ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİBERLERDE (Capsicum annuum L.) ANTER KÜLTÜRÜNDE MEVSİM ETKİSİ VE MİKROSPOR GELİŞİMİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA 2011

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİBERLERDE (Capsicum annuum L.) ANTER KÜLTÜRÜNDE MEVSİM ETKİSİ VE MİKROSPOR GELİŞİMİ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu tez /..../2011 tarihinde aşağıdaki jüri üyeleri tarafından oybirliği/oyçokluğu ile kabul edilmiştir. İmza İmza. İmza. Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof.Dr. Kazım ABAK Doç. Dr. Nuray ÇÖMLEKÇİOĞLU Danışman Üye Üye Bu tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİBERLERDE (Capsicum annuum L.) ANTER KÜLTÜRÜNDE MEVSİM ETKİSİ VE MİKROSPOR GELİŞİMİ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİMDALI Danışman: Jüri: Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Yıl:2011, Sayfa: 89 Prof.Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof Dr. Dr. Kazım ABAK Yard.Doç. Dr. Nuray ÇÖMLEKÇİOĞLU Bu çalışma, yılları arasında Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü seraları ve Doku Kültürü Laboratuarı ile Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Sitoloji Labatuarında yürütülmüştür. Denemede Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü nde yürütülen çalışmalar sonucu düşük sıcaklığa hassas 195 nolu genotip, düşük sıcaklığa tolerant olarak bilinen 421 nolu genotip, yüksek sıcaklığa hassas olan 277A nolu genotip ve yüksek sıcaklığa tolerant olarak standart çeşit tescili yapılan İnan 3363 çeşidi kullanılmıştır Araştırmada iki farklı BAP konsantrasyonu kullanılmıştır. Denenen 4 farklı genotip için en yüksek embriyo uyartımı ve bitkiye dönüşüm oranının belirlenmesi amacıyla anterler farklı zamanlarda kültüre alınmıştır. Kültüre alınan anterlerden elde edilen embriyolar bitki büyüme düzenleyici içermeyen MS ortamlarına alınmıştır. Ayrıca ortamlara dikilen anterler Ekim, Şubat, Mayıs ve Ağustos ayında her iki ortamdan da 0.,1., 2., 3., 4., 8 ve 14. günlerde alınarak carnoy fiksasyon çözeltisi ile sabitlenmiş ve DAPİ ve Asetokarmen boyama yöntemleriyle boyanarak floresan ve ışık mikroskopları ile mikrospor gelişimleri incelenmiştir. Denemenin sonucunda gerek embriyo oluşumu gerekse oluşan embriyoların bitkiye dönüşümü genotiplere, anter alma dönemlerine ve besin ortamlarına göre değişmiştir. Genotipler arasında en yüksek embriyo verimi yüksek sıcaklıklara tolerant olarak belirlenmiş olan İnan 3363 isimli kültür çeşidinden elde edilmiştir. Anter alma dönemlerinden ise en başarılı sonuçlar Nisan ve Ağustos aylarından elde edilmiştir. Besin ortamları arasında ise Kasım, Aralık, Ocak, Nisan ve Eylül aylarında I nolu ortam (MS + 30 g/l sakkaroz + % 0.25 aktif kömür+ 15 mg/l AgNO3 + 4 mg/l NAA + 0.1mg/l BAP) ve Ekim, Mart Mayıs, Temmuz ve Ağustos aylarında II nolu ortam (MS + 30 g/l sakkaroz + % 0.25 aktif kömür+ 15 mg/l AgNO3 + 4 mg/l NAA mg/l BAP) daha başarılı bulunmuştur. Bitkiye dönüşüm, Nisan ayında daha başarılı bulunmuştur. Mikrospor gelişiminde ise tüm genotip ve ortamlarda kültüre alınan anterlerde mikrosporların çekirdekleri yüksek oranda erime ve düşük oranda bölünmeye başlamışlar, çekirdek erimesi ve bölünmesi genotip ve dönemlere göre farklılık göstermiştir. Anahtar Kelimeler: Biber, anter kültürü, mevsim etkisi, mikrospor gelişimi I

4 ABSTRACT MSc THESIS EFFECT OF SEASON ON PEPPER (Capsicum annuum L.) ANTHER CULTURE and MICROSPOR DEVELOPMENT CUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF HORTICULTURE Supervisor: Jury: Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Year:2011, Page: 89 Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof. Dr. Kazım ABAK Asst. Prof Dr. Nuray ÇÖMLEKÇİOĞLU This study was carried out at the Greenhouse and Tissue Culture Laboratory of Alata Horticultural Research Institute and the Histology Laboratory of Department of Horticulture, the Faculty of Agriculture of the Çukurova University between 2009 and Pure line three pepper genotypes one tolerant (421) and one intolerant (195) to lower temperatures, one intolerant (277A) to higher temperatures and tolerant variety (Inan 3363) to higher temperatures derived from a joint study between our department and Alata Horticultural Research Institute were employed in the present study. Two different culture media were used. The anthers were cultured at different periods (12 months) in order to determine the highest embryo stimulation and haploid plant regeneration in the examined four genotypes. Embryos were transferred to hormone free culture media for transform to plant. In addition all anthers were taken on 0.,1.,2.,3.,4.,8., and 14. days of February, May, August and October and fixed with Carnoy s solution. Development of microspores were observed cytologically using 4-6-diamidino-2-phenylindol-2HCl (DAPI) and asetocarmen stain. At the end of the study, it was determined that both embryo development and haploid plant development varied depend on genotype, anther cultivation period and culture medium. The highest embryo ratio was obtained from İnan 3363 cultivar variety that tolerant genotypes to high temperature. The anthers cultured in April and August gave the most yielding results compared to the other periods. The more embryos were obtained from the first medium (Murashige and Skoog + 30 g/l sakaroz % active coal + 15 mg/l silver nitrate + 4 mg/l naphthalene acetic acid + 1 mg/0.1 benzyl amino purin) in the November, December, January, April and September and second medium (Murashige and Skoog + 30 g/l sakaroz % active coal + 15 mg/l silver nitrate + 4 mg/l naphthalene acetic acid + 1 mg/0.5 benzyl amino purin) in October, March, May, July and August. Propotion of empty microspore increased as from first day of culture. Division of nucleus begun on the first day of anther culture. Key words: Pepper, anther culture, microspore development II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve yazım aşamasında yönlendirici katkılarıyla desteğini bulduğum Danışman Hocam Sayın Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA ya sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Çalışmamda kullandığım biber genotiplerinin tohumları sağlayan ve her türlü yardımı aldığım Dr. Davut KELEŞ e, Laboratuar çalışmasında yardımlarını esirgemeyen arkadaşlarım Nihal DENLİ, Hasan PINAR ve Ar. Gör. Hatıra TAŞKIN ve Namık Kemal YÜCEL e, çalışmam sırasında idari ve kişisel yardımı esirgemeyen Enstitü müdürü Şekip KESER e, Laboratuar çalışması sırasında gerekli yardımı hiçbir zaman esirgemeyen Haluk İhsan TEKİN e teşekkürlerimi sunarım. Çalışmam sırasında zamanlarını kullandığım ve hiçbir zaman fedakârlıktan kaçınmayan eşim Nurcan ATA ve kızım Hicran ATA ya sonsuz teşekkürler sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER.....IV ÇİZELGELER DİZİNİ....VI ŞEKİLLER DİZİNİ.... VIII SİMGELER VE KISALTMALAR... X 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOT Materyal Denemede Kullanılan Genotipler ve Özellikleri Metot Bitkilerin Yetiştirilmesi Uygun Anterlerin Seçimi Kültür Sırasında Kullanılan Malzemeler Besin Ortamları Anterlerin Çıkarılması ve Besin Ortamına Ekilmesi Mikrospor Gelişim Aşamasının Belirlenmesi Verilerin Alınması ve Değerlendirilmesi BULGULAR ve TARTIŞMA Anter Kültürü Çalışması Farklı Zamanlarda Alınan Anterlerde Embriyo Oluşturan Anter Oranı, Embriyo Oranı, Embriyo Sayısı, Bitkiye Dönüşen Embriyo Oranı ve Gelişen Bitki Oranları Ekim Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Kasım Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Aralık Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları IV

7 Ocak Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Şubat Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Mart Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Nisan Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Mayıs Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Haziran Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Temmuz Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Ağustos Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Eylül Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Denenen Genotip ve Ortamların Embriyo Oluşturan Anter Oranı, Embriyo Oranı, Bitkiye Dönüşüm ve Gelişen Bitki Oranı Aylara Göre Embriyo Oluşturan Anter Oranı Aylara Göre Embriyo Oranı Aylara Göre Bitkiye Dönüşüm Oranı Aylara Göre Gelişen Bitki Oranı Mikrospor Gelişimi Nolu Genotipin Mikrospor Gelişimi A Nolu Genotipin Mikrospor Gelişimi İnan 3363 Kültür Çeşidinin Mikrospor Gelişimi Nolu Genotipin Mikrospor Gelişimi SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1 Bitkilerin yetiştirilme dönemleri ve çalışma programı Çizelge 3.2. MS (1962) Besin Ortamının Bileşimi Çizelge 4.1. Ekim döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.2. Kasım döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.3. Aralık döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.4. Ocak döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.5. Şubat döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.6. Mart döneminde embriyo oluşturan anter oranı embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.7. Nisan döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.8. Mayıs döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.9. Haziran döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı VI

9 Çizelge Temmuz döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge Ağustos döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge Eylül döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge Aylara göre embriyo oluşturan anter oranı Çizelge Aylara göre embriyo oranı Çizelge Aylara göre bitkiye dönüşüm oranı Çizelge Aylara göre gelişen bitki oranı Çizelge nolu genotipe ait farklı zamanlarda ve farklı ortamlarda mikrospor gelişim oranı Çizelge A nolu genotipe ait farklı zamanlarda ve farklı ortamlarda mikrospor gelişim oranı Çizelge İnan 3363 genotipine ait farklı zamanlarda ve farklı ortamlarda mikrospor gelişim oranı Çizelge nolu genotipine ait farklı zamanlarda ve farklı ortamlarda mikrospor gelişim oranı VII

10 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil A nolu genotipe ait görünüm Şekil nolu genotype ait görünüm Şekil nolu genotipe ait görünüm Şekil 3.4. İnan 3363 kültür çeşidine ait görünüm Şekil 3.5. Deneme süresince deneme serasındaki maksimum, minimum ve ortalama sıcaklık değerleri Şekil 3.6. Denemede kullanılan genotiplerin anter kültürüne alınan tomurcuklarının ve anterlerinin görünümü (İnan 3363, 421, 195 ve 277A nolu genotipler) Şekil 3.7. Biber anterlerinin sabitlenmesinden bir görüntü Şekil 4.1. II nolu besin ortamında 277A nolu genotipten elde edilen bir embriyo görünümü Şekil 4.2. II nolu besin ortamında 277A nolu genotipten elde edilen bir bitki görünümü Şekil 4.3. II nolu besin ortamında İnan 3363 nolu genotipten oluşmuş embriyo görünümü Şekil 4.4. I nolu besin ortamında 277A nolu genotipten oluşmuş bitki görünümü Şekil 4.5. II nolu besin ortamında İnan 3363 kültür çeşidinden oluşmuş bitki görünümü Şekil 4.6. I nolu besin ortamında 421 nolu genotipden oluşan embriyoların görünümü Şekil 4.7. II nolu besin ortamında 421 nolu genotipden oluşmuş bir bitki görünümü Şekil 4.8. II nolu besin ortamında İnan 3363 nolu genotipten oluşmuş bitki Şekil 4.9. II nolu besin ortamında 195 nolu genotipten oluşmuş embriyo görünümü Şekil II nolu besin ortamında 195 nolu genotipten oluşmuş bitki görünümü Şekil I nolu besin ortamında 195 nolu genotipten oluşmuş embriyo görünümü VIII

11 Şekil Aylara göre embriyo oluşturan anter oranı Şekil II nolu besin ortamında 421 nolu genotipten oluşmuş embriyolar Şekil Aylara göre embriyo oranı Şekil Aylara göre bitkiye dönüşüm oranı % Şekil Farklı ortamlarda farklı genotiplerden oluşmuş bitki görünümleri Şekil Aylara göre gelişen bitki oranı % Şekil nolu genotipin Ekim ayı II nolu besin ortamında mikrospor gelişimi Şekil nolu genotipi II nolu besin ortamında mikrospor gelişimi Şekil Boş, tek, iki, ve üç çekirdekli mikrosporların floresan mikroskobu ile görünümü Şekil A nolu genotipin Ekim ayında I nolu besin ortamında mikrospor gelişimi Şekil , 2 ve 4 çekirdeğe sahip mikrosporlar Şekil İnan 3363 kültür çeşidinin Ağustos ayında mikrospor gelişimi Şekil Boş, tek, iki, ve üç çekirdekli mikrosporların ışık mikroskobu ile görünümü Şekil nolu genotipin Ağustos ayında II nolu besin ortamında mikrospor gelişimi IX

12 SİMGELER VE KISALTMALAR MS Murashige and Skoog MMS Modifiye edilmiş Murashige and Skoog 2,4-D 2,4-Dikloro fenoksi asetik asit AgNO3 Gümüş nitrat NAA Naftalen asetik asit BAP Benzil amino purin BA Benzil adenin ABA Absisik asit K Kinetin HCl Hidrojen klorür KOH Potasyum hidroksit ml Mililitre cm Santimetre gr Gram mg Miligram 1 Litre mg/1 Miligram/litre mg Mikrogram μm Mikromol DAPİ 4'-6-Diamidino-2-phenylindole BDO Bitkiye dönüşen embriyo oranı GEO Gelişen embriyo oranı ES Embriyo sayısı X

13 XI

14 1. GİRİŞ 1. GİRİŞ Bitkiler insanlığın varoluşundan buyana insan beslenmesinde çok önemli bir yere sahiptir. Bitkilerden besin olarak yararlanma ilk doğadan toplama şeklinde başlamış daha sonra üstün olan tipler korumaya alınmış, bu aşamadan sonra da tohumları alınarak ilk kültüre alma işlemleri gerçekleştirilmiştir. FAO 2007 verilerine göre bir kişinin almış olduğu ortalama kalori miktarı günlük 2796 kilo kaloridir. Bu miktarın % i bitkisel kaynaklı gıdalardan sağlanmaktadır. Günlük tüketilen toplam kalorinin % 8.72 si sebzelerden sağlanmaktadır. Bitkiler aynı zamanda ilaç ve kozmetik sanayi, enerji üretimi vb alanlarda ham madde olarak kullanılmaktadır. Solanaceae familyasında yer alan biber (Capsicum annuum L.) besin değeri ve üretiminin hızla artması nedeni ile oldukça önemli bir sebze türüdür. Dünyada toplam sebze üretiminin ( milyon ton) % 3.34 ünü (30.68 milyon ton) biber oluşturmaktadır. Türkiye 97 bin ha alanda yaklaşık 1.76 milyon ton biber üretimi ile dünya biber üreticisi ülkeler arasında üçüncü sırada yer almaktadır (FAO, 2008). Biber gıda olarak tüketiminin yanında ilaç sanayinde de kullanılmaktadır. Biberin anavatanı Orta ve Güney Amerika dır. Capsicum annuum ın geniş bir çeşitlilik gösterdiği Meksika ve Orta Amerika biberin birincil gen merkezidir. Güney ve Orta Avrupa, Afrika, Asya ve Latin Amerika nın bazı kesimleri ikincil gen merkezi olarak bilinmektedir (IBPGR, 1983). 16. yy a kadar Avrupa da bilinmeyen biber, 1493 yılında Kolombo nun Amerika yı keşfinden sonra Portekiz e ve İspanya ya getirilmiş ve 16. yy ın ortalarında da Orta ve Kuzey Avrupa ya yayılmıştır (Greenleaf, 1986). İlk kültüre alınan biber genotipleri ve yabani formları muhtemelen küçük meyveli, çok tohumlu, ince etlidir. Bu bitkilerin tohumları muhtemelen kuşlar ve diğer hayvanlar tarafından yayılmışlardır. Daha sonra insanlar, talepleri doğrultusunda olan bitkileri seleksiyon yolu ile seçmişler ve çoğaltmışlardır. Başlangıçta amatör olarak yapılan bu seçimler artan dünya nüfusu ve tüketici talepleri doğrultusunda profesyonel anlamda ıslah çalışmalarını başlatmıştır. Biberde de 20. yüzyıl boyunca meyve kalitesi, hastalıklara karşı mukavemet, erkencilik, 1

15 1. GİRİŞ verimlilik, abiyotik streslere tolerans ve bitki morfolojisinde önemli ıslah çalışmaları yapılmıştır Biberin güneyde 55 enlem ile kuzeyde 52 enlemleri arasında geniş bir aralıkta yetiştiriciliği yapılmaktadır. Optimum çimlenme sıcaklığı C arasında iken yetiştiricilik için en uygun sıcaklık C arasıdır. Ortam sıcaklıkları 32 0 C yi aştığında veya 15 0 C nin altına düştüğünde gelişmesi yavaşlamaktadır. Ülkemizde ve dünyada yetiştiriciliği yaz aylarında açıkta ve kış aylarında ise örtüaltında yapılmaktadır. Bu mevsimlerde biberin ihtiyaç duyduğu optimum iklim koşulları yeterli düzeyde sağlanamazsa verim ve kalite kayıpları oluşmaktadır. Bu nedenle optimum iklim koşullarının dışında verimliliği ve kaliteyi devam ettirebilen çeşitlerin ıslahına ihtiyaç vardır. Bu anlamda ıslah, bir popülasyonun amaç doğrultusunda genetik yapısının değiştirilerek daha verimli ya da daha dayanıklı hale getirilmesidir ve zaman alan bir süreçtir. Islah süresinin kısaltılmasında son yıllarda kullanılan bitki biyoteknolojisi en önemli araçlardan bir tanesidir. Bitki biyoteknolojisi kısaca biyolojik bilimlerdeki gelişmelerin, teknolojideki gelişmler yardımıyla uyguluamaya ve ticari amaçlara yönelik kullanılması şeklinde tanımlanabilir (Kaya 2001). Bitki biyoteknolojisinin amacı, bitkisel üretimde bilinen klasik yöntemlerle çözülemeyen veya çözümü güç olan problemlere çözüm getirerek, daha ekonomik, kalite ve kantite yönünden daha yüksek bitkisel üretimin gerçekleştirilmesine yardımcı olmaktır (Hatipoğlu, 1997). Bitkilere uygulanan biyoteknolojik yöntemlerden biride Doku Kültürü Teknikleridir. Doku kültürü teknikleri içerisine giren haploid bitki üretimi bitki ıslahında önemli bir yere sahiptir (Heiser, 1976; Andrews, 1985). Haploidi tekniği ıslah sürecini kısalttığı için sebze ıslahında geniş uygulama alanı bulmuştur. Haploid bitkilerin en önemli kullanım alanı kendine uyuşmaz türlerde bile tamamen homozigot katlanmış dihaploid hatların hızlı üretimidir. Geleneksel yöntemlerle de saf hatlar elde edilebilir. Fakat bu işlem yabancı tozlanan bitkilerde 10-12, kendine tozlanan bitkilerde 6-7 yıl sürer. Dioik türlerde ise kendileme olanaksızdır. Haploidi yöntemleri ile bu süre 1-2 yıla inmektedir. 2

16 1. GİRİŞ Klasik ıslah çalışmalarında genotiplerin seçilmesi ve bu seçilen genotiplerin saflaştrılması uzun yıllar almaktadır. Ayrıca düşük ve yüksek sıcaklık gibi abiyotik şartlara toleranslık biberde bir çok gen tarafından kontrol edilmekte buda dayanıklılığın yeni nesillere aktarılmasını zorlaştırmaktadır. Denemeler sonucunda herhangi bir stres faktörüne karşı dayanıklı veya tolerant olduğu belirlenen heterozigot bireylerin istenen özellikleri kaybetmeden saflaştırılması haploidizasyon yöntemi ile daha kolay olmaktadır. Haploid kromozom sayısına sahip bitkilerin elde edilmesi ve bunların kolhisin gibi bazı maddelerle kromozom sayılarının iki katına çıkartılmasıyla bir yıl içerisinde % 100 homozigot saf hatlar elde etmek mümkün olabilmektedir. Böylece 5 6 yıl süren homozigotlaştırma işlemini 1 yılda, ıslah çalışmalarını da 3 4 yıl gibi bir sürede tamamlama olanağı ortaya çıkmaktadır. Doğada ortaya çıkış sıklığı az ve düzensiz olan haploid bitkiler yeterli miktarda olmadığı ve istendiği zaman bulunamadığı için ıslah çalışmalarında kullanılabilme özelliğine sahip değillerdir. Erkek veya dişi gamet hücrelerinden in vitro koşullarda haploid embriyo ve bitki elde etme olanağı sağlayan doku kültürü teknikleri birçok bitki türünde dihaploidlerin elde edilmesinde faydalıdır. Solanaceae ve Cruciferae familyalarına ait türlerin birçoğunda anter ve mikrospor kültürleri yoluyla androgenetik haploidler elde edilebilirken, Cucurbitaceae familyasına ait sebze türlerinde eksik polenle uyartım yoluyla daha olumlu sonuçlar alınabilmektedir. Koleva-Gudeva ve ark. (2007) nın bildirdiğine göre; ilk anter kültürü yoluyla in vitro haploid biber çalışması Wang ve ark. (1973) tarafından yapılmıştır. Biberde anter kültürü yoluyla ilk polen embryogenesisi 1973 yılında George ve Narayanaswamy tarafından yapılmıştır. Tekrar edilebilir metot Dumas de Valux ve ark. (1981) tarafından geliştirilmiştir. Ellialtıoğlu ve Tıpırdamaz (2002) bildirdiğine göre ülkemizde biberde anter kültürü yoluyla ilk çalışmalar Abak (1983) tarafından yapılmış, Türkiye orijinli biber genotiplerinde uygun besi ortamında % 10,38 kadar ulaşan haploid bitki elde edilmiştir. Bu yöntemle oluşan haploid bitkilerin kromozom sayıları katlanarak elde edilen saf hatlar, çeşit geliştirmeye yönelik ıslah programlarında kullanılmıştır. 3

17 1. GİRİŞ Biberde anter kültürü ıslah çalışmalarında kullanılmakta ve bu yolla yeni çeşitler geliştirilmektedir. Ancak embriyo ve bitkiye dönüşümde; yetiştirilme koşulları, ortam, uygulama zamanı ve genotipe göre farklılık göstermesi ve bütün genotiplerde yüksek oranda haploid bitki elde edilememesi yöntemin yaygınlaşmasını engelleyen faktörlerdir. Bu çalışmanın amacı farklı iklim isteğine sahip biber genotiplerinin (düşük ve yüksek sıcaklığa hassas ve tolerant genotiplerin) bir yıl boyunca her ay embriyo ve bitkiye dönüşüm oranları tespit edilerek; farklı iklim istekleri ile embriyo ve bitkiye dönüşüm arasında bir ilişkinin varlığını ortaya çıkarmaktır. Ayrıca farklı mevsimlerde tüm genotiplerden alınan anterlerde mikrospor gelişimi de incelenmiştir. 4

18 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlk erkek üreme hücresi kökenli haploid bitki 1920 yılında bodur bir pamuk bitkisinde keşfedilmiştir (Dunwell, 2010). Köksal, (1999) tarafından bildirdiğine göre haploidi konusundaki ilk çalışma 1922 yılında Blakeslee ve ark. tarafından Datura stroamonium bitkisinde yapılmıştır. Daha sonra, pek çok bitki türünde haploid bitki elde etme amacıyla gerek dişi gerekse erkek gamet hücreleri kullanılmıştır yılında Guha ve Maheswari, 1967 yılında da Bourgin in katkılarıyla geliştirilen erkek gamet hücrelerinin kullanıldığı anter kültürü tekniği ile bugün birçok bitkide haploidi yöntemi ıslah programlarında kullanılır hale gelmiştir (Oinuma, 1977; Dumas de Vaulx, 1979; Henry ve Buyser, 1983). Dumas de Vaulx ve ark (1981), Capsicum annuum da anter kültürünün başlangıç döneminde yüksek sıcaklığın (35 C) androgenesise tepkiyi teşvik ettiğini bulmuşlardır. Bajaj, (1990) anter kültüründe başarının genotip, donör bitkinin yetiştirme şartları, anter ve çiçek gözüne yapılan ön uygulamalar, mikrospor gelişme safhası ve inkübasyon koşulları gibi çok sayıda şartlara bağlı olduğunu bildirmiştir. Kristiansen ve Andersen (1993), donör bitkinin sıcaklığı, fotoperiyot ve yaşının mikrospor kültürü üzerine etkisini incelemişler; bitkinin yetiştirme sıcaklığı ve yaşının embriyo gelişimine etkili olduğunu fakat fotoperiyodun etkili olamadığını bildirmişlerdir. Abak (1983), tarafından yapılan bir araştırmada Türkiye orijinli biber materyalinde anter kültürü yoluyla haploid bitki elde etmeye olanak verecek uygun bir besin ortamı ve yöntemi bulmak amaçlanmıştır. Bu amaçla, anter kültürü için en elverişli tomurcuk gelişme döneminin saptanması; kültüre alma işlemi öncesinde uygulanan bazı işlemlerin etkisini incelemeye; besin ortamına katılan büyümeyi düzenleyici maddeler (kinetin ve 2,4-D), sakkaroz ve demir bileşiklerinin değişik dozlarının etkilerini araştırmaya yönelik denemeler yapılmıştır. Elde edilen bulgular ince uzun meyveli yerli biber materyali için en elverişli anter gelişme döneminin (mayoz bölünmeyi izleyen birinci mitoz başlangıcı), tomurcukların mm iriliğine ulaştıkları zamana rastladığını göstermiştir. Anterlerin dikim öncesi nemce 5

19 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR doymuş atmosferde, 25 ºC ve 35 ºC sıcaklıklarda tutulması herhangi bir olumlu etki meydana getirmemiştir. En başarılı sonuçlar, besin ortamına 5 mg/l kinetin, 5 mg/l 2,4-D, 120 g/l sakkaroz, 37.3 mg/l Na 2 EDTA+27.8 mg/l FeSO 4 7H 2 O katılması ile elde edilmiştir. Bu yolla oluşan haploid bitkiler kolhisin yardımıyla diploid hale getirilebilmiş ve saf hatlar üretilebilmiştir. Chuong ve Beversdorf (1985), Brassica napus un 6 ve Brassica carinata nın 1 çeşidinden izole edilen mikrosporları % 13 (W/V) sakkaroz, 0.05 mg/l BA ve 1.00 mg/l NAA eklenerek modifiye edilmiş Nitsch ve Nitsch (NN) ortamında kültüre almışlardır ºC arasındaki sıcaklıklarda embriyogenik tepkiler görülmüştür. En yüksek embriyo yoğunluğu 30ºC de olmuştur ve her anterde 7 54 embriyo gelişmiştir. 30ºC de en yüksek embriyo yoğunluğuna karşın, daha düşük sıcaklıklardaki kültürlerde embriyo kalitesi daha iyi olmuştur. 32ºC de 3 gün inkübasyonu takiben 25ºC de inkübasyon da hem yüksek embriyo verimi hem de yüksek normal embriyo yüzdesi sağlanmıştır. Mikrosporlardan bitkiciklerin gelişimi hem ortamdan hem de genotipten etkilenmiştir. Vegara ve Havranek (1985), biberde yapmış oldukları çalışmada standard ve azaltılmış MS ortamları kullanarak düşük düzeyde embriyo elde ettiklerini, aktif kömürün varlığı embriyo gelişmini ve kültürün canlılığını uzattığını ve anterlerden uzaklaştırılarak başka ortamlara alınan embriyoların tamamının bitkiye dönüştüklerini bildirmişlerdir. Ayrıca ortamdaki FeEDTA varlığının globuler embriyonun oranını artırdığını bildirmişlerdir. Morison ve ark (1986), Capsicum annuum un farklı genotiplerinde yapılan anter kültüründe elde edilen embriyo sayısının ve bunların bitkiye dönüşüm oranlarının farklı olduğunu bildirmişlerdir. Oluşan embriyoların çoğunun bitkiye dönüşmediği, embriyonun bir ucundan kök diğer ucundan kallus oluşumu şeklinde anormal bitki oluşumu gözlendiğini bildirmişlerdir. Lu ve ark. (1991), 22 yazlık buğday çeşidini tarla, sera ve büyütme çemberinde yetişmişler ve ortamlara alınan anterlerde kallus verimini incelemişlerdir. Açık arazi koşullarında yetişen bitkilerden alınan anterlerde kallus verimi yüksek bulunmuş, bunun bitkinin yaşamış olduğu stres faktörlerinin neden 6

20 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR olabiliceğini bildirmişlerdir. Ayrıca denemeye alınan genotipler arasında kallus verimi açısından farklılık bulmuşlardır. Karakullukçu ve Abak (1992), dört değişik patlıcan genotipinin anter kültürüne verdikleri yanıtı incelemişlerdir. En iyi sonuç Halep Karası çeşidinden %7.8 oranında embriyo verimi, % 4.4 oranında haploid bitki ile elde edilmiştir. Adana Topağı, Birecik Yerlisi ve Black Beauty çeşitlerinin anterlerinde irileşme olmuş, kallus gelişmiş, ancak embriyo ve haploid bitki gelişmemiştir. Yang ve ark. (1992), ilkbaharda çiçek tablası oluşturan karnabar genotipinde embriyogenesis için donör bitkinin yetiştirildiği kültür koşulları, tomurcuk büyüklüğü, karbon kaynağı ve miktarı ve sitokinin (BAP) miktarını araştırmışlar; C sıcaklığın olduğu kış ve ilkbahar aylarının yaz ve erken aylarından daha uygun olduğunu, tomurcuk büyüklüğünün ilk polen mitozu aşamasının daha yüksek olduğunu, sukrozun en iyi karbon kayanağı olduğunu ve 140 mg/l en uygun doz olduğunu ve sitokinin kaynağı olan BAP ın embryo verimini negatif yönde etkilediğini bildirmişlerdir. Tiainen (1992), patateste yapmış olduğu anter kültürü çalışmasında Ağustos ayından Temmuz ayına kadar her ay anterleri kültüre almıştır. Ayrıca tomurcuklar +6 C ve +30 C ön sıcaklık uygulamalarına tabi tutulmuştur. Çalışmada hiçbir ön uygulamanın yapılmadığı kontrol grubu ve +6 C lik ön uygulamanın iyi sonuç verdiği belirlenmiştir. Sonuçlar aylar bazında değerlendirildiğinde, Eylül ve Ekim aylarında yüksek sonuçlar (% 15-20) elde edilmiştir. Ancak bu embriyolardan sadece % 6-8 oranında bitkiye dönüşüm sağlanmıştır. Şubat-Mayıs arasındaki aylarda alınan anterlerde embriyo oluşum oranı % 1-3 oranında olmuştur. Karakullukçu ve Abak (1993), besin ortamına değişik düzeylerde katılan bazı organik maddelerin (sakkaroz, glukoz), aktif kömür ve büyümeyi düzenleyicilerin (kinetin, zeatin, 2,4-D, NAA) patlıcan anter kültüründe haploid bitki oluşumu üzerine etkilerini araştırmışlardır. İlk 12 gün boyunca % 12 sakkaroz; % 3 glikoz veya % 6 sakkaroz + % 6.3 glukoz uygulamalarından daha iyi sonuç vermiştir. Aktif kömürün embriyo oluşumuna olumlu bir etkisi gözlenmemiştir. Anterler, kinetin + 2,4-D kombinasyonlarında, zeatin + 2,4-D veya kinetin + NAA kombinasyonlarına göre daha iyi cevap vermişlerdir. Çalışmanın değişik 7

21 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR aşamalarında 5 mg/l kinetin + 5 mg/l 2,4-D ve % 12 sakkaroz kullanılan ortamlarda % 12.1 (Baluroi F1), % 1.5 (Kemer) ve %3.8 (Halep Karası) oranlarında embriyo elde edilmiştir. Mityko ve ark (1995), biberde 4 ıslah hattı, 7 kültür çeşidi ve bunların melezlerinin anter kültürüne tepkisini incelemişlerdir. Korolla ile kaliksin aynı uzunlukta olduğu ya da bir parça geçtiği aşamada toplanan tomurcuklar ilk 8 gün karanlıkta bekletilmiştir. Anterlerin kültüre alınmasından gün sonra embriyo oluşumları gözlenmiştir. İki kültür çeşidi dışındaki bütün genotiplerde bitkiye dönüşüm sağlanabilmiştir. Flow sitometri ile ploidi seviyeleri belirlenen androgenik bitkilerden, haploid ve spontan dihaploidler elde edilebilmiştir. Bitkiye dönüşüm oranları kullanılan genotiplere göre değişmiştir. En iyi sonuç Feherözön çeşidinden elde edilmişledir. Matsubara ve ark (1998), 6 biber genotipini Temmuz ayından Kasım ayına kadar her ay anterleri 0.004mg/l 2,4 D, 0.1 mg/l kinetin, 30 gr/l sukroz ve 2 g/l gelrite içeren MS ortamına dikerek 35 0 C 24 saat inkübe etmişler ve 25 0 C de 16 aydınlık 8 saat karanlık koşullarda kültür koşullarına bırakmışlardır. Sıcaklığın C olduğu Eylül ve Ekim aylarında embriyo ve kallus oluşumu diğer zamanlara göre daha yüksek bulunmuştur. Cheongyang ve Fusihimi Amenega çeştilerinde kallus daha yüksek bulunurken Shishitou ve California Wonder çeşitlerinde embriyo daha çok oluştuğunu bildirmişlerdir. Dias ve Martins (1999), Brassica oleracea nın 27 genotipinde, anter kültürü yöntemi ile embriyo elde edilmesinde gümüş nitratın 3 farklı konsantrasyonunun etkisini araştırmışlardır. Besin ortamına gümüş nitrat ilave edilmesiyle embriyo verimi genotiplerin büyük bir kısmında önemli derecede yükselmiştir. En iyi sonuçlar 10 mg/l AgNO 3 eklenmesi ile elde edilmiştir. Elde edilen sonuçlar Brassica oleracea genotiplerinde anter kültürü ortamına gümüş nitrat ilavesinin embriyo üretimini artıracağını göstermiştir. Çömekçioğlu ve ark. (1999), Şanlıurfa ve Kahramanmaraş biber popülasyonlarında MS ortamına eklenen 4mg/ NAA, 0.1 mg/l BAP, % 0.25 aktif kömür, 30 g/l sakkaroz ile AgNO 3 0 ve 10 mg/l dozlarını denemişler; 0 mg/l AgNO 3 dozunda her iki popülasyonda da embriyo elde edemediklerini 10 mg/l AgNO 3 8

22 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR dozunda Şanlıurfa popülasyonunda % 30.0, Kahramanmaraş popülasyonunda ise % 7.5 embriyo elde ettiklerini bildirmişlerdir. Terzioğlu ve ark. (2000), tarafından Kahramanmaraş biber populasyonunda anter kültürü yapılarak, iki farklı inkübasyon koşulunun embriyo oluşumu üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Denemeler sonucunda 29 0 C de ve sürekli ışıklandırılan koşullarda bekletilen anterlerden elde edilen embriyo sayısı, ilk sekiz gün 35 0 C ve karanlıkta tutulan, daha sonra fotoperiyodik düzende aydınlatılan ve 25 0 C ye ayarlanmış iklim odasında bekletilen anterlerden elde edilen embriyo sayısından daha fazla bulmuşlardır. Çiner ve Tıpırdamaz (2002), Capsicum annuum L. tomurcuklarına 4 0 C de 48 ve 96 saat sürelerde bekletilerek yapılan soğuk şoku uygulamalarının, besin ortamına % 0.25 oranında aktif kömür katılmasının embriyo oluşumuna etkileri incelemişlerdir. MS temel besin ortamına 4 mg mg/l Naftalen Asetik Asit (NAA) ve 1 mg/l Benzil Adenin (BA) veya 1 mg/l NAA ve 4 mg/l BA, % 0.8 agar ve % 3 sakkaroz katılmıştır. En yüksek embriyo oluşumu 4 mg/l NAA ve 1 mg/l BA ve aktif kömür içeren MS besin ortamında kültüre alınan hiçbir ön uygulama yapılmayan kontrol grubu anterlerinden elde edilmiştir. Ortalama androgenik embriyo oluşumu % 12.5 civarında olduğunu belirlemişlerdir. Besin ortamına katılan büyüme düzenleyicileri ve aktif kömürün biber anter kültüründe embriyo oluşturma frekansı üzerinde, soğuk şoku uygulamalarına göre daha etkin olduğu belirlenmiştir. Diğer yandan bu biber genotipinin mikrospor gelişim aşamalarını araştırmışlardır. Sitolojik incelemeleri asetokarmin ezme yöntemi ve parafin metodu kullanılarak yapmışlardır. Tomurcuk büyülükleri, tomurcuk ve anter morfolojileri tanımlanmış ve mikrospor aşamalarını belirlemişlerdir. Çapı 5 mm, uzunluğu 7 mm olan, korolla seviyesinin kaliks ile aynı veya biraz daha uzun olduğu gelişme dönemindeki tomurcukların tek çekirdekli ve 1. polen mitozu aşamasındaki mikrosporları içerdiğini saptamışlardır Ellialtıoğlu ve Tıpırdamaz (2002), ülkemizde biberde anter kültürü yoluyla ilk çalışmaların Abak (1983) tarafında yapılmış olduğunu, Türkiye orijinli biber genotiplerinde uygun besi ortamında % e kadar ulaşan haploid bitki elde edildiğini bildirmiştir. Bu yöntemle oluşan haploid bitkilerin kromozom sayıları 9

23 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR katlanarak elde edilen saf hatlar, çeşit geliştirmeye yönelik ıslah programlarında kullanılmıştır. Ercan ve ark., (2001) 5 adet biber çeşidinde yaptıkları anter kültürü çalışmasında 3 farklı besin ortamının kinetin, BA, NAA, 2,4-D ve aktif kömür içeren toplam 11 farklı versiyonunu kullanmışlardır. Araştırmada, %1 aktif kömür+5 mg/l 2,4-D+5 mg/l kinetin içeren ortamlar ile aktif kömür+4 mg/l NAA+0.1 mg/l BA içeren MS besin ortamında, 35 C de 8 gün karanlıkta bekletilen anterlerden embriyo elde edilebilmiştir. Ellialtıoğlu ve Tıpırdamaz, (2002) 11B14 ve Demre Sivrisi biber çeşitlerine ait çiçek tomurcuklarına yapılan soğuk şoku uygulamalarının ve besin ortamına çift fazlı sistemde katılan aktif kömürün; anter kültüründe, anterlerdeki içsel absisik asit miktarı üzerine etkilerini inceledikleri çalışmalarında; denemelerde kullanılan soğuk şokları ve aktif kömür katkısının, anterlerdeki ABA miktarını azaltırken; embriyo oluşturma yönünde olumlu bir etki yapmadığı bildirmişlerdir. Rodeva ve ark. (2004), 20 Bulgaristan biber genotipinin anter kültürüne uygunluğunu denedikleri çalışmasın 2 genotip indirek organagesis olurken diğer genotipler direk embriyogenesis olduğunu bildirmişlerdir. Çağlar ve ark. (2004), Kahramanmaraş kırmızı biberlerinde (Capsicum annuum L.) androgenesis yoluyla in vitro haploid embriyo oluşturma amaçladıkları çalışmalarında MS ortamına eklenen NAA, 2,4-D, ve ile sitokininlerden BAP ve kinetinin farklı dozları, ayrıca besin ortamlarına eklenen aktif kömür (% 0.25) ve AgN0 3 (10 mg/l) dozları ve yedi gün süre ile 4 o C, 29 o C ve 35 o C karanlık ön uygulamasının 37 farklı kombinasyonu denemişler; bazı ortamlarda sadece kallus olurken, MS + 0.1mg/l BAP + 4 mg/l NAA + % 0.25 aktif kömür + 10 mg/l AgNO 3 bileşimli besin ortamına dikilen anterlerde hiç kallus gelişimi olmadan % 2.8 oranında haploid embriyo gelişimi sağladıklarını bildirmişlerdir. Büyükalaca ve ark. (2004), biber bitkisinde İn vitro da anter kültürü yöntemi ile haploid embriyo üretimi için besin ortamalarına eklenen dört farklı gümüş nitrat konsantrasyonunu (5, 10, 15, 20 mg/l) test etmişlerdir. Anterleri hem açık alandan hemde serada yetiştirilen bitkilerden toplamışlar, test edilen bütün konsantrasyonlarda farklı üretim oranlarıyla haploid embriyo oluşumu 10

24 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR gözlemlenmişlerdir. En yüksek embriyo veriminin 15 mg/l gümüş nitrat içeren ortamdan elde edildiğini, ve serada yetiştirilen bitkilerden alınan anterlerin, açık alanda yetiştirilen bitkilerden alınan anterlere göre daha fazla embriyo verdiğini bildirmişlerdir. Mohamed ve Refaei (2004), yazlık kabaklarda yaptıkları çalışmada tohum ekimlerini Mart, Nisan ve Mayıs ile Eylül, Ekim ve Kasım aylarında gerçekleştirmişler ve bitkilerden anterleri kültür ortamlarına alarak kallus ve bitkiye dönüşümünü incelemişlerdir. Gün uzunluğunun daha az, sıcaklığın düşük olduğu Mart, Ekim ve Kasım aylarında kallus çapı ve rejenere olmuş bitki oranının diğer aylara göre yüksek olduğunu bildirmişlerdir. Rejenere olan bitkilerin sitolojik olarak incelediklerinde de ise % 60 nın haploid % 23 nın diploid % 17 sinin aneuploid olduğunu bulmuşlardır. Taşkın (2005), biberde anter kültürü ile ilgili yaptığı bir çalışmada; Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsünde üç defa kendilenmiş düşük sıcaklığa tolerant olarak belirlenen A71, A269, A313 nolu genotipleri, orta derecede tolerant olarak belirlenen A109 nolu genotipi ve duyarlı olarak belirlenen A74 nolu genotipi ve dört farklı kültür ortamı kullanmıştır. Denenen 5 farklı genotip anterler farklı zamanlarda kültüre almıştır. Ayrıca kültüre alınan ortamlarda gelişmesini tamamlayamayan embriyolar 10 gün süresince 0.5 mg/l absisik asit içeren besin ortamına alınarak absisik asitin embriyo olgunlaşmasına etkisi belirlenmeye çalışmıştır. Denemenin sonucunda gerek embriyo oluşumu gerekse oluşan embriyoların bitkiye dönüşümünün genotiplere, anter alma dönemlerine ve besin ortamlarına göre farklı olduğunu ve genotipler arasında en yüksek embriyo verimini soğuğa tolerant olarak belirlenmiş olan 269 nolu genotipten, anter alma dönemlerinden ise en başarılı sonuçlar Nisan ve Mayıs aylarından elde ettiğini, besin ortamları arasında ise (MS + 30 g/l sakkaroz + % 0.25 aktif kömür + 15 mg/l gümüş nitrat + 4 mg/l NAA + 1 mg/l BAP) ve (modifiye edilmiş MS + 30 g/l sakkaroz + % 0.25 aktif kömür + 15 mg/l gümüş nitrat + 4 mg/l NAA + 0.1mg/l BAP) diğer ortamlara göre daha fazla sayıda embriyo tespit etmiştir. Ayrıca olgunlaşmamış embriyolara absisik asit uygulamasından olumlu bir sonuç alınamadığını bildirmiştir. Sayılır ve Özzambak (2005), 6 kültür çeşidi kullanarak 3 tomucuk büyüklüğü 11

25 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ve MS ve N temel besin ortamalarına eklenen 4 mg/l NAA+ 0.1 mg/l BA aktif karbon ve havuç eksraktı ve bunlardan hiçbirinin eklenmediği 6 farklı kültür ortamı kullanarak yaptıkları çalışmalarında, Çarliston Bağcı 5-6 mm tomurcuk büyüklüğü ve MS+4 mg/l NAA+ 0.1 mg/l BA % 0.1 aktif kömür ve 200 ml havuç ekstraktı en iyi sonucu verdiğini bildirmişlerdir. Ercan ve ark. (2006), donör bitkinin yetiştirme mevsimi ve yaşının anter kültüründe embriyo oluşumuna etkisini araştırmışlar; Sera Demre 8 ve Kekova F1 çeşitlerini kullanarak yaptıkları çalışmada kış sezonunda Sera Demre 8 çeşidi en yüksek embriyo vermiş, her iki çeşitte de en yüksek embriyo oranına 4 aylık bitkilerden alınan anterlerden elde etmişlerdir. Koleva-Gudeva ve ark. (2007), 5 farklı ortam, 3 farklı ön uygulama ve 9 genotip ile biberde yaptıkları anter kültürü çalışmasında ortamlar ve genotipler arasında farklılık olduğunu bildirmişlerdir. Nowaczyk ve Kisia (2006), ıslah hatları ATZ1, PO ve bunların melezi ile yaptıkları anter kültürü çalışmasında anderogenesis % 40 ile ATZ1, % 3.0 PO ve % 1,5 ATZ1 x PO olduğunu bildirmişlerdir. En uygun safhanın taç yaprağın çanak yaprağa eşit veya daha uzun olduğu safha olduğunu tespit etmişlerdir. Keiffer ve ark., (1992) alabaş da yaptıkları anter kültürü çalışmasında kullandıkları 6 genotipde yüksek oranda embriyo elde ettiklerini bildirmişler. Ayrıca kültür süresince mikrospor canlılığını incelemişler, kültürün 9. günü canlı mikrospor oranının % 0 a kadar düştüğünü mikrospor canlılığı ile embriyo verimi arasında ilişkinin olmadığını ve kültürün ilk günlerinde yüksek sıcaklığa mikrosporların hassas olduğunu bildirmişlerdir. Kaltchuk-Santos (1997), 2 adet erken çiçeklenen Brezilya soya fasulyesi çeşitlerine C ön soğuk uygulaması yapmıştır. 0, 5, ve 10. gün soğuk şoku uyguladıkları bitkilerden çiçek tomurcukları toplayarak yaptıkları anter kültürü çalışmasında ilk 4 hafta mikrospor bölünmesini incelemişler, ön soğuk uygulamasının simetrik bölünmeyi veya çoklu çekirdek varlığını etkilemediğini bildirmişlerdir. Çok çekirdekli yapıların simetrik veya asimetrik bölünme sonucu olabiliceğini bildirmişlerdir. Kallus ve embriyo uyartımı için en iyi ortamın B

26 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR mg/l 2,4-D ve 0.5 mg/l BA olduğunu bildirmişlerdir. Histolojik analizin bu sonuçları desteklediğini bildirmişlerdir. Nitta ve ark. (1997), kolza ve lahana üzerinde yaptıkları anter kültürü çalışmasıda kültürün ilk 24 saatinde mikrosporun hacimsel olarak büyüdüğünü ve embriyonik ve embriyonik olmayan mikrosporların aynı özellikleri taşıdığını, bundan sonra embriyonik mikroporların 2 farklı morfolojik değişikliğe uğradığını, birincisi hücre hacminin çimlenme açıklığından genişlediğini, ikncisi mikrospor yığınlarının hücre yüzeyinde hacimsel olarak büyüdüğünü, binucleate mikrosporların bölünmesini ilk üç günde meydana geldiğini ve mikrospor bölünmelerin sırasıyla kolzada % 42.8, 61.8 ve 56.8 asimetrik, % 43.2, 38.2 ve 57.2 si simetrik, lahanada ise % 94.8, 81.4 ve 78.5 asimetrik, % 5.4, 18.6 ve 21.5 simetrik olduğu, bildirmişlerdir. Peng ve ark. (1997), farklı büyüklükteki kuşkonmaz çiçek tomurcuklarını , , , , ve mm olarak erken, orta ve geç tek çekirdekli olarak sınıflayarak 7 gün soğuk ön uygulamaya tabii tuttuktan sonra çiçek tomurcuklarının safhalarının değiştiğini bildirmişlerdir. Bu aşamada yaptıkları incelemede tek hücreli mikrosporların simetrik olarak daha çok bölündüğünü bildirmişlerdir , , mm büyüklüğünde çiçek tomurcukları için bölünmenin % 4.9, % 27.2 ve % 11.4 oranında simetrik gerçekleştiği bildirilmiştir , , mm büyüklüğünde tekrar sınıflanan çiçek tomurcuklarında çıkartılan anterler 500 mg/1 cassein hydrolysate, 800 mg/1 glutamine, 2000 mg/l maya ekstraktı, 2 mg/1 NAA, 1 mg/l BA ve % 6 sukroz içeren MS kültür ortamına dikmişler, mikrosporun kallus üretimi ile geç tek çekirdekli mikrospor aşaması arasında önemli bir ilişki bulmuşlardır. Kuşkonmazda simetrik ilk bölünme ile mikrospor androgenesisinin meydana geldiği bildirmişlerdir. Pescitelli ve Petolino (1998) mısır anter kültüründe in vivo ve in vitro mikrospor gelişmesini belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada; farklı zamanda kültüre alınan anterlerde mithramycin boyama yardımıyla floresan mikroskobu ile anormal mikrospor bölünmesi, çok çekirdekli kütleler, ve embriyo benzeri yapıları incelemişlerdir. Anormal mikrospor bölünmesinin kültürün 7. günü en yüksek seviyeye çıktığını, vejetatif hücrelerin bölünmesinin % 50 yi aştığını, çok çekirdekli 13

27 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR kütlelerin ve embriyo benzeri yapıların ilk olarak 14 günde ortaya çıktığını ve mikrosporların çoğunluğunun çok çekirdek yapıya ulaşamadığını bildirmişleridir. Kim ve ark. (2004), yaptıkları sitolojik çalışmada 0.1 mg/l NAA ve 0.1 mg/l kinetin içeren ortamlara anterleri yerleştirmişler ve yerleştirilen anterlerde 0, 2, 4, 7, 9, ve 14. günlerde DAPİ boyama yöntemi ile mikrosporların gelişimini incelemişlerdir. Anter kültürünün ikinci gününden itibaren ölü polen sayısında önemli bir artış gözlemlemişlerdir. Kültürün 4. gününden itibaren vegetatif çekirdek bölünmesi sonucu oluşan 4 ve daha fazla miktarda hücre çekirdeğinin görüldüğünü ve genaratif çekirdek bölünmesi sonucu oluşan bir embriyoya rastlamadıklarını bildirmişlerdir. Pintos ve ark (2005), mantar meşesi (Quercus suber L.) bitksinde yaptıkları anter kültürü çalışmasında; ilk 4 hafta kültüre alınan anterleri sitolojik yönden incelemişlerdir. Mikrosporların çoğunluğunun ön sıcaklık uygulamasına olumlu tepki verdiğini, ön sıcaklık uygulamasının simetrik bölünmeyi teşvik ettiğini, simetrik olarak bölünmeye başyan mikrosporların çoğunluğunun proembriyoyu oluşturduğunu, kültürün 24. günü globuler ve kotilodenal embriyonun gözlendiğinin ve bu embriyoların bitkiyi oluşturduğunu bildirmişlerdir. Gonzalez ve Jouve (2005) üç tritikale genotipinin anterlerini 2 hafta C de ön uygulamaya tabi tuttuktan sonra; 2 farklı dozda 2,4-D içeren N6 ortamı içerisine anterleri dikmişler ve 0, 1, 2, 3, 5, 8, 10, 14 ve 21. günlerde ortamlardan alınarak mikrospor bölünmesini inceledikleri çalışmalarında, ön uygulama süresince mikrosporlar yaşarken kültürün ilk gününden itibaren ölmeye başladığını, ölüm oranlarının 21 günde % arasında değiştiğini, simetrik bölünme ortamlarda % asimetrik bölünme ise % olarak gerçekleştiğini bildirmişlerdir Supena ve ark., (2005), biberde yapmış oldukları mikrospor çalışmasında kültürün ilk haftasından itibaren çekirdek bölünmesinin gerçekleştiği, boş mikrosporların arttığı ve mikrosporların düşük oranda bölünerek embriyo elde ettiklerini bildirmişlerdir. Bal ve ark. (2009), tütün mikrospor embriyogenesinde kullanılan protokolu modifiye ederek patlıcan mikrosporları üzerinde kullanmışlardır. B ortamına 14

28 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR mannitol ekleyerek 6 gün süresince 33 0 C stres uygulanan mikrosporların ve AT3 ortamına aktarıldığını ve daha sonra +4 0 C, C ve C de 2 gün süresince inkübe edildiğini, ön uygulamadan sonra 0.25 M maltoz içeren AT3 ortamına tranfer edildiğini ve 25 0 C karanlık koşullarda tutulduğunu bildirmişlerdir. Bu uygulamalara tabi tutulan mikrosporların 1 ve 2 hafta sonra çok çekirdekli yapılar oluşturduğunu ve DAPİ boyama yardımıyla gözlemlediklerini bildirmişlerdir. Simetrik bölünmenin 2 gün 33 0 C uygulamaya tabi tutulan sadece tek çekirdekli mikrosporlarda % 19.4 oranında gerçekleştiğini bildirmişlerdir. Zhang ve ark. (2009), yapmış oldukları sitolijik ve histolojik çalışmada floresans mikroskobu, ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu ile anter kültürü için ortamlara konan anterleri incelemişler, ölü mikrospor oranının kültürün ikinci gününden itibaren dramatik bir şekilde arttığını bildirmişlerdir. Ortamlara konan anterlerde 2 farklı gelişme tipinin olduğunu bildirmişlerdir. İlk çekirdek bölünmesi asimetrik olarak meydana geldiğini ve ortaya 2 hücreli tipik polen ortaya çıktığını ve embryonun da polen hücresinin vejataif çekirdeğinin asimetrik olarak devamlı bölünmesi ile meydana geldiğini bildirmişlerdir. 15

29 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 16

30 3.MATERYAL METOT 3.MATERYAL VE METOT Bu çalışma yılları arasında Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü Uygulama Alanı ve Doku Kültürü Laboratuarında ve Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Sitoloji Laboratuarında yürütülmüştür. Araştırmada kullanılan bitkisel materyaller Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü nün biber ıslah materyalleridir Materyal Denemede Kullanılan Genotipler ve Özellikleri Çalışmada kullanılan bitkisel materyaller Keleş (2007) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada düşük sıcaklığa toleransı ve hassasiyeti belirlenmiş olan 421 ve 195 notu genotipler ile Yüksek Sıcaklıklara Toleranslı Güney Doğu Anadolu Bölgesine Uygun Biber (Capsicum Annuum L.) Genotiplerinin Belirlenmesi Projesi kapsamında seçilen ve İnan 3363 adı ile çeşit tescili yapılan genotip ile yüksek sıcaklıklara hassasiyeti bilinen 277A genotiplerdir. 277A Nolu genotip: Yüksek sıcaklığa sıcaklığa duyarlı olduğu belirlenmiştir. Çarliston biber tipindedir. Gövde uzunluğu yaklaşık 28 cm. gövde de orta tüy oluşumu vardır. Yaprak rengi koyu yeşildir ve yapraklar mızrak şeklindedir. Yaprakta tüy oluşumu ortadır. Taç yaprak rengi beyazdır. Taç yapraklar çan şeklindedir. Çanak yaprakta renklenme yoktur. Anter rengi mavi, filament rengi sarıdır. Meyve şekli sivridir. Şekil 3.2 de 277A nolu genotipe ait görünüm yer almaktadır. 17

31 3.MATERYAL METOT Şekil A nolu genotipe ait görünüm 195 nolu genotip: Düşük sıcaklığa duyarlı olduğu belirlenmiştir. (Keleş 2007). Süs biber tipindedir. Gövde uzunluğu yaklaşık 32 cm dir. Gövde de tüy oluşumu azdır. Yaprak rengi yeşildir ve yapraklar mızrak şeklindedir. Yaprakta tüy oluşumu azdır. Taç yaprak rengi beyazdır. Taç yapraklar çan şeklindedir. Çanak yaprakta renklenme yoktur. Anter rengi mavi, filament rengi beyazdır. Meyve şekli sivridir. Şekil 3.2 de 195 nolu genotipe ait görünüm yer almaktadır Şekil nolu genotype ait görünüm 18

32 3.MATERYAL METOT 421 nolu genotip: Düşük sıcaklığa toleranslı olduğu belirlenmiştir (Keleş 2007). Sivri biber tipidir. Gövde uzunluğu yaklaşık 10 cm dir. Gövde de tüy yoğunluğu azdır. Yaprak rengi koyu yeşildir ve yaprak şekli ovaldir. Yapraklarda tüy oluşumu seyrektir. Taç yaprak rengi beyazdır. Taç yapraklar çan şeklindedir. Çanak yaprakta renklenme yoktur. Anter rengi açık mor, filament rengi beyazdır. Meyve şekli sivridir. Şekil 3.4 de 421 nolu genotipe ait görünüm yer almaktadır. Şekil nolu genotipe ait görünüm İnan 3363: Yüksek sıcaklığa toleranslı olarak, Güneydoğu Anadolu bölgesinde seleksiyon yolu ile ıslah edilmiştir. Dolmalık biber tipindedir. Kurutularak toz biber yapımında kullanılmaktadır. Olgunluk öncesi yeşil meyve renkli dar üçgen meyve yapısına sahiptir Şekil 3.4 de 3363 nolu genotipe ait görünüm yer almaktadır. 19

33 3.MATERYAL METOT Şekil 3.4. İnan 3363 kültür çeşidine ait görünüm 3.2. Metot Bitkilerin Yetiştirilmesi Büyükalaca ve ark. (2004) tarafından yapılan bir çalışmaya göre sera koşullarında yetiştirilen donör bitkilerin embriyo uyartımının açık koşullarda yetiştirilen bitkilere göre daha yüksek bulunduğu bildirilmiştir. Bu sebeple bu çalışmada bitkiler sera koşullarında yetiştirilmiştir. Çizelge 3.1 de bitkilerin yetiştirilme dönemi ve çalışma programı gösterilmiştir. Çizelge 3.1. Bitkilerin yetiştirilme dönemleri ve çalışma programı Tohum ekimi Fide dikimi Tomurcuk Alınma Zamanı 27/07/ /09/2009 Ekim 2009 Kasım 2009 Aralık 2009 Ocak 2010 Şubat 2010 Mart 2010 Nisan /02/ /04/2010 Mayıs 2010 Haziran 2010 Temmuz 2010 Ağustos 2010 Eylül

34 3.MATERYAL METOT Tohumlar fide yetiştirmek amacıyla fide yetiştirme serasında torf: perlit (2 h / 1 h) karışımı harç içeren viyollere 90 adet ekilmiş ve fideler 6-7 gerçek yapraklı dönemde iken 50x100 cm aralıklarla plastik seraya her genotipden 50 bitki olacak şekilde dikimleri gerçekleştirilmiştir. Gelişimi için gerekli ilaçlama ve gübreleme yapılmıştır. Şekil 3.5 de deneme süresince yetiştirme alanında oluşan maksimum, minimum ve ortalama sıcaklık değerleri verilmiştir. Şekil Deneme süresince deneme serasındaki maksimum, minimum ve ortalama sıcaklık değerleri Uygun Anterlerin Seçimi Kültüre alınan anterlerin bulunduğu gelişme aşaması haploid embriyo elde edilmesini etkileyen en önemli faktörlerden birisidir. Bunun için en uygun aşama, mikrosporların tek çekirdekli aşamanın sonunda ve/veya iki çekirdekli aşamanın başında olduğu (I. mitoz bölünmesinin başladığı) dönemdir. Daha önce yapılan çalışmalarda biber çiçek tomurcuklarında, çanak yaprak ve taç yaprak boylarının eşit olduğu veya taç yaprakların çanak yapraklardan biraz daha uzun olduğu, anterlerin yaklaşık yarı boyuna kadar antosiyan oluşumunun görüldüğü gelişme aşamasında mikrosporların I. mitoz aşamasında olduğu bildirilmiştir (Chambonnet, 1988). 21

35 3.MATERYAL METOT Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümümü nde yapılan çalışmalarda bu aşamanın anter kültürü için en uygun aşama olduğu belirlenmiştir ve bu çalışmada da tomurcuklar Şekil 3.6. de gösterilen aşamalarda alınmıştır. Şekil Denemede kullanılan genotiplerin anter kültürüne alınan tomurcuklarının ve anterlerinin görünümü (İnan 3363, 421, 195 ve 277A nolu genotipler) Kültür Sırasında Kullanılan Malzemeler Anter kültürü çalışmaları esnasında değişik aşamalarda değişik kültür kapları kullanılmıştır. Kültür esnasında kullanılan malzemelerin (besin ortamları, petri kapları, steril su şişeleri, pens-bistüriler, kurutma kağıtları ve boş kavanozlar) 121 C de sıcaklık ve 1.2 kg/cm 2 basınç altında 15 dakika süre ile otoklavlanarak sterilizasyonları yapılmıştır. Otoklav işlemi tamamlandıktan sonra malzemeler steril kabine alınmış ve kültür aşamalarına geçilmiştir. 22

36 3.MATERYAL METOT Besin Ortamları Anter kültürü için 2 farklı BAP içeriğine sahip MS (Çizelge 3.2) ortamı kullanılmıştır (Büyükalaca ve ark. 2004) ve (Taşkın 2005) Ortam I: MS ortamına eklenen 4 mg/l NAA, 0.1 mg/l BAP, % 0.25 aktif kömür ve 30 g/l sakkaroz ile 15 mg/l AgNO 3 Ortam II: MS ortamına eklenen 4 mg/l NAA, 0.5 mg/l BAP, % 0.25 aktif kömür ve 30 g/l sakkaroz ile 15 mg/l AgNO 3 ortamları kullanılmıştır. Anterlerde oluşan embriyoların bitkiye dönüşümlerinin sağlanması için BGD içermeyen 30 g/l sakkaroz içeren MS ortamı kullanılmıştır Ortam hazırlanırken bütün kimyasallar eklendikten sonra ortamların ph sı 1 N lik HCl ve 1 N lik KOH kullanılarak 5.8 olarak ayarlanmıştır. Katılaştırıcı olarak agar 8 g/l kullanılmıştır. Hazırlanan ortamlar 121 C sıcaklık ve 1.2 kg/cm 2 basınç altındaki otoklavda 15 dakika süre ile sterilize edilmiştir. Sterilizasyon işleminden sonra steril kabin içerisinde ortamlar 6 cm çapındaki steril petriler ve 15 cm uzunluğundaki steril deney tüplerine 10 ml/petri ve 10 ml/tüp olacak şekilde dağıtılmıştır. 23

37 3.MATERYAL METOT Çizelge 3.2. MS (1962) Besin Ortamının Bileşimi Makro elementler Miktarı (mg/l) KNO NH 4 NO MgSO 4. 7H 2 O 370 CaCl 2. 2H 2 O 440 KH 2 PO Mikro elementler Miktarı (mg/l) H 3 BO MnSO 4 H 2 O 15.6 ZnSO 4. 7H 2 O 8.6 Na 2 MoO 4. 2H 2 O 0.25 CuSO 4. 5H 2 O CoCl 2. 6H 2 O KI 0.83 FeSO 4 7H 2 O 27.8 Na 2 EDTA 37.3 Organik Maddeler Miktarı (mg/l) Thiamine-HCl 0.1 Pyridoxine-HCl 0.5 Nikotinik asit 0.5 Myo-inositol 100 Sakaroz Agar 8000 Ph Anterlerin Çıkarılması ve Besin Ortamına Ekilmesi Uygun gelişme döneminde mikrosporlar bulunduran anterlere sahip çiçek tomurcukları, steril kabin içerisinde birkaç damla Tween-20 eklenmiş %15 lik ticari sodyum hipoklorit (NaOCl) çözeltisi içerisinde 15 dakika süreyle dezenfekte edilmiş, daha sonra üç kez beşer dakika süreyle steril saf su ile durulanmıştır. Anterler, otaklavlanmış pens ve bistüri yardımıyla çiçek tomurcukları içerisinden zedelenmeden çıkarılmış ve besin ortamı üzerine, dorsal yüzeyi ortamla temas edecek biçimde ve ortama batırılmaksızın yerleştirilmiştir. Her petri kutusuna bir tomurcuktan çıkan 5 adet anter dikilmiştir. Her uygulama grubunda 5 tekerrürlü ve her tekerrürde de 25 anter olacak şekilde dikimler gerçekleştirilmiştir. Dikim işlemi tamamlanan petri kutularının kenarları streç film ile kapatılarak 35 0 C karanlık koşullarda 48 saat inkübasyona tabi tutulmuştur. İnkübatörden çıkarılan petriler 24

38 3.MATERYAL METOT 25±1ºC sıcaklığa, 16 saat aydınlık ve 8 saat karanlık fotoperyot koşullarına sahip büyütme odasına alınmıştır Mikrospor Gelişim Aşamasının Belirlenmesi Ortamlara konulan anterlerdeki mikrospor gelişiminin belirlenmesi amacıyla Nisan, Temmuz, Ekim ve Şubat ayı olmak üzere 4 defa; 0, 1, 2, 3, 4, 8, ve 14. günlerde ortamlardan alınarak Carnoy sabitleme çözeltisi (%60 etanol, % 30 kloroform, % 10 glasiyal asetik asit) içerisinde sabitlenmiştir. Biber anterleri floresans ışınlarının geçişine engel olan yapılara sahip olduğundan hücre çekirdeği görünmez. Bu yapıların kırılması amacıyla distile edilmiş su ile % 40 demir III klorit solüsyonu hazırlanmış ve bu solüsyondan 10 ml carnoy fiksasyon sıvısı içerisine 300 µl eklenmiştir. Demir III klorit solüsyonu eklenen carnoy fiksasyon solüsyonu içerisinde anterler 30 dakika bekletilmiş ve üzerine % 40 lık demir III klorit solüsyonundan 80 µl tekrar eklenerek 1 gün inkübe edilmiştir (Kim ve Jang 2000). Uygulamadan sonra anterler % 70 lik etanol içerisinde C DAPİ boyamaya kadar muhafaza edilmiştir. Şekil 3.7. Biber anterlerinin sabitlenmesinden bir görüntü 25

39 3.MATERYAL METOT DAPİ stok solüsyonununun ( DAPİ 1 mg/ml ) 1 µl si 1 ml su ile seyreltilerek çalışma solüsyonu hazırlanmıştır. Sabitleme işlemi gerçekleştirilen biber anterleri mikrospor gelişim aşamalarını belirlenmesi amacıyla lam üzerinde pens ve bisturi yardımıyla ezilerek üzerine DAPİ çalışma solüsyonu eklenmiş ve lamelle kapatılarak floresan mikroskobu ile mikrospor gelişim safhaları incelenmiştir. Çalışmanın bu aşaması çok fazla zaman alması sebebiyle mikrospor gelişim aşaması asetokarmin boyama metoduyla ışık mikroskobu ile gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla % 45 glasiyal asetik asit, % 55 distile su ve 2 gr karmen kırmızı eklenerek elde edilen karışım kaynatılmış ve 2 kez filtre kâğıdı yardımıyla süzülerek asetokarmin solüsyonu elde edilmiştir. Lam üzerine biber anterleri konularak pens ve bisturi yardımıyla ezilmiş ve üzerine asetokarmin damlatılarak lamel kapatılmıştır. Hazırlanan preparat 3 dakika sonra ışık mikroskobu ile incelenmiştir. Her bir uygulama için 4 anter ve her anterde de 5 okuma gerçekleştirilmiştir Verilerin Alınması ve Değerlendirilmesi Ortamlara dikilen anterlerde; embriyo oluşturan anter sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, ve gelişen bitki sayıları alınmıştır. Embriyo oluşturan anter oranı: Embriyo oluşturan anter sayısının kültüre dikilen tüm anterlere oranı, Embriyo oranı: Ortamlarda oluşan toplam embriyo sayısının kültüre dikilen tüm anterlere oranı. Bitkiye dönüşen embriyo oranı: Bitkiye dönüşen embriyo sayısının tüm oluşan embriyolara oranı Gelişen bitki oranı: Gelişen toplam bitki sayısınıın oluşan embriyolara oranı hesaplanmıştır. Mikrospor gelişimi ile ilgili olarak; her bir anterdeki boş, tek çekirdekli, iki çekirdekli, üç çekirdekli, dört çekirdekli ve çok sayıda çekirdeğe sahip mikrospor sayıları mikroskop yardımıyla alınarak, o anterde sayılan toplam mikrospor sayısına oranlanmıştır. 26

40 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Anter Kültürü Çalışması Farklı Zamanlarda Alınan Anterlerde Embriyo Oluşturan Anter Oranı, Embriyo Oranı, Embriyo Sayısı, Bitkiye Dönüşen Embriyo Oranı ve Gelişen Bitki Oranları Ekim Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Ekim ayında alınan anterlerin anter kültüründeki durumlarına ait veriler Çizelge 4.1 de verilmiştir. Ekim ayında 277A nolu genotipe ait anterlerden I nolu ortamda % 5.84 ü embriyo oluştururken, II nolu ortama dikilen anterlerden % 8.98 u embriyo oluşturmuştur. Embriyo oranı ise I nolu ortamda % ve II nolu ortamda % olarak gerçekleşmiştir. I nolu ortamda oluşan bu embriyoların % i bitkiye dönüşmüşken, II nolu ortamda bu oran% 2.70 olarak bulunmuştur. 277A nolu genotipin I nolu ortamdan elde edilen embriyolarının % 7.69 u gelişmiş bitkiye dönüşmüştür. İnan 3363 genotipine ait anterlerin I nolu ortamda % i, II nolu ortamda ise i embriyo oluşturmuştur. Embriyo oranı ise I nolu ortamda % 37.5, II nolu ortamda ise % olarak bulunmuştur. I nolu ortamda oluşan embriyoların bitkiye dönüşme oranı % iken, II nolu ortamda oluşan embriyoların bitkiye dönüşme oranları % 7.50 olarak bulunmuştur. I nolu ortamda gelişen bitki oranı % 8.51 iken II nolu ortamda % 5.00 olarak bulunmuştur. 421 nolu genotip ekim ayında II nolu ortamda sadece 1 tane embriyo oluştururken, I nolu ortamda embriyo oluşturmamıştır. 195 nolu genotip her iki ortamda da embriyo oluşturmamıştır. Genotipler arasında Ekim ayında; embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı ve toplam embriyo sayısı İnan 3363 kültür çeşidi en yüksek değerleri alırken, bitkiye dönüşen embriyo oranında ise 277A nolu genotip en yüksek değer almıştır. Ekim ayında 277A ve İnan 3363 genotipleri için, en uygun I nolu ortam olarak bulunmuştur. 421 nolu genotipin, II nolu ortama dikilen anterlerinden 1 adet 27

41 embriyo elde edilirken, 195 nolu genotipden embriyo elde edilememiştir. Aynı dönemde kültüre alınan anterlerin farklı genotiplerde değişik tepkiler göstermesi ile ilgili sonuçlar Karakullukçu ve Abak, (1992), Mityko ve ark., (1995), Dias ve Martins, (1999), Çömlekçioğlu ve ark., (1999), Çömlekçioğlu ve ark., (2001), Ercan ve ark., (2001), Sayılır ve Özzambak, (2002), Çiner ve Tıpırdamaz, (2002), Büyükalaca ve ark., (2004) Taşkın (2005) ve Koleva-Gudeva ve ark., (2007) nın bulguları tarafından da desteklenmektedir. Biber anter kültürü çalışmalarında anormal embriyo oluşumu ve buna bağlı olarak bitkiye dönüşüm oranının düşük olduğunu, Taşkın (2005) tarafından bildirilmektedir. Çizelge 4.1. Ekim döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Genotipler Ortamlar Embriyo oluşturan anter oranı (%) Embriyo oranı (%) Embriyo sayısı (adet) Bitkiye dönüşen embriyo oranı (%) Gelişen bitki oranı (%) I A II Ortalama Toplam I İnan 3363 II Ortalama Toplam I II Ortalama Toplam I II Ortalama Toplam

42 Şekil 4.1. II nolu besin ortamında 277A nolu genotipten elde edilen bir embriyo görünümü Şekil 4.2. II nolu besin ortamında 277A nolu genotipten elde edilen bir bitki görünümü 29

43 Kasım Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Kasım ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiyedönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.2 de verilmiştir. Kasım ayında embriyo oluşturan anter oranı İnan 3363 çeşidinde I nolu ortamda % 9.60 ve II nolu ortamda % 8.51 olarak meydana gelmiştir. Embriyo oranı ise I nolu ortamda % iken, II nolu ortamda % olarak gerçekleşmiştir. 277A nolu genotipin embriyo oluşturan anter oranı, I nolu ortamda % 6.76 iken, II nolu ortamda ise % 2.98 olarak gerçekleşmiştir. Embriyo oranı ise I nolu ortamda % 10.79, II nolu ortamda % 2.98 olarak gerçekleşmiştir. I nolu ortamdan elde edilen embriyoların ortamda bitkiye dönüşüm oranı % iken, II nolu ortamın % olarak gerçekleşmiştir. Her iki ortamda gelişen bitki oranı % olarak gerçekleşmiştir. Bu ayda 195 ve 421 nolu genotiplerde embriyo elde edilememiştir. Genotipler arasında Kasım ayında; embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı ve oluşan toplam embriyo sayısında İnan 3363 kültür çeşidi en yüksek değerleri alırken, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranlarında 277A nolu genotip daha yüksek değerler almıştır. Kasım ayında İnan 3363 ve 277A nolu genotip için en uygun I nolu ortam olarak bulunmuştur. İnan 3363 kültür çeşidinin anterlerinden elde edilen embriyolar bitkiye dönüşmezken, 277A nolu genotipinden elde edilen embriyolar % oranında bitkiye dönüşmüşlerdir. 195 ve 421 nolu genotiplerden her iki ortamda da hiç embriyo oluşmamıştır. En yüksek embriyo oranını II nolu ortamda İnan 3363 çeşidinden elde edilmiş (% 20.98), ancak elde edilen bu embriyolar bitkiye dönüşmemiştir. 30

44 Çizelge 4.2. Kasım döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Genotipler Ortamlar Embriyo oluşturan anter oranı (%) Embriyo oranı (%) Embriyo sayısı (adet) Bitkiye dönüşen embriyo oranı (%) Gelişen bitki oranı (%) I A II Ortalama Toplam I İnan 3363 II Ortalama Toplam I II Ortalama Toplam I II Ortalama Toplam Şekil 4.3. II nolu besin ortamında İnan 3363 nolu genotipten oluşmuş embriyo görünümü 31

45 Şekil 4.4. I nolu besin ortamında 277A nolu genotipten oluşmuş bitki görünümü Aralık Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Aralık ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.3 de verilmiştir. Aralık ayında en yüksek embriyo oluşturan anter oranı düşük sıcaklıklara tolerant olarak bilinen 421 nolu genotipden, I nolu ortamda % 9.32 oranında elde edilmiştir. Aynı genotipin II nolu ortamda, embriyo oluşturan anter oranı % 6.81 olarak gerçekleşmiştir. 421 nolu genotipden elde edilen embriyolarda bitkiye dönüşüm gerçekleşmemiştir. 277A nolu genotipin I nolu ortamına dikilen anterlerden % 7.97 sinden embriyo elde edilirken II nolu ortama dikilen anterler embriyo elde edilememiştir. I nolu ortamdan elde edilen embriyoların bitkiye dönüşüm oranı % 23.81, gelişen bitki oranı ise % 9.52 olarak gerçekleşmiştir. İnan 3363 nolu genotipde sırasıyla I ve II nolu ortamlardan % 4.67 ve 4.73 oranında embriyo elde edilmiş, elde edilen embriyoların % ı sadece I nolu ortamda bitkiye dönüşümü gerçekleştirmiş, II nolu ortamdan elde edilen embriyolarda ise bitkiye dönüşüm gerçekleşmemiştir. Bu çeşitte elde edilen embriyolardan gelişmiş bitki oluşmamıştır. 195 nolu genotip her iki ortamda da embriyo oluşturmamıştır. 32

46 Aralık ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı ve oluşan embriyoların toplamında 421 nolu genotip en yüksek değerleri alırken, bitkiye dönüşen embriyo oranında İnan 3363 kültür çeşidi ve gelişen bitki oranında 277A nolu genotip daha yüksek değer almışlardır. Aralık ayında 421 ve 277A nolu genotipler için en uygun ortam I nolu ortam olarak bulunmuştur. 421 nolu genotipinin anterlerinden elde edilen embriyolar bitkiye dönüşmezken 277A nolu genotipinden elde edilen embriyolar % oranında bitkiye dönüşmüşlerdir. 195 nolu genotipden her iki ortamda da hiçbir sonuç alınamamıştır. II numaralı ortama en olumlu tepkiyi İnan 3363 kültür çeşidi vermiştir. Fakat bu ortamda elde edilen embriyolar bitkiye dönüşmemiştir. Çizelge 4.3. Aralık döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Genotipler Ortamlar Embriyo oluşturan anter oranı (%) Embriyo oranı (%) Embriyo sayısı (adet) Bitkiye dönüşen embriyo oranı (%) Gelişen bitki oranı (%) I A II Ortalama Toplam I İnan 3363 II Ortalama Toplam I II Ortalama Toplam I II Ortalama Toplam

47 Ocak Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Ocak ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.4 de verilmiştir. Ocak ayında embriyo oluşturan anterlerin oranı ve embriyo oranı sırasıyla % ile olarak 277A nolu genotipin I nolu ortama dikilen anterlerinden elde edilmiştir. 277A nolu genotipi II nolu ortamda, embriyo oluşturan anter oranı ve embriyo oranı % 2.40 olmuştur. Oluşan embriyoların I nolu ortamda % i bitkiye dönüşürken II nolu ortamda % 100 ü bitkiye dönüşmüştür. Gelişen bitki oranı ise I nolu ortamda % 25, II nolu ortamda % olarak gerçeklemiştir. İnan 3363 genotipinde ise I nolu ortama dikilen anterlerin % ünde, II nolu ortama dikilen anterlerin % 8.02 sinde embriyo oluşmuş ve embriyo oluşturan anter oranı ise sırasıyla % ve olarak gerçekleşmiştir. Oluşan embriyolar II nolu ortamda bitkiye dönüşemezken, I nolu ortamda % ü bitkiye dönüşmüştür. 421 ve 195 nolu genotiplerde bu ay embriyo oluşumu gerçekleşmemiştir. Ocak ayında embriyo oluşturan anter oranında İnan 3363 kültür çeşidi, embriyo oranı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranında 277A nolu genotip ve toplam embriyo sayısında İnan 3363 kültür çeşidi ile birlikte 277A genotipi en yüksek değerleri almışlardır. 277A ve İnan 3363 genotipleri için; embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, bitkiye dönüşüm oranı ve gelişen bitki oluşturma oranı Ocak ayında en uygun ortam I nolu ortam olarak bulunmuştur. 421 ve 195 nolu genotiplerden her iki ortamda da hiçbir sonuç alınamamıştır. II numaralı ortama en olumlu tepkiyi İnan 3363 kültür çeşidi vermiştir. Fakat bu ortamda elde edilen embriyolar bitkiye dönüşmemiştir. 34

48 Çizelge 4.4. Ocak döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Genotipler Ortamlar Embriyo oluşturan anter oranı (%) Embriyo oranı (%) Embriyo sayısı (adet) Bitkiye dönüşen embriyo oranı (%) Gelişen bitki oranı (%) I A II Ortalama Toplam I İnan II Ortalama Toplam I II Ortalama Toplam I II Ortalama Toplam Şekil 4.5. II nolu besin ortamında İnan 3363 kültür çeşidinden oluşmuş bitki görünümü 35

49 Şubat Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Şubat ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.5 de verilmiştir. Şubat ayında 277A nolu genotipin embriyo oluşturan anter oranı, I ve II nolu ortamda sırasıyla % 2.40 ve 1.60 olarak gerçekleşmiştir. Embriyo oranı ise her iki ortamda da % 2.40 olarak gerçekleşirken bitkiye dönüşüm sadece I nolu ortamda % oranında olmuştur. II nolu ortamdan elde edilen embriyolarda bitkiye dönüşüm gerçekleşmemiştir. İnan 3363 nolu genotipde ise sadece II nolu ortamdan % 0.67 oranında embriyo elde edilirken bu embriyoda bitkiye dönüşmemiştir. 195 ve 421 nolu genotiplerden bu ayda embriyo elde edilmemiştir. Şubat ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, oluşan embriyoların toplamı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranında 277A en yüksek değerleri almıştır. Şubat ayında embriyo oluşturma, embriyo oranı, bitkiye dönüşüm ve gelişen bitki oranının düşük olmasının sebebi bu ayda ortam sıcaklığını çok düşük olması ilk akla gelen olasılıktır. Düşük ortam sıcaklığının embriyo verimin olumsuz yönde etkileyeceğini Tiainen (1992), Büyükalaca ve ark. (2004) ve Taşkın (2005) tarafından desteklenmektedir. 36

50 Çizelge 4.5. Şubat döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Genotipler Ortamlar Embriyo oluşturan anter oranı (%) Embriyo oranı (%) Embriyo sayısı (adet) Bitkiye dönüşen embriyo oranı (%) Gelişen bitki oranı (%) I A II Ortalama Toplam 6 I İnan 3363 II Ortalama Toplam 1 I II Ortalama Toplam 0 I II Ortalama Toplam Mart Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Çizelge 4.6 da Mart ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı verilmiştir. Mart ayında bütün genotiplerden embriyo elde edilmiştir. En yüksek embriyo oluşturan anter oranı, İnan 3363 kültür çeşidinden II ve I nolu ortamlardan sırasıyla % 11.81, % 9.51 oranında elde edilmiştir. I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % ve II nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % oranında bitkiye dönüşüm gerçeklemiştir. Gelişen bitki oranı ise, I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % ve II nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % 5.71 olarak gerçeklemiştir. 195 nolu genotipin anterlerinin I nolu ortamda % 3.75 i ve II nolu ortamdan ise % 1.95 i embriyo oluşturmuştur. Embriyo oranı I nolu ortamda % 6.25 ve II nolu ortamda % 2.95 olarak gerçeklemiştir. I nolu ortamdan elde edilen embriyoların % 60 ı, II nolu ortamdan elde edilen embriyoların % 100 ü bitkiye dönüşmüştür. II nolu 37

51 ortamdan elde edilen embriyolarda gelişen bitki oranı % iken, I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % olarak gerçeklemiştir. 277A nolu genotipin ortamlara dikilen anterlerinden % 2.62 sinde embriyo elde edilmiş ve embriyo oranı % 7.75 olarak gerçekleşmiştir. Elde edilen embriyoların bitkiye dönüşme oranı % olarak gerçeklemiştir. II nolu ortamdan ise embriyo elde edilememiştir. 421 nolu genotipde ise sadece II nolu ortama dikilen anterlerin % 0.80 oranında embriyo oluşturmuş ve embriyo oranı ise % 2.40 olarak bulunurken elde edilen embriyolarda bitkiye dönüşüm gerçeklememiştir. Mart ayında en yüksek embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı ve toplam embriyo oranı İnan 3363 kültür çeşidinden elde edilmiş ancak bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranında 277A nolu genotip daha yüksek olmuştur. İnan 3363 kültür çeşidi için; anterlerin embriyo oluşturma oranı, embriyo oranı I nolu ortamda II nolu ortama göre yüksek olmasına rağmen, I nolu ortam bitkiye dönüşüm ve gelişen bitki oranı açısından daha olumlu bulunmuştur. 277A ve 195 nolu genotipler için I nolu ortam uygun bulunmuştur. 421 nolu genotip için düşük oranda embriyo üretimi olsa da II nolu ortam uygun bulunmuştur. 38

52 Çizelge Mart döneminde embriyo oluşturan anter oranı embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Genotipler Ortamlar Embriyo oluşturan anter oranı (%) Embriyo oranı (%) Embriyo sayısı (adet) Bitkiye dönüşen embriyo oranı (%) Gelişen bitki oranı (%) I A II Ortalama Toplam 9 I İnan 3363 II Ortalama Toplam 56 I II Ortalama Toplam 3 I II Ortalama Toplam Nisan Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Nisan ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı verilmiştir. Nisan ayında bütün genotiplerin her iki ortama dikilen anterlerinden embriyo elde edilmiştir. Nisan ayında en yüksek embriyo oluşturan anter oranı, 277A nolu genotipin I nolu ortamından (% 18.25) elde edilmiştir. II nolu ortama dikilen anterlerin ise % 8.01 i embriyo oluşturmuştur. Embriyo oluşturma oranı I nolu ortamda % 26.86, II nolu ortamda % olarak gerçekleşmiştir. I nolu ortamda oluşan embriyolardan % si ve II nolu ortamda oluşan embriyoların % si bitkiye dönüşmüştür. Gelişen bitki oranları ise, I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % ve II nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % oranında gerçeklemiştir. 421 nolu genotipin I nolu ortama dikilen anterleri % 8.02 oranında embriyo oluştururken, II nolu ortama dikilen anterleri % 6.72 oranında embriyo oluşturmuştur. Embriyo oranı 39

53 I nolu ortamda iken, II nolu ortamda % 7.72 olarak gerçekleşmiştir. II nolu ortamdan elde edilen embriyolarda bitkiye dönüşüm % oranında gerçekleşirken, oluşan embriyoların % si gelişen bitkiye dönüşmüştür. I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % oranında bitkiye dönüşüm gerçekleşmiş ve oluşan embriyolar % oranında gelişen bitki oluşturmuşlardır. 195 nolu genotipin Nisan ayında I nolu ortama dikilen anterlerinin % 7.61 sı, II nolu ortama dikilen anterlerinin ise 6.71 si embriyo oluşturmuştur. Embriyo oranı ise, I nolu ortamda % ve II nolu ortamda % 6.71 olarak gerçekleşmiştir. I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda bitkiye dönüşüm % oranında gerçekleşirken, II nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % oranında gerçekleşmiştir. I nolu ortamda elde edilen embriyolardan % oranında gelişen elde edilirken, II nolu ortamdan elde edilen embriyolardan % oranında gelişen bitki elde edilmiştir. İnan 3363 kültür çeşidinin I nolu ortama dikilen anterlerinin % 6.82 si embriyo oluştururken, II nolu ortama dikilen anterinin % 5.38 i embriyo oluşturmuştur. I nolu ortamdan elde edilen toplam embriyo oranı % iken, II nolu ortamda % 8.07 olarak gerçekleşmiştir. Bitkiye dönüşüm I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % 83.33, II nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % olarak gerçekleşmiştir. Gelişen bitki oranı ise I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % 66.67, II nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % olarak gerçekleşmiştir. Nisan ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı ve oluşan embriyoların toplamında 277A nolu genotip en yüksek değerleri alırken, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranında İnan 3363 kültür çeşidi nolu genotip daha yüksek değer almışlardır. Nisan ayında embriyo oranı açısından bütün genotipler için I nolu ortam en uygun olmuştur. 195 ve 421 nolu genotiplerde I nolu ortamda daha yüksek oranda embriyo oluşurken, bu embriyolarda bitkiye dönüşüm ve gelişen bitki oranları II nolu ortama göre daha düşük bulunmuştur. 40

54 Çizelge 4.7. Nisan döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Genotipler Ortamlar Embriyo oluşturan anter oranı (%) Embriyo oranı (%) Embriyo sayısı (adet) Bitkiye dönüşen embriyo oranı (%) Gelişen bitki oranı (%) I II A Ortalama Toplam 39 I II İnan 3363 Ortalama Toplam 21 I 8,02 12, II 6,72 7, Ortalama Toplam 22 I II Ortalama Toplam 20 Şekil 4.6. I nolu besin ortamında 421 nolu genotipden oluşan embriyoların görünümü 41

55 Şekil 4.7. II nolu besin ortamında 421 nolu genotipden oluşmuş bir bitki görünümü Mayıs Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Mayıs ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.8 de verilmiştir. Mayıs ayında I nolu ortama dikilen İnan 3363 kültür çeşidi anterlerinin % u, II nolu ortama dikilen anterlerinin % i embriyo oluşturmuştur. Embriyo oranı I nolu ortamda % iken, II nolu ortamda % olarak gerçeklemiştir. Bitkiye dönüşüm ise, I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % iken, II nolu ortamdan elde edilen embriyolardan % oranında gerçekleşmiştir. Gelişen bitki oranı ise I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda % 10.13, II nolu ortamda oluşan embriyolarda % olarak gerçekleşmiştir. 277A nolu genotipin sadece II nolu ortama dikilen anterlerinin % 3.36 sı embriyo oluşturmuş ve embriyo oranı ise % 6.02 olarak gerçekleşmiştir. Elde edilen embriyoların % si bitkiye dönüşmüştür. Gelişen bitki oranı ise % olarak gerçekleşmiştir. 195 ve 421 nolu genotiplerden Mayıs ayında embriyo elde edilememiştir. Çizelge 4.8 de Mayıs ayında denemedeki genotiplerin embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşüm oranı ve gelişen bitki oranı verilmiştir. 42

56 Mayıs ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı ve oluşan embriyoların toplamı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranında İnan 3363 kültür çeşidi en yüksek değerleri almıştır Mayıs ayında inan 3363 ve 277A nolu genotipi için en uygun ortam II nolu ortam olmuştur. İnan 3363 kültür çeşidi için I nolu ortamda da yüksek oranda embriyo verimi ve bitkiye dönüşüm sağlanırken diğer genotiplerde embriyo oluşmamıştır. Çizelge 4.8.Mayıs döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Genotipler Ortamlar Embriyo oluşturan anter oranı (%) Embriyo oranı (%) Embriyo sayısı (adet) Bitkiye dönüşen embriyo oranı (%) Gelişen bitki oranı (%) I a II Ortalama Toplam 9 I İnan 3363 II Ortalama Toplam 158 I II Ortalama Toplam 0 I II Ortalama Toplam 0 43

57 Şekil 4.8. II nolu besin ortamında İnan 3363 nolu genotipten oluşmuş bitki Haziran Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Haziran ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşüm oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.9 da verilmiştir. Haziran ayında II nolu ortama dikilen İnan 3363 kültür çeşidi anterlerinin % 5.60 ı embriyo oluşturmuştur. I nolu ortama dikilen anterlerinin ise % 3.43 ü embriyo oluşturmuştur. Embriyo oranları ise I ve II nolu ortamlarda sırasıyla % 5.14 ve % 8.80 olarak gerçeklemiştir. II nolu ortamda oluşan embriyoların % i bitkiye dönüşmüştür. I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda bitkiye dönüşüm gerçekleşmemiştir. 277A nolu genotipin I nolu ortama dikilen anterlerinin % 5.33 ü embriyo oluştururken, II nolu ortama dikilen anterlerinin % 0.80 embriyo oluşturmuştur. Embriyo oranı I nolu ortamda % 6.67 ve II nolu ortamda % 0.80 olarak gerçekleşmiştir. I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda bitkiye dönüşüm % 30 olarak gerçekleşirken, II nolu ortamda bitkiye dönüşüm gerçekleşmemiştir. 195 nolu genotipin I nolu ortama dikilen anterlerinin % 2.40 ı, II nolu ortama dikilen anterlerinin % 1.33 ü embriyo oluşturmuştur. Embriyo oranı ise I nolu ortamda % 2.40, II nolu ortamda % 1.33 olarak gerçekleşmiştir. I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda bitkiye dönüşüm gerçekleşmezken, II nolu ortamdan elde edilen embriyoların % 100 ü bitkiye 44

58 dönüşmüş ve gelişen bitki oranı % 50 olmuştur. 421 nolu genotipin her iki ortama dikilen anterleride embriyo oluşturmamıştır. Haziran ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı ve oluşan embriyoların toplamında İnan 3363 kültür çeşidi, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranında 195 nolu genotip en yüksek değerleri almıştır. Bu ayda İnan 277A nolu genotip için I nolu ortam uygun bulunurken, İnan 3363 ve 195 nolu genotip için II nolu ortam uygun bulunmuştur. 421 nolu genotipden her iki ortamdan embriyo elde edilememiştir. Bu çalışmada Şubat ile birlikte Haziran ayları en düşük embriyo uyartımının olduğu ay olmuştur. Ortam sıcaklıklarını daha uygun olduğu Nisan, Mayıs ve Haziran aylarının embriyo uyartımı ve bitkiye dönüşüm için en uygun olduğu Taşkın (2005) tarafında bildirilmiştir. Çalışmada Haziran ayında embriyo oluşumun düşük oranlarda gerçeklemesinin sebebi anlaşılamamıştır. Çizelge 4.9. Haziran döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Genotipler Ortamlar Embriyo oluşturan anter oranı (%) Embriyo oranı (%) Embriyo sayısı (adet) Bitkiye dönüşen embriyo oranı (%) 277a İnan Gelişen bitki oranı (%) I II Ortalama Toplam 11 I II Ortalama Toplam 20 I II Ortalama Toplam 0 I II Ortalama Toplam 6 45

59 Temmuz Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Temmuz ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşüm oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.10 da verilmiştir. Temmuz ayında sadece sıcağa tolerant İnan 3363 kültür çeşidi ve soğuğa hassas 195 nolu genotipin ortamlara dikilen anterleri embriyo oluşturmuştur. İnan 3363 genotipin I nolu ortam dikilen anterlerinin % i, II nolu ortamda ortama dikilen anterlerin % 9.49 u embriyo oluşturmuştur. Embriyo oranı I nolu ortamda % ve II nolu ortamda % olarak belirlenmiştir. I nolu ortamdan elde edilen embriyolarda bitkiye dönüşüm gerçekleşmezken, II nolu ortamda elde edilen embriyolarda bitkiye dönüşüm ve gelişen bitki oranı % oranında gerçekleşmiştir. 195 nolu genotipin I nolu ortama dikilen anterlerin % 6.00 sı, II nolu ortama dikilen anterlerin % ü embriyo oluşturmuştur. Embriyo oranı, I nolu ortamda % ve II nolu ortamda % olarak gerçekleşmiştir. I nolu ortamda oluşan embriyoların % 3.45 ı, II nolu ortamda oluşan embriyoların % si bitkiye dönüşmüştür. Gelişen bitki oranı ise I nolu ortamda elde edilen embriyolarda % 3.45 ve II nolu ortamda oluşan embriyolarda % 8.70 olarak gerçekleşmiştir. 277A ve 421 nolu genotiplerde, her iki ortama da dikilen anterlerden embriyo elde edilememiştir. Temmuz ayında embriyo oluşturan anter oranı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranında İnan 3363 nolu en yüksek değerleri alırken, Embriyo oranı ve oluşan embriyoların toplamında 195 nolu genotip daha yüksek değer almıştır. İnan 3363 ve 195 nolu genotipler için Temmuz ayında en uygun ortam II nolu ortam bulunmuştur. 46

60 Çizelge Temmuz döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Genotipler Ortamlar Embriyo oluşturan anter oranı (%) Embriyo oranı (%) Embriyo sayısı (adet) Bitkiye dönüşen embriyo oranı (%) 277A İnan Gelişen bitki oranı (%) I II Ortalama Toplam 0 I II Ortalama Toplam I II Ortalama Toplam 0 I II Ortalama Toplam 75 Şekil 4.9. II nolu besin ortamında 195 nolu genotipten oluşmuş embriyo görünümü 47

61 Ağustos Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Ağustos ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.11 de verilmiştir. İnan 3363 kültür çeşidinin II nolu ortama dikilen anterleri % oranında embriyo oluşturma oranı ile en yüksek değer almıştır. I nolu ortama dikilen anterler ise % i embriyo oluşturmuştur. Embriyo oranı ise I nolu ortamda % 27.59, II nolu ortamda % oranında olmuştur. Embriyoların bitkiye dönüşüm oranları I nolu ortamda % ve II nolu ortamda % olarak gerçeklemiştir. Ortamların gelişen bitki oluşturma oranları da sırasıyla I ve II nolu ortamlarda % ve 8.40 olarak gerçekleşmiştir. 195 nolu genotip Ağustos ayında embriyo oluşturma oranı ve embriyo oranı bakımında ikinci genotip olmuştur. I nolu ortama dikilen anterlerin % 4 ü, II nolu ortama dikilen anterlerin % 5.60 ı embriyo oluşturmuş ve embriyo oranı ise I ve II nolu ortamlarda sırasıyla % 8.67 ve % olarak gerçekleşmiştir. I nolu ortamda oluşan embriyoların % 7.69 u ve II nolu ortamda oluşan embriyoların % ü bitkiye dönüşmüştür. I nolu ortamda gelişen bitki olmazken, II nolu ortamda olaşan embriyolarda % olmuştur. 227A nolu genotip ise Ağustos ayında I nolu ortamda % 2.48 oranında embriyo oluşturan anter bulunmuş, embriyo oranı ise % 2.48 olarak gerçekleşmiştir. Bitkiye dönüşüm ve gelişen bitki oluşturma oranı ise % 25 olarak gerçekleşmiştir. II nolu ortama dikilen anterlerin % 3.40 ı embriyo oluşturmuş ve embriyo oluşturma oranı ise % 5.00 olarak gerçekleşmiştir. Oluşan embriyoların % ü bitkiye dönüşürken, % oranında gelişen bitki oluşturmuştur. 421 nolu genotipden, sadece 1 nolu ortamda % 0.83 oranında anterler embriyo oluşturmuş ve embriyo oranı da % 0.83 olarak gerçekleşirken elde edilen embriyo bitkiye dönüşmemiştir. Ağustos ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı ve oluşan embriyoların toplamı, İnan 3363 kültür çeşidi en yüksek değerleri alırken, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranında 277A nolu genotip daha yüksek değerleri almıştır. 48

62 Ağustos ayında inan 421 nolu genotip hariç diğer tüm genotiplerde en uygun ortam II nolu ortam bulunmuştur. İnan 3363 nolu genotip 1 nolu ortamda da başarılı sonuç vermiştir. 421 nolu genotipden I nolu ortamdan düşük oranda embriyo elde edilse bile bitkiye dönüşüm olmamıştır. Anter kültüründe başarıyı etkileyen en önemli faktörlerden biride çevresel faktörlerdir. Çevresel faktörler içerisinde donör bitkinin yetiştirildiği dönemdeki ortam sıcaklığı önemli bir yere sahiptir (Morrison ve ark., 1986); Tiainen, 1992; Kristiansen ve Andersen, 1993; Ercan ve ark., 2006 ve Taşkın, 2005). Çalışmada bazı genotipler yüksek oranda haploid embriyo oluştururken, bazı genotipler düşük oranda embriyo oluşturması; genotiplerin iklim isteklerinin farklı olması ve bitkinin yaşamış olduğu stres faktörlerinin embriyo oluşumunu olumlu yönde etkilemesi akla gelen ilk iki sebeptir. Lu ve ark. (1990) bitkinin yaşamış olduğu streslerin embriyo oluşumunu arttırabileceğini bildirmiştir. Çizelge Ağustos döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Genotipler Ortamlar Embriyo Embriyo Embriyo Bitkiye oluşturan anter oranı (%) oranı (%) sayısı (adet) dönüşen embriyo oranı (%) 277A İnan Gelişen bitki oranı (%) I II Ortalama Toplam 10 I II Ortalama Toplam 171 I II Ortalama Toplam 1 I II Ortalama Toplam 26 49

63 Şekil II nolu besin ortamında 195 nolu genotipten oluşmuş bitki görünümü Şekil I nolu besin ortamında 195 nolu genotipten oluşmuş embriyo görünümü Eylül Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Çizelge 4.12 de Eylül ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşüm oranı ve gelişen bitki oranları verilmiştir. Eylül ayında dikilen anterlerin embriyo oluşturma oranı en yüksek İnan 3363 kültür çeşidinde I nolu ortama dikilen anterlerde % oranında meydana gelmiştir. II 50

64 nolu ortamda ise, embriyo oluşturma oranı % olarak gerçekleşmiştir. Embriyo oranı, I nolu ortama dikilen anterlerde % ve II nolu ortama dikilen anterlerde % olarak gerçekleşmiştir. I nolu ortamda oluşan embriyoların % 6.74 ü, II nolu ortamda oluşan embriyoların % ü bitkiye dönüşmüştür. Gelişen bitki oranı ise I nolu ortamda oluşan embriyolarda % 5.62, II nolu ortamda oluşan embriyolarda % olarak gerçekleşmiştir. Eylül ayında 277A nolu genotipin I nolu ortama dikilen anterlerinin % 7.20 embriyo oluşturmuş ve % embriyo oranı gerçekleşmiştir. II nolu ortama dikilen anterlerin % 2.67 i embriyo oluşturmuş ve embriyo oranı da % 3.33 olarak gerçeklemiştir. Her iki ortamda da bitkiye dönüşüm gerçekleşmemiştir. 195 nolu genotipi anterlerinin I nolu ortamda % 5.47 i embriyo oluşturmuş ve embriyo oranı % olarak gerçekleşmiştir. II nolu ortamda ise anterlerin % 2.0 si embriyo oluşturmuş ve embriyo oluşturma oranı % 1.33 olarak gerçekleşmiştir. Elde edilen embriyolarda bitkiye dönüşüm meydana gelmemiştir. 421 nolu genotipin I nolu ortamda % 2.81, II nolu ortamda ise % 0.67 oranında embriyo oluştururken embriyo oranı ise I nolu ortamda % 4.15, II nolu ortamda % 2.41 olarak gerçekleşmiş, oluşan embriyolarda bitkiye dönüşüm gerçeklememiştir. Eylül ayında embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı ve oluşan embriyoların toplamı ve gelişen bitki oranında İnan 3363 kültür çeşidi yüksek değer alırken bitkiye dönüşen embriyo oranında 421 nolu genotip en yüksek değeri almıştır Eylül ayında tüm genotiplerde embriyo oluşturan anter oranı ve embriyo oranı bakımından I nolu ortama başarılı bulunmuştur. Bitkiye dönüşüm sadece İnan 3363 ve 421 nolu genotiplerde gerçekleşmiştir. İnan 3363 kültür çeşidi II nolu ortamda, bitkiye dönüşüm ve gelişen bitki oranı açısından başarılı daha başarılı bulunmuştur. 51

65 Çizelge Eylül döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Genotipler Ortamlar Embriyo oluşturan anter oranı (%) Embriyo oranı (%) Embriyo sayısı (adet) Bitkiye dönüşen embriyo oranı (%) 277A İnan Gelişen bitki oranı (%) I II Ortalama Toplam 40 I II Ortalama Toplam I II Ortalama Toplam 7 I II Ortalama Toplam Denenen Genotip ve Ortamların Embriyo Oluşturan Anter Oranı, Embriyo Oranı, Bitkiye Dönüşüm ve Gelişen Bitki Oranı Aylara Göre Embriyo Oluşturan Anter Oranı Aylara göre embriyo oluşturan anter oranı Şekil 4.12 ve Çizelge 4.13 de verilmiştir. 277A nolu genotipin I nolu ortama dikilen anterlerinden en yüksek embriyo oluşturma oranı Nisan (% 18.25) ve Ocak (% 14.28) aylarında elde edilirken Temmuz ve Mayıs aylarında ortamlara dikilen anterler embriyo oluşturmamıştır. II nolu ortama dikilen anterlerinden ise, Ekim % 8.98 ve Nisan % 8.01 oranında embriyo oluşumu meydana gelirken Temmuz ayında embriyo oluşmamıştır. İnan 3363 kültür çeşidinin I nolu ortamına dikilen anterlerinden % ile Eylül, % ile Mayıs, % ile Ağustos ve % Ekim aylarından en yüksek embriyo elde edilirken; en düşük oranlar % 0.00 Şubat, % 3.43 Haziran ve % 4.67 Aralık aylarından elde edilmiştir. II nolu ortama dikilen anterler ise Ağustos, 52

66 Mayıs, Ekim ve Eylül aylarında sırasıyla % 40.79, 31.31, ve oranları ile embriyo oluştururken; en düşük embriyo oranı % 0.00 ile Şubat ve % 4.73 ile Aralık aylarında elde edilmiştir. 421 nolu genotipden I nolu ortama dikilen anterlerde embriyo oluşturma oranı en yüksek % ve % 9.81 oranları ile Nisan ve Aralık aylarında elde edilirken Ekim, Kasım, Ocak, Şubat, Mart, Mayıs Haziran ve Temmuz aylarında embriyo oluşturmamışlardır. II nolu ortama dikilen anterler ise % 6.81 ve % 6.72 oranları ile Aralık ve Nisan aylarında en yüksek seviyeler ulaşırken, Kasım, Ocak, Şubat, Mart, Mayıs, Haziran, Temmuz ve Ağustos aylarında embriyo elde edilememiştir. 195 nolu genotipin I nolu ortama dikilen anterlerde embriyo oluşturma oranı en yüksek % 19.31ve % 7.61 ile Temmuz ve Nisan aylarında elde edilirken, Ekim, Kasım, Aralık, Ocak, Şubat ve Mayıs aylarında ortamlara dikilen anterler embriyo oluşturmamışlardır. II nolu ortama dikilen anterler ise % ve % 6.71 oranları ile Aralık ve Nisan aylarında en yüksek seviyeler ulaşırken Ekim, Kasım, Aralık, Ocak, Şubat ve Mayıs aylarında embriyo oluşturmamışlardır. Çizelege 4.13 ve Şekil 4.11 beraber incelendiğinde embriyo oluşturan anter oranı, Ocak ve Nisan aylarında 277A nolu genotip I nolu ortam ile Mayıs, Ağustos ve Eylül aylarında İnan 3363 genotip II ve I nolu ortamlar, Ekim ayında ise İnan 3363 kültür çeşidi II nolu ortamda yüksek bulunmuştur. Sıcağa hassas genotipin anterleri, ortam sıcaklığının düşük olduğu dönemlerde, sıcağa tolerant genotipin anterleri de ortam sıcaklığının yüksek olduğu aylarda yüksek oranda embriyo oluşturmuşlardır. Şubat ve Haziran aylarında tüm genotiplerin embriyo oluşturan anter oranları düşük bulunmuştur. 53

67 54

68 55

69 Aylara Göre Embriyo Oranı Aylara göre embriyo oranı Şekil 4.14 ve Çizelge 4.14 de verilmiştir. 277A nolu genotipin I nolu ortama dikilen anterlerinden en yüksek embriyo oranı Nisan (% 26.86) ve Ocak ( % 14.28) aylarında elde edilirken, Temmuz ve Mayıs aylarında ortamlara dikilen anterler embriyo oluşturmamıştır. II nolu ortama dikilen anterlerinden ise Ekim % ve Nisan % oranında embriyo oluşumu meydana gelirken, Temmuz ayında embriyo oluşmamıştır. Her iki ortama dikilen anterlerin embriyo oluşturma oranı beraber incelendiğinde Nisan (% 18.74), Ekim (% 16.97) ve Ocak (% 14.88) öne çıkan aylar olmuşlardır. Temmuz ayında embriyo oluşumu meydana gelmezken Şubat ayında % 2.78 oranında embriyo oluşmuştur. İnan 3363 kültür çeşidinin I nolu ortamına dikilen anterlerinde; Eylül (% 24.38), Mayıs (% 22.10), Ağustos (%20.95) ve Ekim (% 18.95) aylarında yüksek oranda embriyo oluşurken, en düşük oranlar Şubat (% 0.0,) Haziran (% 3.43) ve Aralık (% 4.67) aylarında gerçekleşmiştir. II nolu ortama dikilen anterler ise, Ağustos, Mayıs, Ekim ve Eylül aylarında % 40.79, 31.31, ve oranları ile embriyo oluştururken; en düşük embriyo oranı Şubat % 0.00 ve Aralık % 4.73 aylarında elde edilmiştir. 421 nolu genotipi I nolu besin ortamında en yüksek embriyo oranları Nisan (% 11.23) ve Aralık (% 9.81) aylarında elde edilirken, Ekim, Kasım, Ocak, Şubat, Mart, Mayıs Haziran ve Temmuz aylarında embriyo elde edilememiştir. II nolu ortama dikilen anterler ise, % 7.72 ve % oranları ile Aralık ve Nisan aylarında en yüksek seviyeler ulaşırken, Kasım, Ocak, Şubat, Mart, Mayıs Haziran, Temmuz ve Ağustos aylarında embriyo elde edilememiştir. 195 nolu genotipden I nolu besin ortamına dikilen anterlerden embriyo oluşturma oranı en yüksek % 19.33, % ve % ile Temmuz, Eylül ve Nisan aylarından elde edilirken, Ekim, Kasım, Aralık, Ocak, Şubat, ve Mayıs aylarında ortama dikilen anterler embriyo oluşturmamışlardır. II nolu ortama dikilen anterler ise, % ve % embriyo oranları ile Temmuz ve Ağustos aylarında en yüksek seviyeler ulaşırken, Ekim, Kasım, Aralık, Ocak, Şubat, ve Mayıs aylarında embriyo oluşturmamışlardır. 56

70 Çizelge 4.14 ve şekil 4.14 beraber incelendiğinde, embriyo oranı, Ocak ve Nisan aylarında 277A nolu genotip, I nolu besin ortamında Mart, Mayıs, Ağustos, Eylül ekim aylarında, İnan 3363 genotip II ve I nolu ortamlar ve Temmuz ayında, 195 nolu genotip II nolu besin ortamında yüksek bulunmuştur. Düşük sıcaklıklara tolerant ve yüksek sıcaklılara hassas genotipler sıcaklığının düşük olduğu dönemlerde, yüksek sıcaklıklara tolerant ve düşük sıcaklıklara hassas genotipler sıcaklığının yüksek olduğu aylarda yüksek oranda embriyo oluşturmuşlardır. Şubat ve Haziran aylarında tüm genotiplerin embriyo oluşturan anter oranları düşük bulunmuştur. Anter kültüründe başarının genotip, (Morison ve ark 1986; Bajaj 1990; Karakullukçu ve Abak 1992; Mityko ve ark 1995; Rodeva ve ark. 2004; Taşkın 2005;), bitkinin yetiştirilme koşulları, (Tiainen 1992; Yang ve ark. 1992; Kristiansen ve Andersen, 1993; Matsubara ve ark 1998; Büyükalaca ve ark. 2004; Mohamed ve Refaei, 2004; Taşkın, 2005; Ercan ve ark. 2006) ortamlar, (Karakullukçu ve Abak 1993; Dias ve Martins 1999; Çömekçioğlu ve ark. 1999; Ercan ve ark. 2001; Büyükalaca ve ark., 2004; Taşkın, 2005; Koleva-Gudeva ve ark. 2007) ve donör bitkinin yaşamış olduğu stres faktörleriyle (Lu ve ark. 1990) ilgili olduğu bildirilmiştir. Bunlardan farklı olarak bu çalışmada anter kültüründe başarıyı, farklı iklim isteklerine sahip genotiplerin farklı yetiştirme dönemlerinde farklı etkileyebiliceği belirlenmiştir. Şekil II nolu besin ortamında 421 nolu genotipten oluşmuş embriyolar 57

71 58

72 59

73 Aylara Göre Bitkiye Dönüşüm Oranı Aylara göre bitkiye dönüşüm oranları Çizelge 4.15 ve Şekil 4.15 de verilmiştir. 277A nolu genotipin I nolu besin ortamından elde edilen embriyoları Nisan Haziran Ocak ve Kasım aylarında en yüksek bitkiye dönüşüm oranları ile öne çıkarken; Eylül, Mart, ve Ekim aylarında bitkiye dönüşüm oranları düşük bulunmuştur. II nolu besin ortamından elde edilen embriyolar ise en yüksek Ocak Ağustos ve Kasım aylarında bitkiye dönüşürken, Ekim ve Şubat ayında düşük bulunmuştur. İnan 3363 kültür çeşidinin I nolu besin ortamından elde edilen embriyoları Nisan Ağustos ve Ocak aylarında bitkiye dönüşümü yüksek bulunurken, Kasım Şubat Temmuz ve Eylül aylarında düşük bulunmuştur. II nolu ortamdan elde edilen embriyolarda ise Mart Nisan ve Eylül ayları yüksek bulunurken, Ekim Kasım, Aralık ve Ocak aylarında düşük bulunmuştur. 421 nolu genotip I nolu besin ortamından elde edilen embriyolar sadece Eylül ve Nisan aylarında bitkiye dönüşürken, diğer aylarda bitkiye dönüşüm gerçekleşmemiştir. 421 nolu genotipin II nolu besin ortamından elde edilen embriyolarında bitkiye dönüşüm Aralık ve Nisan ayında gerçekleşmiştir. 195 nolu genotipin I nolu besin ortamından elde edilen embriyolarda bitkiye dönüşüm En yüksek Mart ve Nisan aylarında meydana gelmiş, Haziran, Temmuz ve Ağustos aylarında bitkiye dönüşüm düşük olarak gerçekleşmiştir. II nolu besin ortamından elde edilen embriyolarda en yüksek oranda bitkiye dönüşüm Mart, Nisan, Haziran ve Ağustos aylarında meydana gelirken, Eylül ayında bitkiye dönüşüm gerçekleşmemiştir. Bitkiye dönüşüm hem ortam, hem de genotiplerden etkilenmektedir. (Chuong ve Beversdorf, 1985;,Karakullukçu ve Abak, 1992; Mityko ve ark. 1995;. Taşkın 2005; Mohamed ve Refaei 2005). 60

74 61

75 62

76 Şekil Farklı ortamlarda farklı genotiplerden oluşmuş bitki görünümleri Aylara Göre Gelişen Bitki Oranı Çizelge 4.16 ve Şekil 4.17 da aylara göre gelişen bitki oranları verilmiştir. 277A nolu genotipin I nolu besin ortamından elde edilen embriyoları Nisan, Ocak, Kasım ve Ağustos aylarında yüksek oranda gelişen bitki oranları ile öne çıkarken, Şubat, Mart ve Eylül aylarında gelişen bitki oranları düşük bulunmuştur. II nolu besin ortamından elde edilen embriyolar ise en yüksek gelişen bitki oranları Kasım, Ocak, Ağustos ve Nisan aylarında gerçekleşirken Ekim, Şubat, Haziran ve Eylül aylarında düşük bulunmuştur. İnan 3363 kültür çeşidinin I nolu besin ortamından elde edilen embriyolarında Mart, Nisan, Mayıs ve Ağustos aylarında gelişen bitki oranları yüksek bulunurken, Kasım, Aralık, Şubat, Haziran ve Temmuz aylarında düşük bulunmuştur. II nolu besin ortamından elde edilen embriyolarda ise Mart Nisan, Mayıs Temmuz ve Eylül ayları yüksek bulunurken, Kasım, Aralık ve Ocak, Şubat ve Haziran aylarında düşük bulunmuştur. 421 nolu genotipin her iki ortamdan da elde edilen embriyolarında sadece Nisan ayında gelişmiş bitki elde edilmiştir. 195 nolu genotipin I nolu besin ortamından elde edilen embriyolarda gelişen bitki oranı en yüksek Mart ve Nisan en düşük de Haziran Ağustos ve Eylül aylarında 63

77 olmuştur. II nolu besin ortamından elde edilen embriyolarda en yüksek gelişen bitki oranı Mart, Nisan, Haziran ve Ağustos aylarında meydana gelirken, en Eylül ayında gelişmiş bitki elde edilememiştir. 64

78 65

79 66

80 4.2. Mikrospor Gelişimi Nolu Genotipin Mikrospor Gelişimi Çizelge 4.17 de farklı dönemlerde ve farklı ortamlarda kültüre alınan 195 nolu genotipin anterlerinin farklı zamanlarda içermiş olduğu boş, tek ve iki çekirdekli mikrospor oranları verilmiştir. 195 nolu genotip kültürün 0. günü Mayıs ayında % oranında tek çekirdekli ve % 0.45 oranında boş mikrospor oranı, Ağustos ayında % oranında tek çekirdekli % 1.24 boş mikrospor oranı ve Ekim ayında % oranında tek çekirdekli, % 1.58 boş mikrospor oranına sahipken kültürün 1. gününden itibaren tek çekirdekli mikrospor oranı, Mayıs ve Ağustos aylarında dalgalı bir seyir izleyerek nispeten daha yavaş bir şekilde ve Ekim ayında ise hızlı bir şekilde düşmüştür. Tek çekirdekli mikrospor oranı; Mayıs ayında I nolu besin ortamında % 7.99 ve II nolu besin ortamında % 7.98, Ağustos ayında I besin ortamında % ve II besin ortamında % 50.35, Ekim ayında I besin ortamında % ve II besin ortamında % 0,00 şeklinde tespit edilmiştir. Tek çekirdekli mikrospor oranının hızla düşüşüne paralel olarak boş mikrosporlar hızla yükselerek kültürün 14. gününde Mayıs ayında I nolu besin ortamında % ve II nolu besin ortamında % 73.76, Ağustos ayında I nolu besin ortamında % 64.12, II nolu besin ortamında % ve Ekim ayında I nolu besin ortamında % ve II nolu ortamda % 100 olarak bulunmuştur. İki çekirdekli mikrosporlar ise Mayıs ayında I ve II nolu besin ortamında 2, 8 ve 14. günlerde, Ağustos ayında II nolu besin ortamında 2. günde, Ekim ayında ise I nolu besin ortamında 2. günde yüksek bulunmuştur. 195 nolu genotipin Mayıs ayı I nolu besin ortamında 14. günde % 1.52 ve II nolu besin ortamında 8. günde % 0.79, 14 günde % 1.47 oranında üç çekirdekli, % 0.58 oranına dört çekirdekli ve % 1.16 oranında çok çekirdekli mikrospor görülmüştür. Ağustos ayında I nolu besin ortamında 4. günde % 0.35, 8. günde % 0.23 ve II nolu besin ortamında 14. günde % 0.68 oranında üç çekirdekli mikrospor ve % 0.82 oranında dört çekirdekli mikrospora sahiptir. Ekim ayında I nolu besin ortamında 1. günde % 3.74, 2. günde % ve 3 günde % 3.88, 14 günde % 0.61, 67

81 II nolu besin ortamında 1.günde % 3.26, 2. Günde % 1.30 ve 3. günde % 0.65 oranında üç çekirdekli mikrosporlar görülmüştür. Tek çekirdekli mikropsporların bölünmesinin Ekim ayında her iki ortamda da düşük oranda olduğu Mayıs ve Ağustos diğer aylara nispeten daha yüksek bir oranda bölünmenin gerçekleştiği belirlenmiştir. Şekil 4.18 ve Şekil 4.19 de farklı zamanlarda kültüre alınan 195 nolu genotipin bölünme durumları gözükmektedir. Kültürün ilk gününden itibaren anterlerdeki mikrosporların büyük çoğunluğunun çekirdekleri eriyerek sadece hücre duvarı kalmıştır. (Keiffer ve ark.1993; Kaltchuk-Santos, 1997; Gonzalez, ve Jouve, 2005; Supena ve ark. 2005; Kim ve ark. 2005; Zhang, 2009) Aynı genotipin farklı zamanlarda ve farklı hızlarda hücre çekirdeklerinin eriyerek kaybolması ve boş mikrosporlarındaki artışı mevsim etkisi olarak açıklanabilir. Anter kültüründe mevsim etkisi Tiainen (1992); Yang ve ark. (1992); Matsubara ve ark (1998); Büyükalaca ve ark., (2004); Mohamed ve Refaei, (2004); Taşkın, (2005); Ercan ve ark., (2006) tarafından bildirilmiştir. Kültürün ilk günlerinden itibaren çekirdekler bölünmeye başlayarak 2 ve daha fazla çekirdeğe sahip mikrosporları oluşturmuşlardır. Bu sonuçlar değişik türlerde yapılan çalışmalara uygundur. (Gonzalez ve Jouve, 2003; Supena ve ark. 2005; Pescitelli ve Petolino 1998) Kültürün 14. günü hala bölünmemiş tek çekirdekli mikrosporlar mevcuttur. Bu sonuçlar Kim ve ark. (2004); Supena ve ark. (2005) sonuçları ile uyumludur. Şekil nolu genotipin Ekim ayı II nolu besin ortamında mikrospor gelişimi 68

82 Şekil nolu genotipi II nolu besin ortamında mikrospor gelişimi Çizelge nolu genotipe ait farklı zamanlarda ve farklı ortamlarda mikrospor gelişim oranı Ortamlar I Ortam II Ortam Boş Tek İki Boş Tek İki Aylar Günler çekirdek çekirdek çekirdek çekirdek Mayıs Ağustos Ekim

83 Şekil Boş, tek, iki, ve üç çekirdekli mikrosporların floresan mikroskobu ile görünümü A Nolu Genotipin Mikrospor Gelişimi Şekil A nolu genotipin Ekim ayında I nolu besin ortamında mikrospor gelişimi 70

84 Çizelge A nolu genotipe ait farklı zamanlarda ve farklı ortamlarda mikrospor gelişim oranı Ortamlar Aylar Günler I Ortam II Ortam Tek İki Tek İki Boş çekirdek çekirdek Boş çekirdek çekirdek Şubat Mayıs Ağustos Ekim Farklı dönemlerde ve farklı ortamlarda kültüre alınan 277A nolu genotipin anterlerinin farklı zamanlarda içermiş olduğu boş, tek çekirdekli ve iki çekirdekli mikrospor oranları Çizelge 4.18 de görülmektedir. 277A nolu genotip, kültürün 0. gününde Şubat ayında % oranında tek çekirdekli, % 0.49 oranında boş ve % 0.54 oranında üç çekirdekli mikrospor, Mayıs, Ağustos ve Ekim aylarında % 100 oranında tek çekirdekli mikrospor oranına sahipken, kültürün 1. gününden itibaren 71

85 tek çekirdekli mikrospor oranı çarpıcı bir şekilde düşerek Şubat ayında 14. günde I nolu besin ortamında % 3.48 ve II nolu besin ortamında % 2.45, Mayıs ayında ayında I nolu besin ortamında % 0.86 ve II nolu besin ortamında % 1.77, Ağustos ayında I nolu besin ortamında % 2.01 ve II nolu besin ortamında % 1.57, Ekim ayında II nolu besin ortamında % 4.09 a düşmüştür. Tek çekirdekli mikrospor oranı hızla düşerken, boş mikrosporlar hızla yükselerek kültürün 14. gününde Şubat ayında I nolu besin ortamında % ve II nolu ortamda % 97.75, Mayıs ayında I nolu besin ortamında % 98.93, II nolu ortamda % 97.19, Ağustos ayında I nolu besin ortamında % 97.38, II nolu besin ortamında % ve Ekim ayında II nolu besin ortamında olarak bulunmuştur. İki çekirdekli mikrosporlar ise Şubat ayında II nolu besin ortamında 2. günde, Mayıs ayında I nolu besin ortamında 2. ve 3. günlerde, II nolu besin ortamında 1. ve 2. günlerde, Ağustos ayında her iki ortamda 2. günde ve Ekim ayında ise I nolu besin ortamında 2. günde II nolu besin ortamında 3. günde yüksek bulunmuştur. 277 nolu genotip Şubat ayında I nolu besin ortamında kültüre alınan anterlerinde 0. günde % 0.54 ve 14. günde % 0.40 oranlarında, Mayıs ayında II nolu besin ortamında kültüre alınan anterlerinde 4. günde % 0.45 oranında, Ağustos ayı II nolu besin ortamında kültüre alınan anterlerinde 1. günde % 7.75 oranında ve Ekim ayı I nolu besin ortamında kültüre alınan anterlerinde 1. günde % 2.69, 2. günde % 3.44 ve 3 günde % 8.66, 4 günde % 1.36 oranlarında ve II nolu ortamda kültüre alınan anterleri 1. günde % 3.96, 2. günde % 10.09, 3. günde % 3.02, 4. günde % 0.88 ve 14 günde % 0.31 oranında üç çekirdekli mikrosporlar görülmüştür. Bütün dönemlerde kültürün ilk gününden itibaren anterlerdeki mikrosporların büyük çoğunluğunun çekirdekleri eriyerek sadece hücre duvarı kalması ve bütün dönemlerde düşük oranlarda hücre bölünmesiyle birlikte kültürün ilerleyen günlerinde oranının düştüğü belirlenmiştir. Kültürün ilk günlerinde çekirdek bölünmesi gerçekleştiren mikrosporlarda da çekirdek erimesinin gerçekleştiği belirlenmiştir. İlk çekirdek bölünmesinin çok düşük oranlarda olduğu ve ilk bölünmenin gerçekleştiği mikrosporlarda da ikinci bölünme oranının çok düştüğü belirlenmiştir 72

86 Şekil , 2 ve 4 çekirdeğe sahip mikrosporlar İnan 3363 Kültür Çeşidinin Mikrospor Gelişimi Şekil 4.19.İnan 3363 kültür çeşidinin Ağustos ayında mikrospor gelişimi 73

87 Çizelge İnan 3363 genotipine ait farklı zamanlarda ve farklı ortamlarda mikrospor gelişim oranı Ortamlar I Ortam II.Ortam Tek İki Tek İki Aylar Günler Boş çekirdek çekirdek Boş çekirdek çekirdek Mayıs Ağustos Ekim Çizelge 4.19 da farklı dönemlerde ve farklı ortamlarda kültüre alınan İnan 3363 kültür çeşidi anterlerinin farklı zamanlarda içermiş olduğu boş tek çekirdekli ve iki çekirdekli mikrospor oranları verilmiştir. İnan 3363 kültür çeşidi kültürün 0. günü Mayıs ayında % oranında tek çekirdekli ve % 0.51 oranında boş mikrospor oranı, Ağustos ayında % oranında tek çekirdekli, % 1.71 oranında iki ve % 8.76 oranında boş mikrospora ve Ekim ayında % oranında tek çekirdekli % 3.53 oranında boş mikrospora sahipken, kültürün 1. gününden itibaren tek çekirdekli mikrospor oranı dalgalı bir şekilde düşerek 14. günde Mayıs ayında I nolu besin ortamında % 6.15, Ağustos ayında I nolu besin ortamında % ve II nolu besin ortamında % ve Ekim ayında I nolu besin ortamında % ve II nolu besin ortamında % 4.69 a düşmüştür. Tek çekirdekli mikrospor oranı düşerken boş 74

88 mikrosporlar yükselerek kültürün 14. gününde Mayıs ayında I nolu besin ortamında % 93.85, Ağustos ayında I nolu besin ortamında % 49.32, II nolu besin ortamında % ve Ekim ayında I nolu besin ortamında % 57.68, II nolu besin ortamında % olarak bulunmuştur. İki çekirdekli mikrosporlar ise Mayıs ayında I nolu besin ortamında 2. günde, II nolu besin ortamında 2. ve 4. günlerde, Ağustos ayında I nolu besin ortamında 3. ve 4. günlerde, II nolu besin ortamında 4. ve 8. günlerde, Ekim ayında ise I nolu besin ortamında 4. ve 8. günlerde, II nolu besin ortamında ise 0. ve 14. günler hariç diğer tüm günlerde yüksek bulunmuştur. İnan 3363 kültür çeşidinin Mayıs ayında I nolu besin ortamında kültüre alınan anterlerinde 14. günde % 0.45 oranında üç çekirdekli mikrosporlar bulunmuştur. İnan 3363 kültür çeşidinde tek çekirdekli mikrosporların bölünmesi bütün dönemlerde diğer genotiplere nazaran daha yüksek olduğu ve hücre bölünmesinin kültürün ilerleyen günlerde dalgalı bir seyir izlemiştir. Bunun sebebi boyama yöntemleri yardımıyla incelenen anterlerin yeterli sayıda olmadığından kaynaklandığı düşünülmektedir. Şekil Boş, tek, iki, ve üç çekirdekli mikrosporların ışık mikroskobu ile görünümü 75

89 Nolu Genotipin Mikrospor Gelişimi Şekil nolu genotipin Ağustos ayında II nolu besin ortamında mikrospor gelişimi Farklı dönemlerde ve farklı ortamlarda kültüre alınan 421 nolu genotipin anterlerinin farklı zamanlarda içermiş olduğu boş, tek çekirdekli ve iki çekirdekli mikrospor oranları Çizelge 4.20 de görülmektedir. 421 nolu genotipin anterleri kültürün 0. günü, Şubat ayında % tek çekirdekli, % 0.89 boş ve % 0.66 oranında iki çekirdekli mikrospor oranı, Mayıs ayında % oranında tek çekirdekli ve % 4.86 oranında iki çekirdekli oranı, Ağustos ayında % oranında tek çekirdekli % 0.92 oranında boş ve % 0.99 oranında iki çekirdekli mikrospor ve Ekim ayında % oranında tek çekirdekli % 4.46 boş mikrospora sahipken, kültürün 1. gününden itibaren tek çekirdekli mikrospor oranı çarpıcı bir şekilde düşerek 14. günde Şubat ayında I nolu besin ortamında % 0.90 ve II nolu besin ortamında % 4.42, Mayıs ayında I nolu besin ortamında % 0.68 ve II nolu besin ortamında % 0.26, Ağustos ayında I nolu ortamda % 7.07 ve II nolu besin ortamında % 4.26, Ekim ayında ise her iki ortamda da % 0 olmuştur. Tek çekirdekli mikrospor oranı hızla düşerken, boş mikrosporlar hızla yükselerek kültürün 14. gününde Şubat ayında I nolu besin ortamında % 99.10, II nolu besin ortamında % 95.11, Mayıs ayında I nolu besin ortamında % 99.19, II nolu besin ortamında % 99.47, Ağustos ayında I nolu besin ortamında % 92.57, II nolu besin ortamında % 93.91, ve Ekim ayında her iki ortamda da % 100 olarak bulunmuştur. İki çekirdekli mikrosporlar ise 76

90 Mayıs ayında 0. günde, Ağustos ayında I nolu besin ortamında 2., 3., ve 8. günlerde II nolu besin ortamında 2. ve 8. günlerde Ekim ayında I nolu besin ortamında 1. günde yüksek bulunmuştur. 421 nolu genotipin Şubat ayında II nolu besin ortamında kültüre alınan anterlerinde 14. günde % 0.47, Mayıs ayında II nolu besin ortamında kültüre alınan anterleri de 14. günde % 0.20 ve Ağustos ayında II nolu besin ortamında kültüre alınan anterlerinde 2. günde % 0.42, 14. günde % 0.33 oranlarında üç çekirdekli mikrosporlar gözlenmiştir. Bütün dönemlerde kültürün ilk gününden itibaren anterlerdeki mikrosporların büyük çoğunluğunun çekirdekleri eriyerek sadece hücre duvarı kalması ve düşük oranlarda hücre bölünmesiyle birlikte kültürün ilerleyen günlerinde oranının düştüğü belirlenmiştir. Kültürün ilk günlerinde çekirdek bölünmesi gerçekleştiren mikrosporlarda da çekirdek erimesinin gerçekleştiği belirlenmiştir. İlk çekirdek bölünmesinin çok düşük oranlarda olduğu ve ilk bölünmenin gerçekleştiği mikrosporlarda da ikinci bölünme oranının çok düştüğü belirlenmiştir 77

91 Çizelge nolu genotipine ait farklı zamanlarda ve farklı ortamlarda mikrospor gelişim oranı Ortamlar Aylar Günler I Ortam II Ortam tek tek boş çekirdek iki çek boş çekirdek iki çek Şubat Mayıs Ağustos Ekim

92 5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER İklim koşullarına adaptasyon bakımından farklı özelliklere sahip (düşük ve yüksek sıcaklığa hassas ve tolerant) biber genotiplerinden farklı zamanlarda alınan anterlerden embriyo ve bitkiye dönüşüm oranları tespit edilerek; farklı genotip ile embriyo ve bitkiye dönüşüm arasında bir ilişkinin olup olmadığı ortaya çıkarmak amacıyla yapılan bu çalışmada yüksek sıcaklıklara sıcağa hassas 277A nolu genotip, yüksek sıcaklara tolerant İnan 3363 isimli kültür çeşidi, düşük sıcaklıklara hassas 195 nolu genotip ve düşük sıcaklıklara tolerant 421 nolu genotipler olmak üzere 4 genotip, 0,1 ve 05 mg/l BAP içeren MS besin ortamları kullanılmıştır. Çalışmada ayrıca genotiplerin anter kültürü süresince farklı zamanlarda mikrospor gelişme durumlarını belirlemek amacıyla, DAPİ ve Asetokarmen boyama yöntemleri ile yardımıyla floresan ve ışık mikroskobu ile incelemeler yapılmıştır. Araştırmadan elde edilen bulgular aşağıdaki gibi özetlenebilir: 1) Deneme sonucunda, yüksek sıcaklığa tolerant İnan 3363 kültür çeşidi Ekim, Kasım, Mart, Mayıs Ağustos ve Eylül aylarında embriyo oranı bakımında en iyi genotip olurken, Aralık ayında düşük sıcaklıklara tolerant 421 nolu genotip, Ocak ve Nisan aylarında yüksek sıcaklara hassas 277A nolu genotip ve Temmuz ayında ise düşük sıcaklıklara hassas 195 nolu genotip öne çıkmıştır. 2) Besin ortamları bakımından sıcaklığın nispeten daha düşük olduğu Kasım, Aralık, Ocak, Nisan ve Eylül aylarında I nolu besin ortamı (MS + 30g/l sakkaroz + % 0.25 aktif kömür + 15 mg/l AgNO3 + 4 mg/l NAA + 1 mg/0.1bap) ve sıcaklığın daha yüksek olduğu Ekim, Mart, Mayıs, Temmuz ve Ağustos aylarında II nolu besin ortamı (MS + 30 g/l sakkaroz + % 0.25 aktif kömür+ 15 mg/l AgNO3 + 4 mg/l NAA mg/l BAP) daha başarılı bulunmuştur. Bahar ve yaz aylarında sürgün gelişmesi yoğun olduğundan bitkinin içsel oksin seviyesi yüksek olduğu için daha yüksek seviyede sitokinin içeren II nolu besin ortamında daha başarılı sonuçların elde edilirken, sürgün gelişmesinin daha az olduğu ve buna bağlı olarakda içsel oksin seviyesinin düştüğü kış aylarında I nolu ortam daha başarılı sonuçlar elde edilmiştir. 3) Genotip ve besin ortamları birlikte değerlendirildiği zaman en yüksek embriyo oranı % 66 ile Ağustos ayında II nolu besin ortamı İnan 3363 kültür çeşidinden elde 79

93 5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER edilirken, genel olarak II nolu besin ortamı daha fazla oranda embriyo oluşumu teşvik ettiği belirlenmiştir. 4) Değişik zamanlarda yapılan anter ekimlerinde ise embriyo oranı bakımından en başarılı sonuçlar % ile Ağustos ayından alınmıştır. Çevresel faktörler içerisinde donör bitkinin yetiştirildiği dönemdeki ortam sıcaklığı önemli bir yere sahiptir (Morrison, ve ark., 1986; Tiainen, 1992; Kristiansen ve Andersen, 1993; Ercan ve ark., 2006 ve Taşkın, 2005). Bitkinin yaşamış olduğu stres faktörlerinin embriyo oluşumunu olumlu yönde etkilemektedir (Lu ve ark. 1990). 5) Değişik zamanlarda elde edilen embriyolarda bitkiye dönşüm bütün genotiplerde zamanlara ortama ve genotiplere göre farklılık göstermiştir. Nisan ayı bütün genotiplerde yüksek oranda bitkiye dönüşüm ile öne çıkmıştır. Taşkın (2005), farklı zamanlarda kültüre alınan anterlerde oluşan embriyoların en yüksek bitkiye dönüşüm oranının Nisan, Mayıs ve Haziran aylarında gerçekleştiğini bildirmiştir. 6) Farklı zamanlarda ortamlardan alınarak sabitlenen anterlerdeki mikrosporların büyük çoğunluğunda kültürün ilk gününden itibaren çekirdek erimesi sonucu boş mikrosporların meydana geldiği ve düşük çekirdek bölünmesi 2 ve daha fazla çekirdek içeren mikrosporların oluştuğu, çekirdek bölünmesi ve erimesinin kültür dönemine ve genotiplere göre farklılık gösterdiği belirlenmiştir. Kültürün ilk gününden itibaren anterlerdeki mikrosporların büyük çoğunluğunun çekirdekleri eriyerek sadece hücre duvarı kalmıştır. (Kim ve ark., 2004; Supena ve ark., 2005; Zhang, 2009.) Aynı genotipin farklı zamanlarda farklı hızlarda hücre çekirdeklerinin eriyerek kaybolması ve boş mikrosporların artışı mevsim etkisi olarak açıklanabilir. Anter kültüründe mevsim etkisini Tiainen (1992), Yang ve ark. (1992), Matsubara ve ark. (1998), Büyükalaca ve ark. (2004), Mohamed ve Refaei (2004), Taşkın (2005) ve Ercan ve ark. (2006) tarafından bildirilmiştir. Kültürün ilk günlerinden itibaren çekirdekler bölünmeye başlayarak 2 ve daha fazla çekirdeğe sahip mikrosporları oluşturmuşlardır. Bu sonuçlar değişik türlerde yapılan çalışmalara uygundur. (Gonzalez ve Jouve, 2003; Supena ve ark., 2005; Pescitelli ve Petolino, 1998) Kültürün 14. günü hala bölünmemiş tek çekirdekli mikrosporlar mevcuttur. Bu sonuçlar Kim ve ark. (2004), Supena ve ark. (2005) nın sonuçları ile uyumludur. 80

94 5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER Araştırmada elde edilen bulgulara dayanarak bu denemede kullanılan genotiplerde haploid embriyo uyartımı ve bitkiye dönüşümün sağlanabilmesi için genotiplerin iklim isteklerine uygun bir zamanda kültür çalışmasının yapılması gerektiği sonucuna varılmıştır. 81

95 5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER 82

96 KAYNAKLAR ABAK, K., Biberde (Capsicum annuum L.) anter kültürü yoluyla haploid bitki elde etme üzerinde araştırma. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yıllığı. Cilt: 33, ANDREWS, J., Peppers. The Domesticated Capsicum. University. of Texas Pres, Box 7819 Austin, Texas ANONYMOUS, FAO Statistical Database, http: ANONYMOUS, FAO Statistical Database, http: BAJAJ, Y.P.S. Bajaj, In vitro production of haploids and their use in cellgenetics and plant breeding, Biotechnology in Agriculture and Forestry, vol. 12, Haploids in Crop Improvement I (1990) pp BAL, U., ELLİALTİOGLU, Ş., and ABAK, K., 2009 İnductıon of symmetrıcal nucleus division and multi-nucleate structures ın microspores of eggplant (Solanum melongena L.) cultured ın vıtro Scientia Agricola 66(4): BLAKESLEE, A.F., BELLING, J., FARNHAM, M.E., and BERGNER, A.D., A haploid mutant in the Jimson weed, Datura Stramonium Science, 55, BÜYÜKALACA, S., ÇÖMLEKÇİOĞLU, N., ABAK, K., EKBİÇ, N., and KILIÇ, N., Effect of silver nitrate and donor plant growing conditions on production of pepper (Capsicum annuum L.) haploid embryos via anther culture. Europ. J. Hort. Sci., 69 (5): CHUONG, P.V., and BEVERSDORF, W.D., High frequency embryogenesis through isolated microspore culture in Brassica napus L. and B. Carinata braun. Plant Science, Volume 39, 3: ÇAĞLAR, Ç., ARAS V., and BAYRAM A., 2004 Kurutmalık kırmızı biberlerde androgenesis yoluyla ın vıtro haploid embriyo uyartımı Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 2004, 17(1), CHAMBONNET, D., Production of haploid pepper plants. Bulletin interne de la station d Amelioration des Plantes Maraicheres d Avignon-Montfavet, France,

97 ÇİNER, D.Ö., and TIPIRDAMAZ, R., The Effects of Cold Treatment and Charcoal on the In vitro Androgenesis of Pepper (Capsicum annuum L.) Turk J Bot 26 (2002) TÜBİTAK. ÇÖMLEKÇİOĞLU, N., BÜYÜKALACA, S., and ABAK, K., Şanlıurfa ve Kahramanmaraş biber populasyonlarında anter kültürü yöntemiyle haploid bitki elde etme olanakları. Türkiye III. Ulusal Bahçe Bitkileri Kongresi, Ankara, ÇÖMLEKÇİOĞLU, N., BÜYÜKALACA, S., and ABAK, K., Effect of silver nitrate on haploid embryo induction by anther culture in pepper (Capsicum annuum). XIth EUCARPIA Meeeting on Genetics and Breeding of Capsicum & Eggplant, 2001, Antalya-Turkiye. DIAS, J.S., and MARTINS, M.G., Effect of silver nitrate on anther culture embryo production of different Brassica oleracea morphotypes. Scientia Horticulturae 82: DUMAS DE VAULX, R., Obtention de plantes haploides chez le melon (Cucumis melo L.) apres pollinisation par Cucumis ficifoilus A. Rich. Comptes Rendus de 1 Academie des Sciences Paris, Serie D, 289, DUMAS DE VAULX, R., and CHAMBONNET, D., and SIBI, M., Culture in vitro d antheres de piment (Capsicum annuum L.): amelioration des taux d obtention de plantes chez differents genotypes par de traitments A+35 C. Agronomie, 11:859 DUNWELL J.M Haploids in flowering plants: origins and exploitation Plant Biotechnology Journal (2010) 8, pp ELLİALTIOĞLU, Ş., and TIPIRDAMAZ, R., Soğuk uygulamaları ve aktif kömürün biberde (Capsicum annuum L.) Anter Kültürü Süresince Absisik Asit Miktarındaki Değişim Üzerine Etkisi. Akdeniz Üniversitesi, Ziraat Fakültesi Dergisi; 15(1):

98 ERCAN, N., BOYACI, F., and AYAR, F., Biberde (Capsicum annuum L.) anter kültürü yoluyla haploid bitki eldesi üzerine farklı besin ortamlarının etkisi. GAP II. Tarım Kongresi, Ekim, Şanlıurfa, Cilt 1, ERCAN, N., SENSOY, F., and SENSOY, A.S., Influence of Growing Season and Donor Plant Age on Anther Culture Response of Some Pepper Cultivars (Capsicum annuum L.) Scientia Horticulturae Scientia Horticulturae. 110 (1): GREENLEAF, W.H., Pepper Breeding. Breeding Vegetable Crops. A.V.I., GONZÁLEZ, J.M., ve JOUVE, N., 2005 Microspore development during in vitro androgenesis in triticale. Bıologıa Plantarum 49 (1): 23-28, 2005 IBPGR, Genetic resources of Capsicum, IBPGR Secretariat, Rome, 49. HATİPOĞLU, R., Bitki Biyoteknolojisi. Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Genel YayınNo: 190. Ders Kitapları Yayın No: A-58. HEISER, C.B.JR., Peppers, In Evoluation of Crop Plants. (Edited by N. W.Simmands, 1986). Longman Sci.& Tech. Report, HENRY, Y., and De BUYSER, J., Androgenese chez le ble tendre. Analysetheorique et utilisation en selection. These de Docteur d Etat. Specialite: Sciences Naturelles. Univ. Paris-Sud, Centre d Orsay, 132 ptannexes KALTCHUK-SANTOS, E., MARIATH, J.E., MUNDSTOCK, E., HU, C., and BODANESE-ZANETTİNİ, M. H Cytological analysis of early microspore divisions and embryo formation in cultured soybean anthers. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 49: , KARAKULLUKÇU, Ş., ve ABAK, K., Bazı patlıcan çeşitlerinin anter kültürüne tepkileri. A.Ü. Ziraat Fakültesi Yıllığı. Cilt:42, Fasikül: s:7-12 KARAKULLUKÇU, Ş., ve ABAK, K., Patlıcanda anter kültürü üzerinde araştırmalar. I. Şeker ve büyümeyi düzenleyicilerin etkileri. Doğa- Turkısh Journal of Agricultural and Forestry, 17:

99 KAYA, Z., Bitki Biyoteknolojisi I Doku Kültürü Uygulamaları sayfa XIV KELEŞ, D., Farklı biber genotiplerinin karakterizasyonu ve düşük sıcaklığa tolerans Sayfa sayısı 212. KIEFFER, M., FULLER, M.P., CHAUVIN J.E., and SCHLESSER A., Anther culture of kale (Brassica oleracea L. convar, acephala (DC.)Alef.) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 33: , KIM M., and JANG IC (2000) Rapid assessment of microspore development stage in pepper using DAPI and ferric chloride. J. Plant Biotech. 2: KIM, M., KIM, J., YOUN, M., CHOI, D., and LEE, K.M., Origin of Multicellular Pollen and Pollen Embryos in Cultured Anthers of Pepper (Capsicum annuum) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 77: 63 72, KRISTIANSEN, K., and ANDERSEN, B., Effect of donor plant temparature, photoperiod and age on anther culture response of Capsicum annuum L. Euphitica 67: KOLEVA-GUDEVA, L.R., SPASENOSKI, M., and TRAJKOVA, F., Somatic embryogenesis in pepper anther culture: The effect of incubation treatments and different media. Scientia Horticulturae, 111 (2007) KÖKSAL, N., Haploid kavun bitkilerinde in vitro ve in vivo yöntemlerle diploidizasyon. Ziraat Fakültesi Yüksek Lisans, Sayfa Sayısı: 116. LU, C.S., SHARMA H.C., and OHM, H.W., 1991 Wheat anther culture: effect of genotype and environmental conditions. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 24: , MATSUBARA, S., YAMAMOTO, M., JO, M.H., and MURAKAMI K., Embryoid and callus formation from microspor by anter culture from july to november in pepper (Capsicuum annuum L.) Scientif Report of the Faculty of Agriculture Okoyama University vol. 87, (1998) MITYKO, J., ANDRASFALVY, A., CSILLERY, G., and FARI, M., Anther culture response in different genotypes and F1 hybrids of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Breeding, 114: MURASHIGE, T., and SKOOG, F., A revised medium for rapid growth and bioassy with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15:

100 MOHAMED, M.F., and REFAEI E. F. S., 2004 Enhanced haploids regeneration in anther culture of summer squash (cucurbita pepo l.) Cucurbit genetics cooperative report 27:57-60 (2004) MORRISON, R., KONING, R.E., and EVANS, D.A., Anther culture of an interspesific hybrid of Capsicum. J. Plant Physiol,126:1-9. NITTA, T., TAKAHATA, Y., and KAIZUMA N., Scanning electron microscopy of microspore embroyogenesis in Brassica spp. Plant Cell Reports (1997) 16: NOWACZYK, P., and KISIA, A., Effect of selected factors on the effectiveness of Capsicum annuum L. anther culture J Appl Genet 47(2), pp OINUMA, T., Tobacco breeding by anther culture Proc. Symp. On Trop Agric. Res., 11, PENG, M., ZIAUDDIN, A., and WOLYN, D.J., Development of asparagus mıcrospores ın vıvo and ın vıtro ıs ınfluenced by gametogenıc stage and cold treatment In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 33: , October- December 1997 PINTOS, B., MANZANERA J.A., and BUENO M.A, 2005 Cytological analysis of early microspore divisions leading to gametic embryo formation in Quercus suber L. anther cultures Acta Physıologıae Plantarum Vol. 27. No. 4B.: PESCITELLI, S.M., and PETOLINO J.F., 1988 Microspore development in cultured maize anthersplant Cell Reports (1988) 7: Plant Cell Reports RODEVA, V.N., IRİKOVA, T.P., and TODOROVA, V.J., 2004 Anther culture of pepper (Capsicum annuum L.) Comparative study on effect of the genotype Biotechnol. & Biotechnol. Eq. 18/2004/3 SAYILIR, A., ve ÖZZAMBAK, E., 2005 Biber anter kültüründe uygun tomurcuk büyüklüğü ile besin ortamı içeriklerinin embriyo verimine etkileri üzerine bir araştırma Ege Üniv. Ziraat. Fak. Derg., 2005, 42(3):

101 TAŞKIN, H., Bazı biber genotiplerinde anter kültürü ile haploid embriyo uyartımında embriyo kalitesinin artırılmasına yönelik bazı uygulamalar. Ziraat Fakültesi Yüksek Lisans, Sayfa Sayısı: 79. SUPENA, E. D. J., SUHARSONO, S., JACOBSEN,E., and CUSTERS J. B. M., 2005 Successful development of a shed-microspore culture protocol for doubled haploid production in Indonesian hot pepper (Capsicum annuum L.) Plant Cell Rep (2006) 25: 1 10 DOI /s y TERZİOĞLU, Ş., ELLİALTIOĞLU, Ş., ve ABAK, K., İnkübasyon koşullarının biber anter kültüründe embriyo oluşumu üzerine etkisi. III. Sebze Tarımı Sempozyumu, Isparta, TIAINEN, T., The influence of culture conditions on anther culture respons of commercial varieties of Solanum tuberosum L. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 30: YANG O., CHAUVİN, J.E., and HERVE Y., A study of factors affecting anther culture of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 28: , VAGERA, J., and HAVRANEK, P., 1985 In vitro Induction of Androgenesis in Capsicum annuum L. and Its Genetic Aspects Bıologıa Plantarum (PRAHA) 27 (1) : , 1985 ZHANG, J.P., GONG, Z.H., ZHANG X.Z., and WANG J.E., Histological and cytological study on the ontogeny of embryoid in pepper anther culture. Journal of molecular cell biology 42 (3-4):

102 ÖZGEÇMİŞ İlköğretimi Mersin ili Mut ve Silifke ilçelerinde, ortaöğrenimi Çumra Ziraat Meslek Lisesinde tamamladı yılında Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümünü kazandı. Aynı bölümden 1997 yılında mezun oldu yılında Bingöl Tarım İl Müdürlüğünde ziraat mühendisi olarak çalışmaya başladı yılında Karaman Tarım İl Müdürlüğüne tayin edildi yılında Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsüne tayin edildi. Halen aynı kurumda görev yapmaktadır. Evli ve bir çocuk babasıdır. 89