Antimikobakteriyel Direnç Mekanizmaları ve Duyarlılık Testleri

Transkript

1 Antimikobakteriyel Direnç Mekanizmaları ve Duyarlılık Testleri Doç. Dr. Nuri ÖZKÜTÜK Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD MANİSA

2 Sunum İçeriği Mikobakterilerde direnç mekanizmaları MTB de duyarlılık testleri Ne zaman? Hangi yöntemle? Hangi ilaçlarla? TDM lerin duyarlılık testlerini; Hangi TDM için? Ne zaman? Hangi yöntemle? Hangi ilaçlarla?

3 Mikobakterilerde doğal direnç Özel hücre duvarı yapısı azalmış geçirgenlik Dışa atım mekanizmaları Beta-laktamaz enzimleri Konaktaki fizyolojik adaptasyon mekanizmaları Çoğu antibiyotiğe doğal direnç Kısıtlı seçenek

4 1943 de Streptomisin keşfedildi The drug would lead the path in the elimination of The Great White Plague Monoterapi 1948 de Streptomisin direnci British Medical Research Council (BMRC) trial Monoterapi alan çoğu hastada direnç gelişti Kombine tedavi ÇİD-TB YİD-TB

5 Dirençle ilişkili tanımlar Tek ilaca direnç: (Mono-resistant) Birden fazla ilaca direnç: (Poly-resistant) Çok ilaca direnç (ÇİD): (Multidrug-resistant, MDR) en az izoniazid ve rifampisine direnç Yaygın ilaca direnç (YİD): (Extensively drug-resistant, XDR) ÇİD e ek olarak florokinolon ve parenteral ikinci seçenek ilaçlardan (kanamisin, amikasin, kapreomisin) birine direnç Primer (yeni olguda) ilaç direnci: Daha önce tedavi almamış veya bir aydan kısa süre tedavi almış olguda görülen direnç Sekonder (tedavi almış olguda) ilaç direnci: En az bir ay kemoterapi almış olguda ortaya çıkan direnç

6 Mikobakterilerde kazanılmış direnç Vahşi M.tuberculosis suşu Spontan mutasyon ( ) Dirençli suş Seleksiyon Sekonder ilaç direnci Bulaşma Primer ilaç direnci Uygunsuz tedavi rejimi İlaç temininde zorluk Tedaviye uyumsuzluk Tanının gecikmesi Yetersiz enfeksiyon kontrolü Aşırı nüfus yoğunluğu

7 Mikobakteriyel İlaç direnç mekanizmaları İlaç İlacın etki mekanizması Dirençle ilişkili gen Gen ürününün fonksiyonu rolü Dirençte mutasyon sıklığı % Rifampisin RNA sentez inhibisyonu rpob RNA polimeraz β subunit İlaç hedefi 95 İzoniazid Pirazinamid Etambutol Streptomisin Amikasin / Kanamisin Kapreomisin / viomisin Mikolik asit sentezi inhibisyonu ve diğer etkiler Membran enerjisinin azalması Arabinogalaktan sentezi inhibisyonu Protein sentez inhibisyonu Protein sentez inhibisyonu Protein sentez inhibisyonu katg Katalaz-peroksidaz Ön ilaç dönüşümü inha Enoil-ACP redüktaz İlaç hedefi 8-43 pnca Pyrazinamidaz / nikotinamidaz Ön ilaç dönüşümü embb Arabinozil transferaz İlaç hedefi rpsl Ribozomal protein S12 İlaç hedefi rrs 16S rrna İlaç hedefi 8-21 gidb rrna metiltransferaz İlaç hedefi rrs 16S rrna İlaç hedefi 76 rrs tlya 16S rrna 2'-0-metiltransferaz İlaç hedefi Kinolonlar DNA giraz inhibisyonu gyra, gyrb DNA giraz subunit A ve B İlaç hedefi Int J Tuberc Lung Dis. 2009;13(11):1320

8 TB da İlaç Direncinin Saptanmasının Önemi İlaç direncinin doğru ve hızlı tanısı Erken etkin tedavi Direnç sürveyansı İlaç direncinin yayılımı Hastalık süresi Kür oranı Enfeksiyon kontrol önlemleri TB KONTROLÜ CLSI M24-A2 Curr Opin Pulm Med 2011, 17:134 EUCAST doc. E.DEF 8.1, 2007

9 Her hasta için kültürde izole edilen ilk M.tuberculosis izolatına duyarlılık testi uygulanmalıdır. Birinci seçenek ilaçlara karşı İDT sonuçları örnek kabul edildikten sonra 30 gün içinde bildirilmelidir. (çoğu izolat için) -CLSI M24-A2 (2011) -CDC, Fact Sheets, Diag. of Tuberculosis Dis., WHO/HTM/TB/2009

10 Mikobakteriyel Duyarlılık Test Yöntemleri Katı kültüre dayalı Konvansiyonel yöntemler Direnç oranı yöntemi Mutlak konsantrasyon yöntemi Proporsiyon (orantı) yöntemi Genotipik (Moleküler) yöntemler Line probe Assay (LPA) Real-time PCR DNA microarray DNA dizi analizi Elektroforez temelli testler SSCP PCR Heterodubleks analiz DGGE RFLP Denaturing HPLC MAS-PCR PCR-ELISA Sıvı kültüre dayalı hızlı ticari yöntemler MGIT 960 Versa TREK (ESP II) BACTEC 460 TB BacT/Alert 3D Mycolor-TK? Nonmoleküler alternatif yöntemler MODS TLA NRA Klasik Rapid Colorimetric DST (MDRXDRTB Colour Test) CRI REMA Alamar blue MTT Mikobakteriyofaj temelli testler Lusiferaz taşıyıcı faj yöntemi Faj çoğaltma yöntemi E test Sensititre MYCOTB (Trek Diagnostic)

11 Uygulama Direkt test Dekontamine ve konsantre edilmiş, ARB pozitif örnek kullanılır. İndirekt test Kültürde üremiş, saf bakteri kolonileri kullanılır. Kültüre dayalı yöntemlerde Dirençli TB kuşkusu yüksek olduğu durumlarda uygulanabilir. İndirekt testle doğrulanmalıdır Moleküler yöntemlerde Kültüre dayalı yöntemlerde Önerilen uygulama Direnç saptandığında kontaminasyon olmadığı doğrulanmalıdır Moleküler yöntemlerde

12 Katı Besiyerinde Kültüre Dayalı Konvansiyonel Yöntemler Direnç oranı yöntemi Mutlak konsantrasyon yöntemi Proporsiyon (orantı) yöntemi Sık kullanılan güvenilir bir yöntemdir. Belli bir ilaç konsantrasyonunda dirençli olan organizmaların oranının belirlenmesini sağlar. Bu oran %1 R

13 Proporsiyon Yöntemi Lowenstein-Jensen (LJ) Ekonomik Geç sonuç verir (4-6 hf) Middlebrook 7H10-7H11 Pahalı Daha hızlı (21 gün) Daha güvenilir CLSI, MD7H10 / MD7H11 besiyerinde yapılan indirekt proporsiyon test yöntemini referans yöntem olarak kabul etmektedir. (Agar Proporsiyon Yöntemi) CLSI, M24-A2

14 Hız? Konvansiyonel katı kültür ve İDT kullanarak ÇİD-TB tanısı Mikroskopi 24 saat Katı kültür 6-8 hf 1. Seçenek İDT 3-4 hf 9-12 hf sonra ÇİD-TB tanısı Sıvı kültür ve İDT kullanarak ÇİD-TB tanısı Mikroskopi 24 saat Sıvı kültür 2-3 hf 1. Seçenek İDT 1-3 hf 3-5 hf sonra ÇİD-TB tanısı WHO, A Roadmap for Ensuring Quality Tuberculosis Diagnostics Services within National Laboratory Strategic Plans, 2011.

15 Öneri 30 gün içinde duyarlılık sonuçlarını bildirebilmek için; Hızlı, kısa enkübasyon süreli, sıvı besiyerinde kültüre dayalı ticari sistemler kullanılmalıdır. CLSI, M24-A2 Aynı amaçla, DSÖ de hızlı, ticari sıvı kültür sistemlerinin kullanımını onaylamıştır. WHO/HTM/TB/

16 Sıvı Besiyerinde Kültüre Dayalı Hızlı Ticari Yöntemler MGIT 960 (Becton Dickinson) Versa TREK (ESP II) (Trek Diagnostic ) FDA onaylı Mycolor-TK? (Salubris)

17 Hız? Konvansiyonel katı kültür ve İDT kullanarak ÇİD-TB tanısı Mikroskopi 24 saat Mikroskopi 24 saat Katı kültür 6-8 hf Sıvı kültür ve İDT kullanarak ÇİD-TB tanısı Sıvı kültür 2-3 hf Çözüm? 1. Seçenek İDT 3-4 hf 1. Seçenek İDT 1-3 hf 9-12 hf sonra ÇİD-TB tanısı 3-5 hf sonra ÇİD-TB tanısı Moleküler Yöntem, sıvı kültür ve İDT kullanarak ÇİD-TB tanısı Mikroskopi 24 saat Moleküler yöntem (+) 24 saat Moleküler yöntem (-) 24 saat Sıvı kültür 2-3 hf 1-2 gün sonra ÇİD-TB tanısı 1. Seçenek İDT 1-3 hf WHO, A Roadmap for Ensuring Quality Tuberculosis Diagnostics Services within National Laboratory Strategic Plans, 2011.

18 Moleküler (Genotipik) yöntemler Line probe Assay (Ters hibridizasyon testi, LPA) Inno-LiPA Rif TB (Innogenetics) GenoType MTBDRplus (Hain LifeScience) GenoType MTBDRsl (Hain LifeScience) Real-time PCR GeneXpert MTB/RIF (Cepheid) DNA microarray Infiniti MDR-TB (AutoGenomics) DNA dizi analizi Konvansiyonel sanger yöntemi Pirosekanslama Elektroforez temelli testler SSCP (Single strand conformation polymorphism) PCR Heterodubleks analiz DGGE (double gradient denaturing gradient gel electrophoresis ) RFLP (restriction fragment length polymorphism) dhplc (denaturing high performance liquid chromatography) MAS-PCR (multiplex-allele-specific PCR) Mismatch analiz Journal of Microbiological Methods 84 (2011)

19 Ticari Moleküler yöntemlerin hedef genleri MTBDRplus (Hain LifeScience) RİF direnci rpob INH direnci katg ve inha MTBDRsl (Hain LifeScience) Etambutol direnci embb Amikasin, kanamisin, viomisin ve kapreomisin direnci rrs Kinolon direnci gyra INNOLIPA RIF TB (Innogenetics) RİF direnci rpob GeneXpert MTB/RIF (Cepheid) RİF direnci rpob Infiniti MDR-TB (AutoGenomics) RİF direnci rpob INH direnci katg ve inha PZA direnci pnca

20 MTBDRplus (Hain LifeScience)

21 Xpert MTB/RIF (Cepheid)

22 Avantajları; Dirençle ilişkili, bilinen mutasyonları saptamada duyarlı ve özgül Kültürden çalışıldığında çok az bir üreme yeterlidir Klinik örneklerden direkt çalışılabilmektedir. Laboratuvar tehlikelerini en aza indirmektedir. Çok hızlı Dezavantajları; İlaç direncine yol açan tanımlanmamış mutasyonlar yanlış duyarlı Sessiz mutasyonlar yanlış dirençli Maliyet?! İlaç Direnç geni Fenotipik dirençte mutasyon sıklığı (%) RIF rpob >95 İNH katg inha ~ %70-90 Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 155. Int J Tuberc Lung Dis. 2009;13(11):1320

23 Belli durumlarda İlaç direncinin hızlı tanısı için moleküler yöntemlerin (LPA lar ve Xpert MTB/RIF) kullanılabileceği onaylanmıştır. - CLSI, M24-A2 - WHO/HTM/TB/ WHO/HTM/TB/2011.4

24 Direnç saptamak amacı ile Hangi durumlarda moleküler yöntem kullanalım? Yayma pozitif örnekten (Direkt) İlaç direnci olduğundan kuşkulanılan hastalarda Daha önceye ait tedavi öyküsü olan Yüksek direnç oranı olan ülke veya etnik gruptan olan Tedaviye iyi yanıt vermeyen ÇİD-TB teması olan hastalar Diğer kişilere hastalığı yayabilecek geniş bir temaslı grubu olan hastalar Kültürden (İndirekt) TDM ile karışık veya diğer bakterilerle kontamine olan MTBC kültürlerinden M24-A2

25 Öneriler; Moleküler yöntem fenotipik duyarlılık testlerinin yerine kullanılamamalıdır. Saf kültür mevcut ise fenotipik testler uygulanmalıdır Sonuçları fenotipik testlerle doğrulanmalıdır. Moleküler yöntem ile ÇİD-TB ilişkili mutasyon saptandığında, hemen kültür temelli yöntem ile birinci ve ikinci seçenek ilaçlara duyarlılık test edilmelidir. M24-A2

26 Sorun ÇİD-TB nin hızlı tanısında ticari sıvı kültür sistemleri ve bazı moleküler testleri onaylanmasına rağmen, Bu testlerin maliyeti ve ileri laboratuvar alt yapısı gerektirmesi kısıtlı kaynağa sahip çoğu yerde bu teknolojilerin uygulanmasını kısıtlamaktadır. Çözüm? Daha ileri altyapı ve tekniklere erişim sıkıntısı olan laboratuvar için ticari olmayan, hızlı, ucuz ve kolay yöntemler

27 Nonmoleküler Alternatif Yöntemler MODS (microscopic observation of drug susceptibility) NRA (nitrate reductase assay) CRI yöntemleri (colorimetric redox indicator) REMA (resazurin microtitre assay ) Alamar blue MTT TLA (thin layer agar) Klasik Rapid Colorimetric DST (MDRXDRTB Colour Test) Mikobakteriyofaj bazlı testler Lusiferaz taşıyıcı faj yöntemi Faj çoğaltma yöntemi

28 DSÖ 2009 uzman grubu kararları; Kısıtlı kaynağı ve uygun koşulları olan yerlerde; 1. MODS ve NRA, ÇİD-TB kuşkulu hastaların taranmasında geçici bir çözüm olarak önerilmektedir 2. İndirekt CRI yöntemleri, ÇİD-TB kuşkulu hastalardan elde edilen MTBC izolatlarının taranmasın da geçici bir çözüm olarak önerilmektedir. (saptama zamanı daha kısa olmayacak, fakat daha ucuz olacak) 3. TLA ve Faj temelli testlerin, ÇİD-TB kuşkulu hastaların taranmasın da hızlı test olarak kullanımını önermek için yeterli kanıt olmadığına karar verilmiştir. WHO, A Roadmap for Ensuring Quality Tuberculosis Diagnostics Services within National Laboratory Strategic Plans, 2010.

29 Sonuç Farklı ekonomik koşullara ve farklı TB yüküne göre en uygun, en hızlı, en doğru, en erişilebilir testi kullanmamız gerekmektedir. İyi donanımlı, deneyimli, kalite değerlendirme programlarına katılan laboratuvarlarda uygulanmalıdır Curr Opin Pulm Med 2011,17: Int J Tuberc Lung Dis 2012,16: EUCAST document E.DEF 8.1

30 Hangi ilaçları test edelim? CLSI INH RIF EMB PZA DSÖ ve TR INH RIF EMB SM + PZA DSÖ (ekonomik alternatif) INH RIF + EMB SM PZA İkinci seçenek ilaçlar (Kanamisin, Amikasin, Kapreomisin, Ofloksasin) M24-A2 WHO/HTM/TB/ WHO/HTM/TB/ SB, Ulusal TB Tanı Lab.ları Ağı Çalışma Usul Ve Esaslarına Dair Tebliğ, 2012

31 TÜBERKÜLOZ DIŞI MİKOBAKTERİLERİN Duyarlılık Testleri Duyarlılık testleri standardize edilmiş TDM ler Yavaş üreyenler; M. avium kompleks M. kansasii M. marinum Hızlı üreyenler; Diğer TDM ler: Duyarlılık test sonuçları ile klinik yanıt uyumu? M24-A2

32 Ne zaman yapmalıyız? Sadece klinik olarak anlamlı olduğuna inanılan izolatlar için yapılır. Kan, doku, steril vücut bölgeleri izolatları 2 pozitif balgam izolatı BAL izolatı Yavaş üreyen TDM ler; Rutin duyarlılık testine gerek yok Tedavi başarısızlığı olanlarda önerilir Hızlı üreyenler; Klinik önemi olan tüm izolatlar için endikedir M24-A2

33 Hangi ilaçları test etmeliyiz? M. avium kompleks Klaritromisin R Moksifloksasin, Linezolid M. kansasii RİF R ikinci seçenek ilaçlar M. marinum RIF, Doksisiklin/Minosiklin, SXT, Hızlı üreyenler Amikasin, Sefoksitin, Siprofloksasin, Klaritromisin, Klaritromisin, EMB, Amikasin, Doksisiklin/Minosiklin, İmipenem, Linezolid, Meropenem, Siprofloksasin, Moksifloksasin, Rifabutin Moksifloksasin, SXT, Tobramisin (sadece M.chelonae için) M24-A2

34 Hangi yöntemi kullanmalıyız? Genel olarak önerilen sıvı mikrodilüsyon Yavaş üreyenler : OADC eklenmiş Cation-adjusted Mueller Hinton broth Hızlı üreyenler : Cation adjusted Mueller Hinton broth Kim yapmalı? Klinik olarak önemli mikobakterileri tanımlayabilen Yeterli bilgi ve deneyimi olan laboratuvarlar yoksa referans lab.a göndermeli veya danışılmalı M24-A2

35 Ticari mikrodilüsyon testi (Sensititre; Trek Diagnostic) Sensititre MYCOTBI M. tuberculosis Sensititre SLOMYCOI Yavaş üreyen TDM Sensititre RAPMYCOI Hızlı üreyen TDM

36 Teşekkürler