Ahmet Alperen PALABIYIK. Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı. Tez Danışmanı Prof. Dr. Abdulkadir YILDIRIM

EXPERİMENTAL TİROİD DİSFONKSİYONLU RAT KARACİĞERİNDE TOTAL OKSİDAN VE TOTAL ANTİOKSİDAN STATUS PARAMETRELERİ ÜZERİNE EGZERSİZİN ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Ahmet Alperen PALABIYIK Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı Tez Danışmanı Prof. Dr. Abdulkadir YILDIRIM Yüksek Lisans Tezi - 2014

T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ EXPERİMENTAL TİROİD DİSFONKSİYONLU RAT KARACİĞERİNDE TOTAL OKSİDAN VE TOTAL ANTİOKSİDAN STATUS PARAMETRELERİ ÜZERİNE EGZERSİZİN ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Ahmet Alperen PALABIYIK Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi Tez Danışmanı Prof. Dr. Abdulkadir YILDIRIM ERZURUM 2014

İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR... III ÖZET... IV ABSTRACT... V SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VII TABLOLAR DİZİNİ... VIII 1. GİRİŞ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 3 2.1. Oksidatif Stres... 3 2.2. Serbest Radikaller... 3 2.2.1. Serbest Radikallerin Sınıflandırılması... 4 2.2.1.1. Süperoksit (O - 2 )... 4 2.2.1.2. Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 )... 5 2.2.1.3. Hidroksil Radikali ( OH)... 6 2.2.1.4. Singlet Oksijen ( 1 O 2 )... 7 2.2.1.5. Hipokloröz Asit... 7 2.2.1.6. Nitrik Oksit... 7 2.2.2. Serbest Radikallerin Oluşumuna Etki Eden Faktörler... 8 2.2.3. Serbest Radikallerin Egzersiz Sırasında Oluşum Mekanizmaları... 9 2.2.4. Serbest Radikallerin Doku ve Hücrelere Zararları... 11 2.2.5. Antioksidanlar... 11 2.3. Egzersiz... 13 2.3.1. Isı Dengesi... 16 2.3.2. Isı Üretimi (Termogenezis)... 16 2.3.3. Isı Kaybı (Termolizis)... 17 3. MATERYAL VE METOT... 19 3.1. Deney Hayvanları... 19 3.2. Deney Grupları... 19 3.3. Doku Örneklerinin Hazırlanması... 20 3.4. Kullanılan Alet ve Cihazlar... 20 I

3.5. Biyokimyasal Ölçüm Yöntemleri... 21 3.5.1. Total Oksidan Status (TOS) Ölçümü... 21 3.5.2. Total Antioksidan Status (TAS) Ölçümü... 22 3.6. İstatistiksel Analiz... 23 4. BULGULAR... 24 5. TARTIŞMA... 27 6. SONUÇ VE ÖNERİLER... 31 KAYNAKLAR... 32 EK-1. ÖZGEÇMİŞ... 38 EK-2. ETİK KURUL ONAY FORMU... 39 II

TEŞEKKÜR Yüksek lisans tezi olarak sunduğum bu çalışmayı, değerli bilgi ve katkıları ile yöneten, tezimin her aşamasında yardımlarını esirgemeyen hocam Sayın Prof. Dr. Abdulkadir YILDIRIM a en derin saygı ve şükranlarımı sunarım. Yüksek lisans eğitimim boyunca her zaman yakın ilgi ve bilimsel desteklerini gördüğüm Biyokimya Anabilim Dalı Başkanı Sayı Prof. Dr. Ebubekir BAKAN a, Prof. Dr. Yaşar Nuri ŞAHİN e, Prof. Dr Nuri BAKAN a, Prof. Dr. Fatih AKÇAY a, Prof. Dr. Hülya AKSOY a, Prof. Dr. Ahmet KIZILTUNÇ a, Prof. Dr. Zuhal UMUDUM a, Prof. Dr. M. Sait KELEŞ e ve Yrd. Doç. Dr. Nurinnisa ÖZTÜRK e, tez kapsamında yapılan laboratuvar analizlerinde yardımcı olan Elvin ALİYEV e ve diğer Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı asistanlarına, Anabilim Dalı sekreteri Keriman ERDEM e, bu çalışmayı 2010/114 BAP proje numarası ile destekleyen Atatürk Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğüne, yoğun eğitim dönemim boyunca sabırla beni destekleyen aileme ve nişanlıma teşekkür ederim. Ahmet Alperen PALABIYIK III

ÖZET Experimental Tiroid Disfonksiyonlu Rat Karaciğerinde Total Oksidan ve Total Antioksidan Status Parametreleri Üzerine Egzersizin Etkilerinin Araştırılması Amaç: Bu çalışmada deneysel olarak hipertiroidi oluşturulan ratların karaciğer dokusunda TOS ve TAS parametreleri üzerine düzenli yapılan dayanıklılık egzersizinin etkilerinin araştırılması amaçlandı. Materyal ve Metot: Yirmi dört erkek Sprague Dawley rat 4 gruba bölündü: Kontrol, hipertroidi, egzersiz ve hipertiroidi + egzersiz. Hipertiroidi, 250 μg/kg vücut ağırlığı dozunda subkutan L-tiroksin uygulanarak oluşturuldu. Dayanıklılık egzersizi haftada 5 gün olmak üzere 8 hafta koşu bandında 23 m/dk hızda 45 dakika koşturularak yaptırıldı. Karaciğer homojenatlarında TAS ve TOS konsantrasyonları ölçüldü. Bulgular: Hipertiroidi grubu ile karşılaştırıldığında, düzenli egzersiz yapan ratların karaciğerinde TAS konsantrasyonunun arttığı ancak bu artışın istatistiksel olarak anlamlı düzeye ulaşmadığı tespit edildi (p=0.064). Egzersiz grubu ile karşılaştırıldığında hipertiroidi + egzersiz grubunda TOS konsantrasyonunun anlamlı düzeyde arttığı görüldü (p=0.035). Sonuç: Bu çalışmanın sonuçları, hem hipertiroidizm hem de dayanıklılık egzersizinin karaciğer dokusunda total antioksidan statusu önemli oranda etkilemediğini ancak egzersizin, hipertiroidili rat karaciğerinde total oksidan statusu anlamlı düzeyde artırdığını göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Dayanıklılık egzersizi, deneysel hipertiroidi, total antioksidan status, total oksidan status IV

ABSTRACT The Investigation of Effects of Exercise on Total Oxidant and Total Antioxidant Status Parameters in the Rat Liver with Experimental Thyroid Dysfunction Aim: The aim of this study was to investigate whether any effect of a regular endurance exercise on TOS and TAS parameters in liver tissue of rats with experimentally induced hyperthyroidism. Material and Method: Twenty-four male Sprague Dawley rats were divided into four groups: control, hyperthyroidism, exercise, and hyperthyroidism + exercise. Hyperthyroidism was induced by L-thyroxine (250 g/kg/day s.c.). The rats in exercise groups were submitted to run on a treadmill at a speed of 23 m/min for 45 minutes, 5 day/week for 8 weeks. TAS and TOS levels were measured on liver homogenates. Results: When compared to hyperthyroidism group, it was found that the liver TAS concentration increased in regular exercised rats, but this elevation did not reach a statistically significant level (p=0.064). Liver TOS concentration increased significantly in hyperthyroidism + exercise group when compared to exercise group rats (p=0.035). Conclusion: The results of study indicate that both hyperthyroidism and endurance exercise does not have a significant effect on the liver total antioxidant status, but endurance exercise increases significantly total oxidant status in liver tissue of rats with hyperthyroidism. Key Words: Endurance exercise, experimental hyperthyroidism, total antioxidant status, total oxidant status V

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ CAT CP : Katalaz : Kreatin Fosfat ETZ : Elektron Transport Zinciri GPX : Glutasyon Peroksidaz GST : Glutatyon-S-transferaz H 2 O 2 : Hidrojen Peroksit HOCl : Hipokloröz Asit MDA : Malondialdehit NO : Nitrik oksit ONOOH : Peroksinitrit OH : Hidroksil Radikali 1 O 2 : Singlet Oksijen SOD RNS ROS RSS TBARS TAS TOS : Süperoksit Dismutaz : Reaktif Nitrojen Türleri : Reaktif Oksijen Türlerine : Reaktif Sülfür Türleri : Tiyobarbitürik Asit Reaktif Maddeler : Total Antioksidan Status : Total Oksidan Status VI

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil No Sayfa No Şekil 4.1. Çalışma gruplarında ölçülen TAS konsantrasyonları. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verildi... 25 Şekil 4.2. Çalışma gruplarında ölçülen TAS konsantrasyonları. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verildi... 26 VII

TABLOLAR DİZİNİ Tablo No Sayfa No Tablo 2.1. Serbest Radikaller.. 4 Tablo 2.2. ATP tüketimi bakımından aerobik ve anerobik sistemlerin karşılaştırılması.. 14 Tablo 2.3. Dayanıklılık yönünden aerobik ve anerobik sistemlerin karşılaştırılması.. 14 Tablo 3.1. Kullanılan alet ve cihazlar.. 20 Tablo 3.2. TOS için ölçüm prosedürü. 21 Tablo 3.3. TAS için ölçüm prosedürü. 22 Tablo 4.1. Deney süresince ratların kilo değişiklikleri 24 VIII

1. GİRİŞ Serbest radikaller bir veya daha fazla eşleşmemiş elektrona sahip, kararsız, yarı ömürleri kısa ancak oldukça reaktif moleküllerdir. Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller, oksijen türevi radikallerdir. Hidroksil radikali, süperoksit, nitrik oksit, lipid peroksit gibi eşleşmemiş elektron içeren moleküller serbest radikallere birer örnek olarak verilebilir. Canlı organizmalarda metabolik süreç içerisinde oluşan serbest radikallerin oluşum hızı ile bunların zararsız hale getirilme hızı oksidatif denge olarak ifade edilen bir denge içerisindedir. Biyolojik sistemlerde oksidatif denge sağlandığı sürece organizma, serbest radikal hasarından korunmaktadır. Serbest radikal oluşum hızının artması ve/veya radikallerin etkisiz hale getirilmesi hızında bir azalma bu dengenin bozulmasına neden olur. 1,2 Oksidatif stres olarak adlandırılan bu durum serbest radikal oluşumu ile antioksidan savunma mekanizmaları arasındaki dengesizliği göstermekte olup, sonuç olarak birçok biyomolekülün yapı ve fonksiyonunun bozulmasına ve hücre hasarının oluşmasına yol açar. 1,2 Tiroid hormonlarının aşırı sentezlenmesi ve bunun yol açtığı klinik durum hipertiroidizm olarak ifade edilir. Bu durumda tiroid hormonlarının artışına bağlı olarak oksijen tüketimi artmakta, enerji metabolizması ve ısı oluşumu normale göre daha çok uyarıldığından bazal metabolizma hızlanmaktadır. 3,4 Hücrelerde serbest oksijen radikallerinin üretildiği ana kaynak mitokondridir ve bundan dolayı serbest oksijen radikallerinin üretim hızı, mitokondriyal oksijen tüketim hızı ile direk olarak ilişkilidir. 5 Deneysel hayvan çalışmaları ve klinik araştırmalar, muhtemelen artan mitokondriyal oksijen tüketimine bağlı olarak hipertiroidizmin oksidatif strese yol açtığını ifade etmektedir. 6,7 1

Fiziksel egzersiz esnasında artan oksijen tüketimi ile serbest oksijen radikallerinin oluşumu arasında bir ilişkinin olduğu, yoğunluğuna ve süresine bağlı olarak egzersizin oksidatif stres oluşturabileceği değişik araştırmalarda rapor edilmiştir. 8,9,10 Bununla birlikte düzenli yapılan dayanıklılık egzersizinin serbest oksijen radikallerinin oluşumunu bir miktar artırmasına rağmen aynı zamanda vücuttaki antioksidan sistemleri de uyararak antioksidan savunmayı güçlendirdiği rapor edilmiştir. 11,12 Bu çalışmada deneysel olarak hipertiroidi oluşturulan ratların karaciğer dokusunda Total Oksidan Status (TOS) ve Total Antioksidan Status (TAS) parametreleri üzerine düzenli yapılan dayanıklılık egzersizinin etkilerinin araştırılması amaçlandı. 2

2. GENEL BİLGİLER 2.1. Oksidatif Stres Vücuttaki fizyolojik aktivitenin doğal ürünü olan serbest radikalleri, organizma doğuştan kazandığı çok hassas bir donanımla oksidan-antioksidan denge olarak tanımlanabilecek bir çizgide tutmaya çalışır. Oksidanlar ve antioksidanlar arasındaki bu dengenin özellikle oksidanlar lehine bozulması membran lipitleri, proteinler ve DNA gibi hücrenin önemli yaşamsal yapılarında bütünlügün bozulmasına ve canlıda patolojik olayların gelişmesine yol açar. Oksidan/antioksidan dengesinin oksidanlar lehinde bozulduğu durumlar: Organizmaya ani ve aşırı miktarda oksijen girişinin artması, epinefrin ve diğer katekolaminlerin artışı, laktik asit, laktat dehidrogenaz, kreatin fosfokinaz gibi glitik enzim aktivitelerinin yükselmesi, sportif yüklenmeler, gebelik ve yaşlılık gibi fizyolojik haller, çevre kirliliğinin yoğun olduğu ortamlar, uzun süre yaşam, yoğun stres, sigara ve alkol kullanımı, doymamış ve kolay peroksitlenebilen yağların diyette fazla miktarda bulunması, antioksidan savunma sistemi yetmezlikleri veya savunma duvarının aşılmasıdır. Bu olgu serbest radikallerin oluşumunun artışından ya da antioksidan aktivitesinin yetersizliğinden ileri gelebilir. 13 2.2. Serbest Radikaller Aerobik organizmalar sürekli olarak reaktif oksijen türevleri olarak adlandırılan moleküler oksijenden türetilen reaktif molekülleri üretirler. Bu serbest radikaller dış orbitalinde tek sayıda ortaklanmamış elektron taşıyan, elektrik yüklü veya yüksüz olabilen atom veya moleküllerdir. Özelliklerinden birisi kısa ömürlü olmaları, bir diğeri ise radikal olmayan maddeler ile reaksiyona girerek yeni radikaller oluşturmaları ve 3

zincir reaksiyonu başlatabilmeleridir. 14 Canlı organizmalarda çeşitli enzimatik veya kimyasal reaksiyonlar sonucu oluşan serbest radikaller ve reaktif oksijen türleri, normal metabolizma sırasında oluşabildikleri gibi organizmanın, ışık, radyasyon, hava kirliliği, sigara dumanı, enflamasyon, şiddetli egzersiz gibi etkilere maruz kalması, medikal olarak bazı ilaçların alınması ve yabancı maddelerin metabolizması sırasında oluşabilirler. 15 2.2.1. Serbest Radikallerin Sınıflandırılması Tablo 2.1. Serbest Radikaller. 16 Reaktif Oksijen Türleri (ROT) Reaktif Nitrojen Türleri (RNS) Süperoksit radikali Ozon Singlet Oksijen Hidrojen Peroksit Hidroksil Radikali Hipoklorik Asit Hipobromik Asit Alkoksil Radikali Peroksi Radikali Hidroperoksil Radikali Nitrik Oksid Azot Dioksid Peroksinitrik Nitroz asit Nitrozil katyonu Nitroksi anyonu Nitroz asit Diazot tetraoksit Peroksinitril asit Nitronyum katyonu Alkilperoksi nitrit Reaktif Sülfür Türleri (RSS) Thiyl Radikali RS - O 2 O 3 1 O 2 H 2 O 2 OH HOCI HOBr RO ROO ROOH NO NOO ONOO HNO 2 NO + NO - HNO 2 N 2 O 4 ONOOH + NO 2 ROONO 2.2.1.1. Süperoksit (O 2 - ) Serbest süperoksit radikal anyonu (O 2 - ) hemen tüm aerobik hücrelerde oksijenin bir elektron alarak indirgenmesi sonucu meydana gelir. 17 O 2 + e - O 2-4

Hem çevresel etkenler, hem de organizmalardaki enzimatik ve enzimatik olmayan tepkimelerle en çok ve en kolay oluşan oksijen radikali, süperoksit radikalidir. Esas önemi, hidrojen perokside kaynaklık etmesi ve geçiş metal iyonlarının indirgeyicisi olmasıdır. Uzun bir yarı ömre sahiptir ve lipofilik özellik gösterir. Bu özelliğinden dolayı da oluştuğu yerden uzak bölgelere difüzyonla yayılabilmektedir. Ancak doğrudan hasar yapıcı etkisi çok fazla değildir. En çok mitokondri, endoplazmik retikulum ve kloroplast gibi hücresel organellerde, elektron transport zincirinin çeşitli komponentlerinden O 2 ye elektron sızması ile olur. 18 Süperoksit aldığı elektronu metal iyonuna, sitokrom c ye veya bir radikale verirse tekrar oksijene oksitlenir. Oksijenden daha oksitleyici olan süperoksit bir elektron daha alırsa peroksi anyonuna indirgenir. Aerobik canlılarda süperoksitlerin H 2 O 2 ye çevrilmesi, katalitik aktivitesi çok yüksek bir enzim olan süperoksit dismutaz (SOD) tarafından katalizlenir ve SOD enziminin yüksek katalitik aktivitesi sebebiyle hücrelerde süperoksit birikimine izin verilmez. 19 2O 2 - + 2H + SOD 2H 2 O 2 + O 2 2.2.1.2. Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 ) Moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması veya süperoksidin bir elektron alması sonucu peroksit meydana gelir. Peroksit molekülü de iki hidrojen atomu ile birleşerek hidrojen peroksidi oluşturur. 20 SOD tarafından katalizlenen reaksiyon sonucunda ortaya çıkar ve reaksiyon sonucu radikal türler meydana geldiğinden bu reaksiyon bir dismutasyon reaksiyonu olarak bilinir. 2O 2 - + 2H + SOD 2H 2 O 2 + O 2 H 2 O 2 nin pk sı 10.6 olduğundan nötral ve asidik koşullarda net yük taşımaz, biyolojik zarlardan kolayca geçebilir. Yapısında paylaşılmamış elektron içermediğinden 5

radikal özelliği taşımaz, reaktif bir tür değildir. Hidrojen peroksidin oksitleyici bir tür olarak bilinmesinin sebebi Cu, Fe gibi metal iyonlarının varlığında hidroksil radikalinin öncüsü gibi davranmasıdır. 19 2.2.1.3. Hidroksil Radikali ( OH) Hidroksil radikali, kimyada en reaktif radikal olarak bilinir. Bu nedenle in vivo oluşan bir hidroksil radikali hemen her moleküle saldırır ve oluştuğu yerde de büyük hasara neden olur. Nonradikal biyolojik moleküllerle zincirleme reaksiyonları başlatır. 17,20-22 Biyolojik ve kimyasal sistemlerde üretilebilen hidroksil radikali canlılarda iki mekanizma ile oluşabilir. Bunlardan ilki iyonlaştırıcı radyasyonun etkisi ile sulu ortamda su moleküllerinin iyonlaşmasıdır. Oluşan hidroksil radikali canlılarda radyasyonun toksik etkisinden sorumlu başlıca türdür. İkincisi ise hidrojen peroksidin eksik indirgenmesidir ve bu vücutta en önemli hidroksil radikali kaynağıdır. Hidrojen peroksidin geçiş metalleri varlığında indirgenmesi (Fenton Reaksiyonu) ve hidrojen peroksidin süperoksit radikali ile reaksiyonu sonucu (Haber-Weiss Reaksiyonu) meydana gelen hidroksil radikali; organik ve inorganik bileşiklerde elektron transfer tepkimelerine neden olur. Ancak normalde OH radikali oluşmaz. Çünkü OH oluşumu için moleküler oksijenin üç değerlikli olarak indirgenmesi gerekir ki bu oldukça zordur. OH radikali oluşabilmesi için süperoksit ve serbest metal iyonları gereklidir. Süperoksit radikali H 2 O 2 nin de öncülü olduğu ve proteinlere bağlı metallerin indirgenip serbest kalmasına neden olabildiğinden biyolojik koşullarda süperoksit yapımının arttığı ortamda OH radikali oluşumu kaçınılmazdır. Metal iyonlarının proteinlere bağlı formda tutulmaları hidroksil radikali yapımını önlemenin en güvenli yoludur. 19,23,24 6

2.2.1.4. Singlet Oksijen ( 1 O 2 ) Oksijenin eşleşmemiş elektronlarından birinin verilen enerji sonucu bulunduğu orbitalden başka bir orbitale veya kendi spininin ters yönüne yer değiştirmesi ile oluşur. 24,25 Singlet oksijenin delta ve sigma olmak üzere iki şekli vardır. 26 Oksijenin enerjetik olarak uyarılan bu formunda spin kısıtlamasının kaldırılmış olması sebebiyle reaktivite çok yüksektir. Aldığı enerjiyi çevreye dalga enerjisi şeklinde verip oksijene geri dönebilir. Diğer moleküllerle etkileştiğinde ya içerdiği enerjiyi transfer eder ya da kovalent tepkimelere girer. Özellikle karbon-karbon çift bağları singlet oksijenin tepkimeye girdiği bağlardır. 19 Singlet oksijen in vivo ortamda sitokrom P 450, endoperoksit sentetaz ve myelo peroksidaz reaksiyonları ile oluştuğu gibi iyonize radyasyonla da oluşabilir. Serbest radikal reaksiyonları sonucu meydana geldiği gibi serbest radikal reaksiyonlarının başlamasına da sebep olur. 2.2.1.5. Hipokloröz Asit Enzimatik olarak nötrofiller tarafından üretilir, güçlü bir oksidandır. Fagositik hücrelerce bakterilerin öldürülmesinde önemli rol oynar. Aktive olan nötrofiller, makrofajlar ve eozinofiller süperoksit üretirler. Özellikle nötrofiller, içerdikleri myeloperoksidaz enzimi aracılığı ile süperoksitin dismutasyonuyla oluşan hidrojen peroksiti klorür iyonuyla birleştirerek güçlü bir antibakteriyel ajan olan hipokloröz asit (HOCl) e dönüştürür. 27 H 2 O 2 + Cl - HOCl + OH 2.2.1.6. Nitrik Oksit Nitrik oksit yüksek yapılı canlılarda amaçlı olarak ve çok önemli biyolojik fonksiyonları yerine getirmek üzere üretilen nitrojen merkezli bir radikaldir. Paylaşılmamış elektron aslında nitrojen atomuna ait ise de, bu elektronun hem nitrojen 7

hem de oksijen atomu üzerinde delokalize olması nedeni ile tam radikal özelliği taşımaz. Bunun sonucu, bilinen diğer radikallere göre reaktivitesi baskılandığında oldukça uzun ömürlüdür. 19 Bu lipofilik serbest radikal, damar endotel hücrelerinde nitrik oksit sentaz enzimi aracılığı ile L-arjininden sentezlenir. Kolayca düz kasa geçerek guanilat siklaz enziminin hem demirine bağlanır ve cgmp sentezini uyarıp damar gevşemesini uyarır. NO, aynı zamanda tiyol gruplarını S-nitrozilasyona uğratarak protein ve reseptör fonksiyonlarını da değiştirir. NO, oluşmuş olan ROT ları ile reaksiyon vererek güçlü bir oksidan olan peroksinitrit (ONOOH) oluşturmakta ve bunun da ileri dekompozisyonu ile 27, 28 OH radikali oluşumuna yol açmaktadır. NO + O 2 - ONOO - + H + ONOOH ONOO - ONOOH NO 2 + OH 2.2.2. Serbest Radikallerin Oluşumuna Etki Eden Faktörler Serbest radikaller üç yolla meydana gelir: 1) Kovalent bağın homolitik parçalanması ile oluşur. Yüksek enerjili elektromanyetik dalgalar ve yüksek sıcaklık kimyasal bağların kırılmasına neden olur. Kırılma sırasında bağ yapısındaki iki elektronun her biri ayrı ayrı atomlar üzerinde kalır ise, her iki atom üzerinde paylaşılmamış elektron kalır ve iki adet yüksek reaktiviteli serbest radikal oluşur. X - Y X + Y 2) Normal bir molekülden tek bir elektronun kaybı ya da bir molekülün heterolitik olarak bölünmesi ile oluşur. Heterolitik bölünmede kovalent bağı oluşturan her iki elektron, atomlardan birisinde kalır. Askorbik asit, GSH ve tokoferol gibi 8

hücresel antioksidanlar radikal türlere tek elektron verip radikalleri indirgerken, kendilerinin radikal formu oluşur. X - Y X - + Y + 3) Normal bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi ile oluşur. Radikal özelliği taşımayan bir moleküle tek elektron transferi ile dış orbitalinde paylaşılmamış elektron oluşuyorsa bu tür indirgenme radikal oluşumuna sebep olabilir. 26 Serbest radikaller, hücrelerde endojen ve ekzojen kaynaklara bağlı olarak oluşurlar. Ekzojen kaynaklı faktörler arasında parakuat, alloksan gibi kimyasalların etkisi altında kalma, karbon tetraklorür, parasetamol gibi ilaç toksikasyonları, iyonize ve ultraviyole radyasyon, hava kirliliği yapan fitokimyasal maddeler, sigara dumanı, solventler gibi çevresel faktörler verilebilir. 29 Endojen faktörlerin başında egzersiz gelir. Özellikle yoğun egzersizle organizmada oksijen türevi radikal oluşumu artmaktadır. Buna karşılık, düzenli yapılan egzersizle bir adaptasyonun oluştuğu, antioksidan enzim aktivitelerinin arttığı, inflamasyon eğiliminin ve serbest demir düzeylerinin azaldığı, DNA tamir mekanizmalarının indüklediği ve LDL'nin oksidasyona duyarlılığının azaldığı bulunmuştur. Diğer endojen faktörler, stres, yaşlanma, doku hasarı ve kronik hastalıklar sayılabilir. Endojen kaynaklardan başka, radyasyon, hava kirliliği, çeşitli kimyasal maddeler, oksidan ilaçlar, sigara ve hiperoksijenasyon gibi ekzojen faktörler de serbest oksijen radikali oluştururlar. 30 2.2.3. Serbest Radikallerin Egzersiz Sırasında Oluşum Mekanizmaları Enerji tüketiminin temel ilkesi de oksidasyondur. Oksidasyon sırasında oksijen ve türevlerinin oldukça aktif şekilleri, özellikle de hidrojen peroksit ve serbest radikaller üretilir. Radikallerin membrandaki çok doymamış yağ asitlerinin peroksidasyonuna neden olduğu, membran permeabilitesinin bozulduğu ve hücre hasarı olduğu 9

bilinmektedir. Özellikle akut ve ağır sportif yüklenmelerin oksidatif hasarı tetikleyerek kas yaralanmalarına sebep olduğu ve radikallerin yorgunluğa sebep olduğu şeklinde çalışmalar devam etmektedir. 31 Sportif yüklenmeyi takiben görülen kas hasarı nötrofil NADPH oksidazdan süperoksit salınımına neden olur. Bununla birlikte, sportif yüklenme esnasında ROT nin en önemli kaynağı mitokondrial süperoksit üretimi olduğu ileri sürülmektedir. Sportif yüklenme sırasında metabolizmaya alınan oksijenin 15 kat arttırılması ve aktif kas hücrelerine kanın yönlendirilmesiyle oksijen kullanımının bu aktif bölgelerde 10 kat ve üzerine çıkmasıyla beraber mitakondrial reaktif oksijen miktarının artması beklenen bir durumdur. Artan metabolik aktivite ile mitokondrial transfer sisteminde elektron sızıntısının artmasıyla, oksidatif streste, lipid peroksidasyonunda ve süperoksit, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali gibi serbest radikallerin üretiminde artış olur. Fakat bununla beraber sportif yüklenmede serbest radikal üretimini arttıran alternatif bir mekanizma vardır ki, o da; iskemi reperfüzyondur. 32 Sportif yüklenmeler esnasında diğer bir serbest radikal üretim mekanizması da hemoglobin ve miyoglobinden kaynaklanır. Hemoglobin ve miyoglobinin otooksidasyonu sırasında serbest radikaller ortaya çıkar. Mitokondrial durumun aksine, hemoglobinlerden ROT üretimi, sportif yüklenmelere bağlı kapiller ve venöz kanda po2 nın azalmasıyla artabilir. Bazı çalışmalar ROT üretiminde artısın; kaslardaki zirve acı azalmaya başladığında ve kas fonksiyonları bastaki değerlerine döndüğü zaman ortaya çıktığını belirterek, ROT üretimin kas hasarını başlatmaktan sorumlu olmadığını fakat toparlanmada aracı rol oynayabileceğini, ROT nin dinlenim esnasında birçok fizyolojik işlemde önemli rol oynadığını bildirmişlerdir. 33 10

2.2.4. Serbest Radikallerin Doku ve Hücrelere Zararları DNA hasarı, nükleotid yapılı enzimlerin yıkımı, protein ve lipidlerle kovalan bağlanma, enzim inaktivasyonu, proteinlerin oksidatif hasara uğraması, lipid peroksidasyonu, zar yapılarının ve fonksiyonlarının etkilenmesi, kollajen ve elastin gibi uzun ömürlü yapılardaki oksidasyon ve redüksiyon olaylarının bozularak kapillerde aterofibrotik değişikliklerin oluşumu, zar proteinlerinin hasarı ve transport sistemlerinin bozulmasıdır. 34 Plazma membranı birçok nedenle serbest radikal reaksiyonları için kritik bir organeldir. Ekstrasellüler olarak üretilen serbest radikaller diğer hücresel bileşenlerle etkileşmeden plazma zarından geçmelidir. Membranlarda bulunan doymamış yağlar ve okside olabilen aminoasit bulunduran transmembran proteinleri serbest radikal hasarına duyarlıdır. Lipid peroksidasyonu veya yapısal olarak önemli proteinlerin oksidasyonu membran geçirgenliği, transmembran iyon gradientinin bozulması, sekretuar fonksiyonların kaybı ve entegre hücresel metabolik olayların inhibisyonu ile sonuçlanır. 34 Lipid peroksidasyonu biyolojik membranlarda akıcılığın kaybına, membran potansiyelinde azalmaya, hidrojen ve diğer iyonlara karşı geçirgenliğin artışına ve sonuçta hücre içeriğinin dışarı boşalmasına neden olur. 35 2.2.5. Antioksidanlar Antioksidan; oksidatif stresin şiddetini daha az aktif radikal oluşturarak veya serbest radikal zincir reaksiyonunun proteinler, lipidler, karbonhidratlar ve DNA üzerine hasarını azaltmak suretiyle bastırmaya yardımcı olan maddedir. 36 Bir antioksidanın faydalı olma potansiyeli değerlendirilirken şu özellikleri göz önüne alınır: 11

1. Emilimi ve vücut tarafından kullanılabilirliği, 2. Etkin dozu, güvenliği ve toksisitesi, 3. Hücrelere, dokulara ve ekstraselüler sıvılara dağılımı, 4. Serbest radikalleri kovabilme yeteneği, 5. Metal bağlama aktivitesi, 6. Gen ekspresyonuna etkisi, 7. Hücresel antioksidanlarla ve antioksidan enzimlerle olan ilişkisi, 8. Kanserojen metabolitleri detoksifiye etme yeteneği. 37 Hücreler, metabolik süreçlerin sonucunda devamlı olarak serbest radikal ve ROS üretirler. 38 Serbest radikallerin hücre içerisinde üretimi o kadar fazladır ki, ani yıkımlardan ve ölümden kaçınmak için hücrede bir koruma sisteminin varlığı gereklidir. Çok sayıda koruma/savunma basamağı tanımlanmıştır: Birinci basamak endojen serbest radikal üretiminin azaltılmasıdır; mitokondriden serbest radikal sızıntısının azaltılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci basamak metabolik hızın azaltılmasıdır. Üçüncü basamak oksidatif stres hasarında anahtar hedeflerin dirençlerinin artırılmasıdır. Dördüncü basamak antioksidanlar tarafından temizlenmek suretiyle serbest radikallere karşı korumanın artırılmasıdır. Beşinci basamak tamir, geri dönüşüm ve yeniden şekillendirme sürecidir. Altıncı basamak ise hücrenin nükleik asit, protein ve lipid unsurları için tamir sürecidir. 39 Fizyolojik koşullarda, hücreler oluşan serbest radikal ürünleri ve peroksitler gibi moleküllerin neden olabileceği oksidatif hasara karşı antioksidan savunma sistemleri tarafından korunur. Bu sistemler şu şekilde sınıflandırılabilir: A. Enzimatik Antioksidanlar: Süperoksit Dismutaz (SOD), katalaz (CAT), selenyum bağımlı glutatyon peroksidaz (GPX), glutatyon-s-transferaz (GST), glutatyon redüktaz (GR). 12

B. Enzimatik Olmayan Antioksidanlar: C vitamini, E vitamini, A vitamini, flavonoidler, melatonin, ürik asit, albümin, haptoglobulin, sistein, seruloplazmin, transferin, laktoferrin, ferritin, oksipurinol, ubikinon (koenzim Q10), bilirubin, mannitol, lipoik asit ve hemopeksin. 40 Genel olarak enzimatik antioksidanlar hücre içinde, enzimatik olmayan antioksidanlar ise hücre dışında daha fazla etkilidir. 2.3. Egzersiz Fiziksel egzersizin, sağlık üzerine birçok yararlı etkisi olduğu kabul edilmektedir, 41 buna karşın egzersiz sırasında serbest radikal üretimin arttığını ve kas, karaciğer, kan ve belki de diğer dokularda oksidatif hasarın meydana geldiğini gösteren kanıtlar vardır. 41-43 Egzersiz sırasında meydana gelen en belirgin biyolojik değişim, oksijen tüketim oranının artmasıdır. 44 Sportif açıdan vücudun fiziksel iş yapabilme yeteneği, enerjiyi mekanik kullanıma çevirebilmesi ile ilgilidir. Bu enerji, hareketin ortaya konulmasında görevli birimler olan kas hücrelerinde depolamış durumda bulunan ATP moleküllerinin parçalanması ile açığa çıkmaktadır. Anaerobik enerji yolu, çalışma için gereken enerjinin tamamını oksijenin olmadığı bir ortamda sağlanmasını temin eden yoldur. 45 Anaerobik enerji yolu kendi içinde iki bölümü ayrılır: Laktik Olmayan Anaerobik Enerji Yolu: Her çeşit hücre aktivitesi gibi kas aktivitesi de enerjiye ihtiyaç duyar. Kas kimyasal enerjiyi mekanik enerjiye çeviren bir yapıdır. 46 Karbonhidrat ve lipit metabolizması yolu ile enerji meydana getirirken organik fosfat bileşikleri, örneğin ATP bütün hücrelerde bulunan bir kimyasal bileşiktir. Her bir fosfat kökünün ayrılması ile 7,3 kkal enerji açığa çıkar. ATP den bir fosfat kökünün ayrılması ile bileşik adenozin difosfat a (ADP) çevrilir, ikinci fosfat kökünün ayrılması ile de adenozin monofosfat a (AMP) dönüşür. 45 Kaslarda ATP ye bağlı 13

maksimum kas gücü ancak 5-6 saniye sürdürülebilecek düzeyde bir depo sağlamaktadır. 45,47 Kasta ATP den başka yüksek enerjili bir fosfat bileşiği daha vardır ki, bu da Kreatin Fosfat tır (CP). Enerji kaynağı olarak kas tarafından doğrudan doğruya ATP gibi kullanılamaz, fakat CP, fosfatını kolayca ADP ye aktarabilir ve kısa yoldan ATP yapımını sağlar. Laktik Anaerobik Enerji Yolu: Anaerobik glikolizde, glukoz veya glikojen oksijene ihtiyaç göstermeden laktik asite kadar parçalanır ve meydana gelen enerji ile 4 molekül ATP resentezlenir. 45,47 Aerobik Enerji Yolu ise, mitokondrilerde besin maddelerinin enerji sağlamak üzere oksidasyonudur. Bir başka değişle; glukoz, yağ asitleri ve amino asitler bazı ara işlemlerden sonra oksijenle birleşerek AMP ve ADP nin ATP ye çevrilmesinde, tüketilecek büyük miktarda enerji serbestleştirirler. Güç üretiminin maksimum hızı yönünden, aerobik sistemle, laktik anaerobik ve laktik olmayan anaerobik sistemleri ATP tüketimi ve dayanıklılık yönünden değerlendirilmeleri sırası ile Tablo 2.2 ve Tablo 2.3 de verilmiştir. 45,47 Tablo 2.2. ATP tüketimi bakımından aerobik ve anerobik sistemlerin karşılaştırılması 45,47 Aerobik sistem Laktik anaerobik sistem Laktik olmayan anaerobik sistem 1 mol ATP/dk 2.5 mol ATP/dk 4 mol ATP/dk Tablo 2.3. Dayanıklılık yönünden aerobik ve anerobik sistemlerin karşılaştırılması 45,47 Laktik olmayan anaerobik sistem 10-15 saniye Laktik anaerobik sistem 30-40 saniye Aerobik sistem sınırsız (besinler bulunduğu sürece) 14

Görüldüğü gibi fosfajen sistemi (laktik olmayan anaerobik yol) kaslarda ani güç deşarjı gerektiren patlayıcılık, sürat ve büyük kuvvet gerektiren çok kısa süreli çalışmalarda dominant olurken, laktik anaerobik yol, kuvvet ve süratte dayanıklılık gerektiren dallarda dominant; aerobik yol ise 3 dk üzerindeki çalışmalarda dominanttır. 45,47 Aerobik ve anaerobik enerji yollarının bir egzersiz sırasında tam olarak birbirinden bağımsız olduğundan söz edilemez. 47 Kas aktivitesi sırasında enerji ihtiyacı dinlenme durumuna oranla 35 kat artar. Fiziksel egzersiz sırasında, aktivitenin devamını sağlayabilmek için ATP molekülünün sürekli olarak sentezlenmesi gerekir ve artan enerji ihtiyacını karşılayabilmek için kan akımı, oksijen alımı ve tüketimi özellikle aktif dokuda artmaktadır. Aerobik egzersiz sırasında tüm vücuttaki oksijen tüketiminin, dinlenim durumuna göre 10 ile 20 kat arttığı gösterilmiştir. 48 Örneğin; 70 kg lık yetişkin bir erkek dinlenme sırasında 3.5 ml/kg/dk veya 352.8 L/gün veya 14.7 mol/gün O 2 kullanır. Kullanılan oksijenin %1 inin O - 2 e dönüştüğü varsayıldığında, yaklaşık olarak 0.147 mol/gün veya 53.66 mol/yıl veya 1.7 kg/yıl lık süperoksit oluşumu söz konusu olacaktır. 49 Reaktif oksijen türlerin üretimindeki artış, metabolik sızıntı veya kaçak olarak da tanımlanır, mitokondride süperoksit ve hidrojen peroksit üretimindeki artışı da beraberinde getirir. 48 Oluşan kaçak ROT üretimi normalde toplam oksijen tüketiminin %2-5 oranında gerçekleşir. 50 Bu oran bazı kaynaklarda %2-3 olarak verilmektedir. 51 Aerobik egzersiz sırasında enerji metabolizmasının hızlanması, hücre içinde reaktif oksijen radikallerin konsantrasyonunu artırır. ROT üretimindeki artış, lipit peroksidasyon hızını artırır ve kasta hasara neden olur. 52 İskelet kasında egzersiz sonrası dönemde lipit peroksidasyonunun artığını gösteren çalışmalar vardır. 53 Reaktif oksijen türlerin üretimi, moleküler oksijen kullanan tüm yaşayan organizmalarda görülen bir olaydır. 54 Fiziksel egzersiz (aktivite), genelde reaktif oksijen 15

türlerine dönüşen metabolik ihtiyaçların artmasına neden olmaktadır. Fiziksel egzersiz sırasında, reaktif oksijen türlerin temel kaynağının aktif kas mitokondrilerinin olduğu düşünülmektedir. 52 Egzersiz sırasında reaktif oksijen türlerin (ROS) aşırı üretimi ciddi bir şekilde antioksidan savunmayı engelleyebilir ve hücresel hemeostasın değişmesine neden olabilir. 55-57 Böylece lipitleri, proteinleri ve nükleik asitleri etkileyen ve farklı hücresel hasarlara neden olan oksidatif stresi başlatabilir. 52 Defalarca tekrarlanan uyarıdan dolayı çok iyi kontrol edilen aerobik antrenman, genleri aşırı uyarabilir ve böylece farklı antioksidan enzimlerin aktivitesini 57,58 ve glutatyon durumunu 58 arttırabilir. Bu artan aktivite, sonuç olarak egzersizin neden olduğu stresin büyüklüğünü azaltır ve egzersiz sırasında meydana gelen hücresel hasarı azaltabilir. 59 Yüksek miktarda oksijen kullanan dokularda antioksidan enzimlerinin miktarının da fazla olduğu bulunmuştur. En fazla antioksidan enzim seviyesinin karaciğerde olduğunu, bunu da dalak ve beyin izlerken, iskelet kası ve kalpte bu seviyenin diğerlerinin ancak yarısı kadar olduğunu, eritrositte ise bunlardan daha az olduğu gösterilmiştir. 54 2.3.1. Isı Dengesi Vücuttaki ısı dengesi ısı oluşumu ve ısı kaybı arasındaki denge ile oluşur. Vücut iç ısısı yükseldiği zaman ısı kaybı mekanizmaları devreye girer ve vücut termolizis ile ısı kaybeder. Vücut iç ısısı düştüğü zaman ise termogenezis mekanizmaları devreye girer ve vücut iç ısısı artırılmaya çalışılır. Kısaca organizmada ısı dengesi şu şekilde ifade edilebilir. 60 Isı dengesi = Isı oluşumu (IO) Isı kaybı (IK) 16

2.3.2. Isı Üretimi (Termogenezis) Vücut normal metabolik süreçlere bağlı olarak içsel ısıyı üretir. Dinlenik durumda veya uykuda, metabolik ısı üretimi düşüktür. Buna karşın şiddetli egzersiz süresince ısı üretimi büyüktür. Egzersiz süresince harcanan enerjinin %75-80 i ısı olarak görünmektedir. Ağır egzersizler süresince bu durum yüksek ısı yükselmesiyle sonuçlanabilir. Gerçekten, sıcak ve nemli ortamda çalışmak vücudun ısı kaybetme yeteneğini ciddi olarak test etme fırsatı verir. 61 Organizmada ısı üretimi besinlerin metabolizmada kullanımı ile oluşmaktadır. Glukozdan enerji üretilirken %44 ü ATP yapımı için kullanırken %56 sı ısıya dönüşür. 62 Isı üretimine istirahat düzeyinde iç organların hemen hemen yarısı (%50), kasların 1/5 i ve deri katılır. Egzersizde ısı üretimi artarken, oluşan ısının %90 ını kaslar oluşturur. Egzersizde kas kasılmalarını sonucu üretilen ısı vücutta birikerek rektal sıcaklığı 40 o C ye kadar çıkarabilir. 62 2.3.3. Isı Kaybı (Termolizis) Vücut iç ısısı yükseldiği zaman vücut ısısını sabit tutmak için, bir takım mekanizmalar devreye girer. 63,64 Isı kaybı yolları şu şekildedir; radyasyon, konveksiyon, kondüksiyon, evaporasyon, solunum, idrar ve dışkı. 65 Isı kaybını oluşturan bu yolları kısaca açıklayalım: Radyasyon (Yayılma): Bir yüzeyden diğerine herhangi bir fiziksel kontak olmaksızın kızılötesi ışınlarla ısı transferidir. 62 transferidir. 66 Kondüksiyon (İletim): İki nesne arasında temas sonucu gerçekleşen ısı Konveksiyon (Dönüşüm): Yüzeye iletilen ısının uzaklaştırılmasıdır. 64 Evaporasyon (Buharlaşma): Vücut ısısının ortama su ile iletimidir (terleme). Suyun sıvı durumdan gaz durumuna geçişidir. 62 17

Solunum: Solunum yolundan suyun buharlaşması ile ısı kaybıdır. Egzersiz sırasında bu yolla ısı kaybının, total kaybedilen ısının %5 kadar olduğu söylenmektedir. kaybeder. 55 İdrar ve Dışkı: Çok azda olsa organizma idrar ve dışkı ile bir miktar ısı Bunlardan radyasyon, konveksiyon ve kondüksiyon çift taraflı işleyen mekanizmalar oldukları için sıcak havalarda vücudun ısı kazanmasına da neden olabilirler. En fazla ısı kaybı evaporasyonla olmaktadır. 67 18

3. MATERYAL VE METOT 3.1. Deney Hayvanları Bu çalışmada, Atatürk Üniversitesi Tıbbi Deneysel Araştırma ve Uygulama Merkezinden temin edilen ve ağırlıkları 200 220 gram arasında değişen toplam 24 adet Sprague-Dawley cinsi erkek rat kullanıldı. Ratlar deney süresince ortalama 22 0 C sıcaklık ve %50-60 nemli ortamda 12 saat gece 12 saat gündüz olacak şekilde tel kafeslerde barındırıldı ve beslendi. Bu çalışma Atatürk Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından onaylandı ve tüm deneysel aşamalar etik kurallar çerçevesinde yürütüldü. 3.2. Deney Grupları Deney hayvanları takip eden şekilde rastgele dört gruba bölündü: Kontrol (n=6), hipertiroidi (n=6), egzersiz (n=6) ve hipertiroidi + egzersiz (n=6). Kontrol grubu ratlara her gün 0.5 ml subkutan izotonik NaCl çözeltisi uygulandı ve hayvanlar haftada 5 gün olmak üzere 8 hafta boyunca koşu bandında 2 m/dk hızda 5 dakika koşturuldu. Hipertiroidi grubundaki ratlara deney süresince her gün 250 g/kg dozunda subkutan L-tiroksin enjeksiyonu yapıldı. 68 Egzersiz grubundaki ratlara her gün 0.5 ml subkutan izotonik NaCl çözeltisi uygulandı ve hayvanlar haftada 5 gün olmak üzere 8 hafta koşu bandında 23 m/dk hızda 45 dakika koşturuldu. Hipertiroidi+egzersiz grubundaki ratlarda, ikinci gruptaki gibi L-tiroksin enjeksiyonu ile hipertiroidi oluşturuldu ve ratlar haftada 5 gün 8 hafta boyunca koşu bandında 23 m/dk hızla 45 dakika koşturuldu. 19

3.3. Doku Örneklerinin Hazırlanması Deney prosedürleri sonunda herbir rat intrakardiyak kan örnekleri alınarak öldürüldü ve hemen ardından çıkartılan karaciğer dokuları buz soğukluğunda serum fizyolojikle iyice yıkanarak kanlı kısımları temizlendi ve kurutma kâğıdı ile ıslaklığı giderildi. TAS ve TOS ölçümleri için alınan karaciğer dokuları PBS çözeltisi içerisinde mekanik homojenizatör aracılığı ile homojenize edildi. Doku homojenatları 4 C de 7800 x g de 15 dakika santrifüj edildi ve supernatantları alınarak -80 C de çalışma anına kadar saklandı. 3.4. Kullanılan Alet ve Cihazlar verilmiştir. Çalışma sırasında kullanılan alet ve cihazlara ait bilgiler Tablo 3.1 de Tablo 3.1. Kullanılan alet ve cihazlar Cihazlar Üretici Firma Santrifüj SIGMA Laborzentrifugen 2-16 PK, Germany Mikrosantrifüj Thermo Fisher Scientific, Germany Hassas terazi Denver Instrument, Germany Homojenizatör OMNI International, USA Distile su cihazı MesMP Minipure Su Arıtma Sistemleri, Türkiye Derin dondurucular Sanyo Ultra Low Temperature Freezer MDF-U281, Japan Magnetik karıştırıcı Fisher, USA; Yellowline MSH basic, Germany Karıştırıcı Heidolph Reax Top, Germany ph Metre InoLab ph 720, Germany Mikroplate çalkalayıcısı Heidolph Titramax 100, Germany Mikroplate yıkayıcısı Bio-Tek EL X50, USA ELISA mikroplate okuyucu Bio-Tek PowerWave XS, USA 20

3.5. Biyokimyasal Ölçüm Yöntemleri 3.5.1. Total Oksidan Status (TOS) Ölçümü TOS ölçümü, ticari olarak üretilmiş ölçüm kiti kullanılarak gerçekleştirildi (Total Oxidant Status Assay Kit, Ürün Kodu: RL0024, Rel Assay Diagnostics Mega Tıp Ltd., Gaziantep, Türkiye). Ölçüm işlemleri üretici firmanın önerileri doğrultusunda gerçekleştirildi (Tablo 3.2). Tablo 3.2. TOS için ölçüm prosedürü Numune Standart Kör Ölçüm tamponu 250 µl 250 µl 250 µl Numune (Doku supernatantı) 37.5 µl - - Standart 1 (deiyonize H 2 O) - - 37.5 µl Dilüe standart 2 (20 µm H 2 O 2 ) 37.5 µl - İlk absorbans için 530 nm de başlangıç absorbanslar okundu ve değerler kaydedildi. Aşağıdaki işlemlere devam edildi. Prokromojen çözelti 12.5 µl 12.5 µl 12.5 µl Karıştırıldı, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi. İkinci absorbanslar için 530 nm de okuma yapıldı. TOS Sonuçlarının Hesaplanması: Yukardaki tabloda belirtilen işlemler yapıldıktan sonra aşağıdaki formül kullanılarak TOS için sonuçlar hesaplandı. Sonuçlar µmol H 2 O 2 Eq/L olarak ifade edildi. A N Sonuç (µmol H 2 O 2 Eq/L) = X C S2 A S2 A N = Numunenin ikinci absorbansı Numunenin ilk absorbansı A S2 = Standart 2 nin ikinci absorbansı Standart 2 nin ilk absorbansı C S2 = Standart 2 nin konsantrasyonu (20 µmol H 2 O 2 Eq/L) 21

3.5.2. Total Antioksidan Status (TAS) Ölçümü TAS ölçümü, ticari olarak üretilmiş ölçüm kiti kullanılarak gerçekleştirildi (Total Antioxidant Status Assay Kit, Ürün Kodu: RL0017, Rel Assay Diagnostics Mega Tıp Ltd., Gaziantep, Türkiye). Ölçüm işlemleri üretici firmanın önerileri doğrultusunda gerçekleştirildi (Tablo 3.3). Tablo 3.3. TAS için ölçüm prosedürü Numune Standart Kör Ölçüm tamponu 200 µl 200 µl 200 µl Numune (Doku supernatantı) 12 µl - - Standart 1 (1 mmol trolox eq/l) 12 µl - Standart 2 (Deiyonize H 2 O) - - 12 µl İlk absorbans için 660 nm de başlangıç absorbanslar okundu ve değerler kaydedildi. Aşağıdaki işlemlere devam edildi. Renkli ABTS radikal çözeltisi 30 µl 30 µl 30 µl Karıştırıldı, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi. İkinci absorbanslar için 660 nm de okuma yapıldı. TAS Sonuçlarının Hesaplanması: Yukardaki tabloda belirtilen işlemler yapıldıktan sonra aşağıdaki formül kullanılarak TAS için sonuçlar hesaplandı. Sonuçlar mmol Trolox Eq/L olarak ifade edildi. Sonuç (mmol Trolox Eq/L) = A S1 - A N A S1 - A S2 A S1 = Standart 1 in ikinci absorbansı Standart 1 in ilk absorbansı A S2 = Standart 2 nin ikinci absorbansı Standart 2 nin ilk absorbansı A N = Numunenin ikinci absorbansı - Numunenin ilk absorbansı 22

3.6. İstatistiksel Analiz İstatistiksel analizler SPSS 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) programı ile yapıldı. Verilerin normal dağılımı Kolmogorov-Smirnov testi ile analiz edildi. Normal dağılıma uyan verilerin gruplar arası karşılaştırmaları için One-Way ANOVA LSD Post Hoc testi kullanıldı. P<0.05 olan farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. 23

4. BULGULAR Deney süresince ratlarda gözlenen kilo değişiklikleri Tablo 4.1 de verilmiştir. Kontrol grubu ve egzersiz grubundaki ratlar, deney süresince sırasıyla ortalama 49 gr (%19) ve 30 gr (%12.9) kilo artışı gösterirken sadece hipertiroidi oluşturulan gruptaki ratlarda bu süre zarfında ortalama 24 gr lık (% 8.6) bir kilo kaybı gözlendi. Buna karşılık hipertiroidi+egzersiz grubundaki ratlarda 8. haftanın sonunda ortalama 21 gr lık (%8.6) bir kilo artışının olması dikkat çekiciydi. Tablo 4.1. Deney süresince ratların kilo değişiklikleri. Gruplar Rat Vücut Ağırlıkları (gr) İlk Tartım (1.Gün) Son Tartım (8. Hafta) Fark (%) Kontrol (n=6 ) 257 306 + 49 Hipertiroidi (n=6) 278 254-24 Egzersiz (n=6 ) 231 261 + 30 Hipertiroidi + Egzersiz (n=6) 244 265 + 21 Karaciğer dokusu supernatantlarında ölçülen TAS ve TOS parametreleri çift çalışıldı ve aritmetik ortalama değerleri kullanılarak istatistiksel analiz yapıldı. Verilerin normal dağılım analizi Kolmogorov-Smirnov testi ile yapıldı. Normal dağılım gösteren verilerin gruplar arası karşılaştırmaları One-Way ANOVA ile analiz edildi. Buna göre karaciğer TAS konsantrasyonları çalışma grupları arasında karşılaştırıldığında, en yüksek TAS değeri egzersiz grubunda gözlendi. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında egzersiz grubunda artış, hipertiroidi+egzersiz gruplarının TAS konsantrasyonlarında ise bir azalış olduğu görüldü. Bununla birlikte gruplar arası 24

TAS (Mikromol H 2 O 2 Eq/L) farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildi. Hipertiroidi grubu ile karşılaştırıldığında, düzenli egzersiz yapan ratların karaciğerinde TAS konsantrasyonunun arttığı ancak bu artışın istatistiksel olarak anlamlı düzeye ulaşmadığı görüldü (p=0.064) (Şekil 4.1). 300 Total Antioksidan Status 250 16.9 21.5 21.3 25.2 200 150 100 219.0 209.0 232.6 215.3 50 0 Kontrol Hipertiroidi Egzersiz Hipertiroidi+Egzersiz Gruplar Şekil 4.1. Çalışma gruplarında ölçülen TAS konsantrasyonları. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verildi. Karaciğer TOS konsantrasyonları çalışma grupları arasında karşılaştırıldığında, en yüksek TOS değeri hipertiroidi+egzersiz grubunda gözlendi. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında egzersiz grubunda azalış, hipertiroidi+egzersiz gruplarında ise ölçülen TOS konsantrasyonlarında istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir artış olduğu görüldü. Bununla birlikte egzersiz grubu ile karşılaştırıldığında hipertiroidi+egzersiz grubunda TOS konsantrasyonunun anlamlı düzeyde arttığı görüldü (p=0.035) (Şekil 4.2). 25

TOS (Mikromol H 2 O 2 Eq/L) Total Oksisan Status 50 45 13.3 * 40 35 10.7 11.2 30 25 4.8 20 15 10 25.8 23.1 19.0 32.3 5 0 Kontrol Hipertiroidi Egzersiz Hipertiroidi+Egzersiz Gruplar *p: 0.035 egzersiz grubu ile karşılaştırıldığında Şekil 4.2. Çalışma gruplarında ölçülen TAS konsantrasyonları. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verildi. 26

5. TARTIŞMA Bu tez çalışmasında deneysel olarak hipertiroidi oluşturulan ratlarda, karaciğer dokusu supernatant örneklerinde ölçülen TAS ve TOS parametreleri üzerine dayanıklılık egzersizinin etkilerinin araştırılması amaçlandı. Tiroid hormonlarının metabolik etkileri değişik metabolik yollarda ROT oluşumunda artış ve oksidatif stres ile direk olarak ilişkili olduğu bilinmektedir. Tiroid hormonlarının genel metabolik etkilerinden biri, hem katabolik hem de anabolik reaksiyonları uyararak bazal metabolik hızı artırmaktır. 3,4 Bu enerji harcanmasına, enerji sağlayan moleküllerin mobilizasyonuna, enerji elde etmek için moleküllerin oksidasyonuna, oksijen tüketiminin artışına, elektron transport zinciri (ETZ) reaksiyonlarında artışa, ısı enerjisi oluşumu ve salınımında artışa yol açar. ETZ reaksiyonlarındaki artış, mitokondriyal kaynaklı ROT üretiminde artışa neden olmaktadır. 5-7 Tiroid hormonları aynı zamanda ROT oluşumu ve etkisiz hale getirilmesi ile ilgili enzimleri kodlayan genlerin ekspresyonunu değiştirerek ekstramitokondriyal ROT üretimine de neden olmaktadır. 69 Deneysel hipertiroidi modelinde rat karaciğer dokusu TAS ve TOS parametreleri üzerine dayanıklılık eğersizinin etkisini araştıran bir araştırmaya literatürde rastlayamadığımız için bizim çalışma sonuçlarımızı birebir karşılaştırma imkânı olmamıştır. Bu yüzden TAS yerine SOD, GPX, CAT, GSH gibi antioksidan molekülleri; TOS yerine MDA gibi oksidatif stres parametresini analiz eden hipertiroidi-egzersiz çalışmaları üzerinden konuyu değerlendirmenin uygun olacağı düşünüldü. Djordjevic ve ark. 70 atlet ve atlet olmayan insanlarda akut egzersiz öncesi ve sonrası kan pro/antioksidan seviyelerini karşılaştırmışlardır. İstirahatte, atletler ile atlet 27

olmayanlar karşılaştırıldığında; atletlerin NO ve indirgenmiş GSH düzeylerini ve SOD ve CAT aktivitelerini daha yüksek, lipid peroksidasyon ürünü tiyobarbitürik asit reaktif maddeler (TBARS) düzeylerini ise daha düşük olduğunu rapor etmişlerdir. Atlet.- olmayan insanlarda ise akut egzersiz sonrası NO, O 2 ve H 2 O 2 düzeylerinde bir artış olduğunu gözlemlemişlerdir. Buna karşılık, antrenmanlı atletlerde akut egzersiz sonrası reaktif oksijen türlerinin azaldığını ve düzenli fiziksel egzersizin redoks homeostazisini dengelediğini ifade etmişlerdir. 70 Chang ve ark. 71 obez rat karaciğer dokusunda orta derecede düzenli yapılan dayanıklılık egzersizinin bazı antioksidan moleküller üzerine olan etkilerini incelemiştir. Bu çalışmada egzersiz yapmayan grupta karaciğer dokusunda Mn-SOD ve GPX antioksidan enzimlerine ait mrna ve protein ekspresyonlarının anlamlı şekilde azaldığı ancak düzenli dayanıklılık egzersizi yaptırılan obez ratlarda bu parametrelerin mrna ve protein ekspresyonlarının belirgin şekilde arttığı ifade edilmiştir. Bununla birlikte yine aynı çalışmada dayanıklılık egzersizinin hepatik Cu/Zn-SOD aktivitesini ve mrna ekspresyonunu değiştirmediğini ancak orta derecede düzenli yapılan dayanıklılık egzersizinin oksidatif strese karşı koruyucu bir etkiye sahip olduğunu belirtmişlerdir. 71 Messarah ve ark. 72 deneysel olarak hipo ve hipertiroidizm oluşturulan ratlarda karaciğer dokusu ve serum örneklerinde lipid peroksidasyonu ve antioksidan parametreler üzerine tiroid bezi fonksiyon bozukluğunun etkilerini araştırmışlar ve bu amaçla GPX, SOD ve CAT aktivitelerini, GSH, TAS ve lipidperoksidasyon ürünü TBARS düzeylerini ölçmüşlerdir. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında hipertiroidili ratlarda hem TBARS düzeyleri hem de antioksidan enzim aktivitelerinin istatistiksel olarak anlamlı düzeyde arttığını, bununla birlikte serum TAS düzeylerinin düştüğünü ve 28

sonuç olarak da hipertiroidizmin ratlarda oksidatif stres oluşturduğunu rapor etmişlerdir. 72 Tong ve ark. 73 adelosan (yaş aralığı 13.9-17.3 yıl) maraton koşucularda profesyonelce yapılan yoğun dayanıklılık egzersizinin serum redoks dengesi (oksidan antioksidan status) üzerine olan uzun süreli (1 yıllık) etkilerini araştırmışlardır. Koşu öncesi ve sonrası (4 saat sonra) alınan venöz kan örneklerinde TBARS, ksantin oksidaz (XO), CAT, redükte GSH, SOD, total antioksidan kapasite (T-AOC) parametrelerini analiz etmişlerdir. Ön değerlendirme ölçümlerinde; koşu öncesi değerleri ile karşılaştırıldığında 21 km koşu sonrası XO, GSH, CAT ve T-AOC değerlerinin değişmediği; profosyonel eğitim süreci tamamlandıktan sonrası yapılan değerlendirmelerde ise koşu öncesi değerlere göre 21 km koşu sonrası serum TBARS ve SOD değerleri azalırken XO ve CAT ın arttığı ifade edilmiştir. Bunlara ilave olarak bir yıl önceki değerlerle karşılaştırıldığında profesyonelce yapılan yoğun dayanıklılık egzersizi sonrası serum T-AOC, XO, CAT ve GSH nın arttığı belirtilmiş ve dayanıklılık egzersizinin yol açtığı ROT oluşumuna karşı uzun süreli profosyonel eğitimin koşucularda antioksidan kapasiteyi artırdığı rapor edilmiştir. 73 Choi ve ark. 74 Sprague-Dawley cinsi ratlarda fiziksel egzersiz ve oksidatif stresin antioksidan aktivite üzerine olan etkilerini araştırmışlardır. Bir grup rat koşu bandında 4 hafta boyunca hergün 30 dk (10 eğim, 0.5-0.8 km/h) koşturularak orta derecede fiziksel egzersize tabi tutulmuşlar. Egzersiz sonrası plazma CAT ve karaciğer SOD aktiviteleri istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artarken karaciğer GSH/GSSH oranı ve MDA düzeylerinin azaldığı ifade edilmiştir. Çalışma sonucu olarak yazarlar orta derecede yapılan fiziksel egzersizin antioksidan savunma sistemini aktive ettiğini rapor etmişlerdir. 74 29

Messarah ve ark. 75 Wistar cinsi ratlarda karaciğer ve kalp dokusu antioksidan enzim aktiviteleri ve lipid peroksidasyonu üzerine hipertiroidizmin etkilerini araştırmışlardır. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında L-tiroksin ile oluşturulan hipertiroidili rat kalp ve karaciğer dokusu homojenatlarında hem MDA düzeylerinin hem de SOD, CAT, GPX ve glutatyon redüktaz gibi antioksidan enzim aktivitelerinin anlamlı düzeyde arttığı belirtilmiştir. Yazarlar hipertiroidi durumunda lipid peroksidasyonunun arttığı ancak buna mukabil enzimatik antioksidanların da artış gösterdiğini belirtmişlerdir. 75 Bu tez çalışmasında ise karaciğer TAS konsantrasyonları çalışma grupları arasında karşılaştırıldığında, en yüksek TAS değeri egzersiz grubunda gözlendi. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında TAS konsantrasyonlarında egzersiz grubunda bir artış, hipertiroidi+egzersiz grubunda ise bir azalış olduğu görüldü. Bununla birlikte gruplar arası farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildi. Karaciğer TOS konsantrasyonları çalışma grupları arasında karşılaştırıldığında, en yüksek TOS değeri egzersiz+hipertiroidi grubunda gözlendi. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında egzersiz grubunda ölçülen TOS da istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir azalma görüldü. Bununla birlikte egzersiz grubu ile karşılaştırıldığında, TOS konsantrasyonunun hipertiroidi+egzersiz grubunda anlamlı düzeyde arttığı tespit edildi. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında hem hipertiroidi hem de egzersiz grubu TOS düzeylerinde bir azalma eğilimi olmasına rağmen hipertiroidi+egzersiz grubundaki bu artışın sinerjik bir etkiden kaynaklanmış olabileceğini düşündürmektedir. 30