T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BOZADAN İZOLE EDİLEN LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS GYL32 SUŞU TARAFINDAN ÜRETİLEN BAKTERİYOSİNİN KARAKTERİZASYONU Gözde KORAL Danışman: Yrd. Doç. Dr. Yasin TUNCER YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ISPARTA

2 TEZ ONAYI Gözde KORAL tarafından hazırlanan Bozadan İzole Edilen Lactococcus lactis subsp. lactis GYL32 Suşu Tarafından Üretilen Bakteriyosinin Karakterizasyonu adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği / oy çokluğu ile Süleyman Demirel Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman : Yrd. Doç. Dr. Yasin TUNCER Süleyman Demirel Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Jüri Üyeleri : Prof. Dr. Zeynep Banu SEYDİM Süleyman Demirel Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Yrd. Doç. Dr. Seyhan ULUSOY Süleyman Demirel Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı Prof. Dr. Mustafa KUŞCU Enstitü Müdürü Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER.. i ÖZET. iv ABSTRACT... v TEŞEKKÜR... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ.. ix SİMGELER DİZİNİ. x 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Laktokokların Taksonomik Özellikleri Bakteriyosinlerin Genel Özellikleri ve Sınıflandırılması Grup I : lantibiyotikler Grup II: lantibiyotik olmayan ısı stabil bakteriyosinler Grup III: yüksek moleküler ağırlığa sahip ısıya duyarlı bakteriyosinler Grup IV: lipit veya karbonhidrat yan grupları içeren kompleks bakteriyosinler Laktokoklar Tarafından Üretilen Bakteriyosinler Diplokoksin Laktokoksin A Laktokoksin B Laktokoksin G Laktokoksin Laktokoksin MN Laktokoksin MMFII Laktokoksin MMT Laktokoksin Q Laktokoksin BZ Laktoztrepsinler Laktisin Laktisin i

4 Laktisin FS Laktisin Z Laktisin Q Laktosiklisin Q Nisin Nisinin gıdalarda kullanımı.. 3. MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Fermente gıda örnekleri Mikroorganizmalar Yöntem Laktokok suşlarının izolasyonu İzolatların tanısı Morfolojik tanı ve katalaz testi Elliker broth ortamında gelişme İzolatların antibakteriyel aktivite özelliklerinin belirlenmesi Proteolitik enzim uygulaması Bakteriyosin üreticisi laktokok izolatının fenotipik tanısı Bakteriyosin üreticisi laktokok izolatının genotipik tanısı Genomik DNA izolasyonu Genomik DNA örneklerinin elektroforezi GYL32 izolatının 16S rdna bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılması ve sekans analizi GYL32 izolatının plazmid içeriğinin tanımlanması Plazmid DNA izolasyonu Plazmid DNA örneklerinin elektroforezi Plazmid büyüklüklerinin hesaplanması Bakteriyosin aktivitesi üzerine ph, sıcaklık, ve enzim uygulamalarının etkisi ph nın bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi Enzim uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi ii

5 Sıcaklık uygulamasının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi Bakteriyosin yapısal genlerinin PZR ile çoğaltılması Hücre liziz Bakteriyosin üretimi Bakteriyosinin kısmi saflaştırılması Trisin-sodyum dodesilsülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (Trisin-SDS- PAGE) Bakteriyosinin moleküler büyüklüğünün hesaplanması Aktif protein bantının tespiti ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Laktokok Suşlarının İzolasyonu Laktokok İzolatlarının Antibakteriyel Aktivite Özelliklerinin Belirlenmesi Proteolitik Enzim Uygulaması Bakteriyosin Üreticisi Laktokok İzolatının Tanısı Plazmid DNA İzolasyonu Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine ph, Sıcaklık ve Enzim Uygulamalarının Etkisi Bakteriyosin Yapısal Genlerinin Belirlenmesi Hücre Liziz Bakteriyosin Üretimi Trisin-Sodyum Dodesilsülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (Trisin-SDS- PAGE) SONUÇ KAYNAKLAR... ÖZGEÇMİŞ iii

6 ÖZET Yüksek Lisans Tezi BOZADAN İZOLE EDİLEN LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS GYL32 SUŞU TARAFINDAN ÜRETİLEN BAKTERİYOSİNİN KARAKTERİZASYONU Gözde KORAL Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Yrd. Doç. Dr. Yasin TUNCER Bu çalışmada, farklı fermente gıda örneklerinden bakteriyosin üreticisi Lactococcus lactis suşlarının izolasyonu ve üretilen bakteriyosinlerin karakterizasyonu amaçlanmıştır. İzole edilen 50 adet laktokok suşu arasından 1 adedinin (GYL32) bakteriyosin üreticisi olduğu belirlendi. Bozadan izole edilen bakteriyosin üreticisi GYL32 izolatı fenotipik olarak API sistemi ve genotipik olarak 16S rdna dizi analizi kullanılarak Lactococcus lactis subsp. lactis olarak tanımlandı. Farklı ph, sıcaklık ve enzim uygulamaları sonucu Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin nisin olduğu belirlendi. Spesifik nisin primerleri kullanılarak yapılan PZR çalışması ve dizi analizi sonucu GYL32 suşunda nisin Z üretiminin genetik determinantlarının genomik DNA üzerinde kodlu olduğu tespit edildi. Hücre liziz çalışması sonucu, Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen nisin Z nin Lb. plantarum LMG2003 suşuna karşı bakterisidal etki gösterdiği belirlendi. GYL32 suşunda bakteriyosin üretimi gelişme fazında başladı ve maksimum bakteriyosin üretimi (5120 AU/mL) bu fazının sonunda ölçüldü. Trisin- SDS-PAGE analizi sonucunda; kısmi saflaştırması yapılan nisin Z nin dimer formunda (6.7 kda) bulunduğu tespit edildi. Anahtar Kelimeler: Fermente gıda, Lactococcus lactis, bakteriyosin, PZR, trisin- SDS-PAGE, nisin Z 2011, 94 sayfa iv

7 ABSTRACT M. Sc. Thesis CHARACTERIZATION OF BACTERIOCIN PRODUCED BY LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS GYL32 STRAIN ISOLATED FROM BOZA Gözde KORAL Süleyman Demirel University Graduate School of Applied and Natural Sciences Food Engineering Department Supervisor: Asst. Prof. Dr. Yasin TUNCER The purpose of this study, isolation of bacteriocin producer Lactococcus lactis strains from different fermented foods. The one strain (GYL32) was determined as bacteriocin producer among the isolated 50 lactoccoccal strains. Bacteriocin producer GYL32 strain isolated from Boza was identified as Lactococcus lactis subsp. lactis, phenotypically by API system and genotypically by 16S rdna analysis. Bacteriocin produced by Lc. lactis subsp. lactis GYL32 strain was characterizated as nisin by different ph, enzyme and heat treatments. PCR analysis using spesific nisin primers and sequence analysis results showed that genetic determinants of nisin Z production in GYL32 strain are encoded on genomic DNA. Cell lysis study showed that nisin Z produced by Lc. lactis subsp. lactis GYL32 was determined as acting bactericidal activity against Lb. plantarum LMG2003 strain. Bacteriocin production in GYL32 strain started in exponential phase and maximum bacteriocin production (5120 AU/mL) recorded at the end of the this phase. Tricine- SDS-PAGE analysis showed that partially purified nisin Z was found as dimer form (6.7 kda). Key Words: Fermented food, Lactococcus lactis, bacteriocin, PCR, tricine-sds- PAGE, nisin Z 2011, 94 pages v

8 TEŞEKKÜR Başta bana bu konuda çalışma imkanı sunan ve çalışmamın her aşamasında bilgi, yardım ve önerilerini esirgemeyen, bilimsel çalışma disiplinini öğrenmemde ve akademik gelişimimde büyük emeği geçen Danışman Hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Yasin TUNCER olmak üzere; Çalışmalarımın her aşamasında bilgi ve tecrübesini benimle paylaşan sayın Dr. Banu ÖZDEN TUNCER e; Laboratuar günlerini birlikte geçirdiğim çalışma arkadaşım Nazlı YOĞURTÇU ya; Beni her konuda destekleyen sevgili aileme ve manevi desteğini benden esirgemeyen arkadaşım Alper DEVECİ ye; 2047-YL-09 no lu proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı na; En içten teşekkürlerimi sunarım. Gözde KORAL ISPARTA, 2011 vi

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. Lantibiyotik grubu bakteriyosinlerin yapısında bulunan modifiye amino asitlerin kimyasal yapısı.. 7 Şekil 2.2. Laktokoksin A nın duyarlı hücrelerde por oluşumu ve dirençlilik mekanizması.. 10 Şekil 2.3. Ltnα ve Ltnβ alt ünitelerinin moleküler yapısı Şekil 2.4. Laktisin Q nun antimikrobiyel etki mekanizması.. 18 Şekil 2.5. Laktosiklisin Q nun moleküler yapısı Şekil 2.6. Lc. lactis suşları tarafından üretilen nisin varyantlarının amino asit dizilimlerinin karşılaştırılması Şekil 2.7. Nisin A, Z ve Q nun moleküler yapısı Şekil 2.8. Nisin U nun moleküler yapısı Şekil 2.9. Nisinin translasyon sonrası modifikasyonu 23 Şekil Nisin A nın biyosentezi, regulasyonu ve dirençliliğini kodlayan gen kümesi. 24 Şekil Nisin por oluşum mekanizması.. 25 Şekil 4.1. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun, Lb. plantarum LMG2003 suşuna karşı verdiği inhibisyon zonu.. 54 Şekil 4.2. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen antibakteriyel maddenin proteinaz K uygulaması sonucu kalan aktivitesi.. 55 Şekil 4.3. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen antibakteriyel maddenin α-kemotripsin uygulaması sonucu kalan aktivitesi.. 56 Şekil 4.4. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun genomik DNA örneği.. 59 Şekil 4.5. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun PZR ile çoğaltılan 16S rdna fragmenti.. 61 Şekil 4.6. Bakteriyosin üreticisi Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun plazmid içeriği 62 Şekil 4.7. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunda nisin yapısal geninin genomik ve plazmid DNA kullanılarak PZR amplifikasyonu 67 vii

10 Şekil 4.8. Nisin primerleri ile Lc. lactis subsp. lactis GYL32 nin çoğaltılan gen bölgesi.. 68 Şekil 4.9. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin Lb. plantarum LMG2003 suşunun gelişmesi üzerine etkisi Şekil Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından bakteriyosin üretimi ve kültür yoğunluğundaki değişim. 71 Şekil Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin trisin-sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez profili.. 73 viii

11 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1. Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin sınıflandırılması 6 Çizelge 2.2. Gıda uygulamalarında kullanılan nisin ve nisaplin miktarları.. 26 Çizelge 3.1. Polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan PZR karışımı. 36 Çizelge 4.1. Araştırmada kullanılan laktokok suşlarının izolasyon materyalleri ve izolasyon materyallerinin sağlandığı iller 50 Çizelge 4.2. İndikatör bakterilere karşı zon veren laktokok izolatları ve zon çapları 53 Çizelge 4.3. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun API 50 CH karbonhidrat fermentasyon test sonuçları Çizelge 4.4. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin aktivitesi üzerine farklı ph, enzim ve sıcaklık uygulamalarının etkisi. 65 ix

12 SİMGELER DİZİNİ APS Amonyum Persülfat Da Dalton dk Dakika DNA Deoksiribonukleik Asit EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit FAO Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Örgütü g Gram GRAS İnsan ve Hayvan Tüketiminde Güvenilir kb Kilobaz kda Kilo Dalton LAB Laktik Asit Bakterisi log Logaritma ma Miliamper mg Miligram ml Mililitre mm Milimetre mm Milimolar M Molar N Normal RNA Ribonukleik Asit SDS Sodyum Dodesil Sülfat SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi TEMED Tetrametil Etilen Daimin WHO Dünya Sağlık Örgütü µg Mikrogram µl Mikrolitre µm Mikrometre ψ Membran potansiyeli x

13 1. GİRİŞ Fermentasyon gıda üretimi ve korunmasında kullanılan en ekonomik ve en eski yöntemlerden biridir. Fermentasyon işlemi, taşınacak materyalin hacminin azaltılmasını, gıdanın tekstürel yapısının iyileştirilmesini, sindirilebilirlik ve besin değerinin arttırılmasını, pişirme için gerekli olan enerji miktarının azaltılmasını ve daha güvenli bir ürün üretilmesini sağlar. Laktik asit bakterileri (LAB) grubunda yer alan Lactococcus (laktokoklar) cinsi üyesi Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis ve Lc. lactis subsp. cremoris başta fermente süt ürünleri olmak üzere, değişik tip fermente gıdaların üretiminde starter kültür suşları olarak kullanılmaktadır. Farklı coğrafik bölgelerde bu bakteriler kullanılarak üretilmiş pek çok fermente gıda sevilerek tüketilmektedir. Laktokoklar fermentasyon süreçlerinde ürünün yapısal ve aromatik özelliklerini geliştirmenin yanı sıra ürettikleri asetoin, diasetil, hidrojen peroksit, organik asitler ve bakteriyosinler gibi antimikrobiyel maddeler yardımıyla ürünün raf ömrünün uzatılmasını da sağlarlar. Her geçen gün gelişen modern teknolojinin gıda endüstrisinde kullanılıyor olmasına rağmen, gıdaların korunması sadece gelişmekte olan ülkeler için değil; gelişmiş ülkeler için de hala önemli bir sorun oluşturmaktadır. Gıda bozulmalarından kaynaklanan ekonomik kayıpları azaltarak, gıda işleme maliyetini düşürerek ve gıda üretim ve taşınması sırasında patojen mikroorganizma bulaşmasını önleyerek tüketici beklentilerini karşılayabilecek, tüketime hazır, taze, besin değeri yüksek, vitamince zengin, az işlem görmüş ve minimum düzeyde kimyasal koruyucu içeren gıdaları üretmek gıda endüstrisinin en önemli sorununu oluşturmaktadır. Günümüzde doğal muhafaza yöntemleri kullanılarak güvenilir hale getirilen gıda maddeleri tüketiciler tarafından daha fazla kabul görmektedir. Bu durum alternatif gıda muhafaza yöntemlerinin geliştirilmesi çalışmalarına hız kazandırmıştır. Yukarıda özetlenen sorunların giderilmesinde kullanılacak alternatif gıda koruma yöntemlerinin başında bakteriyosin üreticisi suşların doğrudan ya da dolaylı bir 1

14 şekilde gıda endüstrisinde kullanımı gelmektedir. Bakteriyosinler, insan ve çevre sağlığı üzerinde olumsuz etki içermemelerinin yanı sıra gıda bozulması ya da Salmonella, Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum ve Clostridium perfringens gibi gıda kökenli hastalık etmeni mikroorganizmalara karşı güçlü koruma sağlamaktadır. Lactococcus lactis suşları tarafından üretilen nisin doğal bir antimikrobiyel madde olması, geniş aktivite spektrumuna sahip olması, toksik olmaması ve sindirim enzimleri tarafından kolayca parçalanması nedeniyle gıda sanayinde en çok uygulama alanı bulan ve üzerinde en çok çalışılan bakteriyosin olmuştur. Nisin, 1953 yılından beri Nisaplin ticari adıyla hazır preparat olarak piyasada satılmaktadır. Gıda ve Tarım Örgütü/Dünya Sağlık Örgütü (FAO/WHO) ve Amerika Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onaylı olan nisin 1996 yılından itibaren Avrupa birliği ülkeleri, Çin ve Amerika nın da arasında bulunduğu 50 den fazla ülkede gıda katkısı olarak kullanılmaktadır. Bakteriyosin üreten suşların doğrudan ya da dolaylı bir şekilde gıda endüstrisinde kullanımının artması, bakteriyosin üretme yeteneği yüksek ya da konakçı spektrumu geniş yeni bakteriyosin üreticilerinin tanımlanması ile mümkün olacaktır. Bu nedenle bakteriyosin üreticisi yeni suşların tanımlanması ve üretilen bakteriyosinlerin karakterizasyonu son yıllarda pek çok araştırmanın odak noktası olmuştur. Bu doğrultuda tasarlanan tezde, farklı fermente gıda örneklerinden bakteriyosin üretim yeteneğine sahip Lactococcus lactis suşlarının izolasyonu, tanısı ve üretilen bakteriyosinlerin karakterizasyonu amaçlanmıştır. 2

15 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Laktokokların Taksonomik Özellikleri Nükleik asit hibridizasyonu, fizyolojik testler, karşılaştırmalı serolojik çalışmalar, süperoksit dismutaz enzim varlığının tanımlanması, lipoteikoik asid yapılarındaki benzerlik, lipit, yağ asidi ve menakinon kompozisyonlarının belirlenmesi sonucu 1985 yılında Streptococcus lactis subsp. lactis, Streptococcus lactis subsp. cremoris, Lactobacillus hordniae, Lactobacillus xylosus, Streptococcus garvieae, Streptococcus plantarum ve Streptococcus raffinolactis türleri, Lactococcus cinsi altında sınıflandırılmıştır. Bu yeni sınıflandırmada S. lactis subsp. lactis, S. lactis subsp. cremoris, S. plantarum, S. garvieae ve S. raffinolactis in sadece cins adları değiştirilmiştir. Lb. xylosus ve Lb. hordniae ise sırasıyla Lc. lactis subsp. lactis ve Lc. lactis subsp. hordniae olarak adlandırılmıştır (Schleifer et al., 1985). Bu sınıflandırmadan beş yıl sonra alabalıklardan izole edilen Lactococcus piscium un tanımlanmasıyla Lactococcus cinsi uzun süre beş tür içermiştir (Williams et al., 1990). Yakın zamanda aktif çamur köpüğünden izole edilen Lactococcus chungangensis (Cho et al., 2008) ve son olarak lahanadan izole edilen Lactococcus fujiensis in (Cai et al., 2010) tanımlanmasıyla günümüzde Lactococcus cinsi; Lc. lactis, Lc. raffinolactis, Lc. garvieae, Lc. plantarum, Lc. piscium, Lc. chungangensis ve Lc. fujiensis olmak üzere yedi tür içermektedir. Gram pozitif, katalaz negatif, fakültatif anaerob, endospor oluşturmayan hareketsiz koklar olarak tanımlanan Lactococcus cinsi üyesi bakteriler küresel ve oval şekilli olup, ortalama x µm boyutlarındadır (Schleifer, 1987; Holt et al., 1994). Laktokoklar sıvı besi ortamlarında tek, çift veya kısa zincirler halinde üreme gösterirler. Benzer morfolojik yapı göstermelerinden dolayı streptokok, enterokok ve leukonostok cinslerinden ayrımları zordur. Hücre çiftlerinin temas yönünde uzaması morfolojik tanıda laktobasillerle de karıştırılmalarına yol açmaktadır. Gelişmeleri 3

16 için başta azot kaynakları olmak üzere çok sayıda besin maddesine gereksinim duyarlar. Optimum gelişme sıcaklıkları 30 o C olan laktokoklar, 10 o C nin altında ve 45 o C nin üzerindeki sıcaklıklarda, % 6.5 NaCl varlığında ve ortam ph sının 9.6 olması halinde gelişme gösteremezler. Homofermentatif özellikte olan laktokoklar, şeker katabolizması sonucu ana ürün olarak L(+) laktik asit üretirler (Schleifer, 1987; Holt et al., 1994; Boumerdassi et al., 1997; Samaržija et al., 2001). Lactococcus cinsi üyesi bakteriler, Lancefield serolojik N grubunda yer alırlar. Zayıf α-hemolitik aktivite gösteren bazı Lc. lactis subsp. lactis suşları hariç, laktokoklar hemolitik aktivite göstermemektedir (Schleifer, 1987; Holt et al., 1994; Boumerdassi et al., 1997; Casalta and Montel, 2008). Lactococcus lactis türü; Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. hordinae ve Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis olmak üzere üç alt tür ve bir biyovaryete içermektedir. Lc. lactis subsp. hordinae dışındaki Lc. lactis türü üyesi bakteriler başta fermente süt ürünleri olmak üzere farklı fermente gıdalarda tek başlarına veya Streptococcus ve Lactobacillus gibi diğer laktik asit bakterileriyle beraber starter kültür suşları olarak kullanılmaktadır (Özer, 2007). Lc. lactis subsp. hordinae ise bitkisel habitatını değiştirmemiş bir alt tür olup, laktozu fermente etme yeteneği içermemesinden dolayı süt endüstrisinde starter kültür suşu olarak kullanılmamaktadır (Schleifer, 1987). Lc. lactis subsp. lactis suşları arjinin hidrolizi sonucu amonyak oluşturmaları, maltozu ve ribozu fermente etmeleri, 40 o C inkübasyon sıcaklığında, ph nın 9.2 olması halinde ve % 4 NaCl varlığında gelişebilme özellikleri ile Lc. lactis subsp. cremoris suşlarından belirgin bir şekilde ayrılırlar (Schleifer, 1987; Stiles and Holzapfel, 1997; Axelsson, 1998). Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis suşlarının sitrat metabolizması sonucu, diaestil ve asetoin oluşturma yetenekleri, bu suşları Lc. lactis subsp. lactis suşlarından ayıran tek farklılıktır. Bu suşlarda sitrat metabolizmasının ana enzimi olan sitrat permeaz aktivitesinin 8 kilobaz büyüklükteki bir plazmid tarafından kodlandığı saptanmıştır (Özer, 2007). 4

17 2.2. Bakteriyosinlerin Genel Özellikleri ve Sınıflandırılması Bakteriyosinler farklı bakteri grupları tarafından üretilen, antimikrobiyel aktiviteye sahip, ribozomal olarak sentezlenen, peptitler veya proteinlerdir (Jack et al., 1995; Cotter et al., 2005; Zendo et al., 2010). İlk bakteriyosin 1925 yılında Gratia tarafından tanımlanmıştır. Escherichia coli tarafından üretilen protein yapısındaki bu inhibitör madde kolisin olarak isimlendirilmiştir (Gratia, 1925). Kolisinin bulunmasını takiben 1928 yılında çeşitli laktik streptokokların (laktokokların) bazı laktik asit bakterileri üzerine inhibitör etki gösterdiği belirlenmiştir (Rogers and Whittier, 1928). Bundan beş yıl sonra Whitehead (1933), protein yapısında inhibitör bir madde tanımlamıştır. Bu inhibitör madde 1947 yılında nisin veya grup N inhibitory substance (-in son eki antibiyotik özelliğini belirtmektedir) olarak adlandırılmıştır (Mattick and Hirsch, 1947). Bakteriyosinlerin genel özellikleri, ribozomal olarak sentezlenen protein yapısındaki bileşikler olmaları ve özellikle yakın akraba türlere karşı antibakteriyel aktivite göstermeleridir (Gillor et al., 2005). Benzer aktivite göstermelerinden dolayı bakteriyosinler, birçok kaynakta antibiyotikler ile karıştırılmaktadır. Ancak bakteriyosinleri antibiyotiklerden ayıran bazı farklılıklar bulunmaktadır. Bakteriyosinler ribozomal olarak sentezlenen ürünlerdir, antibiyotikler ise enzimatik işlenme aracılığıyla aktif formlarını kazanırlar. Bakteriyosinler genellikle gelişme fazında üretilen birincil metabolitlerdir, antibiyotikler ise durma fazında üretilen ikincil metabolitlerdir. Her bakteriyosinin kendi dirençlilik proteini vardır. Dirençlilik proteinini kodlayan genler, bakteriyosinin yapısal genleri ile bağlantılıdır. Antibiyotik dirençliliği yöneten genler ise, yapısal antibiyotik genleri ile bağlantılı değildir. Bakteriyosinlerin etki spektrumları antibiyotiklere göre çok daha dardır (Chen and Hoover, 2003; Gillor et al., 2005). Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinler, amino asit dizilimleri, etki mekanizmaları, biyolojik aktiviteleri, ısı toleransları, modifiye aminoasit varlıkları ve salgı mekanizmaları göz önünde bulundurularak dört ana grup altında 5

18 sınıflandırılmıştır (Çizelge 2.1.) (Klaenhammer, 1993; Diep and Nes, 2002; Jeevaratnam et al., 2005; Zendo et al., 2010). Çizelge 2.1. Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin sınıflandırılması Grup I. Lantibiyotikler Ia: Nisin benzeri lantibiyotikler. Katyonik özellik içerirler. Ib: Duramisin benzeri lantibiyotikler. Globüler proteinler olup düşük negatif yük içerirler. Grup II. Lantibiyotik olmayan ısı stabil bakteriyosinler IIa: Antilisteriyal etkili pediosin benzeri bakteriyosinler IIb: İki bileşenli (iki peptitli) bakteriyosinler IIc: Siklik bakteriyosinler IId: Diğer grup II bakteriyosinler Grup III. Yüksek moleküler ağırlığa sahip ısıya duyarlı bakteriyosinler Grup IV. Lipit veya karbonhidrat yan grupları içeren kompleks bakteriyosinler Grup I: lantibiyotikler Lantibiyotikler, lantiyonin (Ala-S-Ala), β-metillantiyonin (Abu-S-Ala), dehidroalanin ve dehidrobütirin gibi nadir bulunan amino asitleri içeren (Şekil 2.1.), ribozomal olarak sentezlenen, ısı stabil, küçük (<5 kda), birden fazla halka yapısı içeren ve membran üzerinde aktivite gösteren peptitlerdir (Cintas et al., 2001; Gillor et al., 2005; Jeevaratnam et al., 2005; de Vuyst and Leroy, 2007; Todorov, 2009). Lantibiyotikler translasyon sonrası modifiye olmuş peptitlerin amino asit kompozisyonu ve etki mekanizmaları esas alınarak iki alt gruba ayrılmışlardır. Grup Ia nisin ve benzerlerini ve grup Ib ise duramisin ve benzerlerini içerir. Grup Ia lantibiyotikler katyonik, lineer ve düzgün olmayan şekillidirler. Bu grup üyesi lantibiyotikler hedef hücre membranlarında porlar oluşturur ve membran potansiyelini bozarak duyarlı bakterileri inhibe etmektedirler. Grup Ia üyesi 6

19 bakteriyosinlerinden bazıları nisin, subtilin, Pep5, epiderminin ve gallidermin dir. Grup Ib lantibiyotikler, yüksüz veya negatif yüklü globular peptitlerdir. Bu grup üyesi bakteriyosinler enzim inhibitörü olarak görev yaparlar. Grup Ib üyesi bakteriyosinlerden bazıları mersasidin ve sinnamisin dir (Gillor et al., 2005; Reunanen, 2007; Todorov, 2009). Şekil 2.1. Lantibiyotik grubu bakteriyosinlerin yapısında bulunan modifiye amino asitlerin kimyasal yapısı (Reunanen, 2007) Günümüzde 30 farklı bakteri tarafından üretilen yaklaşık 50 adet lantibiyotik grubu bakteriyosin tanımlanmıştır (Patton and van der Donk, 2005; Breukink and Kruijff, 2006). Lantibiyotik grubu bakteriyosinlerin üretiminden sorumlu gen kümeleri, plazmidler veya transpozonlar gibi hareketli elemanlar üzerinde veya bakteri kromozomu üzerinde lokalize olmuş olabilir (Gillor et al., 2005). Pek çok lantibiyotik için yapısal genleri içeren gen kümelerinin DNA dizisi belirlenmiştir. Lantibiyotik gen kümeleri çeşitli korunmuş genler içermektedir. Korunmuş bu genlerin translasyon ürünleri olan; öncü protein LanA, öncü proteinin modifikasyonundan sorumlu enzimler LanM veya LanB ve LanC, lider peptidin uzaklaştırılması için gerekli proteaz LanP, modifiye öncü peptidin taşınmasını sağlayan protein LanT, biyosentezi düzenleyen proteinler LanK ve LanR, dirençliliği sağlayan LanI ve LanFEG proteinleri farklı lantibiyotiklerin biyosentezinde benzer aktiviteleri gerçekleştirmektedir (Reunanen, 2007). 7

20 Grup II: lantibiyotik olmayan ısı stabil bakteriyosinler Grup II bakteriyosinler küçük moleküler ağırlığa sahip (<10 kda), ısı stabil, lantiyonin, β-metillantiyonin, dehidroalanin ve dehidrobütirin gibi modifiye olmuş amino asit kalıntıları içermeyen peptitlerden oluşmaktadır. Bu grup üyesi bakteriyosinler, grup IIa, grup IIb, grup IIc ve grup IId olmak üzere dört alt gruba ayrılmıştır (Cintas, 2001; Jeevaratnam et al., 2005; de Vuyst and Leroy, 2007; Todorov, 2009). Grup IIa üyesi bakteriyosinler, Listeria türlerine karşı aktivite gösteren pediosin benzeri bakteriyosinlerdir. Pediosin PA-1 bu grubun en önemli temsilcisidir. Grup IIb bakteriyosinler, iki peptit içerirler. Tam aktivite gösterebilmeleri için bu iki peptide birden ihtiyaçları vardır. Grup IIc bakteriyosinleri siklik bakteriyosinlerdir. Grup IId üyesi bakteriyosinler ise, söz edilen ilk üç grup içerisinde yer almayan diğer grup II üyesi bakteriyosinleri içerir (Jeevaratnam et al., 2005; de Vuyst and Leroy, 2007; Todorov, 2009) Grup III: yüksek moleküler ağırlığa sahip ısıya duyarlı bakteriyosinler Grup III üyesi bakteriyosinler, ısıya duyarlı ve büyük moleküler ağırlığa sahip bakteriyosinlerdir. Bu grubun üyeleri 30 kda ve üzerinde moleküler büyüklüğe sahiptirler. Bu grubun bazı üyeleri Lb. helveticus tarafından üretilen helvetisin J ve helvetisin V-1829 ve Lb. acidophilus tarafından üretilen laktisin B dir (Chen and Hoover, 2003; Jeevaratnam et al., 2005; de Vuyst and Leroy, 2007; Todorov, 2009) Grup IV: lipit veya karbonhidrat yan grupları içeren kompleks bakteriyosinler Grup IV altında sınıflandırılan bakteriyosinlerin biyolojik aktiviteleri için, polipeptit yapısı dışında karbonhidratlar veya lipitler gibi ilave bazı yapılar içermeleri gerekmektedir. Plantarisin S, laktosin 27 ve leukonosin S bu grubun bazı üyeleridir (Ennahar et al., 2000; Nes and Holo, 2000; Jeevaratnam et al., 2005). 8

21 2.3. Laktokoklar Tarafından Üretilen Bakteriyosinler Diplokoksin Lc. lactis subsp. cremoris tarafından üretilen diplokoksin, laktokoklarda tanımlanan ilk protein benzeri inhibitör maddedir. Diplokoksin laktokok suşlarına karşı güçlü bakterisidal etki göstermektedir. Moleküler ağırlığı 5300 Da olan diplokoksin, 51 amino asit kalıntısı içerir. Diplokoksin lantiyonin, β-metillantiyonin, dehidroalanin ve dehidrobütirin gibi nadir bulunan amino asitleri içermez. Tripsin, pronaz ve α- kemotripsin enzimleri diplokoksinin aktivitesini tamamen inhibe etmektedir (Davey and Richardson, 1981). Lc. lactis subsp. cremoris 346 suşunda diplokoksin üretimi ve dirençliliğini determine eden genler 81 kb büyüklükteki konjugatif plazmid üzerinde bulunmaktadır (Davey, 1984) Laktokoksin A Laktokoksin A, bazı Lc. lactis suşları tarafından üretilen dar etki spektrumuna sahip bir bakteriyosindir. Hidrofobik bir peptit olan laktokoksin A 54 amino asit içermektedir. Yapılan genetik analizler sonucu, Lc. lactic subsp. lactis LMG2130 suşunda 55 kb büyüklükteki plazmidin laktokoksin A üretiminden sorumlu olduğu belirlenmiştir (Holo et al., 1991). Laktokoksin A primer etkisini sitoplazmik membran üzerinde göstermektedir. Bu bakteriyosin Lc. lactis hücrelerinde sitoplazmik membranın geçirgenliğini değiştirmektedir. Laktokoksin A ile muamele edilen duyarlı hücrelerde hücre içi iyonların dışarı sızması ve proton itici gücün azalmasını takiben hücre ölümü gerçekleşmektedir (Klaenhammer, 1993). Laktokoksin A nın hedefi tanıması ve hedef yapı üzerinde aktivite gösterebilmesi için özel bir membran reseptörüne gereksinim duymaktadır. Laktokoksin A hücre membranında bulunan mannoz fosfotransferaz (man-pts) sistemi bileşenleri olan IIC ve IID proteinlerini tanıyarak bu proteinlere bağlanmakta ve duyarlı hücrelerde por oluşumuna neden olmaktadır. Üretici hücrelerde laktokoksin A dirençlilik proteini LciA, reseptör proteinler IIC ve IID ile kompleks oluşturarak bakteriyosinin 9

22 bağlanıp por oluşturmasını engellemektedir. LciA proteini sadece laktokoksin A varlığında reseptör proteinlere bağlanmaktadır. Ortamda bakteriyosin olmadığı zaman reseptör proteinler ile interaksiyona girmemektedir (Şekil 2.2.) (Diep et al., 2007). Şekil 2.2. Laktokoksin A nın duyarlı hücrelerde por oluşumu ve dirençlilik mekanizması (Diep et al., 2007) Laktokoksin B Laktokoksin B, Lc. lactis subsp. cremoris 9B4 suşu tarafından üretilen 47 amino asit kalıntısı içeren hidrofobik bir bakteriyosindir. Diplokoksin üretiminden sorumlu genler p9b4 plazmidi üzerinde yer alan ve 1.2 kb büyüklükte olan bir bölge üzerinde yer almaktadır (Nettles and Barefoot, 1993). Laktokoksin B, duyarlı laktokok suşlarının hücre membranında porlar açmaktadır. Duyarlı hücrelerde oluşan porlar, öncelikle proton itici güçte kayba neden olmaktadır. Daha sonra hücre içi iyonların ve amino asitlerin hücre dışına kontrolsüz akışı meydana gelmektedir (Venema et al., 1993). Laktokoksin B, laktokoksin A gibi duyarlı hücrelerin sitoplazma membranında bulunan man-pts sistemi bileşenleri IIC ve IID proteinlerine bağlanarak por oluşumuna neden olmaktadır (Diep et al., 2007). 10

23 Laktokoksin G Laktokoksin G, ilk kez Lc. lactis LMG2081 suşundan izole edilmiş olan grup IIb üyesi bir bakteriyosindir (Nissen-Meyer et al., 1992). Bu bakteriyosin 39 amino asit içeren α ve 35 amino asit içeren β olarak adlandırılan iki alt birim içermektedir (Nes and Holo, 2000). Bu bakteriyosin, ph değişimine karşı yüksek düzeyde direnç göstermektedir (McAuliffe et al., 2001). Laktokoksin G, özellikle Lc. lactis suşlarına karşı inhibitör etki göstermektedir (Nissen-Meyer et al., 1992; Zendo et al., 2006). Laktokoksin G, duyarlı hücrelerde ATP konsantrasyonunu düşürmekte, Na +, K +, Li +, Cs + ve Rb + gibi tek değerli katyonların sızması ile membran potansiyelinin değişimine yol açmakta ve amino asit birikimini engellemektedir (Moll et al., 1996; Zendo et al., 2010) Laktokoksin 972 Laktokoksin 972, Lc. lactis subsp. lactis IPLA 972 suşu tarafından üretilen tek peptitden oluşan bir bakteriyosindir (Martinez et al., 1996). Laktokoksin 972, şimdiye kadar söz edilen bakteriyosinlerden farklı olarak, hidrofobik özellik içermemektedir (Martinez et al., 1999). Laktokoksin 972 ile muamele edilen duyarlı hücrelerde, sitoplazmik içerikte sızma ve DNA/RNA gibi makro moleküllerin sentezinde önemli bir azalma tanımlanmamıştır (González et al., 1996, Martinez et al., 1996, Martinez et al., 1999). Laktokoksin 972, lipit II molekülüne bağlanarak duyarlı hücre membranlarında por oluşumuna neden olduğu belirlenen ilk lantibiyotik grubuna dahil olmayan bakteriyosindir (Martinez et al., 2008) Laktokoksin MN Laktokoksin MN, laktokoksin M ve laktokoksin N alt ünitelerinden oluşan grup IIb üyesi bir bakteriyosindir. Laktokoksin M alt birimi 48 amino asit, laktokoksin N alt birimi ise 47 amino asit içermektedir. Lc. lactis subsp. cremoris 9B4 suşunda laktokoksin MN üretimi p9b4 plazmidi üzerinde yer alan 1.8 kb büyüklükte olan bölge tarafından kodlanmaktadır (van Belkum et al., 1991; Nettles and Barefoot, 11

24 1993; Nes and Holo, 2000). Laktokoksin M alt ünitesi 4325 Da ve laktokoksin N alt ünitesi ise 4377 Da moleküler ağırlığa sahiptir (Zendo et al., 2010) Laktokoksin MMFII Tunus ta üretilen geleneksel bir fermente süt ürününden izole edilen Lc. lactis subsp. lactis MMFII suşu tarafından üretilen laktokoksin MMFII, proteinaz K, tripsin ve papain enzimleri ile muamele edildiğinde aktivitesini tamamen kaybetmektedir. Bu bakteriyosin glukoamilaz, lipaz, α-amilaz ve lizozim enzimlerinden ise etkilenmemektedir. Laktokoksin MMFII ısı uygulamasına duyarlıdır. 80 C de ve 100 C de 30 dakika ısı uygulaması sonucu, sırasıyla % 42 ve % 75 oranında aktivite kaybına uğramaktadır. Bakteriyosin ph arasında tam aktivite gösterirken, daha düşük ve yüksek ph larda aktivitede önemli oranda azalma olmaktadır. 37 amino asit içeren laktokoksin MMFII nin moleküler ağırlığı 4143 Da dur. N-uç bölgesinde YGNGV konsensüs serisi içermesi ve Listeria ya karşı aktivite göstermesinden dolayı, laktokoksin MMFII IIa alt grubu bakteriyosinlere dahil edilmiştir (Ferchichi et al., 2001) Laktokoksin MMT24 Laktokoksin MMT24, Tunus ta üretilen geleneksel bir peynir olan Rigouta dan izole edilen Lc. lactis subsp. lactis MMT24 suşu tarafından üretilmektedir. Dar bir inhibitör spektrumuna sahip olan laktokoksin MMT24 genellikle yakın akraba türler üzerine bakterisidal etki göstermektedir. Grup IIb üyesi bir bakteriyosin olan laktokoksin MMT24, pepα ve pepβ olmak üzere iki alt üniteden oluşmaktadır. Bakteriyosinin tam antibakteriyel aktivite gösterebilmesi için her iki alt protein ünitesine de ihtiyaç duymaktadır. Saflaştırılmış pepα alt ünitesi 3765 Da ve pepβ alt ünitesi ise 3255 Da moleküler büyüklüğe sahiptir. Laktokoksin MMT24 ün inhibitör etkisi tripsin, proteinaz K ve pronaz E ile tamamen kaybolmaktadır. Laktokoksin MMT24 ün, ph arasında aktivitesinde bir değişim olmamaktadır. Bu bakteriyosin 65 ºC de 30 dakika ve 100 ºC de 15 dakika ısı uygulamasına, liyofilizasyona ve -20 ºC de 6 ay depolanmaya karşı dirençlidir. Laktokoksin 12

25 MMT24 duyarlı hücrelerde K + iyonlarının sızmasına ve dolayısıyla membran potansiyelinin değişmesine neden olmaktadır (Ghrairi et al., 2005) Laktokoksin Q Laktokoksin Q mısırdan izole edilen Lc. lactis subsp. lactis QU 4 suşu tarafından üretilen iki bileşenli bir bakteriyosindir. Laktokoksin Q sadece Lc. lactis suşları üzerine inhibitör etki göstermektedir. Bakteriyosin α ve β olarak adlandırılan iki alt birim içermektedir. Biyokimyasal analizler sonucu α alt biriminin 39 amino asitten (4260 Da) ve β alt biriminin ise 35 amino asitten (4018 Da) oluştuğu belirlenmiştir. Laktokoksin Q, laktokoksin G ile yüksek oranda yapısal benzerlik göstermektedir. İki bakteriyosinin α ve β alt birimleri arasında sırasıyla 6 ve 3 amino asit farkı bulunmaktadır (Zendo et al., 2006) Laktokoksin BZ Boza dan izole edilen Lc. lactis subsp. lactis BZ suşunda tanımlanan laktokoksin BZ çeşitli Gram pozitif ve Gram negatif gıda patojenlerine karşı geniş etki spektrumuna sahiptir. Moleküler büyüklüğü 5500 Da olan laktokoksin BZ; lipaz, katalaz, α-amilaz ve pankreatin enzimleri ile muamele edildiğinde aktivitesini korumaktadır. Ancak bu bakteriyosinin aktivitesi papain ve pepsin uygulaması ile tamamen tripsin uygulamasıyla ise kısmen kaybolmaktadır. 90 ºC de 30 dakika ısı uygulamasına dirençli olan bakteriyosin 110 ve 121 ºC de 15 dakika ısı uygulamaları sonucunda ise aktivitesini tamamen kaybetmektedir. Laktokoksin BZ asidik ve nötral ph ( ) da aktivitesini korumakta ancak, bazik ph ( ) da bakteriyosin aktivitesi önemli oranda azalmaktadır. Listeria monocytogenes e karşı bakterisidal etki gösteren laktokoksin BZ üretimi logaritmik fazda başlamakta ve bakteriyosin üretimi erken durma fazında maksimum düzeye ulaşmaktadır (Şahingil et al., 2010). 13

26 Laktoztrepsinler Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris ve Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis suşları tarafından üretilen laktoztrepsinlerin Las 1, Las 2, Las 3, Las 4 ve Las 5 olmak üzere tanımlanmış beş türü bulunmaktadır. Laktoztrepsinler sadece asidik ph larda aktivite göstermektedirler (Kozak et al., 1977). Proteolitik enzimlere karşı duyarlı olan laktoztrepsinler, 100 o C de 10 dakika sıcaklık uygulamasına dirençlidirler. Sadece laktoztrepsin o C de 10 dakika ısı uygulaması sonucu aktivitesini kaybetmektedir (Bardowski et al., 1979). Dar konakçı etkinliğine sahip olan laktoztrepsinler; Lactococcus, Lactobacillus ve Leuconostoc cinsi üyesi bazı bakterilere karşı inhibitör etki göstermektedir. Laktoztrepsinler duyarlı hücrelerde hücre duvarı, DNA, RNA ve protein sentezi üzerine etki göstermektedir. Las 5 kullanılarak yürütülen çalışmalarda, bu bakteriyosinin duyarlı bakterilerde protein, DNA ve RNA gibi makromoleküllerin sentezinde kayda değer bir farklılık yaratmasının dışında ATP, K +, Ca +2 ve Mg +2 iyonlarının hücre dışına sızmasına da neden olduğu belirlenmiştir (Kozak et al., 1978; Zajdel et al., 1985; Klaenhammer 1993) Laktisin 3147 Laktisin 3147 ilk kez, İrlanda da Kefir danesinden izole edilen Lc. lactis subsp. lactis DPC3147 suşunda tanımlanmıştır. Gram pozitif bakterilere karşı geniş etki spektrumuna sahip olan laktisin 3147 Acetobacter, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Listeria, Pediococcus, Pneumococcus, Propionibacterium, Staphylococcus ve Streptococcus suşlarına karşı antibakteriyel aktivite göstermektedir (Ryan et al., 1996; Ryan et al., 1999; O Sullivan et al., 2003; Martín et al., 2004). İki bileşenli bir bakteriyosin olan laktisin 3147 nin tam antibakteriyel aktivitesini gösterebilmesi için Ltnα ve Ltnβ (Şekil 2.3.) alt ünitelerinin sinerjik etkisine ihtiyaç duymaktadır (McAuliffe et al., 1998). 14

27 Şekil 2.3. Ltnα ve Ltnβ alt ünitelerinin moleküler yapısı (Piper et al., 2009) Laktisin 3147, hedef hücrelerin sitoplazmik membranlarında iyon spesifik porlar oluşturarak, potasyum ve fosfat iyonlarının sızmasına neden olmaktadır. Ancak ATP gibi büyük moleküller oluşan bu porlardan sızmamaktadır. Açılan porlardan iyonların sızması sonucu membran potansiyeli ( ψ) zarar görmekte fakat ph değişimi ( ph) olmamaktadır. ph nın değişmemesi oluşan porlardan protonların sızmadığını ve porların seçici geçirgen davrandığını düşündürmüştür (McAuliffe et al., 1999). Translasyon sonrası modifiye edilen Ltnα ve Ltnβ alt üniteleri nadir bulunan lantiyonin (Ala-S-Ala) ve β-metillantiyonin (Abu-S-Ala) amino asitlerini yüksek oranda içermektedir (McAuliffe et al., 2000). Ltnα ve Ltnβ alt ünitelerinin moleküler ağırlıkları sırasıyla 3306 ve 2847 Da olarak belirlenmiştir (Morgan et al., 2005). Lc. lactis subsp. lactis C01 suşunda laktisin 3147 üretim ve dirençlilik genlerinin genetik determinantları, moleküler büyüklüğü 60.2 kb olan konjugatif özellikteki pmrc01 plazmidi üzerinde bulunmaktadır (Dougherty et al., 1998). Farklı organize olmuş iki ayrı gen kümesinde toplam 10 gen tarafından determine edilen laktisin 15

28 3147 üretimi ve dirençliliği pmrc01 plazmidinde 12.6 kb büyüklükteki bölge üzerinde bulunmaktadır (McAuliffe et al., 2000). Bu bakteriyosin gıda ve biyomedikal alanlarında uygulanabilme potansiyeline sahiptir. Laktisin 3147 üreticisi Lc. lactis subsp. lactis DPC3147 suşunun, Cheddar peynirlerinde olgunlaşma sırasında starter olmayan LAB sayısını azaltarak peynir kalitesini olumlu yönde etkilediği belirlenmiştir (Ross et al., 1999). Laktisin 3147 üreticisi transkonjugant Lc. lactis subsp. lactis DPC4275 suşu kullanılarak üretilen Cottage peynirinde, L. monocytogenes sayısının önemli seviyede düştüğü buna karşılık kontrol peynirinde ise L. monocytogenes sayısının (10 4 kob/g) değişmeden kaldığı belirlenmiştir. Ayrıca laktisin 3147 nin sağım makinelerinde kullanılan emzik contalar aracılığıyla sığırlara bulaşan mastitis etmeni mikroorganizmaların (streptokoklar ve stafilokoklar) kontaminasyon sıklığını azalttığı görülmüştür (Ryan et al., 1999; O Sullivan et al., 2003a; Gillor et al., 2005; Klostermann et al., 2010) Laktisin 481 Lc. lactis in bazı suşları tarafından üretilen laktisin 481 tek peptit zincirinden oluşan bir lantibiyotiktir. Grup Ia üyesi bir bakteriyosin olan laktisin 481 duyarlı hücrelerin sitoplazma mebranında porlar oluşturarak antibakteriyel aktivite göstermektedir (O Sullivan et al., 2003b; Güzel-Seydim and Ekinci, 2007). Laktisin 481 orta düzeyde bir inhibisyon spektrumuna sahiptir. Özellikle Lactococcus, Lactobacillus ve Leuconostoc cinsi üyesi bakteriler başta olmak üzere Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidipropionici, Streptococcus thermophilus, Staphylococcus carnosus ve Emmental peynirlerinde geç şişmeden sorumlu Clostridium tyrobutyricum türlerine karşı bakterisidal etki göstermektedir (Mackay et al., 1996; O Sullivan et al., 2002). Laktisin 481 in üretimi, dirençliliği ve transportundan sorumlu gen kümesi (lctamtfeg) plazmidler üzerinde kodludur (O Sullivan et al., 2003b; Tükel and Akçelik, 2004). Son yıllarda laktisin 481 üreticisi suşlar peynir olgunlaşmasını hızlandırıcı ajanlar olarak kullanılmaktadır. Laktisin 481 in peynir üretiminde kullanılan starter kültürleri lize etmesi sonucu yardımcı enzimler peynir matriksine 16

29 salınmakta ve bunun neticesinde de peynirin olgunlaşması hızlanmaktadır (O Sullivan et al., 2002; O Sullivan et al., 2003b; Güzel-Seydim and Ekinci, 2007) Laktisin FS92 Lc. lactis subsp. lactis FS92 tarafından üretilen laktisin FS92, Bacillus, Clostridium ve Listeria ya karşı inhibitör etki gösteren geniş aktivite spektrumlu bakteriyosindir. Laktisin FS92, 100 o C de 20 dakika veya 121 o C de 15 dakika ısı uygulamasına karşı dirençlidir. Bu bakteriyosin α-kemotripsin, pepsin, pronaz E ve proteinaz K enzimlerine karşı duyarlıdır. Laktisin FS92 polipeptidi 32 amino asit içermektedir. Saflaştırılmış laktisin FS92 nin Trisin-SDS-PAGE analizi sonucu moleküler büyüklüğü yaklaşık 3500 Da olarak tanımlanmıştır (Mao et al., 2001) Laktisin Z Lc. lactis QU 14 suşu tarafından üretilen laktisin Z başta Bacillus ve Lactobacillus cinsi üyesi bakteriler olmak üzere çeşitli Gram pozitif bakterilere karşı inhibitör etkiye sahiptir. 53 amino asit kalıntısı içeren bakteriyosinin moleküler ağırlığı 5969 Da dur. Laktisin Z nin amino asit dizisi Lc. lactis QU 5 suşu tarafından üretilen laktisin Q ile % 94 gibi yüksek oranda benzerlik göstermektedir. Laktisin Z, erken ve geç logaritmik faza kadar geliştirilen Bacillus coagulans JCM 2257 T kültürü üzerine litik etki göstermekte ancak durma fazına kadar geliştirilen kültür üzerine ise litik etki göstermemektedir. Geniş ph aralığında aktivitesini koruyan laktisin Z diğer laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin aksine asidik ph (2.0 ve 4.0) da aktivitesinde azalma olurken alkali ph (8.0 ve 10.0) da aktivitesini korumaktadır (Iwatani et al., 2007) Laktisin Q Laktisin Q grup IId üyesi, katyonik, 53 amino asit içeren, tek pepitten oluşan ve Gram pozitif bakterilere karşı geniş etki spektrumuna sahip olan bir bakteriyosindir (Fujita et al., 2007). Laktisin Q nun antimikrobiyel özellikleri nisin ile benzerlik 17

30 göstermektedir. Nisin A ve laktisin 3147 nin aksine laktisin Q duyarlı hücre membranlarında por oluşturmak için lipit II molekülüne ihtiyaç duymamaktadır (Yoneyama et al., 2009a; Yoneyama et al., 2010). Laktik asit bakterilerince üretilen diğer pek çok bakteriyosinin aksine laktisin Q duyarlı hücre membranlarında büyük por oluşumuna neden olmaktadır (Şekil 2.4.). Laktisin Q tarafından oluşturulan porların ortalama büyüklüğü nm çapındadır. Oluşan bu porlardan iyonlar ve ATP nin yanı sıra hücre için yapısal öneme sahip olan proteinlerde sızmaktadır (Yoneyama et al., 2009b; Zendo et al., 2010). Şekil 2.4. Laktisin Q nun antimikrobiyel etki mekanizması. Laktisin Q nun hücre membranına bağlanması ve por oluşumu (a), açılan nm çapındaki porlardan iyonların, ATP nin ve küçük proteinlerin sızması (b), peptit translokasyonu ve lipit flip-flop hareketi (lipitlerin membranda yer değiştirmesi) (c) (Zendo et al., 2010) Laktosiklisin Q Lactococcus spp. QU12 suşu tarafından üretilen laktosiklisin Q, laktokoklarda tanımlanan ilk siklik bakteriyosindir (Şekil 2.5.). 61 amino asit kalıntısı içeren 18

31 bakteriyosinin moleküler ağırlığı 6063 Da dur. Gram pozitif bakterilere karşı geniş etki spektrumuna sahip olan laktosiklisin Q özellikle Bacillus, Lactococcus ve Enterococcus cinsi üyesi bakterilere karşı güçlü inhibitör etki göstermektedir. Laktosiklisin Q pepsin ve proteinaz K uygulaması sonucu aktivitesini tamamen kaybetmektedir (Sawa et al., 2009). Şekil 2.5. Laktosiklisin Q nun moleküler yapısı (Sawa et al., 2009) Nisin Nisin, Lc. lactis suşlarında tanımlanan ilk bakteriyosindir. İlk kez 1928 yılında İngiltere de Rogers ve Whitter in çeşitli laktik streptokokların bazı laktik asit bakterilerini inhibe ettiğini belirlemeleriyle keşfedilmiştir. Ancak bu inhibitör maddenin tanımlanması ve nisin isminin verilmesi 1944 yılında Mattick ve Hirsch tarafından yapılmıştır. Nisin 1969 yılında FAO/WHO gıda katkı maddeleri uzman komitesi tarafından güvenli doğal bir gıda katkısı olarak kabul edilmiştir (FAO/WHO, 1969) yılında Avrupa Ekonomik Topluluğu (European Economic Community, EEC) tarafından gıda katkı maddeleri listesine alınmış ve E234 kodu verilmiştir. Amerika Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından 1988 yılında nisin, GRAS (insan ve hayvan tüketiminde güvenilir) statüsünde kabul edilmiştir. Günümüzde pek çok lantibiyotik grubu bakteriyosin tanımlanmış olmasına rağmen, gıda katkısı olarak kullanımına izin verilen tek lantibiyotik grubu üyesi bakteriyosin nisindir. Nisin 1996 yılından itibaren Avrupa Birliği ülkeleri, Çin ve Amerika nın da arasında bulunduğu 50 den fazla ülkede gıda katkısı olarak kullanılmaktadır (Reunanen, 2007). 19

32 Nisinin moleküler ağırlığı yaklaşık 3350 Da dur. Üretim ortamlarında dimer (6700 Da) veya tetramer (13400 Da) halinde bulunabilmektedir (Liu and Hansen, 1990). Isıl işleme dayanıklı (121 ºC de 15 dakika) olan nisin, α-kemotripsin ve proteinaz K uygulamalarına karşı ise duyarlıdır (De Vuyst and Vandamme, 1994). Geniş ph ( ) aralığında aktivite gösterebilen nisin molekülünün çözünürlüğü, stabilitesi ve biyolojik aktivitesi ortam ph sına göre değişmektedir. Asidik ortamlarda nisinin çözünürlüğü artmakta ve bu nedenle inhibisyon etkinliği yükselmektedir. Nisin molekülünün çözünürlüğü ph 2 de 57 mg/ml, ph 6 da 1.5 mg/ml ve ph 8.5 de ise 0.25 mg/ml dır (Liu and Hansen, 1990). Bugüne kadar nisinin; nisin A (Gross and Morell, 1971), nisin Z (Mulders et al., 1991), nisin Q (Zendo et al., 2003), nisin U (Wirawan et al., 2006) ve nisin F (de Kwaadsteniet et al., 2008) olmak üzere beş doğal varyantı tanımlanmıştır. Streptococcus uberis tarafından üretilen nisin U dışında tüm nisin varyantları Lc. lactis suşları tarafından üretilmektedir. Nisin varyantları bir birinden amino asit dizilimlerindeki farklılıklar esas alınarak ayrılmaktadır (Şekil 2.6.). Şekil 2.6. Lc. lactis suşları tarafından üretilen nisin varyantlarının amino asit dizilimlerinin karşılaştırılması (de Kwaadsteniet et al., 2008) Nisin A, Z ve Q 34 amino asitten oluşmaktadır (Şekil 2.7.). Peptit zincirinde yer alan amino asitlerden 8 tanesi nadir bulunan amino asitlerdir. Bu moleküllerin hepsi 1 lantiyonin, 4 β-metillantiyonin, 2 dehidroalanin ve 1 dehidrobütirin amino asiti 20

33 içermektedir. Nisinin yapısında bulunan lantiyonin ve β-metillantiyonin amino asitleri A, B, C, D ve E olarak isimlendirilen 5 adet halka yapıyı oluştururlar. Lc. lactis suşları tarafından üretilen nisin türlerinin birincil yapıları incelendiğinde aminoasit dizilimlerinin farklılığı göze çarpmaktadır. Nisin A da 27. pozisyonda histidin amino asiti bulunurken, nisin Z, Q ve F de aynı pozisyonda asparajin amino asiti bulunmaktadır. Nisin Q da 15. pozisyonda valin amino asiti varken nisin Z, A ve F de alanin amino asiti bulunmaktadır. Nisin Q nun 21. pozisyonunda lösin amino asiti bulunurken nisin A, Z ve F de metiyonin amino asiti bulunmaktadır. Nisin A ve nisin Z nin 30. pozisyonunda izolösin amino asiti bulunurken nisin Q ve nisin F de aynı pozisyonda valin amino asiti yer almaktadır (Gross and Morell, 1971; Mulders et al., 1991; Zendo et al., 2003; de Kwaadsteniet et al., 2008). Şekil 2.7. Nisin A, Z ve Q nun moleküler yapısı. A-E: lantiyonin köprüleri, Dha: dehidroalanin; Dhb: dehidrobütirin; Ala-S-Ala: lantiyonin; Abu-S-Ala: β- metillantiyonin (Reunanen, 2007) 21

34 Nisin U nun yapısı diğer nisin varyantlarından farklıdır (Şekil 2.8.). 31 aminoasit içeren nisin U 1 lantiyonin, 4 β-metillantiyonin, 1 dehidroalanin ve 2 dehidrobütirin amino asiti içermektedir (Wirawan et al., 2006). Şekil 2.8. Nisin U nun moleküler yapısı. A-E: lantiyonin köprüleri, Dha: dehidroalanin; Dhb: dehidrobütirin; Ala-S-Ala: lantiyonin; Abu-S-Ala: β- metillantiyonin (Reunanen, 2007) Nisin biyosentezi eksponensiyel gelişme fazında meydana gelmektedir. Hücreler durma fazına girdiği zaman ise, nisin üretimi de tamamen durmaktadır (van der Meer et al., 1993; Kim et al., 1997; Cheigh et al., 2002; de Arauz et al., 2009). Nisin üretimi, olgunlaşması, dirençliliği ve regülasyonu için gerekli olan genler büyük konjugatif transpozonlar (~70 kb) üzerinde kodludur. Değişik çalışmalarda, sakkaroz fermentasyon yeteneği ile nisin üretimi özelliklerini kodlayan gen kümesinin (nisa/z/q BTCIPRKFEG) yakın ilişkili olduğu belirlenmiştir. Tn5276 (Rauch and de Vos, 1992), Tn5301 (Dodd et al., 1990), Tn5307 (Buchman et al., 1988), Tn5481 (Immonen et al., 1998) transpozonları üzerinde nisin üretiminden sorumlu genlerin yanı sıra sakkaroz fermentasyon yeteneğinin genetik determinantları da bulunmaktadır. Nisin biyosentezinden sorumlu gen kümesi nisa/z/qbtciprk, nisi, nisrk ve nisfeg olmak üzere 4 operon içermektedir (Qiao et al., 1996; Ra et al., 1996; Li and O Sullivan 2006; Lubelski et al., 2008). Nisin gen kümesinde bulunan NisA/Z/Q genleri 57 amino asitlik nisin öncü peptidinin sentezinden, nisb geni dehidrasyondan, nist geni öncü peptidin taşınmasından, nisc geni halka oluşum reaksiyonlarından, nisp geni 23 amino asitlik lider peptidin uzaklaştırılması için gerekli olan serin proteazın sentezlenmesinden (Şekil 2.9.), nisrk genleri 22

35 düzenlemeden, nisi (lipoproteini kodlar) ve nisfeg (ABC sınıfı taşıyıcı proteinleri kodlar) genleri dirençlilik sisteminden sorumludurlar (Engelke et al., 1994; Reunanen, 2007). Şekil 2.9. Nisinin translasyon sonrası modifikasyonu (Breukink and de Kruijff, 2006) Nisin biyosentezi nisr ve nisk genleri tarafından regüle edilmektedir. Hücre dışında olgunlaşmış nisin birikiminin kritik seviyeye ulaşmasıyla, hücre membranına bağlı histidin sensör kinaz olan NisK proteininde histidin fosforilize edilerek aktif hale geçer (van der Meer et al., 1993; Engelke et al., 1994; Kuipers et al., 1995; Lubelski et al., 2008). Daha sonra fosfat NisR proteinine transfer edilir ve hücre içi yanıtı düzenleyici NisR proteini, nisa/z/q/fbtcip ve nisfeg genlerinin 23

36 transkripsiyonunun başlamasını sağlar (Şekil 2.10.) (Kuipers et al., 1995; de Ruyter et al., 1996; Qiao et al., 1996; Lubelski et al., 2008). Şekil Nisin A nın biyosentezi, regulasyonu ve dirençliliğini kodlayan gen kümesi (Zendo et al., 2010) Nisin Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Micrococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Listeria ve Mycobacterium türlerinin dahil olduğu Gram pozitif bakterilere karşı bakterisidal etki göstermektedir (Sahl et al., 1995). Nisinin hedef hücreler üzerinde bakterisidal etki gösterebilmesi için başlangıç reseptörlerine ihtiyaç duymaktadır. Nisin, membrana bağlı hücre duvarı öncüsü lipit II molekülüne bağlanarak duyarlı hücre membranlarında por oluşumuna neden olmaktadır (Breukink et al., 1999). Nisin porlarının çapı yaklaşık nm büyüklüğündedir. Açılan bu porlar nedeniyle membran geçirgenliği artmakta ve porlardan küçük iyonlar ve ATP hücre dışına sızmaktadır (Wiedemann et al., 2004). Yapılan çeşitli araştırmalarda, nisinin duyarlı hücrelere bağlanması ve por oluşturması için, bakteriyosinin N-uç bölgesinin yanında, C-uç bölgesinin de negatif yüklü membran yüzeyi ile etkileşiminin gerekli olduğu belirlenmiştir (Demel et al., 1996; Breukink et al., 1997; van Kraaij et al., 1998; Breukink et al., 2003; Hsu et al., 2004). Duyarlı hücrelerde por oluşumu için 8 adet nisin ve 4 adet lipit II molekülüne gereksinim vardır (Şekil 2.11.) (Hasper et al., 2004). 24

37 Şekil Nisin por oluşum mekanizması. Nisinin sitoplazma membranına ulaşması (a), nisinin N- uç bölgesindeki iki halkası (A ve B) aracılığı ile lipit II molekülüne bağlanması (b), nisin-lipit II por oluşumu (c), nisin-lipit II kompleksinin üstten görünümü (Breukink and de Kruijff, 2006) Nisin Gram pozitif bakterilerin vejatatif formları yanında Clostridium ve Bacillus cinsi üyesi bakteriler tarafından üretilen sporlara karşı da inhibitör etki göstermektedir. Nisinin bakteriyel sporlara karşı aktivitesi protein kalıntılarındaki sülfidril gruplarına bağlanarak olmaktadır (Morris et al., 1984). Bakteri sporları ısıl işlem uygulamasından sonra nisine çok daha duyarlı hale gelmektedir. Bu durum ısıl işlem görmüş gıdalarda nisin kullanımı açısından önemli bir faktördür. 121 o C de 3 dakika ısıl işleme maruz bırakılmış Clostridium sporları ısıl işlem uygulanmamış sporlara oranla nisine 10 kat daha hassas hale gelmektedir (de Arauz et al., 2009). Normalde, Gram negatif bakteriler hücre duvarında yer alan lipopolisakkarit (LPS) kompozisyonundan dolayı nisine karşı dirençlidir. LPS nisine karşı bariyer görevi görmekte ve nisinin stoplazma mebranına ulaşmasını engellemektedir. Bu tabaka sadece 600 Da ve altındaki moleküler büyüklüğe sahip olan maddelerin geçişine izin vermektedir. Oysaki laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin birçoğunun moleküler ağırlığı çok daha büyüktür. Diğer yandan EDTA gibi çelat oluşturucu ajanlar LPS tabakasında bulunan magnezyum iyonlarını bağlayarak bu tabakanın stabilitesini bozmaktadır. Bundan dolayı nisin LPS katmanından geçmekte 25

38 ve sitoplazma membranında nisin porlarını oluşturabilmektedir (Chung and Hancok 2000; Millette et al., 2004; de Lima Grisi and Lira, 2005) Nisinin gıdalarda kullanımı Nisin doğal bir antimikrobiyel madde olması, toksik olmaması, sindirim enzimleri tarafından kolayca parçalanması ve üretici bakteri Lactococcus lactis in GRAS statüsünde bir mikroorganizma olması nedeniyle gıda sanayinde en çok uygulama alanı bulan ve üzerinde en çok çalışılan bakteriyosindir. Nisin, 1953 yılından beri Nisaplin (Applin & Barret Ltd., UK) ticari adıyla hazır preparat olarak piyasada satılmaktadır. Nisaplin yaklaşık olarak % 2.5 oranında nisin içermektedir (Delves- Broughton, 2005). Nisin ve Nisaplin in uygulama alanları ve miktarları Çizelge 2.2. de özetlenmiştir. Çizelge 2.2. Gıda uygulamalarında kullanılan nisin ve nisaplin miktarları (Delves- Broughton, 2005) Gıda Uygulamaları Hedef organizmalar Nisin miktarı (mg/kg mg/l) Nisaplin miktarı (mg/l) İşlem görmüş peynirler Clostridium spp Bacillus spp. Pastörize süt ve Clostridium spp Süt ürünleri Bacillus spp. Pastörize çorbalar B. cereus C. pasteurianum Fıstık B. cereus Konserve gıdalar C. botulinum (yüksek asitli) C. thermosaccharolyticum Pişirilmiş sosisler Laktik asit bakterileri Brohothrix thermosphacta Listeria monocytogenes Dip soslar Laktik asit bakterileri Salata sosları Laktik asit bakterileri Bira Pediococcus spp. Lactobacillus spp

39 Nisin, özellikle peynir, sıvı yumurta ürünleri, düşük asitli konserve gıdalar, çeşitli pastörize süt ürünleri ve salata soslarının mikrobiyel kontaminantlardan korunması amacı ile 50 den fazla ülkede kullanılmaktadır. Peynirlerde nisin kullanımının temel amacı; peynir üretimi ve olgunlaşması sırasında ciddi problemlere neden olan L. monocytogenes kontaminasyonlarından korunmakdır (Delves-Broughton, 1996). Peynir üretiminde karşılaşılan bir diğer önemli sorun Clostridium cinsi üyesi bakterilerden kaynaklanan bütirik asit fermentasyonudur. Nisin özellikle C. tyrobutiricum sporlarının gelişimini engellemek amacıyla pastörize peynir üretiminde kullanılmaktadır (Schillinger et al., 1996). Salata sosları, bira, şarap, elma suyu gibi ısıl işlem uygulanamayan gıdalarda nisin kullanılarak istenmeyen LAB lerinin gelişimine engellenmektedir. Bunun dışında mayalar nisine karşı dirençli mikroorganizmalar olmalarına karşın alkol fermentasyonu sırasında nisin eklendiğinde aktivite gösterebilmektedir (Delves-Broughton, 2005). Nisin medikal uygulamalarda da kullanılmaktadır. Nisinin Helicobacter pylori nin gelişmesini ve kolonizasyonunu engelleyerek ülseri tedavi edici özelliğe sahip olduğu belirlenmiştir (Gillor et al., 2005). Ayrıca, sığır mastitis tedavisinde nisin, mastitis etmeni Streptococcus ve Staphylococcus türlerine karşı güçlü bakterisidal etki göstermektedir (Sears et al., 1995; Cao et al., 2007; Wu et al., 2007). Bazı gıda katkı maddelerinin nisine karşı antagonistik etki gösterdiği belirlenmiştir. Sodyum metabisülfit (antioksidan, ağartıcı ve antimikrobiyel) ve titanyum dioksit (beyazlatıcı) gibi gıda katkıları nisinin antimikrobiyel etkisini düşürmektedir (Delves-Broughton et al., 1996). Nisinin amfipatik özellikte olması nedeniyle bazı gıda maddelerinde kullanımı sınırlıdır. Nisinin özellikle yağlar ile interaksiyona girmesinden dolayı antimikrobiyel aktivitesi azalmaktadır. Yüksek oranda yağ içeren etlerde nisin, fosfolipitler ile güçlü bir etkileşime girmekte ve bu durum nisinin antimikrobiyel aktivitesini sınırlamaktadır (Deegan et al., 2006; Taylor et al., 2007). Son yıllarda mikroorganizmaların inaktivasyonunda, bakteriyosinler ile birlikte farklı engel parametrilerinin beraber oluşturduğu sinerjik etkiden yararlanma eğilimi giderek artmaktadır. Osmotik şok, düşük ph, deterjan ve çelat ajanlarının varlığı, ısıl işlem içermeyen yüksek hidrostatik basınç ve dalgalı elektrik alan gibi farklı engel 27

40 parametreleri ile kombine edilen nisin uygulamaları sonucu bakteriyel inaktivasyon seviyesi artmaktadır. Escherichia coli ve Salmonella Typhimurium gibi nisine dirençli Gram negatif bakteriler bu proseslerin ardından letal değerin altında hasara uğramalarından dolayı duyarlı hale gelmektedirler (Jeevaratnam et al., 2005; de Vuyst and Leroy, 2007; Reunanen, 2007; Pathanibul et al., 2009). 28

41 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal Fermente gıda örnekleri Yüksek lisans tez çalışması kapsamında Antalya, Isparta ve Tekirdağ illerinden temin edilen geleneksel olarak üretilmiş Boza (5 adet), Beyaz Peynir (5 adet), Tulum Peyniri (5 adet), Kefir (5 adet) ve Tarhana (5 adet) örnekleri kullanılmıştır Mikroorganizmalar Araştırma kapsamında Türkiye nin değişik illerinden sağlanan Boza, Beyaz Peynir, Tulum Peyniri ve Kefir örneklerinden izole edilen 50 adet muhtemel laktokok izolatı kullanılmıştır. Ayrıca, laktokok izolatlarının antibakteriyel aktivitelerinin belirlenmesi için 26 adedi (Lactococcus lactis subsp. lactis SIK83, Lactobacillus sakei NCDO2714, Lactobacillus plantarum LMG2003, Lc. lactis subsp. lactis IL1403, Lc. lactis subsp. lactis 105, Lc. lactis subsp. lactis LMG2908, Lc. lactis subsp. lactis T1, Lc. lactis subsp. lactis 731, Lc. lactis subsp. lactis 2, Lc. lactis subsp. lactis LMG2912, Listeria innocua LMG2813, Listeria monocytogenes ATCC19115, L. monocytogenes ATCC15813, Escherichia coli LMG3083 CFAI (ETEC), Salmonella enterica serotype Typhimurium SL1344, Pseudomonas fluorescens P1, Enterecococcus faecalis LMG2708, Enterecococcus faecalis LMG2602, Staphylococcus aureus FRI100, Staphylococcus aureus ATCC6538, Staphylococcus carnosus LMG2709, Pediococcus pentosaceus LMG2001, Bacillus cereus LMG2732, Lc. lactis subsp. lactis JC17, Lc. lactis subsp. cremoris LMG2132 ve Lc. lactis subsp. lactis LMG2088) Prof. Dr. Ingolf F. Nes den (Department of Genetics and Biochemistry, Agricultural University of Norway, Ås/Norway) ve 1 adedi ise (Micrococcus luteus RSK1123) Refik Saydam Hıfzısıhha Enstitüsü Kültür Koleksiyonundan olmak üzere toplam 27 adet indikatör bakteri kullanılmıştır. 29

42 Bakteriler; M17 broth, Luria Bertani broth (LB), de Man Rogosa Sharpe broth (MRS), GM17 broth (% 5 glukoz) ve Triptik Soy broth (% 0.5 maya ekstraktı) ortamlarına % 20 oranında steril gliserol ilave edilerek 20 o C de saklanmıştır. Çalışma materyalleri gliserol ilave edilmemiş M17, LB, MRS, GM17 ve TSB broth ortamlarında +4 C de ve haftalık transferler yapılarak korunmuştur Yöntem Laktokok suşlarının izolasyonu Laktokok suşlarının izolasyonu için Boza, Beyaz Peynir, Kefir, Tarhana ve Tulum Peyniri örneklerinin tamponlanmış peptonlu su (Merck, Darmstadt, Almanya) kullanılarak 10-7 seviyesine kadar seri dilüsyonları hazırlanmıştır. Dilüsyonlardan mikropipet yardımıyla 0.1 ml alınarak Neutral Red Chalk Lactose Agar (NRCLA) ortamlarına aktarılmış ve drigalski spatülü ile yayılmıştır. 30 o C de 48 saat inkübasyona bırakılan petri kutularında tipik laktokok kolonileri; koyu kırmızı renkte ve çevrelerinde berrak zon oluşumu kriterlerine göre seçilmiştir (Harrigan and McCance, 1966). Neutral Red Chalk Lactose Agar Laktoz 10 g Pepton 3 g Lablemco et ekstraktı 3 g Maya ekstraktı 3 g Agar 15 g CaCO 3 15 g Neutral red (% 1 lik çözelti) 5 ml Destile su 1000 ml ph 6.8 ± 0.02 (sterilizasyondan önce) Laktoz, CaCO 3 ve neutral red ayrı ayrı 121 o C de 15 dakika sterilize edilmiştir. Diğer bileşenler bir başka erlenmayer içerisinde sterilize (121 o C de 15 dakika) edilmiş ve sıcaklığı 45 o C ye soğuduktan sonra ayrı sterilize edilen laktoz, CaCO 3 ve neutral red sırasıyla bu erlenmayere ilave edilmiştir. 30

43 İzolatların tanısı Morfolojik tanı ve katalaz testi Seçilen kolonilerin mikroskobik morfolojileri, Gram boyama yöntemi ile hazırlanan preparatların 1000 X büyütme ile ışık mikroskobunda (Zeiss, Almanya) incelenmesi sonucunda belirlenmiştir. Katalaz testi için, M17 agar (Laboratorios Conda, Spain) ortamında geliştirilen bakteri kolonileri lam üzerine aktarılmış ve % 3 lük hidrojen peroksit çözeltisinden bir damla ilave edilerek, mikroskop altında 1000 X büyütmede gaz çıkışı olup olmadığı incelenmiştir. Gaz çıkışı gözlenen lamlarda test pozitif olarak değerlendirilmiştir. S. aureus FRI100 suşu katalaz testlerinde pozitif kontrol olarak kullanılmıştır Elliker broth ortamında gelişme İzolatlar Elliker broth ortamında 30 o C de 18 saat geliştirildikten sonra, % 6.5 NaCl ilave edilerek ve ph sı 9.6 ya yükseltilerek hazırlanan iki ayrı Elliker broth ortamına inoküle edilmiş ve 30 o C de 18 saat inkübasyona tabi tutulmuştur. Bu testlere ek olarak izolatların Elliker broth ortamında 10 ve 45 o C de gelişme özellikleri de incelenmiştir. Elliker Broth Tripton 20 g Maya ekstraktı 5 g Jelatin 2.5 g Glukoz 5 g Laktoz 5 g Sakkaroz 5 g Sodyum klorür 4 g Sodyum asetat 1.5 g Askorbik asit 0.5 g Destile su 1000 ml ph 6.8 ± 0.02 (sterilizasyondan önce) 31

44 İzolatların antibakteriyel aktivite özelliklerinin belirlenmesi Antibakteriyel aktivite özellikleri test edilen laktokok izolatları M17 broth (Merck, Darmstadt, Almanya) ortamında 30 o C de 18 saat geliştirilmiştir. Aktif kültürden M17 agar ortamına öze yardımıyla sürme yapılmış ve 30 o C de 18 saat inkübasyona tabi tutulmuştur. İnkübasyon süresi sonunda oluşan koloniler, steril kürdan aracılığıyla bir petride 5 farklı izolat olacak şekilde M17 agar ortamlarına nokta ekim yapılmış ve 30 o C de 18 saat inkübe edilmişlerdir. MRS (Merck, Darmstadt, Almanya), GM17 (% 0.5 glukoz), TSB (% 0.5 maya ekstraktı) veya LB broth ortamlarında geliştirilen indikatör bakterilerden 100 µl alınarak, % 0.7 oranında agar içeren 5 ml yumuşak agar (MRS, GM17, TSB veya LB) ortamlarına inoküle edilmiştir. Sonrasında bu ortamlar antibakteriyel aktivitesi test edilecek laktokok kolonileri üzerine homojen bir şekilde yayılmıştır. Petri kutuları indikatör bakterilerin gelişmesi için uygun olan inkübasyon sıcaklığında 18 saat inkübasyona bırakılmıştır. Süre sonunda, laktokok izolatlarının indikatör bakterilere karşı verdikleri inhibisyon zonları incelenmiştir (van Belkum et al., 1989). Luria Bertani Broth Tripton 10 g Maya ekstraktı 5 g NaCl 10 g Destile su 1000 ml ph 7.0 ± 0.02 (sterilizasyondan önce) Ortam içerikleri 1000 ml destile su içerisinde çözülmüş ve 121 o C de 15 dakika süre ile sterilize edilmiştir Proteolitik enzim uygulaması Laktokok izolatları tarafından üretilen antibakteriyel maddelerin protein yapısında olup olmadığı proteolitik enzim uygulamasıyla test edilmiştir. 30 o C de 18 saat süreyle geliştirilen laktokok izolatları devirde 5 dakika süre ile santrifüj 32

45 (Sigma 2-16P, Rotor No: 12148, Almanya) edilmiştir. Çöken katı fazın karışmamasına dikkat edilerek yeni tüplere aktarılan kültür üst sıvıları 0.45 µm por çaplı membran filtreden (Sartorius, Almanya) geçirilerek sterilize edilmiştir. Sterilize edilen kültür üst sıvılarından 20 µl alınarak M17 agar ortamlarına damlatılmıştır. Damlatılan üst sıvıların yaklaşık 1 cm uzağına son enzim konsantrasyonu 50 mg/ml olacak şekilde hazırlanan pepsin (ph 3.0 Sigma Chem. Co., ABD), proteinaz K (ph 7.0 Amresco, Solon, Ohio, ABD), α- kemotripsin (ph 7.0 Sigma Chem. Co., ABD) veya tripsin (ph 7.0 Sigma Chem. Co., ABD) enzim solüsyonundan 20 µl damlatılmıştır. Damlatılan sıvıların agara nüfuz etmesi için petri kutuları 30 dakika oda sıcaklığında tutulmuştur. Süre sonunda steril kültür üst sıvısı ve enzim damlatılarak hazırlanan petri kutularının üzerine üst tabaka olarak 100 µl indikatör bakteri ilave edilmiş yumuşak agar dökülmüş ve petriler 30 o C de 18 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda zon şekilleri incelenmiştir. Denemelerde GYL14 ve GYL41 suşları için L. innocua LMG2813 ve GYL32 suşu için ise Lb. plantarum LMG2003 indikatör bakteri olarak kullanılmıştır (Ryan et al., 1996) Bakteriyosin üreticisi laktokok izolatının fenotipik tanısı Proteolitik enzim uygulaması sonucunda bakteriyosin üreticisi olduğu tespit edilen GYL32 izolatının fenotipik tanısında API 50 CH karbonhidrat sitripleri ve API 50 CHL karbonhidrat fermentasyon besiyeri (Biomerieux, Marcy-I Etaile, Fransa) kullanılmıştır. Deneme üretici firma tarafından önerilen yönteme göre yapılmıştır Bakteriyosin üreticisi laktokok izolatının genotipik tanısı Genomik DNA izolasyonu Genomik DNA izolasyonu için Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu M17 broth besiyerinde 30 o C de 18 saat süre ile geliştirilmiştir. Aktif GYL32 kültüründen 0.5 ml alınarak steril Eppendorf tüplerine aktarılmıştır. Hücrelerin çöktürülmesi için tüpler devirde 5 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No: 12148, Almanya) 33

46 edilmiştir. Üst faz dökülmüş ve hücre çökeltisi 0.5 ml liziz çözeltisi ile çözülmüştür. Tüpler su banyosu içerisinde 37 o C de 30 dakika inkübasyona bırakılmıştır. Süre sonunda tüplere 30 µl %10 luk sodyum dodesil sülfat (SDS) ilave edilmiş ve 80 C de 5 dakika tutulmuştur. Lize olan hücre süspansiyonu üzerine 0.7 ml fenolkloroform (1:10) ilave edilerek devirde 5 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No:12148, Almanya) işlemine tabi tutulmuştur. Üst faz alınarak yeni steril Eppendorf tüplerine aktarılmış ve üzerine 0.7 ml 2-propanol ilave edildikten sonra tüpler bir kez daha santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No: Almanya) edilmiştir (13000 devir/dk. 5 dakika). Oluşan çökelti 50 µl Tris-EDTA (ph 8.0) içerisinde çözülmüştür. İzole edilen genomik DNA örnekleri 20 o C de muhafaza edilmiştir (Cancilla et al., 1992). Liziz Çözeltisi NaCl 250 mm EDTA 10 mm Tris HCl 10 mm Lizozim 100 mg Destile su 50 ml ph 8.0± 0.02 SDS (%10) SDS 10 g Destile su 100 ml Tris- EDTA Tris g EDTA g Destile su 100 ml ph 8.0 ±

47 Genomik DNA örneklerinin elektroforezi Genomik DNA örneklerinin elektroforezi % 0.7 agaroz oranı ile hazırlanan jellerde yapılmıştır. Agaroz 35 ml tris-asetat elektroforez tamponu içerisinde mikro dalga fırında çözülmüştür. Hazırlanan ortamın 45 C ye kadar soğuması beklenmiş ve yatay elektroforez plakasına dökülmüştür (Thermo Minicell Primo EC320, ABD). Daha sonra, jel tarağı yerleştirilmiş ve jelin polimerizasyonu için dakika beklenmiştir. Jelin polimerizasyonunu takiben jelin üzerini kapatacak biçimde elektroforez tankına tampon çözelti ilave edilmiş ve jele zarar verilmeden tarak ortamdan alınmıştır. 15 µl genomik DNA örneği, 2 µl marker boya çözeltisi ile karıştırılmış ve mikropipet yardımıyla örneğin tamamı jel kuyucuğuna aktarılmıştır. Elektroforez, 65 voltta saat süreyle yapılmıştır. Süre sonunda elektrik akımı kesilmiş ve ortamdan alınan jel, kullanılan elektroforez tamponunun yeni hazırlanmış 0.2 µg/ml etidyum bromit içeren çözeltisinde 1 saat boyanmıştır. Boyama işleminin sonunda jeller, 366 nm dalga boyunda ultraviyole ışık altında incelenmiştir. Jel fotoğrafının çekiminde UviTec DBT-08 (Cambridge, İngiltere) jel görüntüleme sistemi kullanılmıştır. Tris-Asetat Tampon (1X) Tris 4.84 g Sodyum asetat 4.08 g EDTA 0.37 g Destile su 1000 ml ph 8.0 ± 0.02 Marker Boya Brom fenol blue 0.25 g Sakkaroz 40 g Destile su 100 ml 35

48 GYL 32 izolatının 16S rdna bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılması ve sekans analizi Bakteriyosin üreticisi GYL32 izolatında 16S rdna bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılması Techne Genius (Cambridge, İngiltere) termal döngü cihazında yapılmıştır. Toplam 50 µl PZR karışımı (Çizelge 3.1.) kullanılan çalışmada, 1 döngü 94 ºC de 120 saniye başlangıç denatürasyonu, 30 döngü 94 ºC de 30 saniye / 55 ºC de 60 saniye / 72 ºC de 90 saniye çoğaltma ve 1 döngü 72 ºC de 10 dakika son uzama aşamalarından oluşan PZR protokolü kullanılmıştır. GYL32 izolatında 16S rdna bölgesinin çoğaltılmasında pa (ileri) 5 -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 ve pe (geri) 5 - CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3 genel bakteriyel primerler kullanılmıştır (Edwards et al., 1989). Çoğaltılan 16S rdna PZR fragmentlerinin elektroforezi Thermo Minicell Primo EC320 cihazında % 1 agaroz oranı ile hazırlanan jelde yapılmış ve fragmentin büyüklüğü O GeneRuler TM 100-bp DNA marker (Fermentas #SM1153, Litvanya) kullanılarak hesaplanmıştır. PZR ürünlerinin DNA dizi analizi ABI PRISM 3730XL (Perkin Elmer, ABD) otomatik gen sekans cihazı kullanılarak REFGEN Gen Araştırmaları ve Biyoteknoloji Ltd. Şti. (Ankara, Türkiye) inde yaptırılmıştır. 16S rdna dizi benzerliği National Center for Biotechnology Information (NCBI) BLAST programı kullanılarak tespit edilmiştir. Çizelge 3.1. Polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan PZR karışımı Madde adı Hacim PCR master mix (Fermentas #K0171, Litvanya) 25 µl İleri primer 1 µl Geri primer 1 µl Kalıp DNA 3 µl Nükleaz içermeyen H 2 O 20 µl Toplam hacim 50 µl 36

49 GYL32 izolatının plazmid içeriğinin tanımlanması Plazmid DNA izolasyonu M17 broth ortamında 30 o C de 18 saat geliştirilen GYL32 kültüründen, 10 ml lik M17 broth ortamlarına birer ml inokülasyonlar yapılmış ve tüpler 30 o C de saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi bitiminde santrifüj tüplerine aktarılan bakteri kültürleri, 6000 devirde 15 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No: 12141, Almanya) işlemine tabi tutulmuştur. Elde edilen hücre çökeltisi kurutulduktan sonra 379 µl sakkaroz tamponunda çözülmüştür. 37 o C ye kadar ısıtılan bu ortama 96.5 µl lizozim ilave edilmiş ve su banyosunda 37 o C de 5 dakika bekletilmiştir µl Tris-EDTA-1 uygulamasından sonra, tüplere % 20 SDS çözeltisinden 27.6 µl aktarılarak karıştırılmıştır. Bu aşamada ortamda viskozitenin artışı lizizin başladığını göstermektedir. Lizizin tamamlanması için santrifüj tüpleri 37 o C su banyosunda 10 dakika süre ile tutulmuştur. Süre sonunda tüpler mekanik karıştırıcıda, yüksek devirde 30 saniye karıştırılarak kromozomal DNA nın kırılması sağlanmıştır. Ortama yeni hazırlanmış 3 N NaOH çözeltisinden 27.6 µl ilave edilmiş ve tüpler düz bir zemin üzerinde 10 dakika süre ile yavaşça çevrilerek kromozomal DNA nın alkali denatürasyon koşulları oluşturulmuştur. Denatürasyon aşamasının sonunda santrifüj tüplerine 49.6 µl Tris-HCl çözeltisi aktarılarak, 3 dakika süre ile yine düz bir zeminde hafifçe karıştırılmıştır. Ortam ph sının arasına düşüşü ile nötralizasyonun sağlandığı belirlenmiştir. Tüplere, 4 o C de tutulan 5 M NaCl çözeltisinden 71.7 µl ve % 3 NaCl ile doyurulmuş fenol çözeltisinden 700 µl ilave edilerek, 4 o C de devirde 15 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No: 12148, Almanya) işlemi uygulanmıştır. Tüplerde oluşan üst faz, mikropipet yardımıyla yeni tüplere aktarılmış ve deproteinasyonun sağlanması için 700 µl kloroform/izoamilalkol (24:1) çözeltisi ilave edilmiştir. Bu ortamlara 4 o C de devirde 15 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No: 12148, Almanya) işlemi uygulanmış, oluşan üst faz yeni tüplere alınmış ve üzerine eşdeğer hacimde soğuk etil alkol aktarılmıştır. Etil alkol ilave edilen tüpler -20 o C de bir gece bekletildikten sonra, devirde 15 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No: 12148, Almanya) uygulanarak plazmid DNA çöktürülmüş ve sıvı faz dökülerek çökeltiler 37

50 kurutulmuştur. Kurutulan çökeltiler 20 µl Tris-EDTA-2 içerisinde çözülmüş ve RNaz A stok çözeltisinden 2 µl ilave edilerek su banyosunda 37 C de dakika inkübe edilmiştir (Anderson and McKay, 1983). Sakkaroz Çözeltisi Tris g EDTA g Sakkaroz 6.7 g Destile su 100 ml ph 8.0 ± 0.02 Lizozim Çözeltisi Tris 0.3 g Lizozim 0.1 g Destile su 10 ml ph 8.0± 0.02 Tris-EDTA-1 Tris 0.6 g EDTA 9.31 g Destile su 100 ml ph 8.0± 0.02 SDS Çözeltisi Tris 0.6 g EDTA 0.74 g SDS 20 g Destile su 100 ml ph 8.0 ± 0.02 Tris-HCl Tris-HCl g Destile su 100 ml ph 7.0 ±

51 Tris-EDTA-2 Tris g EDTA g Destile su 100 ml ph 7.5 ± 0.02 %3 NaCl ile Doyurulmuş Fenol Çözeltisinin Hazırlanışı: 100 g fenol üzerine 20 ml destile su ve 3 g NaCl aktarılarak 45 o C deki su banyosunda çözülmüştür. Ortama 0.1 g hidroksiguinolin ilave edilmiş ve karıştırılmıştır. Oda sıcaklığında tutulmuştur. RNaz A Çözeltisi: 5 ml steril destile su içerisinde hazırlanan 0.05 M sodyum asetat çözeltisinin ph sı asetik asit ile 5.0 a ayarlanmış ve üzerine 5 mg RNaz A ilave edilmiştir. Kaynar su içerisinde ortam 5 dakika tutulduktan sonra -20 o C de saklanmıştır Plazmid DNA örneklerinin elektroforezi Plazmid DNA örneklerinin elektroforezi % 0.7 agaroz oranı ile hazırlanan jellerde yapılmıştır (Meyers et al., 1976). Yatay jel sistemi (Thermo Minicell Primo EC320, ABD) için agaroz, 35 ml tris-asetat elektroforez tamponu içerisinde çözülmüştür. 37 C de dakika RNaz uygulanan DNA örnekleri su banyosundan alınarak 2 µl marker boya çözeltisi ile karıştırılmış ve mikropipet yardımıyla jel kuyucuklarına aktarılmıştır (20 µl). Elektroforez, 65 voltta saat süreyle yapılmıştır. Elektroforez işlemi sonunda, jel yeni hazırlanmış etidyum bromit (0.2 µg/ml) içeren çözeltide 1 saat boyanmıştır. Boyama işleminin sonunda jeller, 366 nm dalga boyunda ultraviyole ışık altında incelenmiştir (Macrina et al., 1982). Fotoğrafların çekiminde UviTec DBT-08 (Cambridge, İngiltere) jel görüntüleme sistemi kullanılmıştır. 39

52 Plazmid büyüklüklerinin hesaplanması GYL32 suşundan izole edilen plazmidlerin büyüklüklerinin saptanmasında, moleküler büyüklükleri bilinen ccc DNA marker larının elektroforetik hareketleri ile, büyüklüklerinin logaritmaları arasında belirlenen doğrusal ilişkiden yararlanılmıştır (Macrina et al., 1978; Southern, 1979; Schaffer and Sederoff, 1981). Marker cccdna moleküllerinin agaroz jel fotoğrafı üzerinde ölçülen göç aralıkları ile bilinen büyüklüklerinin logaritmik değerlerine bağlı olarak eğrileri çıkarılmıştır. İstatistik analizlerle jel için korelasyon katsayısı ve eğrinin eğimi belirlenerek, GYL32 suşundan izole edilen plazmidlerin büyüklükleri hesaplanmıştır (Campbell, 1974; Elder and Southern, 1983; Elder et al., 1983). A G = Ortalama X = (3.1) N C H = Ortalama Y = (3.2) N E ( G. C ) Eğrinin Eğimi (I) = (3.3) B ( G. A ) E ( G. C ) Korelasyon Katsayısı (J) = (3.4) [ D - ( H. C ) ]. [ B ( G. A ) ] Moleküler Büyüklük (W) = Antilog 10 [ I. ( α G ) + H ] (3.5) 40

53 X = Marker DNA moleküllerinin agaroz jel üzerindeki göç aralığı (mm) Y = Marker DNA moleküllerinin büyüklüğü (kilobaz) A = X 1 + X 2 + X X n B = X 1 + X 2 + X X n C = log 10 Y 1 + log 10 Y 2 + log 10 Y log 10 Y n D = ( log 10 Y 1 ) 2 + ( log 10 Y 2 ) 2 + ( log 10 Y 3 ) ( log 10 Y n ) 2 E = X 1 ( log 10 Y 1 ) + X 2 ( log 10 Y 2 ) + X 3 ( log 10 Y 3 ) X n ( log 10 Y n ) α = Moleküler büyüklüğü bilinmeyen plazmidin jel üzerindeki göçü (mm) Bakteriyosin aktivitesi üzerine ph, sıcaklık ve enzim uygulamalarının etkisi ph nın bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi 30 o C de 18 saat geliştirilen Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu 6000 devirde 15 dakika süreyle santrifüj edilmiş (Sigma 2-16P, Rotor No: 12141, Almanya) ve kültür üst sıvısının ph sı 6 N NaOH veya 6 N HCl kullanılarak değerleri arasında ayarlanmıştır. ph ları ayarlanan kültür üst sıvıları 0.45 µm por çaplı membran filtrelerden (Sartorius, Almanya) geçirilerek sterilize edilmiştir. Bu şekilde hazırlanan ortamlar +4 o C de 24 saat bekletilmiştir. ph değişimlerinin bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisi, membran filtreden geçirildikten sonra hiçbir işleme tabi tutulmayan kültür üst sıvısının inhibisyon aktivitesi ile farklı ph değerlerine ayarlanan kültür üst sıvılarının inhibisyon aktivitelerinin karşılaştırılması sonucu tanımlanmıştır. Denemelerde nisin üreticisi Lc. lactis subsp. lactis SIK83 pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Bakteriyosin aktivitesindeki değişmeler, kritik dilüsyon yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Denemelerde indikatör bakteri olarak Lb. plantarum LMG2003 suşu kullanılmıştır. Kültür üst sıvıları kuyucuklara 50 µl olacak şekilde aktarılmıştır. Bakteriyosin aktivitesi, aşağıdaki formül kullanılarak arbitrary ünite (AU) cinsinden hesaplanmıştır. D değeri inkübasyon süresi sonunda indikatör bakterinin gelişiminin engellendiği en yüksek dilüsyon oranını göstermektedir (Franz et al., 1997). Bakteriyosin aktivitesi (AU/mL) = 1000 x 50-1 x D -1 (3.6) 41

54 Enzim uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi Enzim uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisini belirlemek için, nötralize edilmiş kültür üst sıvılarına, son enzim konsantrasyonu 1 mg/ml olacak şekilde proteinaz K, tripsin, α-kemotripsin, pepsin, α-amilaz (ph 7.0 Sigma Chem. Co., ABD), lipaz (ph 7.0 Sigma Chem. Co., ABD), katalaz (ph 7.0 Sigma Chem. Co., ABD) ve lizozim (ph 7.0 Sigma Chem. Co., ABD), enzimleri ilave edilmiş ve 37 o C de 2 saat inkübasyona bırakılmıştır. Enzim aktiviteleri, 100 o C de 5 dakika ısı uygulaması ile sonlandırılmıştır. Kontrol olarak, enzim ilave edilmemiş kültür üst sıvıları kullanılmıştır. Farklı enzim uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisi, kritik dilüsyon yöntemi kullanılarak formül 3.6 ya göre hesaplanmıştır (Franz et al., 1997) Sıcaklık uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi Bakteriyosin aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisi, nötralize edilmiş kültür üst sıvılarının 100 o C de 5, 10, 15 ve 20 dakika tutulmasından sonra, bu ortamlardan alınan örneklerin Lb. plantarum LMG2003 indikatör bakterisine karşı denenmesi suretiyle belirlenmiştir. Kontrol olarak sıcaklık uygulanmamış kültür üst sıvısı kullanılmıştır. Sıcaklığın bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisi, ph ve enzim uygulamalarının etkisinin belirlendiği testlerde olduğu gibi kritik dilüsyon yöntemi kullanılarak formül 3.6 ya göre hesaplanmıştır (Franz et al., 1997) Bakteriyosin yapısal genlerinin PZR ile çoğaltılması Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunda nisin yapısal genlerinin PZR ile çoğaltılması Techne Genius (Cambridge, İngiltere) termal döngü cihazında yapılmıştır. PZR denemelerinde GYL32 suşundan izole edilen plazmid DNA ve genomik DNA örnekleri kalıp olarak kullanılmıştır. Çizelge 3.1. de verilen karışımın kullanıldığı PZR reaksiyonu, 1 döngü 94 ºC de 120 saniye başlangıç denatürasyonu, 30 döngü 42

55 94 ºC de 45 saniye / 52.5 ºC de 45 saniye / 72 ºC de 60 saniye çoğaltma ve 1 döngü 72 ºC de 10 dakika son uzama aşamalarından oluşmaktadır. Nisin yapısal genlerinin çoğaltılmasında pa (ileri) 5 -AAG AAT CTC TCA TGA GT-3 ve pe (geri) 5 - CCA TGT CTG AAC TAA CA-3 primerleri kullanılmıştır (Rodriguez et al., 1995). Çoğaltılan PZR fragmentlerinin elektroforezi O GeneRuler TM 100-bp DNA marker (Fermentas #SM1153, Litvanya) kullanılarak % 1 agaroz oranı ile hazırlanan jelde yapılmıştır. PZR ürünlerinin DNA dizi analizi REFGEN Gen Araştırmaları ve Biyoteknoloji Ltd. Şti. (Ankara, Türkiye) inde yaptırılmıştır. Çoğaltılan bölgenin DNA dizi benzerliği BLAST programı kullanılarak tespit edilmiştir Hücre liziz Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu M17 broth besiyerinde 30 o C de 18 saat süre ile geliştirilmiş ve kültür 6000 devirde 15 dakika santrifüj (Sigma 2-16P, Rotor No: 12141, Almanya) edilmiştir. Çöken katı fazın karışmamasına dikkat edilerek yeni tüplere aktarılan kültür üst sıvısının ph sı 6.0 a ayarlanmış ve 0.45 µm por çaplı membran filtreden (Sartorius, Almanya) geçirilerek sterilize edilmiştir. Steril kültür üst sıvısından 20 ml alınarak erken gelişme fazına kadar geliştirilen 100 ml Lb. plantarum LMG2003 kültürüne ilave edilmiştir. Bakteriyosin ilave edilen ve edilmeyen Lb. plantarum LMG2003 kültürlerinin optik yoğunluğu, 1cm ışık yoluna sahip küvetler kullanılarak 600 nm dalga boyunda birer saat aralıklarla 9 saat boyunca ölçülmüştür (Shimadzu UV-1600-V spectrophotometer, Japan). Kültürlerin optik yoğunluğunun ölçülmesinde şahit olarak steril MRS broth besiyeri kullanılmıştır (Todorov and Dicks, 2005) Bakteriyosin üretimi Bakteriyosin üretimi için; bir gecelik aktif Lc. lactis subsp. lactis GYL32 kültüründen, 100 ml M17 broth ortamına % 1 oranında ekim yapılmış ve 30 o C de inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyona bırakılan kültürden birer saat arayla 9 saat boyunca aseptik koşullarda örnek alınmış ve optik yoğunluğu ve bakteriyosin üretim miktarı ölçülmüştür. Bakteriyosin üretim miktarı kritik dilüsyon yöntemi kullanılarak 43

56 Lb. plantarum LMG2003 indikatör suşuna karşı belirlenmiştir. Spektrofotometrik ölçümlerde şahit olarak steril M17 broth besiyerleri kullanılmıştır (Todorov and Dicks, 2005) Bakteriyosinin kısmi saflaştırılması Bir gecelik aktif Lc. lactis subsp. lactis GYL32 kültüründen, 100 ml M17 broth ortamlarına % 1 oranında ekim yapılmış ve 30 o C de 18 saat süreyle inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda, kültür devirde 20 dakika santrifüj (Sigma 3K 30, Rotor No: 12155, Almanya) işlemine tabi tutulmuştur. Çöken katı fazın karışmamasına dikkat edilerek, yeni tüplere aktarılan kültür üst sıvısının ph sı 10 N NaOH kullanılarak 6.5 e ayarlanmıştır. Kültür üst sıvısına, son konsantrasyon oranı % 40 olacak şekilde yavaş yavaş amonyum sülfat ilave edilmiş ve eriyinceye kadar karıştırılmıştır. Amonyum sülfat ilave edilmiş kültür üst sıvısı santrifüj tüplerine aktarılmış ve +4 o C de 1 gece manyetik karıştırıcıda karıştırılmıştır. Daha sonra örnekler +4 o C de devirde 30 dakika süreyle santrifüj (Sigma 3K 30, Rotor No: 12155, Almanya) edilmiştir. İşlem sonunda üst faz dökülmüş ve çökelti oda sıcaklığında kurutulmuştur. Kurutulan çökelti 5 ml sodyum fosfat tampon (ph 7.0) içerisinde çözülmüş ve üzerine 75 ml metanol/kloroform (1:2 v/v) çözeltisi ilave edilerek +4 o C de 1 saat bekletilmiştir. Bu süre sonunda örnekler +4 o C de devirde 45 dakika santrifüj (Sigma 3K 30, Rotor No: 12155, Almanya) edilmiş, üst faz dökülmüş ve çökelti kurutulmuştur. Son aşamada kurutulan çökelti 1 ml steril ultra saf suda çözülmüş ve 20 o C de saklanmıştır (Moreno et al., 2003). Sodyum Fosfat Tampon NaH 2 PO 4.H 2 O 0.55 g Na 2 HPO 4.7H 2 O 1.61 g Destile su 100 ml ph 7.0 ±

57 Trisin-sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (Trisin-SDS- PAGE) Trisin-SDS-PAGE denemeleri Schägger ve von Jagow (1987) tarafından önerilen yöntem kullanılarak yapılmıştır. Dikey jel elektroforez sisteminde, iki adet 10x10 cm ebatlarında cam plaka kullanılmıştır. Elektroforez plakaları % 70 lik etanol çözeltisi ile yıkanıp kurutulduktan sonra, plakalar arasına jel tarağının yerleştirildiği üst kısım hariç, 0.8 mm kalınlığında ayırıcılar konulmuştur. Bu aşamadan sonra, jel tarağının 0.5 cm altına kadar gelecek şekilde % 16.5 lik ayırıcı jel dökülmüş ve üzerine 1 ml destile su ilave edilmiştir. Ayırıcı jelin polimerizasyonu için 45 dakika beklenmiş ve destile su filtre kağıdı aracılığı ile ortamdan alınmıştır. Plakanın geri kalan kısmı % 9.8 lik toplayıcı jel dökülerek tamamlanmış ve tarak yerleştirilmiştir. Toplayıcı jelin polimerizasyonu için 45 dakika daha beklendikten sonra cam plakalar elektroforez tankına yerleştirilmiştir. Tarak çıkarılmış ve tank haznelerine tris-trisin-sds tampon ilave edilmiştir. Son aşamada, bakteriyosin örnekleri 10 µl olacak şekilde kuyucuklara aktarılmıştır. Jel sistemine, toplayıcı jel için 30 volt ve ayırıcı jel için ise 90 volt elektrik akımı uygulanmıştır. Bakteriyosin örneklerinin elektroforetik ayrımının tamamlanmasının ardından jel, 2 ayrı parçaya bölünmüştür. Jellerden biri Commasie brillant blue R250 boya çözeltisine alınarak, burada bir saat boyanmıştır. Bu süre bitiminde jel, fazla boyanın geri alındığı çözeltide protein bantları netlik kazanıncaya kadar (30-60 dak) bekletilmiş ve fiksasyon çözeltisi (% 10 luk asetik asit) içine alınmıştır. Boyanmamış jel parçası aktif protein bandının tespiti için kullanılmıştır. Akrilamid/Bis-akrilamid Çözeltisi Akrilamid 30 g Bis-akrilamid 0.8 g Destile su 100 ml Whatman No.1 ile filtre edilen çözeltinin bulunduğu erlenmayer, alüminyum folyo ile kaplanarak +4 o C de tutulmuştur. 45

58 Tris.Cl/SDS, ph 8.45 Tris 182 g SDS 1.5 g Destile su 500 ml ph 8.45 ± 0.02 ye ayarlanır. +4 o C de saklanır. Tris.Cl/SDS, ph 6.8 Tris 6.05 g SDS 0.4 g Destile su 100 ml ph 6.8 ± 0.02 ye ayarlanır. +4 o C de saklanır. Örnek Tamponu Tris.Cl/SDS, ph ml Gliserol 2.4 ml SDS 0.8 g Dithiothreitol 0.31 g Commasie brillant blue R250 2 mg Destile su 10 ml APS (% 10) Amonyum persülfat 0.1 g Destile su 1 ml Ayırıcı Jel Akrilamid/Bis-akrilamid 8.75 ml Tris.Cl/SDS, ph ml Gliserol 1.58 ml Destile su 165 µl Dökmeden hemen önce, 100 µl % 10 amonyum persülfat ve 20 µl tetrametil etilen diamin (TEMED) ilave edilmiştir. 46

59 Toplayıcı Jel Akrilamid/Bis-akrilamid 1.66 ml Tris.Cl/SDS, ph ml Destile su 2.22 ml Dökmeden hemen önce, 25 µl % 10 amonyum persülfat ve 5 µl TEMED ilave edilmiştir. Tris-Trisin-SDS Tampon (1X) Tris g Trisin g SDS 1 g Destile su 1000 ml ph 8.3 ± 0.02 ye ayarlanır. +4 o C de saklanır. Commasie Brilliant Blue Boya Çözeltisi Commasie brilliant blue R250 1 g Metanol 400 ml Glasiyel asetik asit 100 ml Destile su 500 ml Boya Geri Alma Çözeltisi Metanol 400 ml Glasiyel asetik asit 100 ml Destile su 500 ml Jel Fiksasyon Çözeltisi Glasiyel asetik asit 100 ml Destile su 900 ml 47

60 Bakteriyosinin moleküler büyüklüğünün hesaplanması Beyaz ışık kaynağı üzerine yerleştirilerek alınan jel fotoğraflarında Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin moleküler büyüklüğü; 42, 26, 17, 10, 4.6 ve 1.7 kda luk proteinleri içeren marker karışımı (Fermentas #SM1861, Litvanya) kullanılarak, UviTec (Cambridge, İngiltere) Photo programı yardımıyla hesaplanmıştır Aktif protein bantının tespiti Aktif protein bantının belirlenmesinde kullanılan boyanmamış jel parçası indikatör mikroorganizmanın gelişimini inhibe edebilecek kimyasallardan arındırılmak için aseptik koşullarda steril ultra saf su ile 3 saat boyunca yıkanmıştır. Birer saat aralıklarla jelin yıkandığı steril ultra saf su değiştirilmiştir. Yıkanan jel, besiyeri ile jel arasında hava boşluğu kalmayacak şekilde içerisinde MRS agar bulunan petri kutusuna (Ø 14 cm) yerleştirilmiştir. Daha sonra, bir gecelik aktif Lb. plantarum LMG2003 kültürü % 0.7 oranında agar içeren 20 ml MRS yumuşak agar besi ortamı içerisine inoküle edilmiştir. Hazırlanan ortam jel yüzeyini tamamen kaplayacak şekilde homojen olarak yayılmış ve 37 ºC de 18 saat süre ile inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda jel üzerinde oluşan inhibisyon zonu incelenmiştir (Tuncer and Özden, 2010). 48

61 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. Laktokok Suşlarının İzolasyonu Araştırma kapsamında kullanılan Lc. lactis suşları; Antalya, Isparta ve Tekirdağ illerinden sağlanan geleneksel yollarla üretilmiş Boza, Beyaz Peynir, Kefir ve Tulum Peyniri örneklerinden izole edilmiştir (Çizelge 4.1.). Araştırmada kullanılan Tarhana örneklerinin hiç birinden laktokok suşu izole edilememiştir. Fermente gıda örneklerinin peptonlu su kullanılarak hazırlanan seri dilüsyonlarından Neutral Red Chalk Lactose Agar (NRCLA) ortamlarına yayma ekim yapılmış ve 30 C de 48 saat inkübasyona tabi tutulmuştur. İnkübasyon süresi sonunda NRCLA ortamlarında koyu kırmızı renkte ve çevrelerinde berrak zon oluşumu gösteren koloniler muhtemel laktokok izolatı olarak seçilmiştir. Seçilen izolatlardan, Gram pozitif, kok morfolojisine sahip, katalaz negatif, Elliker broth ortamında 30 C de gelişme gösterebilen ancak 10 o C ve 45 o C inkübasyon sıcaklığında, ph sı 9.6 ya ayarlanmış ve % 6.5 NaCl içeren Elliker broth ortamlarında 30 C de gelişemeyen 50 adet izolat Lactococcus cinsi üyesi olarak tanımlanmış ve çalışma materyali olarak seçilmiştir. Seçilen Lactococcus izolatları M17 broth ortamlarına % 20 oranında gliserol ilave edilerek -20 C de muhafaza edilmiştir. Farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda Beyaz Peynir (Durlu-Özkaya et al., 2001; Dağdemir and Özdemir, 2008), Boza (Hancıoğlu and Karapınar, 1997; Gotcheva et al., 2000; Tuncer and Özden, 2010), Kefir (Frengova et al., 2002, Kojic et al., 2007; Chen et al., 2008), Tarhana (Dağlıoğlu et al., 2002) ve Tulum Peyniri (Tükel et al., 2007; Tuncer vd., 2008) gibi farklı fermente gıda örneklerinden Lactococcus lactis suşları izole edilmiştir. Araştırma kapsamında kullanılan Tarhana örneklerinin hiç birinden laktokok suşu izole edilememesi, söz konusu örneklerde laktokok suşu olmadığını düşündürmüştür. Tarhana örnekleri dışında tez çalışması kapsamında kullanılan diğer fermente gıda örneklerinden elde edilen sonuçlar literatür verileri ile uyum göstermiştir. 49

62 Çizelge 4.1. Araştırmada kullanılan laktokok suşlarının izolasyon materyalleri ve izolasyon materyallerinin sağlandığı iller Bakteri No İzolasyon Materyali İl GYL1 Beyaz peynir Isparta GYL2 Beyaz peynir Isparta GYL3 Tulum peyniri Isparta GYL4 Tulum peyniri Isparta GYL5 Beyaz peynir Tekirdağ GYL6 Beyaz peynir Tekirdağ GYL7 Boza Tekirdağ GYL8 Tulum peyniri Tekirdağ GYL9 Tulum peyniri Tekirdağ GYL10 Beyaz peynir Antalya GYL11 Beyaz peynir Antalya GYL12 Beyaz peynir Antalya GYL13 Tulum peyniri Antalya GYL14 Tulum peyniri Antalya GYL15 Tulum peyniri Antalya GYL16 Kefir Isparta GYL17 Kefir Isparta GYL18 Kefir Isparta GYL19 Kefir Isparta GYL20 Tulum peyniri Isparta GYL21 Tulum peyniri Isparta GYL22 Tulum peyniri Isparta GYL23 Boza Tekirdağ GYL24 Boza Tekirdağ GYL25 Boza Tekirdağ 50

63 Çizelge 4.1. (devam) Bakteri No İzolasyon Materyali İl GYL26 Kefir Tekirdağ GYL27 Kefir Tekirdağ GYL28 Kefir Tekirdağ GYL29 Boza Isparta GYL30 Boza Isparta GYL31 Boza Isparta GYL32 Boza Isparta GYL33 Beyaz peynir Tekirdağ GYL34 Beyaz peynir Tekirdağ GYL35 Beyaz peynir Tekirdağ GYL36 Kefir Isparta GYL37 Kefir Isparta GYL38 Boza Antalya GYL39 Boza Antalya GYL40 Boza Antalya GYL41 Kefir Antalya GYL42 Kefir Antalya GYL43 Kefir Antalya GYL44 Beyaz peynir Isparta GYL45 Beyaz peynir Isparta GYL46 Beyaz peynir Isparta GYL47 Kefir Isparta GYL48 Kefir Isparta GYL49 Tulum peyniri Tekirdağ GYL50 Tulum peyniri Tekirdağ 51

64 4.2. Laktokok İzolatlarının Antibakteriyel Aktivite Özelliklerinin Belirlenmesi Fermente gıda örneklerinden izole edilen laktokok izolatlarının antibakteriyel aktivitelerinin belirlenmesinde van Belkum vd. (1989), tarafından önerilen yöntem kullanılmıştır. Toplam 27 adet Gram pozitif ve Gram negatif indikatör bakteriye karşı antibakteriyel aktivite özellikleri araştırılan 50 adet laktokok izolatından 3 adedinin (GYL14, GYL32 ve GYL41) çeşitli indikatör bakterilere karşı inhibisyon zonu oluşturduğu belirlenmiştir (Çizelge 4.2.). Antibakteriyel aktivite testleri sonucu, indikatör bakterilere karşı inhibisyon zonu oluşturduğu tespit edilen laktokok izolatlarının birbiri ile aynı aktivite spektrumu göstermediği belirlenmiştir. GYL14 izolatının denemelerde kullanılan indikatör bakterilerden 2 adedine karşı (L. innocua LMG2813 ve M. luteus RSK1123); GYL32 izolatının indikatör bakterilerden 22 adedine karşı (Lb. sakei NCDO2714, Lb. plantarum LMG2003 (Şekil 4.1.), Lc. lactis subsp. lactis IL1403, Lc. lactis subsp. lactis 105, Lc. lactis subsp. lactis LMG2908, Lc. lactis subsp. lactis T1, Lc. lactis subsp. lactis 731, Lc. lactis subsp. lactis 2, Lc. lactis subsp. lactis LMG2912, Lc. lactis subsp. lactis JC17, Lc. lactis subsp. cremoris LMG2132, L. innocua LMG2813, L. monocytogenes ATCC19115, L. monocytogenes ATCC15813, M. luteus RSK1123, E. faecalis LMG2708, E. faecalis LMG2602, S. aureus ATCC6538, S. aureus FRI100, S. carnosus LMG2709, P. pentosaceus LMG2001 ve B. cereus LMG2732); GYL41 izolatının ise, indikatör bakterilerden 3 adedine karşı (Lc. lactis subsp. lactis IL1403, L. innocua LMG2813 ve M. luteus RSK1123) inhibisyon zonu oluşturduğu belirlenmiştir. Laktokok izolatlarından hiçbiri denemelerde kullanılan Gram negatif (P. fluorescens P1, E. coli LMG3083 CFAI (ETEC) ve S. enterica serotype Typhimurium SL1344) bakterilere karşı antibakteriyel aktivite göstermemiştir. 52

65 Çizelge 4.2. İndikatör bakterilere karşı zon veren laktokok izolatları ve zon çapları İndikatör Suşlar Sıcaklık ( C) Besiyeri* Test Edilen Bakteriler ** (Ømm) GYL14 GYL32 GYL41 SIK83 Lb. sakei NCDO MRS Lb. plantarum LMG MRS Lc. lactis subsp. lactis IL GM Lc. lactis subsp. lactis GM Lc. lactis subsp. lactis LMG GM Lc. lactis subsp. lactis T1 30 GM Lc. lactis subsp. lactis GM Lc. lactis subsp. lactis 2 30 GM Lc. lactis subsp. lactis LMG GM Lc. lactis subsp. lactis JC17 30 GM Lc. cremoris LMG GM Lc. lactis subsp. lactis LMG GM Lc. lactis subsp. lactis SIK83 30 GM E. faecalis LMG GM E. faecalis LMG GM L. innocua LMG LB L. monocytogenes ATCC LB L. monocytogenes ATCC LB P. fluorescens P1 37 LB E. coli LMG3083 CFAI (ETEC) 37 LB S. Typhimurium SL LB M. luteus RSK TSB S. aureus FRI TSB S. aureus ATCC TSB S. carnosus LMG TSB P. pentosaceus LMG TSB B. cereus LMG TSB *MRS: de Man Rogosa Sharpe Broth; GM17: Glukoz M17 Broth (% 5 glukoz); LB: Luria Bertani Broth; TSB: Triptik Soy Broth (% 0.5 maya ekstraktı) ** GYL: Lc. lactis izolatı; SIK83: Lc. lactis subsp. lactis (nisin üreticisi) 53

66 Şekil 4.1. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun, Lb. plantarum LMG2003 suşuna karşı verdiği inhibisyon zonu Bakteriyosin üreticisi suşların belirlenmesinde ilk aşama olarak indikatör bakterilere karşı inhibisyon zonu oluşturan suşların seçilmesi gelmektedir. Bu amaçla kullanılan, farklı araştırmacılar tarafından önerilen birçok yöntem bulunmaktadır (Gratia, 1946; Kékessy and Piguet, 1970; Tagg and McGiven, 1971; Tagg et al., 1976; Geis et al., 1983; van Belkum et al., 1989). Bu yöntemler doğrudan ve dolaylı olmak üzere iki ana sınıf altında toplanmaktadır. Doğrudan ve dolaylı yöntemlerin ortak amacı, bakteriyosin üretim özellikleri araştırılan suşların indikatör bakterilere karşı inhibisyon zonu oluşturup oluşturmadığının belirlenmesidir. Uygulanan yönteme göre kuyucuk veya koloni etrafında berrak ve keskin hatlı inhibisyon zonunun gözlenmesi test edilen bakterinin bakteriyosin üreticisi olduğuna dair güçlü bir kanıt olarak değerlendirilmektedir (De Vuyst and Vandamme, 1994; Degaan et al., 2006). Farklı araştırıcılar tarafından yapılan birçok araştırmada laktokoklar tarafından üretilen bakteriyosinlerin başta yakın akraba türler olmak üzere çeşitli Gram pozitif gıda patojenlerine karşı da inhibitör etki gösterdiği belirlenmiştir. Antibakteriyel aktivite özellikleri araştırılan laktokok suşlarının hiçbirinin Gram negatif bakterilere karşı inhibisyon zonu oluşturmaması literatür verileri ile uyum göstermektedir (Geis 54

67 et al., 1983; Ryan et al., 1996; Mao et al., 2001; Iwatani et al., 2007; Tuncer and Akçelik, 2007; Özkalp et al., 2007; Özden and Akçelik, 2008; Tuncer, 2009) Proteolitik Enzim Uygulaması Çeşitli indikatör bakterilere karşı antibakteriyel aktivite gösterdiği tespit edilen GYL14, GYL32 ve GYL41 izolatları tarafından üretilen antibakteriyel maddelerin protein yapısında olup olmadığı proteolitik enzim uygulaması sonucu tespit edilmiştir. Proteolitik enzim uygulamasında, GYL14 ve GYL41 suşları için L. innocua LMG2813 ve GYL32 suşu için ise, Lb. plantarum LMG2003 indikatör bakteri olarak kullanılmıştır. Proteolitik enzim uygulaması sonucu, GYL14 ve GYL41 izolatları tarafından üretilen antibakteriyel maddelerin α-kemotripsin, pepsin, proteinaz K ve tripsin enzimlerinden etkilenmediği, buna karşı GYL32 izolatı tarafından üretilen antibakteriyel maddenin pepsin ve tripsin enzimlerinden etkilenmez iken proteinaz K (Şekil 4.2.) ve α-kemotripsin (Şekil 4.3.) enzimleri ile muamele edilmesi sonucu aktivitesini kaybettiği belirlenmiştir. Şekil 4.2. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen antibakteriyel maddenin proteinaz K uygulaması sonucu kalan aktivitesi 55

68 Şekil 4.3. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen antibakteriyel maddenin α-kemotripsin uygulaması sonucu kalan aktivitesi Bakteriyosinlerin tümünde antibakteriyel etkinlik ana protein yapıdan kaynaklanmaktadır. Laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin tripsin, α-kemotripsin, pepsin ve proteinaz K gibi proteolitik enzimler ile muamele edilmeleri sonucu aktivitelerini ya tamamen ya da kısmen kaybettikleri belirlenmiştir (van Belkum et al., 1989; Piard et al., 1990; Dieye et al., 2001; Tuncer and Akçelik, 2007; Özden and Akçelik, 2008; Tuncer, 2009; Tuncer and Özden, 2010). Proteolitik enzim uygulaması sonucu inhibitör etkinin tamamen veya kısmen ortadan kalkması üretilen antibakteriyel maddenin bakteriyosin olduğunu, proteolitik enzim uygulamasından etkilenmemesi ise üretilen antibakteriyel maddenin bakteriyosin dışında başka bir inhibitör madde olabileceğini işaret etmektedir. GYL32 izolatı tarafından üretilen antibakteriyel maddenin proteolitik enzimler α-kemotripsin ve proteinaz K dan etkilenmesi, GYL32 izolatı tarafından üretilen inhibitör maddenin bakteriyosin olduğunun güçlü delili olarak değerlendirilmiştir GYL14 ve GYL41 izolatları tarafından üretilen antibakteriyel maddelerin denemelerde kullanılan proteolitik enzimlerden etkilenmemesi ise, bu izolatların bakteriyosin dışında başka bir inhibitör madde ürettiklerini işaret etmektedir. Farklı 56

69 araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda, laktokok cinsi üyesi bakterilerin bakteriyosinler dışında; başta laktik asit olmak üzere, diasetil, asetoin ve hidrojen peroksit gibi farklı antimikrobiyel maddeler ürettikleri tespit edilmiştir (Jay, 1982; McKay, 1983; Condo, 1987; Hugenholtz and Starrenburg, 1992; Morita et al., 1997; Hsu et al., 2002; Devlieghere et al., 2004) Bakteriyosin Üreticisi Laktokok İzolatının Tanısı Proteolitik enzim uygulaması sonucunda bakteriyosin üreticisi olduğu tespit edilen GYL32 izolatının tür düzeyinde tanısında API 50 CH (Biomerieux, Marcy-I Etaile, Fransa) karbonhidrat fermantasyon testinin yanı sıra 16S rdna dizi analizi kullanılmıştır. API 50 CH karbonhidrat testi üretici firma tarafından önerilen yönteme göre yapılmıştır. Karbonhidrat fermantasyon testi sonucunda, GYL32 izolatının 49 karbonhidrat içerisinden L-arabinoz, riboz, D-ksiloz, galaktoz, glukoz, fruktoz, mannoz, mannitol, N-asetil-glukozamin, amigdalin, arbutin, eskulin, salisin, sellobioz, maltoz, laktoz, sukroz, trihaloz, nişasta, gentiobioz ve glukonat ı fermente ettiği ancak geri kalan 28 karbonhidrattan hiçbirini fermente edemediği tespit edilmiştir (Çizelge 4.3.). GYL32 izolatının karbonhidrat fermantasyon profilinin üretici firma veri bankası ile kıyaslanması sonucu bakteriyosin üreticisi GYL32 izolatının Lc. lactis subsp. lactis 1 ile % 99.8 oranında benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. Bakteriyosin üreticisi Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun genetik tanısında, 16S rdna dizi analizi yöntemi kullanılmıştır. Genomik DNA izolasyonu için GYL32 suşu M17 broth besiyerinde 30 o C de 18 saat geliştirilmiş ve aktif GYL32 kültüründen genomik DNA örnekleri Cancilla vd. (1992), tarafından önerilen yönteme göre izole edilmiştir. Genomik DNA örneklerinin elektroforezi tris-asetat elektroforez tamponu kullanılarak % 0.7 agaroz oranı ile hazırlanan jelde yapılmıştır. Jel fotoğrafı UviTec DBT-08 (Cambridge, İngiltere) jel görüntüleme sistemi kullanılarak çekilmiştir (Şekil 4.4). 57

70 Çizelge 4.3. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun API 50 CH karbonhidrat fermentasyon test sonuçları Karbonhidrat GYL32* Karbonhidrat GYL32 0 Kontrol** - 1 Gliserol - 2 Eritritol - 3 D-Arabinoz - 4 L-Arabinoz + 5 Riboz + 6 D-Ksiloz + 7 L-Ksiloz - 8 Adonitol - 9 β-metil-d-ksilozid - 10 Galaktoz + 11 Glukoz + 12 Fruktoz + 13 Mannoz + 14 Sorboz - 15 Ramnoz - 16 Dulsitol - 17 Inositol - 18 Mannitol + 19 Sorbitol - 20 α-metil-d-mannozid - 21 α-metil-d-glukozid - 22 N-Asetil-Glukozamin + 23 Amigdalin + 24 Arbutin + *GYL32: Lc. lactis subsp. lactis GYL32 **Karbonhidrat içermeyen test kuyucuğu 25 Eskulin 26 Salisin 27 Sellobioz 28 Maltoz 29 Laktoz 30 Melibioz 31 Sukroz 32 Trihaloz 33 Inulin 34 Melezitoz 35 Rafinoz 36 Nişasta 37 Glikogen 38 Ksilitol 39 Gentiobioz 40 D-Turanoz 41 D-Lyxoz 42 D-Tagatoz 43 D-Fukoz 44 L-Fukoz 45 D-Arabitol 46 L-Arabitol 47 Glukonat 48 2-Keto-Glukonat 49 5-Keto-Glukonat

71 Şekil 4.4. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun genomik DNA örneği 1-2 Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu 3 O GeneRuler DNA Marker (bç) : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200,

72 Bakteriyosin üreticisi GYL32 suşunda 16S rdna bölgesinin PZR ile çoğaltılması genel bakteriyel primerler kullanılarak Techne Genius (Cambridge, UK) termal döngü cihazında yapılmıştır. Çoğaltılan PZR fragmentinin elektroforezi % 1 agaroz oranı ile hazırlanan jelde yapılmış ve söz konusu fragmentin moleküler büyüklüğü yaklaşık 900 bç bulunmuştur (Şekil 4.5.). GYL32 suşunda PZR ile çoğaltılan 16S rdna gen bölgesinin DNA dizisi BLAST programında analiz edilmiş ve Lc. lactis subsp. lactis genomundaki bölge ile % 100 oranında homoloji gösterdiği belirlenmiştir. Bakterilerin koloni morfolojileri, kültürel ve biyokimyasal özellikleri gibi fenotipik karakterleri incelenerek tür ve alt tür düzeyinde tanısı yapılabilmektedir. Ancak fenotipik karakterler kullanılarak yapılan tanımlama çalışmalarında izolatların tür ve alt tür düzeyinde kesin bir ayrımının yapılamaması nedeniyle günümüzde bakteriyel tanımlama çalışmaları, nükleik asit homolojisi, genomik DNA restriksiyon analizi veya restriksiyon fragment boy polimorfizmi (restriction fragment length polymorphism, RFLP), değişken alanlı jel elektroforezi (pulsed field gel electrophoresis, PFGE), 16S rdna genlerini tanımlayıcı PZR uygulamaları ve DNA dizi analizleri gibi moleküler genetik yöntemler ile desteklenerek yapılmaktadır (Brown, 2001; Samaržija et al., 2001; Pu et al., 2002; Ben Amor et al., 2007). API 50 CH karbonhidrat test sonucu ve 16S rdna dizi analizinden elde edilen veriler ışığında tez çalışması kapsamında izole edilen bakteriyosin üreticisi GYL32 izolatının Lc. lactis subsp. lactis olduğu kesinlik kazanmıştır. 60

73 Şekil 4.5. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun PZR ile çoğaltılan 16S rdna fragmenti 1-2 Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun genomik DNA sı 3 Negatif kontrol 4 O GeneRuler DNA Marker (bç) : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200,

74 4.5. Plazmid DNA İzolasyonu Bakteriyosin üreticisi Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun, Anderson ve McKay (1983) tarafından önerilen alkali denatürasyon yöntemi kullanılarak yapılan plazmid izolasyonu çalışması sonucu moleküler büyüklükleri 37.2 ve 25.1 kb olan 2 adet plazmid içerdiği belirlenmiştir (Şekil 4.6.). Şekil 4.6. Bakteriyosin üreticisi Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun plazmid içeriği 1 ccc Plazmid DNA Marker (kb) : 16.2, 14.1, 12.2, 10.2, 8.0, 7.2, 6.0, 5.0, 4.0, 2.9, GYL32 (kb) : 37.2,

75 Pek çok laktokok suşunda laktoz fermentasyonu, proteolitik aktivite, faj dirençlilik özellikleri, ekzopolisakkarit ve bakteriyosin üretimi gibi endüstriyel öneme sahip özelliklerin genetik determinantları plazmidler üzerinde kodludur (Gasson and Davies, 1984; von Wright and Sibakov, 1993; Hill and Ross, 1998; Samaržija et al., 2001). Çeşitli araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda, Lactococcus cinsi suşların moleküler büyüklükleri genellikle kb arasında değişen 1-11 adet plazmid içerdiği belirlenmiştir (Klaenhammer et al., 1978; Kuhl et al., 1979; Davies et al., 1981; von Wright et al., 1986; Lucey et al., 1993; Liu et al., 1997; Tükel ve Akçelik, 2000; Özden and Akçelik, 2008; Tuncer, 2009). Bakteriyosin üreticisi Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun içerdiği plazmidlerin sayı ve büyüklükleri, bu literatür verileri ile tam uyum göstermektedir Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine ph, Enzim ve Sıcaklık Uygulamalarının Etkisi Proteolitik enzim uygulaması sonucu bakteriyosin üreticisi olduğu belirlenen Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin tanısında etki spektrumunun belirlenmesine ek olarak bakteriyosinin farklı ph, sıcaklık ve enzim uygulamalarına karşı davranışı esas alınmıştır. Denemelerde nisin üreticisi Lc. lactis subsp. lactis SIK83 suşu pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Aktivite belirleme çalışmaları sonucu, Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun kültür üst sıvısının Lb. plantarum LGM2003 suşuna karşı 5120 AU/mL aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin aktivitesinin ph değerleri arasında arttığı, ph değerleri arasında stabilitesini koruduğu ve ph 9.0, 10.0 ve 11.0 değerlerinde ise aktivitesinin, sırasıyla % 50, % 87.5 ve % oranlarında azaldığı belirlenmiştir. Enzim uygulamaları sonucu söz konusu suş tarafından üretilen bakteriyosin α-kemotripsin ve proteinaz K ile tamamen inaktive olmuştur. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosin denemede kullanılan diğer enzimlerden etkilenmemiştir. GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosin, 100 ºC de 5, 10, 15 ve 20 dakika sıcaklık uygulamalarında aktivitesini koruduğu tespit edilmiştir. Farklı ph, enzim ve 63

76 sıcaklık uygulamaları sonucu, GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin denemelerde kontrol olarak kullanılan SIK83 tarafından üretilen nisin ile tamamen aynı davranışı gösterdiği belirlenmiştir (Çizelge 4.4.). Tez çalışmasında elde edilen verilere benzer olarak, standart nisin molekülünün α- kemotripsin ve proteinaz K enzimleri ile tamamen inaktive olmakta, ancak α-amilaz, katalaz, lipaz, lizozim, pepsin ve tripsin enzimlerinden ise etkilenmemektedir (Delves-Brougton, 1990; de Vuyst and Vandamme, 1994). Nisin molekülünün çözünürlüğü, stabilitesi ve biyolojik aktivitesi ortam ph sına göre değişmektedir. Asidik ortamlarda nisinin çözünürlüğü artmakta ve bu nedenle inhibisyon etkinliği yükselmektedir. Nisin molekülünün asidik ortamlarda çözünürlüğünün arttığı ve bu nedenle inhibisyon etkinliğinin yükseldiği farklı araştırıcılar tarafından yürütülen çalışmalarda da belirlenmiştir (Olasupo et al., 1999; Noonpakdee et al., 2003; Akçelik et al., 2006; Tuncer, 2009). Liu ve Hansen (1990), tarafından yapılan çalışmada, nisin çözünürlüğünün ph 2 de 57 mg/ml, ph 6 da 1.5 mg/ml ve ph 8.5 de ise 0.25 mg/ml olduğu belirlenmiştir. Nisin ph 2 de ºC ısıl işleme dayanıklıdır. Ancak, aynı sıcaklık değerinde ph 5 de % 40 oranında ve ph 6.8 de ise % 90 oranında aktivitesini kaybetmektedir (Tramer, 1966). Yapılan başka bir çalışmada ise, nisinin ph 2 de 121 ºC de 15 dakika ısıl işleme dayanıklı olduğu belirlenmiştir (Vessoni Penna et al., 2005). Konakçı etkinliğine ilave olarak ph, sıcaklık ve enzim muamelelerine karşı gösterdiği tam uyuşmaya göre Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosin nisin olarak tanımlanmıştır (Franz et al., 1997; Ross et al., 1999; McAulifee et al., 2001; Twomey et al., 2002; Liu et al., 2005; Akçelik et al., 2006; Tuncer, 2009). 64

77 Çizelge 4.4. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin aktivitesi üzerine farklı ph, enzim ve sıcaklık uygulamalarının etkisi Bakteriyosin Aktivitesi (AU/mL) Muamele GYL32* SIK83** Kontrol ph ph ph ph ph ph ph ph ph ph Proteinaz K 0 0 Tripsin α-kemotripsin 0 0 Pepsin α Amilaz Lipaz Katalaz Lizozim C de 5 dakika C de 10 dakika C de 15 dakika C de 20 dakika *GYL32: Lc. lactis subsp. lactis GYL32 **SIK83: Lc. lactis subsp. lactis SIK83 (nisin üreticisi) 65

78 4.7. Bakteriyosin Yapısal Genlerinin Belirlenmesi Konakçı etkinliğinin yanı sıra farklı ph, enzim ve sıcaklık uygulamalarına karşı gösterdiği tam uyuşmaya göre nisin üreticisi olduğu tespit edilen Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunda, nisin üretiminin genetik determinantı PZR yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Nisin yapısal genlerinin çoğaltılmasında Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşundan izole edilen plazmid ve genomik DNA örnekleri kullanılmıştır. Spesifik primerler kullanılarak yürütülen PZR denemeleri sonucunda, GYL32 suşunun genomik DNA sı üzerinde yaklaşık 1060 bç lik nisin genine özgül bölgelerin çoğaltılması sağlanmıştır. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun plazmid DNA örnekleri üzerinde yürütülen PZR çalışmalarında ise, söz konusu suşun plazmidlerinde nisin genine özgül herhangi bir bölgenin çoğaltılmadığı tespit edilmiştir (Şekil 4.7.). Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunda spesifik nisin primerleri kullanılarak çoğaltılan PZR ürününün DNA dizi analizi ABI PRISM 3730 XL (Perkin Elmer, ABD) otomatik gen sekans cihazı kullanılarak tespit edilmiştir (REFGEN, Ankara). BLAST programı kullanılarak yapılan DNA dizi benzerliği çalışması sonucu, PZR ürünün nisin Z yapısal geni ile % 100 oranında uyum gösterdiği tespit edilmiştir (Şekil 4.8.). PZR denemesi ve sekans analiz sonuçları, Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin nisin Z olduğuna kesinlik kazandırmıştır. Bu güne kadar yapılan çalışmalarda Lc. lactis subsp. lactis suşlarının nisin A (Gross and Morell, 1971), nisin Z (Mulders et al., 1991), nisin Q (Zendo et al., 2003) ve nisin F (de Kwaadsteniet et al., 2008) olmak üzere dört farklı nisin varyantı ürettiği belirlenmiştir. 66

79 Şekil 4.7. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunda nisin yapısal geninin genomik ve plazmid DNA kullanılarak PZR amplifikasyonu 1 Negatif kontrol 2 O GeneRuler DNA Marker (bç) : 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun genomik DNA sı 4 Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun plazmid DNA sı 67

80 AAATAGATAAATAGATAAATAGATAAATAGATAAATAGAT AAATAGATAAATAGATAAATAGATAAATAGATAAATAGAT AAATAGATAAATAGATAAATAGATAAATATTTATGGGGAG GACAAGTGAACTTATCATGATTAATTGTAAACGATTGAGT TCTGAATGTTTCAAATTATGAGGAACAACAGGAGTTGGAC TATTCTTTAAACGCCTCGACGATACCATCACTCTTCATTAG CCTAAAATTAACAAGTTAAAATCATTAGAATAATCTCTTTT ACAAAAAATATTTATTTAAGTTATAGTTGACGAATATTTAA TAATTTTATTAATATCTTGATTTTCTAGTTCCTGAATAATA TAGAGATAGGTTTATTGAGTCTTAGACATACTTGAATGAC CTAGTCTTATAACTATACTGACAATAGAAACATTAACAAA TCTAAAACAGTCTTAATTCTATCTTGAGAAAGTATTGGTA ATAATATTATTGTCGATAACGCGAGCATAATAAACGGCTC TGATTAAATTCTGAAGTTTGTTAGATACAATGATTTCGTTC GAAGGAACTACAAAATAAATTATAAGGAGGCACTCAAAAT GAGTACAAAAGATTTTAACTTGGATTTGGTATCTGTTTCG AAGAAAGATTCAGGTGCATCACCACGCATTACAAGTATTT CGCTATGTACACCCGGTTGTAAAACAGGAGCTCTGATGGG TTGTAACATGAAAACAGCAACTTGTAATTGTAGTATTCAC GTAAGCAAATAACCAAATCAAAGGATAGTATTTTGTATCT CAAAAAT Şekil 4.8. Nisin primerleri ile Lc. lactis subsp. lactis GYL32 genomunda çoğaltılan gen bölgesi Altı çizigi bölge nisin Z yapısal genini göstermektedir (nisz) 68

81 4.8. Hücre Liziz Hücre liziz denemelerinde, Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun steril nötralize kültür üst sıvısından (5120 AU/mL) 20 ml alınarak erken gelişme fazına kadar geliştirilen Lb. plantarum LMG2003 kültürüne (100 ml) ilave edilmiş ve kültürün optik yoğunluğu 9 saat boyunca ölçülmüştür. Nötralize edilmiş kültür üst sıvısının ilave edilmesini takip eden ilk 1 saatin sonunda Lb. plantarum LMG2003 kültürünün optik yoğunluğu (600 nm) değerinden seviyesine ve ikinci saatin sonunda ise kültür yoğunluğunun değerine düştüğü belirlenmiştir. Daha sonraki ölçümlerde ise Lb. plantarum LMG2003 kültürünün gelişiminin tamamen durduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.9.) OD (600 nm) Bakteriyosin Zaman (saat) Şekil 4.9. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin Lb. plantarum LMG2003 suşunun gelişmesi üzerine etkisi. Bakteriyosin ilave edilmemiş ( ) ve bakteriyosin ilave edilmiş ( ). Ok aktif bakteriyosin içeren nötralize edilmiş steril kültür üst sıvısının ilave edildiği noktayı göstermektedir 69

82 Daha önce yapılan çalışmalarda da nisinin güçlü bakterisidal etki gösterdiği ve duyarlı hücreleri kısa bir süre içinde inhibe ettiği tespit edilmiştir. Mattick ve Hirsch (1947), 150 IU/mL düzeyinde nisin ilave edilmiş Streptococcus agalactiae kültürünün dakika gibi kısa bir sürede inhibe olduğunu belirlemişlerdir. Benzer olarak Ogden ve Waites (1986), nisin ile muamele edilmiş Lactobacillus suşlarının kısa sürede inhibe olduklarını tespit etmişlerdir. Yapılan bir diğer çalışmada ise, Bozadan izole edilen Lc. lactis subsp. lactis YBD11 suşu tarafından üretilen nisin benzeri bakteriyosinin Micrococcus luteus kültürü üzerine bakterisidal etki gösterdiği belirlenmiştir (Tuncer and Özden, 2010) Bakteriyosin Üretimi Bakteriyosin üretiminin belirlenmesi amacıyla 30 ºC de 18 saat geliştirilen aktif Lc. lactis subsp. lactis GYL32 kültüründen 100 ml M17 broth ortamına % 1 oranında ekim yapılmış ve 30 ºC de inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi boyunca kültürden birer saat aralıklarla aseptik koşullarda örnek alınmış ve optik yoğunluğu ve bakteriyosin aktivitesi ölçülmüştür. Yapılan ölçümler sonucu Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun inkübasyonun 2. saati sonunda 40 AU/mL düzeyinde bakteriyosin ürettiği tespit edilmiştir. İnkübasyonun ilerleyen saatlerinde, bakteriyosin aktivitesinin hücre yoğunluğunun artışına paralel olarak yükseldiği belirlenmiştir. En yüksek bakteriyosin aktivitesi (5120 AU/mL) kültür yoğunluğunun değerine ulaştığı 8. saatin sonunda tespit edilmiştir (Şekil 4.10.). Bakteriyosin üretiminin gelişme fazında başlamış ve gelişme fazının sonunda maksimum seviyeye ulaşmış olması Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin primer metabolit kinetiğine sahip olduğuna işaret etmektedir. De Vuyst ve Vandamme (1992), Lc. lactis subsp. lactis NIZO22186 suşunda nisin üretiminin bakteriyel gelişme ile arttığını ve maksimum nisin üretimine gelişme fazının sonunda ulaşıldığını belirtmişlerdir. Tez çalışmasında elde edilen sonuçlara benzer olarak Lc. lactis subsp. lactis NIZO22186 suşunda nisin üretiminin primer metabolit kinetiğine sahip olduğunu belirtmişlerdir. Farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda da nisin biyosentezinin gelişme fazında gerçekleştiği ve 70

83 hücrelerin durma fazına girdiği zaman nisin biyosentezinin tamamen durduğu tespit edilmiştir (van der Meer et al., 1993; Kim et al., 1997; Cheigh et al., 2002; Tuncer and Özden, 2010). Boza dan izole edilen farklı bakteriyosin üreticisi suşların kullanıldığı çalışmalarda da, Pediococcus acidilactici (Nieto-Lozano et al., 2002), Lactobacillus paracasei subsp. paracasei M3 (Atanasovva et al., 2003), Pediococcus pentosaceus ST18 (Todorov and Dicks, 2005) Lactobacillus plantarum ST194BZ (Todorov and Dicks, 2006) ve Lc. lactis subsp. lactis BZ (Şahingil et al., 2010) suşları tarafından üretilen bakteriyosinlerin primer metabolit kinetiğine sahip oldukları saptanmıştır. B ak teriyosin A k tivitesi (A U /m L ) O D (600 n m ) Zaman (saat) 0 Şekil Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından bakteriyosin üretimi ve kültür yoğunluğundaki değişim ( ) 71

84 4.10. Trisin-Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (Trisin-SDS- PAGE) Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin moleküler büyüklüğü, trisin-sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez (trisin-sds- PAGE) sisteminde belirlenmiştir. Amonyum sülfat (% 40) kullanılarak kısmi saflaştırması yapılan Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun kültür üst sıvısının trisin-sds-page analizi sonucu moleküler büyüklükleri 49.3, 46.8, 45.3, 38.1, 10.8 ve 6.7 kda olan 6 protein bantı içerdiği belirlenmiştir (Şekil 4.5.). Trisin-SDS-PAGE sistemi ile elde edilen jelde aktif protein bantının (antibakteriyel aktivite gösteren) belirlenmesi amacıyla jel üzerine Lb. plantarum LMG2003 indikatör bakteri olarak yayılmış ve 37 ºC de 18 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda yaklaşık 6.7 kda büyüklüğe sahip olan bant etrafında inhibisyon zonu meydana geldiği belirlenmiştir (Şekil 4.12.). Bu sonuç antibakteriyel aktiviteden 6.7 kda büyüklüğe sahip olan proteinin (bakteriyosin) sorumlu olduğunu göstermiştir. Yapılan çalışmalar nisin monomerinin moleküler ağırlığının yaklaşık 3350 Da olduğunu göstermiştir. Ancak, nisin üretim ortamlarında sadece monomer halinde değil dimer (6700 Da) veya tetramer (13400 Da) halinde de bulunabilmektedir (Liu and Hansen, 1990). Değişik araştırmalarda, üretim ortamlarından ekstrakte edilerek hazırlanan preparatlar üzerinde yürütülen analizler, çeşitli Lactococcus lactis suşları tarafından üretilen nisinin çoğunlukla monomer halinde bulunduğunu göstermiştir (Gross and Morell, 1967; Gross, 1977; Mulders et al., 1991, Akçelik et al., 2006; Tuncer, 2009). Yapılan tez çalışmasında, üretim ortamından ekstrakte edilerek kısmi saflaştırması yapılan bakteriyosinin 6.7 kda moleküler büyüklüğe sahip olması, Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen nisin Z nin dimer halinde bulunduğuna işaret etmektedir. 72

85 Şekil Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin trisin-sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez profili 1 Protein marker (kda) : 42.0, 26.0, 17.0, 10.0, 4.6, GYL32* (kda) : 49.3, 46.8, 45.3, 38.1, 10.8, Protein marker ** (kda) : 42.0, 26.0, 17.0, 10.0, 4.6, GYL32** (kda) : 6.7 *GYL32: Lc. lactis subsp. lactis GYL32 * *Jelin üstüne üst tabaka olarak Lb. plantarum LMG2003 suşu dökülmüştür 73

86 5. SONUÇ 1. Araştırma kapsamında Bozadan izole edilen nisin Z üreticisi Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşu farklı fermente gıdaların üretiminde biyokoruyucu olarak kullanım potansiyeli taşımaktadır. 2. Nisin Z üreticisi Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun laktik asit üretimi, proteolit aktivite ve faj dirençlilik özellikleri bundan sonra yapılacak çalışmalarda belirlenerek söz konusu suşun starter kültür olarak kullanım potansiyeli araştırılmalıdır. 3. Lc. lactis subsp. lactis GYL32 suşunun pilot üretim tesislerinde denenmesi suretiyle endüstriyel boyutta üretim sırasında metabolik karakterlerin stabilitesi test edilmelidir. 74

87 6. KAYNAKLAR Akçelik, O., Tükel, Ç., Özcengiz, G., Akçelik, M., Characterization of bacteriocins from two Lactococcus lactis subsp. lactis isolates. Molecular Nutrition & Food Research, 50, Anderson, D.G., McKay, L.L., A simple and rapid method for isolating large plasmid DNA from lactic streptococci. Applied and Environmental Microbiology, 46, Atanassova, M., Choiset, Y., Delgalarrondo, M., Chobert J-M., Dousset X., Ivanova, I., Haertlé, T., Isolation and partial biochemical characterization of a proteinaceous anti-bacterial and anti-yeast compound produced by Lactobacillus paracasei subsp. paracasei M3. International Journal of Food Microbiology, 87, Axelsson, L., Lactic acid bacteria: classification and physiology. In: Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects 2nd Edition. (Salminen, S. and von Wright, A. -eds) Marcel Dekker Inc., pp. 1-72, New York. Bardowski, J., Kozak, W., Dobrzanski, W.T., Further characterization of lactostrepcins-acid bacteriocin of lactic streptococci. Acta Microbiologica Polonica, 28, Ben Amor, K., Vaughan, E.E., de Vos, W.M., Advanced molecular tools for the identification of lactic acid bacteria. Journal of Nutrition, Boumerdassi, H., Monnet, C., Desmazeaud, M., Corrieu, G., Isolation and properties of Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis CNRZ 483 mutants producing diacetyl and acetoin from glucose. Applied and Environmental Microbiology, 63, Breukink, E., de Kruijff B., Lipid II as target for antibiotics. Nature Reviews Drug Discovery Breukink, E., van Heusden, H.E., Vollmerhaus, P.J., Swiezewska, E., Brunner, L., Walker, S., Heck, A.J., de Kruijff, B., Lipid II is an intrinsic component of the pore induced by nisin in bacterial membranes. Journal Biological Chemistry, 278,

88 Breukink, E., van Kraaij, C., Demel, R.A., Siezen, R.J., Kuipers, O.P., de Kruijff, B., The C-terminal region of nisin responsible for the initial interaction of nisin with the target membrane. Biochemistry, 36, Breukink, E., Wiedemann, I., van Kraaij, C., Kuipers, O.P., Sahl, H., de Kruijff B., Use of the cell wall precursor lipid II by a pore-forming peptide antibiotic. Science 286, Brown, E.W., Molecular differentiation of bacterial strains. In: Molecular Epidomilogy. (Carrington, M. and Rus Hoelzel, A. -eds.) Oxford University Pres, pp , Oxford UK. Buchman, G.W., Banerjee, S., Hansen, J.N., Structure, xpression, and evolution of a gene encoding the precursor of nisin, a small protein peptide. Journal of Biological Chemistry, 263, Cai, Y., Yang, J., Pang, H., Kitahara, M., Lactococcus fujiensis sp nov., a lactic acid bacterium isolated from vegetable. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, (in press). Campbell, R.C., Statistics for Biologists. Cambridge University Press, Second Edition, 385 p. Cancilla, M.R., Powell, I.B., Hillier, A.J., Davidson, B.E., Rapid genomic fingerprinting of Lactococcus lactis strains by arbitrarily primed polymerase chain reaction with 32 P and fluorescent labels. Applied and Environmental Microbiology, 58, Cao, L.T., Wu, J.Q., Xie, F., Hu, S.H., Mo, Y., Efficacy of nisin in treatment of clinical mastitis in lactating dairy cows. Journal of Dairy Science, 90, Casalta, E., Montel, M.C., Safety assessment of dairy microorganisms: The Lactococcus genus. International Journal of Food Microbiology 126, Cheigh, C.I., Choi, H.J., Park, H., Kim, S.B., Kook, M.C., Kim, T.S., Hwang, J.K., Pyun, Y.R., Influence of growth conditions on the production of a nisin-like bacteriocin by Lactococcus lactis subsp. lactis A164 isolated from kimchi. Journal of Biotechnology, 95,

89 Chen, H., Hoover, D.G., Bacteriocins and food applications. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2, Chen, H-C., Wang, S-Y., Chen, M-J., Microbiological study of lactic acid bacteria in kefir grains by culture-dependent and culture-independent methods. Food Microbiology, 25, Cho, S-L., Nam, S-W., Yoon, J-H., Lee, J-S., Sukhoom, A., Kim, W., Lactococcus chungangensis sp. nov., a lactic acid bacterium isolated from activated sludge foam. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58, Chung, W., Hancok REW. Action of lysozyme and nisin mixtures against lactic acid bacteria. Inernational Jorunal of Food Micribiyology. 60, Cintas, L.M., Casaus M.P., Hérranz C., Nes I.F., Hernández P.E., Bacteriocins of lactic acid bacteria. Food Science and Technology International, 7, Condo, S., Responses of lactic acid bacteria to oxygen. FEMS Microbiology Reviews, 46, Cotter, P.D., Colin, H., Ross, R.P., Bacterial lantibiotics: strategies to improve therapeutic potential. Current Protein and Peptide Science, 6, Dağdemir, E., Özdemir S., Technological characterization of the natural lactic acid bacteria of artisanal Turkish White Picled cheese. International Journal of Dairy Technology, 61, Dağlıoğlu, O., Arıcı M., Konyalı, M., Gümüş, T., Effects of tarhana fermentation and drying methods on the fate of Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus. European Food Research & Technology, 215, Davey, G.P., Plasmid associated with diplococcin production in Streptococcus cremoris. Applied and Environmental Microbiology, 48, Davey, G. P. and Richardson, B. C Prufication and some properties of diplococsin from Streptococcus cremoris 346. Applied and Environmental Microbiology, 41, Davies, F.L., Underwood, H.M., Gasson, M.J., The value of plasmid profiles for strain identification between Streptococci and the relationship between 77

90 Streptococcus and lactic acid bacteria. Journal of Applied Bacteriology, 51, De Arauz, L., Jozola, A., Mazzola, P., Pena, T., Nisin biotechnological production and application. Trends in Food Science & Technology, 20, De Kwaadsteniet, M., ten Doeschate, K., Dicks, L.M.T., Characterization of the structural gene encoding nisin F, a new lantibiotic produced by a Lactococcus lactis subsp. lactis isolate from freshwater catfish (Clarias gariepinus). Applied and Environmental Microbiology, 74, De Lima Girisi, T.C.S., Lira, K.G., Action of nisin and high ph on growth of Staphylococcus aureus and Salmonella sp. in pure culture and in the meat of land crab (Ucıdes Cordatus). Brazilian Journal of Microbiology, 36, De Ruyter, P.G., Kuipers, O.P., de Vos, W.M., Controlled gene expression systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin. Applied and Environmental Microbiology, 62, De Vuyst, L., Leroy, F., Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 13, De Vuyst, L., Vandamme, E.J., Influence of the carbon source on nisin production in Lactococcus lactis subsp. lactis batch fermentations. Journal of General Microbiology 138, De Vuyst, L., Vandamme, E.J., Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Microbiology, Genetics and Applications. Chapman and Hall, New York, 539 p. Deegan, L.H., Cotter, P.D., Hill, C., Ross, P., Bacteriocins: biological tools for bio-preservation and shelf-life extension. International Dairy Journal, 16, Delves-Broughton, J., Nisin and its application as a food preservative. Journal of the Society of Dairy Technology, 43, Delves-Broughton, J., Nisin as a food preservative. Food Australia, 57,

91 Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R.J., Hugenholtz, J., Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie van Leeuwenhoek, 69, Demel, R.A., Peelen, T., Siezen, R.J., de Kruijff, B., Kuipers, O.P., Nisin Z, mutant nisin Z and lacticin 481 interactions with anionic lipids correlate with antimicrobial activity. A monolayer study. European Journal of Biochemistry, 235, Devlieghere, F., Vermeiren, L., Debevere, J., New preservation technologies: possibilities and limitations. International Dairy Journal, 14, Diep, D.B., Nes, I.F., Ribosomally synthesized antibacterial peptides in Gram positive bacteria. Current Drug Targets, 3, Diep, D.B., Skaugen, M., Salehian, Z., Holo, H., Nes, I.F., Common mechanisms of target cell recognition and immunity for class II bacteriocins. Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), 104, Dieye, Y., Usai, S., Clier, F., Gruss, A., Piard, J.C., Design of a protein targeting system for lactic acid bacteria. Journal of Bacteriology, 183, Dodd, H.M., Horn, N., Gasson, M.J., Analysis of the genetic determinant for production of the peptide antibiotic nisin. Journal of General Microbiology, 136, Dougherty, B.A., Hill, C., Weldman, J.F., Richardson D.R., Venter, J.C., Ross, R.P., Sequence and analysis of the 60 kb conjugative bacteriocin producing plasmid pmrc01 from Lactococcus lactis DPC3147. Molecular Microbiology, 29, Durlu-Özkaya, F., Xanthopoulos, V., Tunail, N., Litopoulou-Tzanetaki, E Technologically important properties of lactic acid bacteria isolates from Beyaz cheese made from raw ewes milk. Journal of Applied Microbiology, 91, Edwards, U., Rogall, T., Blocker, H., Emde, M., Bottger, E.C., 1989, Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Research, 17,

92 Elder, J.K., Amos, A., Southern, E.M., Shippey, G.A., Measurement of DNA length by gel electrophoresis (I). Analytical Biochemistry, 128, Elder, J.K., Southern, E.M., Measurement of DNA length by gel electrophoresis (II): comparison of methods for plating mobility of fragment length. Analytical Biochemistry, 170, Engelke, G., Gutochowski-Eckel, Z., Hammelman, M., Entian, K.D., Regulation of nisin biosynthesis and immunity in Lactococcus lactis 6F3. Applied and Environmental Microbiology, 60, Ennahar, S., Sashihara, T., Sonomoto, K., Ishizaki, A., Class IIa bacteriocins: biosynthesis, structure and activity. FEMS Microbiology Reviews, 24, FAO/WHO Expert Committee on Food Additives Specifi cations for identity and purity of some antibiotics. Twelth Report. WHO Technical Report Series, No Ferchichi, M., Frere, J., Mabrouk, K., Manai, M., Lactococcin MMFII, a novel class IIa bacteriocin produced by Lactococcus lactis MMFII, isolated from a Tunisian dairy product. FEMS Microbiology Letters, 205, Franz, C.M.A.P., Du Toit, M., von Holy, A., Schillinger, U., Holzapfel,W.H., Production of nisin-like bacteriocins by Lactococcus lactis strains isolated from vegetables. Journal of Basic Microbiology, 37, Frengova, G.I., Simova, E.D., Beshkova, D.M., Simov, Z.I., Exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria of kefir grains. Zeitschrift für Naturforschung, 57, Fujita, K., Ichimasa, S., Zendo, T., Koga, S., Yoneyama, S., Nakayama, J., Sonomoto, K., 2007.Structural analysis and characterization of Lacticin Q, a novel bacteriocin belonging to a new family of unmodified bacteriocins of Gram positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 73, Gasson, M.J., Davies, F.L., The genetics of lactic acid bacteria. In: Advances in Microbiology and Biochemistry of Cheese and Fermented Milk. (Davies, F.L. and Law, B.A. -eds) Elsevier Applied Science Publishers, pp New York. 80

93 Geis, A., Singh, J., Teuber, M., Potential of lactic Streptococci to produce bacteriocin. Applied and Environmental Microbiology, 45, Ghrairi, T., Frére, J., Berjeaud, J.M., Mania, M., Lactococcin MMT24, a novel two-peptide bacteriocin produced by Lactococcus lactis isolated from rigouta cheese. International Journal of Food Microbiology, 105, Gillor, O., Nigro, L.M., Riley, M.A., Genetically engineered bacteriocins and their potential as the next generation of antimicrobials. Current Pharmaceutical Design, 11, 1-9. González, B., Glaasker, E., Kunji, E.R.S., Driessen, A.J.M., Suárez, J.E., Konings, W.N., Bactericidal mode of action of plantaricin C. Applied and Environmental Microbiology, 62, Gotcheva, V., Pandiella, S. S., Angelov, A., Roshkova, V.G., Webb, C., Microflora identification of the Bulgarian cereal-based fermented beverage Boza. Process Biochemistry, 36, Gratia, A., Sur un remarquable exemple d antagonisme entre deux souches de colibacille. C.R. Seances Society of Biology. 93, Gratia, A., Techniques selectives pour la recherche systematique des germes antibiotiques. C.R. Seances Society of Biology. 140, Gross, E., T, Q-unsaturated and related amino acids in peptides and proteins. In: Protein Cross-Linking-B. (Fiedman, M. eds.) Plenum, pp , New York. Gross, E., Morell, J.L., The presence of dehydroalanine in the antibiotic nisin and its relationship to activity. Jounal of American Chemistry Society, 89, Gross, E., Morell, J.L., The structure of nisin. Jounal of American Chemistry Society, 93, Güzel-Seydim, Z., Ekinci, F.Y., Bacteriocins of lactic acid bacteria. In: Metabolism and Applications of Lactic Acid Bacteria. (Özer, B. -eds.) Research Signpost, pp , Krela, India. Hancıoglu, Ö., Karapınar, M., Microflora of boza, a traditional fermented Turkish beverage. International Journal of Food Microbiology, 35,

94 Harrigan, F.W., McCance, E.M., Laboratory Methods in Microbiology. Academic Pres London, 285 p, New York. Hasper, H.E., de Kruijff, B., Breukink, E., Assembly and stability of nisin-lipid II pores. Biochemistry. 43, Hill, C., Ross, R.P., Starter cultures for the dairy industry. In: Genetic Modification in the Food Industry. (Roller, S. and Harlander, S. -eds.) pp Blackie Academic and Professonal, London. Holo, H., Nilssen, Ø., Nes, I.F., Lactococcin A, a new bacteriocin from Lactococccus lactis subsp. cremoris: isolation and characterization of the protein and its gene. Journal of Bacteriology, 173, Holt, G.H., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., Williams, S.T., Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Williams and Wilkins Co., Ninth Edition, 787 p. Hsu, S.T., Breukink, E., Tischenko, E., Lutters, M.A., de Kruijff, B., Kaptein, R., Bonvin, A.M., van Nuland, NA., The nisin-lipid II complex reveals a pyrophosphate cage that provides a blueprint for novel antibiotics. Nature Structural & Molecular Biology, 11, Hsu, S-T., Breukink, E., de Kruijff, B., Kaptein, R., Bonvin, A.M.J.J., van Nuland, N.A.J., Mapping the targeted membrane pore formation mechanism by solution NMR: the nisin Z and lipid II interaction in SDS micelles. Biochemistry, 41, Hugenholtz, J., Starrenburg, M.J.C., Diacetyl production by different strains of Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis and Leuconostoc ssp. Applied Microbiolgy and Biotechnology, 38, Immonen, T., Saris, P.E.J., Characterization of the nisfeg operon of the nisin Z producing Lactococcus lactis subsp. lactis N8 strain. DNA Sequence, 9, Iwatani, S., Zendo, T., Yoneyama, F., Nakayama, J, Sonomoto, K., Chracterizaion and structure analysis of a novel bacteriocin, Lacticin Z, produced by Lactococcus lactis QU 14. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 71(8),

95 Jack, R.W., Tagg, J.R., Ray, B., Bacteriocins of gram positive bacteria. Microbiology Reviews, 59, Jay, J.M., Antimicrobial properties of diacetyl. Applied and Environmental Microbiology, 44, Jeevaratnam, K., Jamuna, M., Bawa A.S., Biological preservation of foods- Bacteriocin of lactic acid bacteria. Indian Journal of Biotechnology, 4, Kékessy D.A., Piguet, J.D., New method for detecting bacteriocin production. Applied and Environmental Microbiology, 20, Kim, W.S., Hall, R.J., Dunn, N.W., The effect of nisin concentration and nutrient depletion on nisin production of Lactococcus lactis. Applied Microbiology and Biotechnology, 48, Klaenhammer, T. R., Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Reviews, 12, Klaenhammer, T.R., McKay, L.L., Baldwin, K.A., Improved lysis of group N streptococci for isolation and rapid characterization of plasmid DNA. Applied and Environmental Microbiology, 35, 592. Klostermann, K., Crispie, F., Flynn, J., Meaney, W.J., Ross, R.P., Hill, C., Efficacy of a teat dip containing the bacteriocin lacticin 3147 to eliminate Gram-positive pathogens associated with bovine mastitis. Journal of Dairy Research, 77, Kojić, M., Lozo. J., Begović, J., Jovčić, B., Topisirović. L.J., Characterization of Lactococci isolated from homemade kefir. Archives of Biological Sciences, 59, Kozak, W., Bardowski, J., Dobrzanski, W.T., Lactostrepcin-a bacteriocin produced by Streptococcus lactis. Bulletin Academy Polish Science Cl., 25, Kozak, W., Bardowski, J., Dobrzanski, W.T., Lactostrepcins-acid bacteriocins produced by lactic streptococci. Journal of Dairy Research, 45, Kuhl, S.A., Larsen, L.D., McKay, L.L., Plasmid profiles of lactose-negative and proteinase-deficient mutants of Streptococcus lactis C10, ML3 and M18. Applied and Environmental Microbiology, 37,

96 Kuipers, O.P., Beerthuyzen, M.M., De Ruyter, P.G.G.A., Luesink, E.J., De Vos, W.M., Autoregulation of nisin biosynthesis in Lactococcus lactis by signal transduction. Journal Biological Chemistry, 270, Li, H., O Sullivan, D.J., Identification of a nisi promoter within the nisabctip operon that may enable establishment of nisin immunity prior to induction of the operon via signal transduction. Journal of Bacteriology, 188, Liu, C.Q., Dunn, N.W., Duan, K., Cloning and sequence analysis of a plasmid replicon from Lactococcus lactis subsp. cremoris FG2. Journal of General Microbiology, 43, Liu, C.Q., Su, P., Khunajakr, N., Deng, Y.M., Sumual, S., Kim, W.S., Tandianus, J.E., Dunn, N.W., Development of food-grade cloning and expression vectors for Lactococcus lactis. Journal of Applied Microbiology, 98, Liu, W., Hansen, J.N., Some chemical and physical properties of nisin, a small protein antibioic produced by Lactococcus lactis. Applied and Environmental Microbiology, 56, Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G.N., Kuipers, O.P., Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cellular and Molecular Life Sciences, 65, Lucey, M., Daly, C., Fitzgerald, G.F.,1993. Relationship between Lactococcus lactis subsp. lactis 952, and industrial lactococcal starter culture and strains 712, ML3 and C2. Journal of Applied Bacteriology, 75, Mackay, V.C., Arendse, G., Hastings, J.W., Purification of bacteriocins of lactic acid bacteria: problems and pointers. International Journal of Food Microbiology, 34, Macrina, F.L., Kopecko, D.J., Jones, K.R., Ayers, D.S., McCoven, S.M., A multiple plasmid containing Escherichia coli strain: convenient source of size reference plasmid molecules. Plasmid, 1, Macrina, F.L., Tobian, J.A., Jones, K.R., Evans, R.P., Clewell, D.B., A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sangius. Gene, 19,

97 Mao, Y., Muriana, P.M., Cousin, M.A., Purification and transpositional inactivation of Lacticin FS92, a broad-spectrum bacteriocin produced by Lactococcus lactis FS92. Food Microbiology, 18, Martín, M.G., Sender, P.D., Peirú, S., de Mendoza, D., Magni, C., Acidinducible transcription of the operon encoding the citrate lyase complex of Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis CRL264. Journal of Bacteriology, 186, Martinez, B., Fernandez, M., Rodriguez, A., Suárez, J.E., Synthesis of lactococcin 972, a bacteriocin produced by Lactococcus lactis IPLA 972, depends on the expression of a plasmid-encoded bicistronic operon. Microbiology, 145, Martinez, B., Suárez, J.E., Rodriguez, A., Lactococcin 972, a homodimeric lactococcal bacteriocin whose primary target is not the plasma membrane. Microbiology, 142, Mattick, A.T.R., Hirsch, A., Further observation on an inhibitor (nisin) from lactic streptococci. Lancet, 2, 5-7. McAuliffe, O., Hill, C., Ross, R.P., Inhibition of Listeria monocytogenes in cottage cheese manufactured with a lacticin 3147-producing starter culture. Journal of Applied Microbiology, 86, McAuliffe, O., Hill, C., Ross, R.P., Each peptide of the two-component lantibiotic lacticin 3147 requires a separate modification enzyme for activity. Microbiology, 146, McAuliffe, O., Ross, R.P., Hill, C., Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action. FEMS Microbiology Reviews, 25, McAuliffe, O., Ryan, M.P., Ross, R.P., Hill, C., Breeuwer, P., Abee, T., Lacticin 3147, a broad-spectrum bacteriocin which selectively dissipates the membrane potential. Applied and Environmental Microbiology, 64, McKay, L.L., Functional properties of plasmids in lactic streptococci. Antonie van Leeuwenhoek, 49, Millette, M., Smoragiewicz, W., Lacroix, M., Antimicrobial potential of immobilized Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC against selected bacteria. Journal of Food Protection, 67,

98 Moll, G., Ubbink-Kok, T., Hildeng-Hauge, H., Nissen-Meyer, J. Nes, I. F., Konings, W.N., Driessen, A.J.M., Lactococcin G is a potassium ion-conducting, two-component bacteriocin. Journal of Bacteriology, 178, Moreno, M.R. Foulquie., Callewaert, R., Devreese, B., Van Beeumen, J., De Vuyst, L., Isolation and biochemical characterisation of enterocins produced by enterococci from different sources. Journal of Applied Microbiology, 94, Morgan, S.M., O Connor, P.M., Cotter, P.D., Ross, R.P., Hill C., Sequential Actions of the Two Component Peptides of the Lantibiotic Lacticin 3147 Explain Its Antimicrobial Activity at Nanomolar Concentrations. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49, Morita, H., Kamizono, K., Nakamura, S., Fujita, Y., Sakata, R., Nagata, Y., McKay, L.L., Cloning of citrate permease gene of Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis NIAI N-7 and expression in citrate-negative lactococci. Milchwissenschaft, 52, Morris, S., Walsh, R.C., Hansen, J.N., Identification and characterization of some bacterial membrane sulfhydryl groups which are targets of bacteriostatic and antibiotic action. Journal of Biological Chemistry, 259, Mulders, J.W.M., Boerrigter, I.J., Rollema, H.S., Siezen, R.J., De Vos, W.M., Identification and characterization of the lantibiotic nisin Z, a natural nisin variant. European Journal of Biochemistry, 201, Nes, I.F., Holo, H., Class II antimicrobial peptides from lactic acid bacteria. Biopolymers, 55, Nettles, C.G., Barefoot, S.F., Biochemical and genetic characterization of bacteriocins of food-associated lactic acid bacteria. Journal of Food Protection, 56, Nieto-Lozano, J.C., Reguera-Useros J.I., Pelaez-Martinez M.C., de la Torre, A.H., Bacteriocinogenic Activity From Starter Culture Used In Spanish Meat Industry. Meat Science, 62,

99 Nissen-Meyer, J., Holo, H., Havarstein, L.S., Sletten, K., Nes, I.F.,1992. A novel lactococcal bacteriocin whose activity depends on the complementary action of two peptides. Journal of Bacteriology, 174, Noonpakdee, W., Santivarangkna, C., Jumriangrit, P., Sonomoto, K., Panyim, S., Isolation of nisin-producing Lactococcus lactis WNC 20 strain from nham, traditional Thai fermented sausage. International Journal of Food Microbiology, 81, O Sullivan, L., Morgan, S.M., Ross, R.P., Hill, C., Elevated enzyme release from lactococcal starter cultures on exposure to the lantibiotic lacticin 481, produced by L. lactis DPC5552. Journal of Dairy Science, 85, O Sullivan, L., Ross, R.P., Hill, C., 2003b. A lacticin 481-producing adjunt culture increases starter lysis while inhibiting nonstarter lactic acid bacteria proliferation during Cheddar cheese ripening. Journal of Applied Microbiology, 95, O Sullivan, L., Ryan, M.P., Ross, R.P., Hill, C., 2003a. Generation of food-grade lactococcal starters which produce the lantibiotics lacticin 3147 and lacticin 481. Applied and Environmental Microbiology, 69, Ogden, K., Waites, M.J., The action of nisin on beer spoilage lactic acid bacteria. Journal of Institute Brewing, 92, Olasupo, N.A., Schillinger, U., Narbad, A., Dodd, H., Holzapfel, W.H., Occurrence of nisin Z production in Lactococcus lactis BFE 1500 isolated from wara, a traditinol Nigerian cheese product. International Journal of Food Microbiology, 53, Özden, B., Akçelik, M., Genetic analysis of bacteriocin production ability and phage adsorption type resistance system in six Lactococcus lactis strains. Acta Alimentaria, 37, Özer, B., Metabolism and Applications of Lactic Acid Bacteria. Research Signpost, Kerala, India, 197 p. Özkalp, B., Özden, B., Tuncer, Y., Şanlıbaba, P., Akçelik, M Technological characterization of wild-type Lactococcus lactis strains isolated from raw milk and traditional fermented milk products in Turkey. Lait, 87,

100 Pathanibul, P., Taylor, T.M., Davidson, P.M., Harte, F., Inactivation of Escherichia coli and Listeria innocua in apple and carrot juices using high pressure homogenization and nisin. International Journal of Food Microbiology, 129, Patton, G.C., van der Donk, W.A., New developments in lantibiotic biosynthesis and mode of action. Current Opinion in Microbiology, 8, Piard, J.C., Delorme, F., Giraffa, G., Commissaire, J., Desmazeaud, M., Evidence for a bacteriocin produced by Lactococcus lactis CNRZ 481. Netherlands Milk and Dairy Journal, 44, Piper, C., Draper, L.A., Cotter, P.D., Ross, R.P., Hill, C., A comparison of the activities of lacticin 3147 and nisin against drug-resistant Staphylococcus aureus and Enterococcus species. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 64, Pu, Z.Y., Dobos, M., Limsowtin, G.K.Y., Powell, I.B., Integrated polymerase chain reaction-based procedures fort he detection and identification of species and subspecies of the Gram-positive bacterial genus Lasctococcus. Journal of Applied Microbiology, 93, Qiao, M., Ye, S., Koponen, O., Ra, R., Usabiaga, M., Immonen, T., Saris, P.E., Regulation of the nisin operons in Lactococcus lactis N8. Journal of Applied Bacteriology, 80, Ra, S.R., Qiao, M., Immonen, T., Pujana, I., Saris, E.J., Genes responsible for nisin synthesis, regulation and immunity form a regulon of two operons and are induced by nisin in Lactococcus lactis N8. Microbiology, 142, Rauch, P.J.G., De Vos, W.M., Characterization of the novel nisin-sucrose conjugative transposon Tn5276 and its integration in Lactococcus lactis. Journal of Bacteriology, 174, Reunanen, J., Lantibiotic nisin and its detection methods. Department of Applied Chemistry and Microbiology Division of Microbiology Faculty of Agriculture and Forestry and Viikki Graduate School in Biosciences University of Helsinki. 42s. Helsinki. 88

101 Rodrígues, J.M., Cintas, L.M., Casaus, P., Horn, N., Dodd, H.M., Hernández, P.E., Gasson, M.J., Isolation of nisin-producing Lactococcus lactis strains from dry fermented sausages. Journal of Applied Bacteriology, 78, Rogers, L.A., Whittier., E.O., Limiting factors in lactic fermentation. Journal of Bacteriology, 16, Ross, R.P., Galvin, M., McAuliffe, O., Morgan, S.M., Ryan, M.P., Twomey, D.P., Meaney, W.J., Hill, C., Developing applications for lactococcal bacteriocins. Antonie van Leeuwenhoek, 76, Ryan, M.P., Flynn, J., Hill, C., Ross, R.P., Meaney, W.J., The natural food grade inhibitor, Lacticin 3147, reduced the incidence of mastitis after experimental challenge with Streptococcus dysgalactiae in nonlactating dairy cows. Journal of Dairy Science, 82, Ryan, M.P., Rea, M.C., Hill, C., Ross, R.P., An application in cheddar cheese manufacture for a strain of Lactococcus lactis producing a novel broad spectrum bacteriocin lacticin Applied and Environmental Microbiology, 62, Sahl, H-G., Jack, R.W., Bierbaum, G., Biosynthesis and biological activities of lantibiotics with unique post-translational modifications. European Journal of Biochemistry, 230, Samaržija, D., Antunac, N., Havranek, J.L., Taxonomy, physiology and growth of Lactococcus lactis: a review. Mljekarstvo, 51, Sawa, N., Zendo, T., Kiyofuji, J., Fujita, K., Himeno, K., Nakayama, J., Sonomoto, K., Identification and characterization of lactocyclicin Q, a novel cyclic bacteriocin produced by Lactococcus sp. strain QU 12. Applied and Environmental Microbiology, 5, Schaffer, H.E., Sederoff, R.R., Improvement estimation of DNA fragment lengths from agarose gels. Analytical Biochemistry, 115, Schägger, H., von Jagow, G., Tricine-SDS-PAGE for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kda. Analytical Biochemistry, 166,

102 Schillinger, U., Geisen, R., Holzapfel, W.H., Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods. Trends in Food Science & Technology, 7, Schleifer, K.H., Recent changes in taxonomy of lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Reviews, 46, Schleifer, K.H., Kraus, J., Dvorak, C., Kilpper-Bälz, R., Collins, M.D., Fischer, W., Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the genus Lactococcus gen. nov. Systematic and Applied Microbiology, 6, Sears, P.M., Peele, J., Lassauzet, M., Blackburn, P., Use of antimicrobiol proteins in the treatment of bovine mastitis. In: Proceeding of the 3rd International Mastitis Seminar. pp Southern, E.M., Measurement of DNA lengths by gel electrophoresis. Analytical Biochemistry, 100, Stiles, M.E., Holzapfel, W.H., Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. International Journal of Food Microbiology, 36, Şahingil, D., İşleroğlu, H., Yıldırım, Z., Akçelik, M., Yıldırım, M., Characterization of lactococcin BZ produced by Lactococcus lactis subsp. lactis BZ isolated from boza. Turkish Journal of Biology, 34, Tagg, J.R., Dajani, A.S., Wannamaker, L.W., Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Bacteriological Reviews, 40, Tagg, J.R., McGiven, A.R., Assay system for bacteriocins. Applied Microbiology, 21, 943. Taylor, T.M., Davidson, P.M., Zhong, Q., Extraction of nisin from a 2.5% commercial nisin product using methanol and ethanol solutions. Journal of Food Protection, 70, Todorov, S.D. Dicks, L.M.T., Screening for bacteriocin-producing lactic acid bacteria from boza, a traditional cereal beverage from Bulgaria comparison of the bacteriocins. Process Biochemistry, 41, Todorov, S.D., Bacteriocins from Lactobacıllus plantarum production, genetic organization and mode of action. Brazilian Journal of Microbiology, 40,

103 Todorov, S.D., Dicks, L.M.T., Pediocin ST18, An anti-listerial bacteriocin produced by Pediococcus pentosaceus ST18 isolated from boza, a traditional ceral beverage from Bulgaria. Process Biochemistry, 40, Tramer, J.,1966. Nisin in food preservation. Chemistry & Industry, 11, Tuncer, Y., Phenotypic and genotypic characterization of nisin-producing Lactococcus lactis subsp. lactis YB23 isolated from raw milk in Turkey. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 23, Tuncer, Y., Akcelik M., Technological characterization of wild-type Lactococcus lactis strains isolated from raw milk and traditional fermented milk products in Turkey. Australian Journal of Dairy Technology, 62, Tuncer, Y., Özden, B., Partial biochemical characterization of nisin-like bacteriocin produced by Lactococcus lactis subsp. lactis YBD11 isolated from Boza, A traditional fermented Turkish beverage. Romanian Biotechnological Letters, 15, Tuncer, Y., Özden, B., Avşaroğlu, M.D., Bozanın bazı mikrobiyolojik özelliklerinin ve laktik asit bakterisi izolatlarının antibakteriyel aktivitelerinin belirlenmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 12, Tükel, Ç., Akçelik, M, Plasmid encoded lacticin 481 production in Lactococcus lactis subsp. lactis CM41. Milchwissenschaft, 59, Tükel, Ç., Akçelik, M., Lactococcus lactis subsp. lactis suşlarında laktoz plazmidlerinin tanımlanması. Turkish Journal of Biology, 24, Tükel, Ç., Avşaroğlu, M.D., Şimşek, Ö., Akçelik, M., Isolation and partial characterization of a novel bacteriocin produced by Lactococcus lactis ssp. lactis MC38. Journal of Food Safety. 27, Twomey, D., Ross, R.P., Ryan, M., Meaney, B., Hill, C., Lantibiotics produced by lactic acid bacteria: structure, function and applications. In: Lactic acid bacteria: genetics, metabolism and applications (Sizezen, R.J., Kok, J., Abee, T. and Schaafsma, G. Eds.) pp Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. 91

104 van Belkum, M.J., Hayema, B.J., Geis, A., Kok, J., Venema, G., Cloning of two bacteriocin genes from a lactococcal bacteriocin plasmid. Applied and Environmental Microbiology, 55, van Belkum, M.J., Kok, J., Venema, G., Holo, H., Nes, I.F., Konings, W.N., Abee, T., The bacteriocin lactococcin a specifically increases permeability of lactococcal cytoplasmic membranes in a voltage independent, proteinmediated manner. Journal of Bacteriology, 173, van der Meer, J.R., Rollema, H.S., Siezen, R.J., Beerthuyzen, M.M., Kuipers, O.P., De Vos, W.M., Characterization of the nisin a operon genes nisp, encoding a subtilisin-like serine protease involved in precursor processing, and nisr, encoding a regulatory protein involved in nisin biosynthesis. Journal of Bacteriology, 175, van Kraaij, C., Breukink, E., Noordermeer, M.A., Demel, R.A., Siezen, R.J., Kuipers, O.P., de Kruijff, B., Pore formation by nisin involves translocation of its C-terminal part across the membrane. Biochemistry, 37, Venema, K., Abee, T., Haandrikman, A.J., Leenhouts, K.J., Kok, J., Konings W.N., Venema, G., Mode of actions of lactococcin B, a thiol-activated bacteriocin from Lactococcus lactis. Applied and Environmental Microbiology, 59, Vessoni Penna, T.C., Jozala, A.F., Novaes, L.C.L., Pessoa Jr., A., Cholewa, O., Production of nisin by Lactococcus lactis in media with skimmed milk. Applied Biochemistry and Biotechnology, 121, von Wright, A., Sibakov, M., Genetic modification of lactic acid bacteria. In: Lactic Acid Bacteria (von Wright, A. and Salminen, S. Eds.) pp Dekker, New York. von Wright, A., Suominen, M., Sivelä, S., Identification of lactose fermentation plasmids of streptococcal dairy starter strains by Southern hybridization. Letters of Applied Microbiology, 2, Whitehead, H.R., A substance inhibiting bacterial growth, produced by certain strains of lactic streptococci. Biochemical Journal, 27,

105 Williams, A.M., Fryer, J.L., Collins, M.D., Lactococcus piscium sp. Nov. a new Lactococcus species from salmonid fish. FEMS Microbiology Letters, 68, Wirawan, R.E., Klesse, N.A., Jack, R.W., Tagg, J.R., Molecular and genetic characterisation of a novel nisin variant produced by Streptococcus uberis. Applied and Environmental Microbiology, 72, Wu, J., Hu, S., Cao, L., Therapeutic Effect of nisin Z on subclinical mastitis in lactating cows. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 51, Yoneyama, F., Imura, Y., Ichimasa, S., Fujita, K., Zendo, T., Nakayama, J., Matsuzaki, K., Sonomoto, K., 2009a. Lacticin Q, a lactococcal bacteriocin, causes high-level membrane permeability in the absence of specific receptors. Applied and Environmental Microbiology, 75, Yoneyama, F., Imura, Y., Ohno, K., Zendo, T., Nakayama, J., Matsuzaki, K., Sonomoto, K., 2009b. Peptide-lipid huge toroidal pore, a new antimicrobial mechanism mediated by a lactococcal bacteriocin, lacticin Q. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53, Yoneyama, F., Shioya, K., Zendo, T., Nakayama, J., Sonomoto, K., Effect of a negatively charged lipid on membrane-lacticin Q interaction and resulting pore formation. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 74, Zajdel, J.K., Ceglowski, P., Dobrzanski, W.T., Mechanism of action of lactostrepcin 5, a bacteriocin produced by Streptococcus cremoris 202. Applied and Environmental Microbiology, 49, Zendo, T., Fukao, M., Ueda, K., Higuchi, T., Nakayama, J., Sonomoto, K., Identification of the lantibiotic nisin Q, a new natural variant produced by Lactococcus lactis isolated from a river in Japan. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 67, Zendo, T., Koga, S., Shigeri, Y., Nakayama, J., Sonomoto, K., Lactococcin Q, a novel two-peptide bacteriocin produced by Lactococcus lactis QU 4. Applied and Environmental Microbiology, 72, Zendo, T., Yoneyama, F., Sonomoto, K., Lactococcal membranepermeabilizing antimicrobial peptides, Applied Biotechnology and Microbiology, 88,

106 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Gözde KORAL Doğum Yeri ve Yılı : Tekirdağ, 1986 Medeni Hali : Bekar Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Tekirdağ Anadolu Lisesi, Lisans : Süleyman Demirel Üniversitesi, Çalıştığı Kurum ve Yıl: Sueno Hotels Beach Side,