KAPİLER ELEKTROFOREZ. Uzm. Ecz. Emirhan NEMUTLU

Transkript

1 KAPİLER ELEKTROFOREZ Uzm. Ecz. Emirhan NEMUTLU

2 Elektroforez, iletken bir çözelti içindeki yüklü/yüksüz parçacıkların veya moleküllerin bir elektriksel alan varlığında göç etmesidir.

3 Kapiler Elektroforezin Avantajları Kısa analiz süresi Küçük numune hacmi (1-10 l) Az miktarda çözelti harcaması Ucuz Yüksek etkinlik ( teorik tabaka sayısı) Tekrarlanabilirlik Kullanım alanının geniş olması

4 Kapiler elektroforezde ayrımı gerçekleştirilebilen moleküller Proteinler Peptidler Amino asitler Nükleik asitler Ġnorganik iyonlar Organik bazlar Organik asitler

5 Kapiler Elektroforez Yöntemleri Kapiler zon elektoroforez (CZE) Miseller elektrokinetik kapiler kromatografi (MEKC) Kapiler jel elektroforez (CGE) Kapiler izotakoforez (CITP) Kapiler izoelektrik odaklama (CIEF)

6 Kapiler Zon Elektroforez (CZE)

7 Elektroosmotik Akış (EOF)

8

9 EOF Laminar Akış

10 EOF nin belirlenmesi Doğal işaretleyiciler (Naturel markers) Çalışan ph da iyonize olmayan Kullanılan dedektörle tanımlanabilen Saf Kapiler ile reaksiyona girmeyen Çalışma elektroliti içinde çözünen Metanol, Formaldehit, Aseton, Dimetilsülfoksit

11 Elektroosmotik hareketlilik ( EOF ) EOF = / 4 = Tampon dielektrik sabiti = Zeta potansiyeli = Tampon çözeltisinin viskozitesi

12 Zeta potansiyeli ( ) = 4 e / = Difüzyon tabakası kalınlığı e = Yüzey alana düşen yük = Tampon dielektrik sabiti

13 Elektroforetik Kuvvet Elektroforetik kuvvet : yük / çap

14 Elektroforetik hareketlilik ( EP ) EP = q / 6 d q = Ġyonize numunenin yükü d = Numune yarıçapı = Tampon çözeltisinin viskozitesi

15 CZE ayırım sırası Katyon Nötral Anyon Zaman

16 CZE ayırım sırası

17 Ayırıma Etki Eden Parametreler Tampon çözeltisi Tampon çözeltisi derişimi Tampon çözeltisi ph sı Organik faz içeriği Sıcaklık Uygulama voltaj Enjeksiyon süresi

18 Tampon çözeltisi seçimi

19 Tampon çözeltisinin derişimi

20 mau 5 0 mau 5 0 mau 5 0 mau mau mm mm mm mm mm min min min min min

21 Migration time (min) Peak area 6 5,5 5 t of MEL t of IS MEL IS ,5 4 3, Borrate concentration (mm)

22 ph etkisi 2,5 DHBA 2,6 DHBA 3,5 DHBA 3,4 DHBA

23

24 mau 5 a ph 7.5 M D mau b ph 8 M D dak mau c M D ph 8.5 dak 0 mau 6 4 d ph 9 M D dak dak

25 Migration time (min) N t of MEL t of IS Rs of MEL-IS N of MEL N of IS ,5 8,0 8,5 9,0 ph

26 Organik faz etkisi

27 mau a % 0 MeOH M D 0 mau b % 5 MeOH M D dak 0 mau 4 2 c % 10 MeOH M D dak 0 mau 4 2 d M % 15 MeOH D dak dak

28 Migration time (min) Resolution (Rs) 7 6 t of MEL t of IS Rs of MEL-IS MeOH % 7

29 Sıcaklık etkisi mau C 0 mau mau C C min min min

30 Uygulama voltajı

31 Peak height (mau) Peak width (min) Enjeksiyon süresi h of MEL h of IS w of MEL w of IS Injection time (s) 0,06 0,04 0,02 0

32 Kapiler elektroforez cihazı

33

34 Kapiler Teflon kapiler Pyreks kapiler Fused silika kapiler PVA kaplı kapiler CEP kaplı kapiler Kapiler elektrokromatografi kapileri

35

36 Kapilerin yıkanması Fused silika kapiler için 1 N NaOH 0.1 N NaOH Distile su Çalışma elektroliti Organik çözücü ve kuvvetli asit

37 Enjeksiyon yöntemleri Basınç Vakum Sifon Elektrokinetik

38 Dedektör UV/ VIS DAD Fluorescence Laser induced fluorescence Conductivity Indirect detection *

39 UV/VIS

40 Ġndirekt UV dedeksiyon

41 CE-MS

42 Vial Cam vial Renkli cam vial Mikro vial Polietilen vial

43 Dış basınç uygulanması

44 Kapiler termostat Hava Su Güç kaynağı 30 kv ile 30 kv

45 Validasyon Doğrusallık (Linearity) Tekrarlanabilirlik (Repeability) Tayin sınırı (LOQ) Gözlenebilme sınırı (LOD) Sağlamlık (Robustness) Tutarlılık (Ruggedness) Kesinlik (Precision) Doğruluk (Accuracy)

46 KESĠNLĠK DOĞRULUK SEÇĠCĠLĠK ARALIK GÖÇ ZAMANI PĠK CEVABI DOĞRUSALLIK LOD LOQ SAĞLAMLIK VE TUTARLILIK

47 Ġç Standart Seçimi Avantajı Göç zamanındaki farklılıkları Enjeksiyondan gelebilecek farklılıkları

48 Doğrusallık Pik alanı Pik yüksekliği Pik alan oranları Pik normalizasyonu (Pik alanı / Göç zamanı) Pik normalizasyon oranları

49 Pik Genişlemesi / Kuyruklanmasının Nedenleri Çalışma elektrolitinin derişimi Sıcaklık kontrolü ve Joule ısınması Enjeksiyon süresi Enjeksiyon ile numune taşınması Kapiler yüzeyine adsorpsiyon Kapiler yüzeyinin şartlandırılması Kapilerin düzgün kesilmemesi veya zamanla zarar görmesi Numune derişimi

50

51

52 Duyarlılığın artırılması Dedektör hücresi Numune yüklemesi (Sample stacking)

53

54

55 High sensitivity cell

56 Kesinlik Ġç standart kullanımı Sıcaklık kontrolü Enjeksiyon zon genişliği Kapilerin şartlandırılması Buharlaşma Çalışma elektrolitinin hazırlanması

57 Kapiler elektroforezde yöntem geliştirme Literatür tarama Çözünürlüğü pka Tanımlanabilmesi (Direkt & indirekt)

58 Çeşitli ph ph 2.5 ph 7 ph 9 Pik Var mı? Evet EOF den ayrı mı? Evet Hayır Hayır Kontrol MECK Numune derişimi yeterli mi?

59 Optimizasyon Ayırım ph Kapiler uzunluğu Enjeksiyon hacmi Voltaj Kapiler iç çapı Pik şekli Tampon derişimi Tampon içeriği Organik faz Göç zamanı ph Kapiler uzunluğu Voltaj Sıcaklık

60 Optik izomerlerin ayırımı D ve L isomerleri siklodekstran ilavesi ile ayrılabilirler.

61 Sülfat siklodekstrin

62 Hekzabarbital CZE HPLC

63 Kanda katyon tayini E. Nemutlu, N. Özaltın, Determination of magnesium, calcium, sodium and potassium in blood plasma sample by capillary zone electrophoresis Anal. Bioanal. Chem , 2005.

64 Kaynaklar: Emirhan Nemutlu, Meloksikamın Farmasötik Preparatlardan UV Spektrofotometrisi ve Kapiler Elektroforez Yöntemi ile Analizi, Bilim Uzmanlığı Tezi, ANKARA, 2002 E. Nemutlu, N. Özaltın, Determination of magnesium, calcium, sodium and potassium in blood plasma sample by capillary zone electrophoresis Anal. Bioanal. Chem , N. Özaltın, E. Nemutlu, C. Yardımcı, Ġ. Süslü, Application of micellar electrokinetic capillary chromatography for the determination of nifedipine and its degradation product in pharmaceutical preparations, Anal.Lett., 36 (2), , E. Nemutlu, N. Özaltın, S. Altınöz, Determination of rofecoxib, in the presence of its photodegradation product, in pharmaceutical preparations by micellar electrokinetic capillary chromatography, J. Anal. Bioanal. Chem., 378 (2) , E. Nemutlu, C. Yardımcı, N. Özaltın, Determination of sertaconazole in pharmaceutical preparations by capillary zone electrophoresis, Anal. Chim. Acta, , Capillary Electrophoresis, Agillent