MİKROBİYOLOJİ LABORATUARINDA SIK KULLANILAN BAZI BESİYERLERİNİN HAZIRLANMASI VE MUHAFAZASI Çevre Mühendisliği Laboratuarlarında yaptığımız mikrobiyolojik deneylerde en çok buyyon ve jeloz besiyerlerini kullanırız. Bu besiyerleri üretilecek mikroorganizmanın besin ihtiyacına göre, uygun maddeleri belli miktarlarda alarak hazırlanır. Daha çok piyasada ticari olarak hazırlanmış, hazır besiyerleri kullanılır. Besiyerleri yapılacak deney miktarına göre haftalık veya günlük hazırlanır ve buzdolabında saklanır. Besiyerlerini hazırladığımız cam kaplar temiz ve steril olmalıdır. ph her besiyerinin kendi özelliğine göre uygun olarak hazırlanmalıdır. Hazırlanacak Besiverleri : -Nutrient Agar -Buyyon -Laktoz Broth -Brillant Green Broth -Sabourand Dekstroz Agar Kullanılacak Malzemeler - Hazır besiyerleri - Terazi, pertri kutusu, deney tüpü, balon, mezür - Pipet v.b. - Otoklav, benmari - Bunzen beki( bek alevi) NUTRIENT AGAR (Genel Üretim Besiyeri): Ticari olarak piyasada bulunduğu gibi, bileşimindeki maddeler sağlanarak da hazırlanabilir.
Bileşimi: Lab-Lemco powder---------1 gr. Yeast Extract-------------------2 gr. Pepton---------------------------5 gr. Sodium Cloride----------------5 gr. Agar (jeloz)--------------------15 gr. --------------------1000 ml. ph---------------------------------7.4 Besiyerini hazırlarken yapılacak deney miktarı göz önünde tutulur. Besiyerinin bileşimindeki maddeler hassas bir terazide tartılır. Tartılan maddeler steril bir litrelik, bir cam balona konur. Bir miktar distile su ilave edilerek iyice karıştırılır. Daha sonra distile suyla tamamlanarak sıcak su banyosunda balon içindeki maddelerin çözülmesi sağlanır.50-60 C' ye soğuduğunda 1N NaOH ile ph 7.4 ± 0.2'ye ayarlanır. 121 C 'de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Sonra 50-60 C' ye kadar soğuduktan sonra aseptik koşullarda petri kutularına 18-20 ml olacak şekilde taksim edilir. +4 C' de saklanır. BUYYON (Sıvı Besiyeri-Broth): Pepton-------------------------10 gr. NaCI---------------------------5 gr. Beef extract (et özeti)--------5 gr. ----------------1000 ml. ph------------------------------7.2 İçeriğindeki maddeleri birer birer tartarak bir balona konur. Üzerine 1000 mi. distile su ilave ederek sıcak su banyosunda çözülmesi sağlanır. İN NaOH ile ph 7.2 ± 0.2'ye ayarlanır. Süzgeç kağıdı bulunan huni ile başka bir balona süzülür. Tüplere uygun oranlarda konarak otoklav da 121 C'de 15 dakika veya 120 C'de 20 dakika sterilize edilir.
LAKTOZ BROTH (Laktozlu Buyyon - Özel Besiyeri) Laktoz---------5 gr. Beef extract-----3 gr. Pepton-----------------5 gr. -------1000 ml. ph-----------------6,9 Besiyerinin bileşimindeki maddeler hassas terazide tartılır. Tartılan maddeler steril bir litrelik bir cam balona konur. Bir miktar distile su ilave edilerek iyice çalkalanır ve balon içindeki maddelerin çözülmesi sağlanır. Daha sonra distile suyla litreye tamamlanır. 1 N NaOH ile ph'ı 6.9+0.2 'ye ayarlanır. Tüplerin içine uygun oranlarda konarak, otoklavda sterilize edilir. BRİLLANT GREEN BROTH pepton--------------------10 gr. Laktoz-------------------10 gr. Oxgall (dehidrat)----------20 gr. Brillant Green-----------0.0133 gr. ----------------1000 ml. ph----------------------------7,1 İlk önce pepton ve laktoz bir litrelik balonda 500 ml. distile suyla çözülür. 200 ml. distile suda Oxgall çözülerek ilave edilir. Brillant green ilave edilir ve litreye tamamlanır. 1 N NaOH ile ph'ı 7.1 e ayarlanır. Tüplere konarak otoklavda sterilize edilir. SABOURAND DEKSTROZ AGAR Dekstroz------------40 gr. Pepton-----------------10 gr. Agar----------------15 gr. -------------1000 ml. ph------------------------5,6
Sabourand Dekstroz Agar hazır besiyerinden 65 gr. tartılır ve bir balona konur.üzerine 1000 mi. distile su ilave edilerek sıcak su banyosunda çözülmesi sağlanır. 1 N NaOH ile ph 5.6 ± 0.2'ye ayarlanır. Besiyeri soğumadan (50-60 C) tüplere uygun oranlarda konarak otoklavda sterilize edilir. Otoklavdan çıktıktan sonra tüpleri hafif yatık konumda tutarak soğuyup katılaşması sağlanır.
EK 2. MİKROBİYOLOJİ LABORATUARINDA SIK KULLANILAN BAZI BOYA SOLUSYONLARININ HAZIRLANMASI VE MUHAFAZASI METİLEN MAVİSİ 1 Stok Solusyon Metilen Mavisi 1,5 g. Alkol (% 95) 100 cc. Metilen mavisi bir havana konur, üzerine konan azar miktarlardaki alkolde ezilerek eritilir. Bir şişeye alınan boya solusyonu, 4 5 saat çalkalanır ve 24 saat bekletildikten sonra filtre kağıdından süzülür ve şişelerde saklanır. 2 Kullanma Solusyonu (Löffler) Metilen mavisi (stok) solusyon (% 0,01 KOH li) 30 cc. 100 cc. Önce sidtile su içine % 0,01 oranında KOH konur ve karıştırılır, sonra da 30 cc. Stok metilen mavisi solusyonu katılır ve iyice karıştırılır. Bir gün bekledikten sonra filtre kağıdından süzülerek cam kapaklı şişelerde muhafaza edilir. 1 Stok Solusyon Jansiyana moru 5 g. JANSİYANA MORU Alkol (% 95) 100 cc. Bir havana konulan jansiyana moruna azar azar alkol ilave edilerek ezilir ve erimesi sağlanır. Buradan bir şişeye konarak 4 5 saat çalkalanır ve 24 saat bekletildikten sonra filtre kağıdından süzülür ve cam kapaklı şişelerde saklanır. 2 Kullanma Solusyonu (karbollü) Jansiyana moru solusyon (stok) (% 1 lik) 10 cc. 100 cc.
Bromkrezol Moru İndikatörü Besi yerlerine indikatör olarak katılan bir eriyiktir. Ortamın ph sına göre rengi değişir. (ph 5.2 de sarı, ph 6,8 de ise mor renktedir) Bromkrezol moru 0,4 g. NaOH (N/20) 13,8 cc. 86,2 cc. Önce bromkrezol moru, NaOH ile birlikte havanda ezilerek eritilir. sonra yavaş yavaş ve karıştırarak distile su ilave edilir. bu eriyikten, 100 cc.lik besi yerlerine 0,2 0,4 cc. kadar konur. Bromtimol Mavisi İndikatörü : Bu da aynı amaçla besi yerlerine katılır. Ortamda bulunan ve fermente olabilen karbonhidratların ayrışması sonu oluşan asitler, indikatörün rengini açarlar. Besi yerinin ph sı 7,2 7,6 da ise rengi mavi, ph 6,0 ise rengi sarı olur. Bromtimol mavisi 0,4 g. NaOH (N/20) 6,4 cc. 93,6 cc. Bromtimol mavisi havana konarak NaOH ile iyice karıştırılarak eritilir. Sonra distile su katılarak iyice karıştırılır. Besi yerlerine % 0,2 0,4 oranında (yani 100 cc. Besi yerine 0,2 0,4 cc miktarında katılır). Bromtimol mavisi eriyiği alkolde de hazırlanabilir. Bromtimol mavisi 0,2 g. Alkol (% 95) Damıtık su 50 cc. 50 cc. Boya alkolde eritilir ve sonra distile su ilave edilir ve iyice karıştırılır. Besi yerlerine % 1 oranında katılır.
Fenol Kırmızısı İndikatörü : İndikatör olarak besi yerlerine katılan bir maddedir. Fenol Kırmızısı 0,4 g. NaOH (N/20) 23,5 cc. 76,5 cc. Önce fenol kırmızısı, NaOH ile birlikte havanda ezilerek ve sonra distile su katılarak iyice karıştırılır. besi yerlerine % 0,2 0,4 cc. oranında katılır. Ortamın ph sı 6,8 e inerse sarı renk, ph 8,0 civarında ise eflatun rengindedir. Fizyolojik Tuzlu Su İzotonik bir solusyon olması nedeniyle laboratuarlarda çok kullanılır. NaCl 8,75 g. 1000 cc. Tuz distilesuya karıştırlarak eritilir ve otoklavda sterilize edilir. Fizyolojik Su ( fosfat tamponlu) Bu eriyiğin ph sı genellikle 7,2 7,3 civarındadır. NaCl 8,0 g. K 2 HPO 4 1,21 g. KH 2 PO 4 0,34 g. 1000 cc. Maddeler distile su içinde sıra ile çalkalanarak eritilir. Süzgeç kağıdından süzülür ve otoklavda sterilize edilir. Kova Ayıracı Kültürlerde oluşan indolü ortaya koymada kullanılır. P dimetil amino benzaldehid 5 g. Amil alkol (veya butil alkol) HCl (konsantre) 75 cc. 25 cc.
Önce p dimetil amino benzaldehid alkolde eritilir ve sonra hidroklorik asit yavaş yavaş katılır. Ağzı kapaklı şişelerde buz dolabında muhafaza edilir. Lugol Solusyonu Gram boyama yönteminde mordan olarak kullanılır. İyot 1 g. veya İyot 5 g. KI 2 g. veya KI 10 g. 300 cc. veya 100 cc. İyot ile KI havanda iyice ezilir. Sonra distile su yavaş yavaş katılır ve iyice karıştırılır. Sonra şişeye aktarılır. Kahverengi şişelerde saklanır. Metil Kırmızısı İndikatörü Besi yerlerinin ph sını ölçmede işe yarayan bir indikatördür. Ortamın ph sı 4,4 e inince, bu indikatör kırmızı renkte ve ph 6 da ise sarıdır. Metil kırmızısı 0,2 g. Alkol (% 95) 50 cc. 50 cc.