cells. Environ Sci Technol 2004;38:

8 [9] Erenler Özalp Şebnem. L- Asparaginaz Geninin (ANSb) Farklı Gram-Negatif Bakterilere Klonlanması, İzolasyonu Ve Ekspresyonu. İnönü Üniversitesi- Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı, Doktora Tezi, [10] Guclu Esra Nezafed. Enterobacter aerogenes ve Rekombinant Suşlarında Mikrobiyal Yakıt Pili Uygulaması. İnönü Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü. Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı, [11] Richter, H., McCarthy, K., Nevin, K.P., Johnson, J.P., Rotello, V.M., Lovley, D.R., Electricity generation by Geobacter sulfurreducens attached to gold electrodes. Langmuir 24, [12] Rezaei, F., Xing, D., Wagner, R., Regan, J.M., Richard, T.L., Logan, B.E., Simultaneous cellulose degradation and electricity production by Enterobacter cloacae in a microbial fuel cell. Appl. Environ. Microbiol. 75, [13] Watson, V.J., Logan, B.E., Power production in mfcs inoculated with Shewanella oneidensis MR-1 or mixed cultures. Biotechnol. Bioeng. 105, [14] Nimje, V.R., Chen, C.Y., Chen, C.C., Jean, J.S., Reddy, A.S., Fan, C.W., Pan, K.Y., Liu, H.T., Chen, J.L., Stable and high energy generation by a strain of Bacillus subtilis in a microbial fuel cell. J. Power Sources 190,