GA/J ÜNİVERSİTESİ DIŞIIEKIMLIGI FAKÜLTESİ DERGİSİ

ISSN : 1300-3100 GA/J ÜNİVERSİTESİ DIŞIIEKIMLIGI FAKÜLTESİ DERGİSİ THE JOURNAL OF THE DENTAL FACULTY OF GAZİ UNIVERSITY CİLT : 12 OCAK-1995 SAYI : 1

ISSN : 1300-3100 GAZI ÜNİVERSİTESİ DİŞHEKIMLIGI FAKÜLTESİ DER İSİ. GİSİ THE JOURNAL OF THE DENTAL FACULTY OF GAZİ UNIVERSITY CİLT : 12 OCAK - 1995 SAYI : 1

T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ DİŞHEKİMLİĞİ FAKÜLTESİ YAYIN KOMİSYONU BAŞKAN Prof. Dr. Mustafa TÜRKER ÜYE Prof. Dr. Oktay ÜNER ÜYE Prof. Dr. Şule YÜCETAŞ ÜYE Prof. Dr. Erol DEMİREL ÜYE Prof. Dr. Tayfun ALAÇAM DERGİ YAZIŞMA ADRESİ : Emek Mah. 82. Sokak No.: 4 Tel : 212 62 20 06510 ANKARA/TÜRKİYE GAZİ ÜNİVERSİTESİ İLETİŞİM FAKÜLTESİ BASIMEVİ

İ Ç İ N D E K İ L E R C O N T E N T E S ARAŞTIRMALAR RESEARCH 1 Rekombinant insan Kemik Morfogenetik Proteini-2'nin İnvivo Etkinliğinin Araştırılması. In vivo efficeacy of recombinant human bone morphogenetic protein-2. Cansu ALPASLAN 7 Rekombinant İnsan Kemik Morfogenetik Proteini-2 Tarafından İndüklenen Kemik Oluşumuna Hücresel Cevabın İncelenmesi. Cellular response in recombinant human morphogenetic protein-2 induced bone formation. Cansu ALPASLAN 13 Süt Dişi Kanal Dolgu Maddelerinin Toksisite Potensiyellerinin İnvitro Değerlendirilmesi. In vitro evaluation of cytotoxic effects of primary teeth root canal filling materials. Alev ALAÇAM, Özlem TOLUNOĞLU, Taner KARAOĞLU, İbrahim BURGU 19 İmmünosüpresyonun Tam Kalınlık Deri Allogreftlerinin Rejeksiyonu Üzerine Etkisi. (Histopatolojik Çalışma). The effect of immunosupression on the rejection of full-thickness skin allografts. İhsan Levent ARAL 27 interkuspal Pozisyonda Deneysel Engelleyici Okluzal Temasın Anteriortemporal ve Masseter Kasların Maksimum Diş Sıkma Sırasındaki Aktivitelerine Etkisi. The influence on experimental interfering occlusal contact on the activity of anterior temporal and masseter muscles during maximal clenching in the intercuspal position. Caner YILMAZ, Suat YALUĞ, Engin KOCABALKAN, Arife DOĞAN 33 Alt Tam Protez İçine Yerleştirilen Yumuşak Astar Maddelerinde Elastiklik Modülünün ve Kalınlığın Kuvvet Dağılımına Etkisi. Effect of young's modules and thickness of soft lining materials in a lower complete denture base on stress distrubition. Sevda SUCA, Erman TEKKAYA Ill

41 Periodontal Hastalığın Tedavisinde Metroni dazol'ün Etkisi. The effect of metronidazole in the treatm ent of peri-odontal disease. Atilla ÖZDEMİR, Ahmet C. BAŞUSTAOĞLÜ 47 hpidermal Büyüme Faktörünün (EGF) Deri Allogreftieri Üzerine Olan Etkilerinin Histopatolojik Olarak Araştırılması. Effects of epidermal growth factor (EGF) on the skin allogrofts. İhsan Levent ARAL, Nadir GÜNGÖR, Tülin OYGÜR, Leyla CİNEL 55 İki Daimi Yumuşak Astar Maddesinin Çekme Gerilimi, Uzama Miktarı, Elastiklik Modülü, Sertliği ve Polimetilmetakrilat Kaide Maddesine Bağlanabiiirliklerinin Karşılaştırılması. Comparison of tensile strenth elastic modules elongation and bond strengh of two permanent soft denture lining matirals to denture hasa resin. Sevda SUCA 63 Oral Kanser Riski ile Çeşitli Gıdalar Araş ındaki İlişki. 1988-1994 Yılları Arasında Yapılan Epidemiyoiojik Çalışmaların İncelenmesi. Diet and the risk of oral cancer : Evalu stion of the epidemiologic studies between 1988-1994. Cansu ALPASLAN 69 Polietilen ve Karbon Fiber ile Desteklenm iş Akrilik Resinlerin Kırılmaya Karşı Dirençleri. The fracture resistance of polymethyl - metachylate reinforced with polyethylene and carbon fibers. Özgül KARACAER, Arife DOĞAN, Rıza GÜRBÜZ VAKA BİLDİRİMİ CASE REPORT 75 Gingival Fibromatozis (Olgu Bildirimi). Gingival Fibromatosis (A Case Report). Nadir GÜNGÖR, Derviş YILMAZ, Dilek UĞAR 79 Ön Bölgede Tek Diş Eksikliğinde implant Uygulamaları. Implant application in single anterior tooth replacement. Osman GÜMRÜ, Çetin KASABOĞLU, Murat AYDIN IV

83 Dehidrate İnsan Kemik Grefti ile Desteklenen Sinüs Lift Operasyonu. Sinus lift procedure using dehyrated human bone graft. Osman GÜMRÜ 87 İskeletsel 2. Sınıf ve High Angle Olgulara Jasper Jumper Apareyi Uygulaması. (2 Olgu Nedeniyle). Application of jasper jumper appliance on skeletal class 2 with high angle cases (Case report). Oktay ÜNER, Sema YÜKSEL, Orhan MERAL V

YAYIN KURALLARI 1. 2, Gazi Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Dergisi Fakülte'nin yayın organıdır. Dişhekimliği ve Tıp Dallarında yapılan araştırmalar, vaka takdimleri ve derlemeler yayınlanır. Gazi Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Dergisi yılda 2 sayı olarak yayınlanır ve iki sayıda bir cilt tamamlanır. 3. Başka yerde yayınlanan yazılar dergiye alınmaz. Çeviriler eser sahibinin imzası, izin belgeleri ve asılları ile birlikte gönde rilmelidir. 4. Araştırmalar ve derlemeler 15, vaka takdim leri 5 daktilo sayfasını geçmemelidir. Da ha uzun yazıları yayın kurulu kısaltmakta serbesttir. Metinler daktilo ile standart daktilo kâğıdına ve sayfanın bir yüzüne iki satır aralıklı olarak yazılarak yayın kurulu na iki nüsha halinde teslim edilmelidir. Sayfanın sağ ve solunda ikişer santimetre aralık bırakılmalıdır. Pelür ya da başka tür kâğıda yazılmış nüshalar kabul edilmez. 5. Başlıklar metne uygun, kısa ve açık ifadeli olmalıdır. Yazarın veya yazarların akade mik unvanları, adları ve soyadları başlığın alt ve ortasına konmalıdır. Yazarların çalış tıkları kurumların adları, soyadlarının sonu na konulacak (*) işareti ile birinci sayfanın altında not halinde bildirilmelidir. 6. Araştırmaların yazılış düzeni şöyle olmalı dır : Özet (Türkçe), Özet (Yabancı dilde, ko nu başlığı ile birlikte), Giriş, Materyal ve Metod, Bulgular, Tartışma, Yararlanılan Kay naklar ve Yazışma Adresi. Yazışma adre sinde gereğinde bağlantı kurulacak yazarın telefon numarasıda bulunmalıdır. 7. Yazının anlamını ifade edecek nitelikte en az 5 satır Türkçe özetle birlikte, bu özetin ingilizce, Almanca veya Fransızca çevirile ri yazılmalıdır. 8. Türkçe özetin altına konuyu tanımlayabile cek en az 2 anahtar kelime ve yabancı dil- de özetin altına bunların karşılıkları yazılmalıdır. 9. Resimler net ve parlak fotoğraf kâğıdına basılmış ve resim ebatları (13x15) olmalıdır. Grafik, diyagram ve şemalar çini mürekkebi ve aydınger kâğıdına veya şablon kartonuna çizilmelidir. Bunların arkasına yazar adı, yazı başlığı, şekil numarası ve yerleri ayrı bir zart içinde yazıya eklenmelidir. Klişelerin konulacağı yerler yazı içerisinde de işaretlenmelidir. Grafik, diyagram ve şekil altı yazılar metin dışında ayrı bir daktilo kâğıdına yazılmalıdır. Tablolar bir başlık bulundurmalıdır. Fotomikrograflarda boyama yöntemi ve büyütme gösterilmelidir. Elektromikrografiarda ve scanning elektronmikrograflarda büyütme bulunmalıdır. Tablo numarası üzerinde romen rakamıyla, şekiller altta normal rakamlarla gösterilir. 10. 11. 12. Dergi basım koşulları renkli fotoğraf basımı mümkündür. yabancı dildeki uygun olduğunda, ücret karşılığında Yararlanılan kaynaklar ya metindeki geçiş sırasına göre veya yazarların soyadiarma göre alfabetik olarak düzenlenmelidir. Yararlanılan kaynakların yazılış şekli şu sıraya göre olmalıdır : a) Dergiler : Yazarın soyadı, adının ilk harf leri, yazının başlığı, derginin kısaltılmış adı, cilt numarası, sayfa numarası, yılı. Dergi isimleri «Index Medicus»da veri len listeye göre kısaltılmalıdır. b) Kitaplar : Yazarın soyadı, adının ilk harf leri, kitabın adı, baskı veya cilt numara sı, basıldığı basımevi, basıldığı şehir, yılı. Dergiye gönderilecek yazılarda imlâ ve terminoloji yönünden şu noktalara dikkat edilmesi gerekmektedir. Anatomi terimlerinin Latinceleri kullanılmalı ve bunlar tırnak içerisinde orijinal imlâsı ile yazılmalıdır. Dîş- VII

hekimliği ve Tıp diline yerleşmiş terimler söylendiği şekilde yazıldıktan sonra parantez içerisinde orijinal yazılış şekli belirtilmelidir. 13. Metin içindeki sayfa üstlerine yazmak ama cıyla, yazarlar konu başlıklarını beş kelime yi geçmeyecek şekilde kısaltarak birinci sayfanın en başına parantez içerisinde bil dirmek zorundadırlar. 14. Dergide yayınlanacak yazıların bilimsel niteliğinden yazar ya da yazarlar sorumludur. Bilimsel yayınlar ile tenkitler ve cevapları «Editöre Mektuplar» bölümünde yayınlanır. 15. Dergi ile ilgili her hususta Gazi Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Dergisi Yayın Komisyonu Başkanlığı ile bağlantı kurulur. Yayınlanması istenilen makalelerin başvu ruları bir dilekçe ile Yayın Komisyonu Baş kanlığına yapılır. 16. Yayın Kurulunun, yayın kurallarına uyma yan yazıları yayınlamamak, düzeltilmek üze re yazarına geri gönderme yetkisi vardır. Yayın komisyonuna gelen yazılar şekil yö nünden incelendikten sonra danışma kuru luna gönderilir. Danışma Kurulunun en az 15 gün içindeki incelemesi sonucunda olum lu rapor alınan makalelere yayınlanabilir raporu verilebilir. Yayınlanması kabul edi len yazılar sıraya alınır. 17. Yayınlanmak üzere gönderilen yazılar her hangi bir siyasal düşünceyi ve uygulamayı içerir, savunur ya da eleştirir mahiyette olamaz. 18. Deî-gide yayınlanan yazıların telif hakkı Ga zi Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi'ne aittir, başka yerde yayınlanamaz. Dergide yayınlanan yazılara Gazi Üniversitesi Rektörlüğü'nce belirlenecek esaslar içinde te-!if hakkı ödenir. VIII

G.Ü. Dişhek. Fak. Der. Cilt XII, Sayı 1, Sayfa 1-6, 1995 : REKOMBİNANT İNSAN KEMİK MORFOGENETİK PROTEİNİ - 2'NİN İNVİVO ETKİNLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI Cansu ALPASLAN* ÖZET. SUMMARY Rekombinant teknikle üretilen insan kemik morfogenetik proteini-2 (rhbmp-2) aktif bir kemik indükleyici molekül olmakla birlikte, klinik uygulamalarda kullanılabilmesi için uygun bir taşıyıcıyı gerektirmektedir. Bu çalışmada polilaktik asit poliglikolik asit kopolimeri ve kan pıhtısı taşıyıcı olarak kullanılarak rhbmp-2'nin invivo etkinliği immünohistokimyasal olarak araştırılmıştır. Materyalin deri aitına implantasyonunu takiben deney grubunda birinci haftada kıkırdak ve kemik formasyonu, üçüncü haftada kemik iliği formasyonu gözlenirken, kontrol grubunda altıncı haftada bile kemik veya kıkırdak formasyonu gözlenmemiştir. Polilaktik asit poliglikolik asit kopolimeri deney ve kontrol gruplarında altıncı haftada rezorbe olmuş, istenmeyen herhangi bir reaksiyona sebep olmamış, böylece rhbmp-2 için uygun bir taşıyıcı olarak kullanılabileceğini kanıtlamıştır. Anahtar Kelimeler Proteini, taşıyıcı. Kemik Morfogenetik Key Words delivery system. In Vivo Efficacy of Recombinant Human Bone Mcrphogenetic Prctein-2 Recombinant human bone morphogenetic protein-2 that is an active bone inductive molecule, requires a delivery system for clinical applications. In vivo efficacy of rhbmp-2 was studied immunohistochemicallv, using polyiactic acid Dolyglycolic acid copolymer as a delivery system. Following subcutaneous implantation, cartilage and bone formation was observed by 1 week and bone marrow by 3 weeks in the experimental group; whereas control group did not reveal such findings even at 6 weeks. Polyiactic acid polyglycolic acid copolymer resorbed by 6 weeks both in the experimental and control groups; and proved to be a suitable delivery system for rhbmp-2 without causing unfavorable reactions. Bone Morphogenetic Protein, GİRİŞ Demineralize kemik parçacıklarının ektopik bir bölgeye implante edildiğinde, embriyolojik kemik oluşumu veya kırık iyileşmesindekine benzer bir şekilde kemik oluşumunu indüklediği ilk kez Urist(1) tarafından deneysel olarak gösterilmiştir. Demineralize kemikte, kemik oluşumundan sorumlu tutulan aktif faktörün protein yapısında olduğu belirlenmiş ve kemik morfogenetik proteini (Bone Morphogenetic Protein - BMP) olarak adlandırılmıştır. Kemik tamir olayında ve hatta kemiğin normal yapısının korunmasında önemli rolleri olduğu düşünülen BMP'- lerden bugüne kadar 7 adedinin moleküler ya- pısı belirlenerek BMP-1'den BMP-7'ye kadar adlandırılmıştır (2-5). Sığır kemiğinde kemik indüksiyonundan sorumlu aktif proteinler izole edilip, aminoasit dizilimlerinden yararlanarak rncleküler yapıları belirlenmiş ve genetik mühendisliği yardımıyla saflaştırılarak üretilebilinmiştir. BMP-1 dışında diğer 6 BMP'nin aminoasit dizillimi benzer olup Transforming Büyüme Faktörü - beta (TGF - beta) grubu ile de çok yakın benzerlik göstermektedir (4, 5). G.Ü. Dişhekimliği Fakültesi, Ağız, Diş, Çene rlastalıkları ve Cerrahisi Anabilim Dalı, Öğretim Üyesi.

İnsan Kemik Morfogenetik Proteini-2'nin invivo Etkinliyi G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995 Oral ve maksillofasiyal cerrahi konseptlerini değiştirebilecek son gelişmelerden birisi BMP'lerin klinik kullanımda yer alması olmuştur (6). Ancak BMP'nin elde edilebilmesi için çek fazla miktarda kemiği gerektirmesi yaygın kullanımını olanaksız kılmaktadır (2). En yeni gelişmelerden birisi olan ve BMP'lerin rekombinant teknik yardımıyla üretilebilmesine olanak sağlayan yöntemlerin geliştirilmesi uygun kemik bulma zorunluluğunu ortadan kaldırmaktadır (7). Bu teknikle rekombinant insan BMP rnrnası bir tip insan osteosarkom hücresinden (U2OS) elde edildikten sonra DNA yapısı belirlenmekte ve insana ait bu DNA dizilimi Chinese Hamster Ovary (CHO) hücrelerine kopyalanarak üretilebilinmektedir (5). Ancak klinik vakalarda kullanımından önce rekombinant insan morfogenetik proteini-2 (recombinant human bone morphogenetic protein-2, rhbmp-2)'nin uygun bir taşıyıcı kullanılarak kemik oluşumundaki etkinliğinin hayvan çalışmaları ile gösterilmesi gereklidir. Bu çalışma polilaktik asit poliglikolik asit kopolimeri ve kan pıhtısı taşıyıcı olarak kullanıldığında rhbmp-2'nin etki mekanizmasının ve taşıyıcısının etkinliğinin in vivo ortamda immünohistokimyasa! olarak incelenmesi amacıyla yapılmıştır. MATERYAL VE METOD Bu çalışmada 32 adet 5 haftalık beyaz Long Evans ratı kullanıldı. Deney hayvanlarının göğüs bölgesine orta hattan deri insizyonu yapılarak kunt diseksiyonla alttaki kas doku ile deri arasında materyalin yerleştirilmesine uygun boşluk oluşturuldu. 20 ig rhbmp-2, 200 \x\ kan pıhtısı ve sentetik bir taşıyıcı yardımıyla göğüs bölgesinde deri altına bilateral olarak yerleştirildi. Sentetik taşıyıcı olarak 250 um çapında ve polilaktik asit - poliglikolik asit kopolimeri yapısında pöröz mikro küreler kullanıldı. Kontrol hayvanlarında ise deri altına sadece kan pıhtısı ve sentetik taşıyıcı yerleştirildi. İnsizyonlar primer olarak kapatılarak deri üzerinde implant materyalinin yerleştirildiği bölge küçük metal küpler ile işaretlendi. implant materyalinin yerleştirilmesini takiben 1, 3. 5 ve 6. haftalarda deney ve kontrol grupları için 4'er hayvan tartılarak eter ve 10 mg/100 gr ketamin ile anestezi altına alındı. Diaframa paralel olarak yapılan deri ve kas insizyonu ile intraperitonel boşluğa ulaşıldı ve buradan da göğüs kafesine girilerek kalbin sol ventrikülünden sokulan plastik bir kanül yardımıyla hayvanlara fiksatif solüsyon verildi. İmmünohistokimyasal inceleme amacıyla hayvanlar 250 cc 1/4 Karnovski solüsyonu ile fikse edildi. Fiksasyonu takiben deri diseke edilerek implante edilen materyaller alttaki kas doku ve kaburgalar ile birlikte blok olarak çıkartıldı. Postoperatif fiksasyon amacıyla elde edilen spesimenler 1 saat 1/4 Karnovski solüsyonunda bekletildi, daha sonra kakodilat bafır içeren şişelere alındı. Spesimenler % 4.13'lük etilen diamin tetra-setik asit (EDTA] da (ph 7.3) 4 C'de 10-21 gün süreyle dekalsifiye edildi. Dekalsifikasyonu takiben spesimenler küçük parçalara kesilerek değişen derecelerde etanol ile (% 70, % 80, % 90, % 95, % 100) ikişer kez 10'ar dakika süreyle dehidre edildi. Spesimenler immünohistokimyasal değerlendirme için dehidrasyonu takiben Technovit 8100 rezine (Heraeus Kulzer GmbH. Philipp-Reis-Strasse 8. D-6393 Wehrheim /TS) gömüldü. Porter-Blum MT-1 mikrotomu kullanılarak cam bıçak yardımıyla 2 jı'luk kesitler alındı. Alınan kesitler tartarik asite dirençli asit fosfataz aktivitesinin (TRAP) tayini için Azo boyası ve ardından metilen mavisi ile boyanarak ışık mikroskobunda incelendi. SONUÇLAR rhbmp-2'nin kan pıhtısı ve sentetik taşıyıcı yardımıyla deri altına implante edildiği deney grubunda birinci haftada sınırlı bir bölgede lokalize kıkırdak formasyonu ve sentetik taşıyıcının periferinde kemik formasyonu gözlendi (Resim 1, 2). Üçüncü haftada kemik formasyonunun pöröz mikro kürelerin arasındaki boşluklarda ve içlerinde de yer aldığı gözlendi (Resim 3). Yeni oluşan kemik yüzeyinde osteoblastlar ve TRAP boyası ile pozitif olarak boyanan osteoklastlar kemikte aktif bir yeniden şekillenme olduğuna işaret etmekteydi. Üçüncü haftada implantın iç kısımlarında kemik iliği formasyonu olduğu ve hematopoetik hücrelerin yer aldığı gözlendi (Resim 4). Beşinci haftada kemik ve

:.... Cilt 12, Sayı 1 ALPASLAN Resim 1. rhbmp-2'nin subkutan olarak implante edildiği deney grubunda birinci haftada sınırlı bir bölgede izlenen kıkırdak formasyonu (Azo boyası ve metilen mavi x 20). Resim 4. Deney grubunda 3. haftada kemik iliği formasyonu ve hematopoetik hücreler görülmektedir. (Azo boyası ve metilen mavi x 40). kemik iliği formasyonu aynı biçimde devam etmekte olup taşıyıcının büyük bir kısmının rezorbe olduğu dikkati çekti. Altıncı haftada ise taşıyıcının tamamen rezorbe olduğu saptandı [Resim 5). Resim 2. Deney grubunda 1. haftada taşıyıcının periferinde kemik formasyonu görülmektedir. (Azo boyssı ve metilen mavi x 20). IBIIİÎİ S : :;.., ; ; ;;;:,--<-[.... '. u s H Deney grubu ile kıyaslandığında kontrol grubunda hiç bir dönemde kemik ve kıkırdak oluşumu gözlenmedi (Resim 6). Sadece sentetik taşıyıcı ve kan pıhtısının implante edildiği kontrol grubunda iltihabi reaksiyon veya yabancı cisim reaksiyonu gözlenmedi. Taşıyıcı deney grubundaki ile benzer olarak altıncı haftada rezorbe oldu. Sil Resim 3. Deney grubunda 3. haftada pöröz mikro küreler arasında kemik formasyonu görülmektedir. (Azo boyası ve metilen mavi x 20). Resim 5. Ceney prubur.da G. haftac'j kemik ve kemik iliği formasyonunun yamssra taşıyıcının tamamsn rezorbe olduğu izlenmektedir (Azo boyası ve metilen mavi :< 10).

' insan Kemik Morfogenetik Proteini-2'nin invivo Etkinliği G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995 oluşturan sentetik bir taşıyıcının gösterilmesi gereklidir. etkinliğinin Resim 6. Kontrol grubunda 4. haftada bile kıkırdak veya kemik oluşumu gözlenmemektedir. (Azo boyası ve metilen mavi x 20). TARTIŞMA Bu çalışmada deri altına polilaktik asit poliglikolik asit kopolimeri ve kan pıhtısı ile birlikte implante edilen rhbmp-2 yedinci günde kıkırdak ve kemik oluşumunu, 21. günde de kemik iliği oluşumunu indükleyerek canlı kemik dokusu oluşumunu sağlamıştır. Diğer çalışmalarda (7) bildirilen bulguların aksine kemik oluşumu kıkırdak oluşumunu takiben oluşmamıştır. Kemik ve kıkırdak oluşumu 7. günde farklı lokalizasyonlarda gözlenmiştir. BMP'lerin klinik kullanıma girmesiyle yakın bir gelecekte otojen kemik greftlerinin kullanımı azalabilecek veya tamamen ortadan kalkabilecektir. BMP'lerin klinik kullanımda yer alabilmesine yönelik, taşıyıcı olarak kullanılabilecek biomateryal arayışı ve bu materyallerin daha çok geliştirilmesi ise çalışmaların en çok yoğunlastırıidığı alanlardan birini oluşturmaktadır. BMP'nin lokal olarak kemik oluşumunu indükleyebilmesi için bir taşıyıcı yardımıyla o bölgede immobilize edilmesi gereklidir. Bu amaçla aktif matriksten arıtılmış allojenik kemik veya otojen kemik taşıyıcı olarak kullanıldığında kemik indüksiyonu sağlanmıştır (8-10). Ancak BMP'nin insanlarda yaygın olarak kullanılabilmesi için biyolojik uyumu iyi olan, kolay elde edilebilir ve uygulanabilir olan ve aynı zamanda kemik dokunun gelişimi için uygun bir yapı BMP bir taşıyıcı olmaksızın tek başına kullanıldığında kemik indüksiyonun oluşması için çok fazla miktarda kullanılması gerekmiştir (7). Taşıyıcının fonksiyonu hücresel cevap gelişinceye kadar indüktif proteinleri o bölgede immobilize etmesi olabilir. BMP'ler için ideal taşıyıcının belirlenmesi başarılı bir osteoindüktif imp- Isntın geliştirilebilmesi açısından oldukça büyük önem taşımaktadır. İdeal olarak taşıyıcı implant sınırları içinde BMP'nin kemik oluşumunu stimüle etmesini sağlamalıdır. Aynı zamanda biyolojik uyumu iyi olmalı, vücutta yıkılarak metabolik olarak uzaklaştırılabilmeli, yeni oluşan kemikle tamamen yer değiştirmeli, BMP için inert olmalıdır (11). Bu çalışmada taşıyıcı olarak kullanılan polilaktik asit poliglikolik asit kopolimeri bu özellikleri taşıyarak ideal bir taşıyıcı olarak kullanılabileceğini düşündürmüştür. Yapılan invitro bir çalışmada hücre ataçmanının ve osteoblast gelişiminin en fazla polilaktid- glikolid yüzeylerde, en az hidroksilapatit yüzeylerde, hidroksilapatit/polilaktid- glikolid yüzeylerde ise orta derecede olduğu gösterilmiştir (12). Polilaktik asit poliglikolik asit kopolimeri biyolojik uyumu iyi olan ve biodegrade olabilen bir materyal olup, plak şekli ortognatik cerrahi sonrası osteosentez amacıyla kullanıldığında geç komplikasyonlar olmaksızın normal iyileşme sağlanmıştır (13). Bu çalışmada rhbmp-2'nin taşıyıcısı olarak kullanılan polilaktik asit poliglikolik asit kopolimeri istenmeyen bir reaksiyona sebep olmamış ve kemik indüksiyonuna izin vererek 6. ayda tamamen rezorbe olmuştur. Miyamoto ve arkadaşları (14) polilaktik asit-polietilen glikol blok kopolimerinin BMP için uygun bir taşıvıcı olduğunu ileri sürerek 3. haftada rezorbe olduğunu bildirmişlerdir. Ancak bu çalışmada kemik oluşumunun 3. haftada mikro küreler arasındaki boşluklara doğru sokularak devam ettiği ve taşıyıcının halen matriks görevini sürdürdüğü gözlenmiştir. Bunun yanısıra degrade olan polimerlerle 40 gün süresince günlük sabit dozda ilaç sahnımı sağlandığı bildirilmiştir (15). Bu nedenle rhbmp-2 taşıyıcısının 6. haftada rezorbe olması kemik oluşumunun daha uzun ındüklenmesi açısından avantaj olabilir. Kortikal kemik defektlerine implante edilen po-

Cilt 12, Sayı 1 ALPASLAN lilaktid poliglikolid kopolimerinin absorbsiyonu ile yeni kemik oluşumu arasında bir bağlantı bulunmamakla birlikte degredasyon hızlı olduğunda kemik rejene»asyonunun inhibe olduğu gözlenmiştir (16). Reddi ve arkadaşları (17, 18) demineralize kemik tozunun kemik indüksiyon kapasitesinin partikül büyüklüğüne bağlı olduğunu bildirerek 74-420 um büyüklüğündeki partiküllerin kemik oluşumunu indüklediğini ancak 44-74 [im büyüklüğündekilerin indüklemediğini bildirmişlerdir. Yine, Syftestad ve Urist(19) partikül büyüklüğü 125 um'den küçük olduğunda kemik indüksiyonunun oluşmadığını bildirmişlerdir. Bunun sebebi implantın yapısının hücreler için bir atinite oluşturması ve vaskülarizasyon için uygun bir iskeletsel yapı sağlaması olabilir. Nitekim, demineralize kemik partikülleri sıkıştırılıp kes içine imolante edildiğinde vaskülarizasyonun geciktiği ve buna bağlı olarak da rekalsifikasyon ve kemik gelişiminin geciktiği bildirilmiştir (20). Bu çalışmada da mikro kürelerin 250 fim büyüklüğünde oluşu erken kemik formasyonunda rol oynayan önemli faktörlerden biri olabilir. rh.bmp-2'nin polilaktik - poliglikolik asit kopolimeri ve kan pıhtısı ile birlikte deri altına implantasyonu ile kemik iliğini de içeren canlı kemik dokusunun indüksiyonu, klinik uygulamalarda polilaktik asit poliglikoük asit kopolimerinin rhbmp-2 için uygun bir taşıyıcı olabileceğini düşündürmektedir. KAYNAKLAR 1. Urist, M R. : Bone: Formation by Autoinduction. Science (Wash. DC), 150: 893-899, 165. 2. Wozney J.M., Rosen V., Celeste A.J., Mitsock L.M., Whitters M.J., Kriz R.W., Hewick R.M., Wang E.A. : Novel Regulators of Bone Formation : Molecular Clones and Activities. Science, 242 : 1528-1534, 1988. 3. Luyten, F.P., Cunningham, N.S., Ma, S., Muthukumaran, N., Hammonds, R.G., Nevins, W.B., wood. W.I., Reddi, A.H. : Purification and Partial Amino Acid Sequence of Osteogenin, a Protein Initiating Bone Differentiation. J. Biol. Chem., 264 : 13377-13380, 1989. 4. Celeste A.J., lannazzi J.A., Taylor R.C., Hewick R.M., Rosen V., Wang E.A., Wozney J.M. : Identification of Transforming Growth Factor (J Family Members Present in Bone-Inductive Protein Purified from Bovine Bone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 9843-9347, 1990. 5. Wozney, J.M. : Bone Morphogenetic Proteins and Their Gene Expression. In : M. Noda ed. : Cellular and Molecular Biologv of Bone. Academic Press, Inc., San Diego, pp. 131-167, 1993. 6. Stoelinga. P.J.W. : Editorial. Int. J. Oral Maxillofac Surg., 23 : 193, 1994. 7. Wany E.A., Rosen V.. D'alessandro J.S., Bauduy M., Cordes P., Harada T., Israel D.I., Hewick R.M., Kerns, K.M. LaPan, P., Luxenberg, D.P., McQuaid, D., Moutsatsos, I.K., Nove, J. Wozney, J.M.: Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein Induces Bone Formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 2220-2224, 1990. 8. Johnson, E.E., Urist, M.R., Finerman, G.A. : Repair of Segmental Defects of the Tioia With Cancellous Bone Grafts Augmented With Human Bone Morphogenetic Protein. A Preliminary Report. Clin. Orthop., 236 : 249-257. 1988. 9. Johnson, E.E., Urist, M.R., Finerman, G.A. : Bone Morphogenetic Protein Augmentation Grafting of Resistant Femoral Nonunions. Clin. Orthop., 230 : 257-265, 1988a. 10. Johnson, E.E., Urist, M.R., Finerman, G.A. : Resis tant Nonunions and Partial or Complete Segmenta! Defects of Long Bones. Treatment With Implants of a Composite of Human Bone Morphogenetic Protein (BMP) and Autolyzed, Antigen-Extracted, Allogenic (AAA) Bone. Clin. Orthop., 277 : 229-237, 1992. 11. Toriumi, D.M., East, C.A., Larrabee, W.F. : Osteoinductive Biomaterials for Medical Implantation. Journal of Long - Term Effects of Medical Implants. 1 (1) : 53-77, 1991. 12. Elgendy, H.M., Norman, M.E., Keaton, A.R., Laurencin, C.T. : Osteoblast-like Cell (MC3T3-E1) Prolife ration on Bioerodible Polymers : an Approach Towards the Development of a Bone-bioerodible Polymer Composite Material. Biomaterials, 14 (4) : 263-269, 1993. 13. Suuronen, R. Laine, P., Pohjonen, T., Lindqvist, C : Sagittal Ramus Osteotomies Fixed With Biodegra dable Screws : A Preliminary Report. J. Oral Ma xillofac. Surg., 52: 715-720, 1994. 14. Miyamoto, S., Takaoka, K., Okada, T., Toshikawa, H., Hashimoto, J., Suzuki, S., Ono, K. : Polylactic Acid- Polyethylene Glycol Block Copolymer. A New Biodegradable Synthetic Carrier for Bone Morpho genetic Protein. Clin. Orthop., 294 : 333-343, 1993.

İnsan Kemik Morfogenetik Proteini-2'nin İnvivo Etkinliği G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995 15. Refajo, M.F., Arroyo, M.H. : Sustained Delivery of Retinoic Acid from Microspheres of Biodegradable Polymer in Proliferative Vitreoretinopathy. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 34 (9): 2743-2751, 1993. 16. Winet, H., Hollinger, J.O. : Incorporation of Polylactide- Polyglycolide in a Cortical Defect: Neoosteogenesis in a Bone Chamber. J. Biomed. Mater. Res., 27 (5) : 667-676, 1993. 17. Reddi, A.H., Muggins. C.B. : Influence of Transplan ted Tooth and Bone on Transformation of Fibroblasts. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 143 : 634-637, 1973. 18. Sampath, T.K., Reddi, AH.: Importance of geometry of the Extracellular Matrix in Endochondral Bone Differentiation. J. Cell Biol., 98: 2192-2197, 1984. 19. Eyftestad, G., Urist, M.R. : Degradation of Bone Matrix Morphogenetic Activity by Pulverization. Clin. Orthop., 141 : 281-286, 1979. 20. Yamashita, K., Horisaka, Y., Okamoto, Y., Yoshimura, Y. Matsumoto, N., Kawada, J., Takagi, T.: Architec ture of Implanted Bone Matrix Gelatin Influences Heterotopic Calcification and New Bone Formation. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 197 (3): 342-347, 1991.

G.Ü. Dişhek. Fak. Der. Cilt XII. Sayı 1, Sayfa 7-11, 1995 REKOMBİNANT İNSAN KEMİK MORFOGENETİK PROTEİNİ-2 TARAFINDAN INDÜKLENEN KEMİK OLUŞUMUNDA HÜCRESEL CEVABIN İNCELENMESİ Cansu ALPASLAN' ÖZET Kemik morfogenetik proteinlerinin kemik oluşumunu indükleyici etkisi olduğu billinmekle birlikte kemik oluşumuna yol açan hücresel olaylar tam olarak bilinmemektedir. Bu çalışma rekombinant insan kemik morfogenetik proteini-2 (rhbmp-2)'nin deri altına yerleştirilmesini takiben gelişen hücresel olayların belirlenmesi amacıyla yapılmıştır. İmplantasyonu takiben üçüncü günde kemik oluşumunda önemli rolü olduğu düşünülen me7enşimal hücre proliferasyonu ve yeni damar formasyonu gözlenirken, dördüncü günde kıkırdak, beşinci günde ise kemik formasyonu izlenmiştir. rhbmp-2'nin kemik indüksiyonunu kan hücreleri, stromal hücreler ve mezenşimal hücreler arasında ilişkiyi stimüle ederek gerçekleştirdiği sonucuna varılmıştır. Anahtar Kelimeler : Kemik Morfogenetik Proteini, kemik indüksiyonu. SUMMARY Cellular Respanse In Recombinant Human Morphogenetic Protein-2 induced Bone Formation Although bone inductive property of bone morphogenetic proteins is well known, the accurate cellular mechanisms that lead to bone formation is not clear. This study was undertaken for the characterization of cellular response following subcutaneous implantation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhbmp-2). Mesenchymal cell proliferation and angiogenesis, that is thought to be of crucial importance in bone formation was observed on day 3, followed by cartilage formation on day 4 and bone formation on day 5. It was concluded that rhbmp-2 induce bone formation by stimulating cell to cell interactions between blood cells, stromal cells and mesenchymal cells. Key Words bone induction. Bone Morphogenetic Protein, GİRİŞ Kemik formasyonu pek çok hücrenin lokal ve sistemik regülatörler aracılığı ile etkileşimini içeren oldukça karmaşık bir mekanizmadır. Demineralize kemiğin iskelet dışı bir bölgede kemik oluşumunu indüklediğinin gösterilmesi (1, 2) bu aktiviteden sorumlu moleküllerin araştırılması yönünde yapılan çalışmaların başlangıcını oluşturmuştur. Kemikten farklı yapılara sahip çok sayıda büyüme faktörü izole edilerek bu aktiviteden sorumlu tutulmuştur (3-6). Son yıllarda yapılan çalışmalarla kemik oluşumundan sorumlu moleküllere bir seri Kemik Morfogenetik Proteini (Bone Morphogenetic Protein- BMP] eklenmiştir (7, 8). BMP'ler bugüne kadar izole edilebilen büyüme faktörleri arasında kıkırdak ve kemik oluşumunu stimüle eden en aktif faktörlerdir (9). Kemik oluşumunda rol oynayan hücreler arası ilişkilerin detaylı olarak anlaşılabilmesi, kemik oluşumunu stimüle eden yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi açısından büyük önem taşımaktadır. BMP'ler tarafından oluşturulan ke- G.Ü. Dişhekimliği Fakültesi Ağız, Diş, Çene Hastalıkları ve Cerrahisi Anabilim Dalı Öğretim Üyesi.

Kemik Oluşumunda Hücresel Cevabın İncelenmesi G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995 mik formasyonu, kırık iyileşmesi ve embriyolojik kemik oluşumunu taklit ettiği için kemik oluşumu ve kemik rezorbsiyonundan sorumlu hücrelerin ve hücreler arası etkileşimin incelenebilmesi için oldukça uygun bir model oluşturmaktadır (11). Kemikten elde edilen BMP'ler gibi rhbmp-2 bugüne kadar kıkırdak ve kemik oluşumunu indüklediği gösterilen tek moleküldür (11). Ancak kemik oluşumundaki etki mekanizması tam olarak anlaşılabilmiş değildir. Bu çalışma rhbmp-2'nin iskelet dışı bir bölgeye implantasyonunu takiben gelişen hücresel cevabın ve hücreler arası ilişkinin incelenerek, kemik doku oluşumundaki etki mekanizmasının belirlenebilmesi amacıyla yapılmıştır. MATERYAL VE METOD Steril petri kaplarında her hayvan için 20 [ig rhbmp-2, polilaktik asit-poliglikolik asit kopolimeri yapısında ve 250 (im çapındaki pörözmikro küreler ve diğer bir rattan temin edilen 200 -il kan ile karıştırıldı (rhbmp-2 Yamanouchi Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo tarafından sağlandı). Deney hayvanı olarak kullanılan 24 adet Long Evans ratının göğüs bölgesi traş edilerek deri insizyonu yapıldı ve elde edilen bu karışım deri altına implante edildi. İnsizyonlar primer olarak kapatıldı. İmplantların yerleştirilmesinden 1, 3, 4, 5, 6 ve 7 gün sonra hayvanlar eter ve ketamirı (10 mg/100 gr) ile anestezi altına.alındı. Kalbin sol ventrikülünden girilerek önce Ringer solüsyonu ve takiben 250 cc % 3 oranında glutaraldehit içeren 0.05 M kakodilat bafır ile fikse edildi. Deri altına yerleştirilen implantlar çevre dokular ile birlikte çıkartılarak gynı fiksatif solüsyon içinde 4 C'de 1 gece bekletildi. Spesimenler % 4.13 etilen diamin tetrasetik asit (EDTA) ile (ph 7.4) 4 C de 7 gün süreyle dekaisifiye edildi. Dekalsifikasyonu takiben spesimenler küçük parçalara bölünerek % 1'lik osmiyum tetroksit (OsCX) ile ikinci kez fikse edildi. Değişen derecelerde etanol ile (% 70, % 80, % 90, % 95, % 100) ikişer kez 10'ar dakika dehidre edildi. Propilen oksitte iki kez 10'ar dakika bekletildikten sonra Epok 812 (Öken, Tokyo, Japonya) rezine gömüldü. Işık mikroskobunda incelemek için cam bıçakla C.5 u, kesitler aılnarak toluidin mavisi ile boyandı. Elektron mikroskobunda incelemek üzere Porter-Blum MT-1 mikrotomu (Sorvall Porter Blum Ultramicrotome MT-1, Ivan Sorvall Inc., New Town, Conneticut) kullanılarak 60-90 nm kesitler alındı. Bu kesitler bakır gridler iie toplandı; tannik asit, uranil asetat ve kurşun sitrat ile boyanarak elektron mikroskobu ile incelendi. SONUÇLAR Birinci günde geçici polimorf nükleer lökosit infiltrasyonu gözlendi. Üçüncü günde yoğun mezenşimal hücre proliferasyonu, çeşitli hücrelerde mitoz ve yeni damar oluşumunda belirgin artış vardı (Resim 1). Elektron mikroskobu ile incelendiğinde şişkin endotelyal hücrelerle karakterize yeni damarların oluştuğu ve bu damarların hemen yakınında mezenşimal hücrelerle kan hücreleri arasında hücrelerarası ilişkinin olduğu gözlendi (Resim 2). Yine, elektron mikroskobu düzeyinde kemik iliği kökenli stromal hücrelerle differansiye olmamış mezenşimal hücreler arasında yakın ilişki olduğu göz- Resim 1. İmplantasyonu takiben 3. günde hücre proliferasyonu ve yeni damar oluşumunda belirgin bir artış olduğu görülmektedir. (Toluidin mavisi x 40).

Cilt 12, Sayı 1 ALPASLAN., Resim 2. Elektron mikroskobu düzeyinde yeni oluşmuş kan damarının hemen yakınında kan hücresi ile mezenşimal hücre arasındaki ilişki görülmektedir. Resim 4. İmplantasyonu takip eden 4. günde kondrosit formasyonu görülmektedir. (Toluidin mavisi x20). lendi (Resim 3). Ancak üçüncü günde kıkırdak veya kemik oluşumu gözlenmedi. Dördüncü günde mezenşimal hücre proliferasyonunun izlendiği bölgede, mezenşimal hücreler arasında kondrositlerin oluştuğu gözlendi [Resim 4). Beşinci günde ise kıkırdak formasyonu yanında kemik formasyonu da başlamıştı (Resim 5). Altıncı günde kemik oluşumunun artarak devam ettiği ve implantm iç kısımlarına doğru sokularak ilerlediği gözlendi (Resim 6). Yedinci günde ise kalsifiye kıkırdak dokusunun çok çekirdekli dev hücreler tarafından rezorbe edilerek yerini yeni oluşan kemiğe bırakmakta olduğu gözlendi. s*,- Resim 5. İmplantasyonu takip eden 5. günde kemik formasyonu görülmektedir. (Toluidin mavisi x 20). Z2 Resim 3. Elektron mikroskobu düzeyinde stromal hücre ile mezenşimal hücre arasındaki ilişki görülmektedir. Resim 6. İmplantasyon sonrası 6. günde kemik formasyonundaki artış görülmektedir. (Toluidin mavisi x 20). 9

Kemik Oluşumunda Hücresel Cevabın İncelenmesi G.Ü. Dişhek, Fak. Der., 1995 TARTIŞMA Demineralize kemiğin ektopik bir bölgeye implantasyonunu takip eden birinci günde geçici polimorf nükleer lökosit infiltrasyonu gözlenmekte, bunu üçüncü günde mezenşimal hücrelerin matrikse ataçmanı izlemektedir. Mezenşimal progenitor hücreler hızla çoğlarak 6-7. günlerde kondroblast ve kondrositlere dönüşmektedir. Vaskülarizasyon 9. günde izlenirken 10-12. günlerde kıkırdak rezorbe olarak yeni oluşan kemikle yer değiştirmektedir (1, 2). Kemikten izole edilen BMP'lerden bazılarının endokondral kemik oluşumunda izlenen bu olaylar serisini taklit ederek kemik oluşumunu indüklediği gösterilmekle birlikte, kemik oluşumunu hangi hücreleri etkileyerek gerçekleştirdiği bilinmemektedir. Bu çalışmada rhbmp-2 de bu olaylar serisini izleyerek ancak daha kısa sürede, implantasyonu takiben beşinci günde kemik oluşumunu indüklemiştir. BMP saflaştırılmamış şekliyle kullanıldığında az miktarda aktif kemik indükleyici materyal içerdiğinden ve ayrıca kemik formasyonunu inhibe edici faktörleri de içerebileceğinden saflaştırılarak üretilen rhbmp-2 daha erken ve kaliteli kemik oluşumunu indüklemektedir (7). BMP implantasyonunu takiben 3. günde mezenşimal hücrelerde belirgin bir çoğalma izlenmiştir. BMP direkt olarak hücrelerde bölünmeye sebep olarak etki edebileceği gibi çevredeki mezenşimal hücreler üzerinde kemotaksik bir etki oluşturarak da hücre artışına sebep olabilir. Yapılan invitro bir çalışmada demineralize rat kemik matriksinin kas kökenli mezenşimal hücreler üzerinde kemotaksik etkisi olduğu gösterilmiş ve bu kemotaksik sinyalin demineralize kemik matriksi içeriğindeki protein komponenti ile ilişkili olduğu öne sürülmüştür (12). Üçüncü günde mezenşimal hücre proliferasyonu yanında diğer önemli bir bulgu da yeni damar oluşumundaki artıştı. Yeni damar oluşumunun daha sonraki kemik oluşumu için büyük önem taşıdığı bildirilmiştir (13, 14). Yeni damar oluşumu öncü hücrelerin kan dolaşımıyla implantasyon bölgesine gelmesi açısından oldukça önemli olabilir. İnvitro ortamda çeşitli hücre tipleri BMP'ye karşı çoğalmalarını arttırarak veya azaltarak cevap vermektedir. Osteoblastik ve osteoprogenitör hücreler genellikle hücre proliferasyonunu arttırarak cevap vermektedirler. Aynı zamanda BMP mezenşimal hücrelerin çeşitli fenotiplere dönüşümünü sağlamaktadır. Normal şartlarda kemik hücrelerine dönüşmeyecek olan differansiye olmamış hücreler, BMP'nin stimülasyonu ile kemik hücrelerine dönüşmektedir (15). Bu çalışmada invivo olarak da benzer bulgular gözlenmiş, yeni oluşan kan damarları ve bu yolla bölgeye geldiği düşünülen kan hücreleri ile differansiye olmamış mezenşimal hücreler arasındaki ilişki elektron mikroskobu düzeyinde gösterilmiştir. Elde edilen bulgular bu hücreler arasındaki ilişkinin kemik hücrelerinin oluşumunda oldukça önemli bir basamağı oluşturduğunu düşündürmektedir. implantasyonunu takiben rhbmp-2 beşinci günde kıkırdak ve kemik oluşumunu indüklemiştir. rhbmp-2'nin periost kökenli hücreler üzerindeki etkisini araştıran invitro bir çalışmada rhbmp-2'nin kemik oluşum süresini azalttığı ve oluşan kemik miktarını arttırdığı ancak kıkırdak oluşumu üzerinde bir etkisi olmadığı gösterilmiştir. Tavuk periost hücrelerinden oluşan kültür ortamındaki hücresel ve moleküler olaylar kırık iyileşmesindeki olaylara benzediğinden, kırık iyileşmesindeki periostal kemik oluşumunda rhbmp-2'nin kıkırdak oluşumundan değil kemik oluşumundan sorumlu olduğu öne sürülmüştür (16). Benzer olarak bu çalışmada da kemik oluşumu için geçen süre kısalmıştır. rhbmp-2 invivo olarak hem kıkırdak hem kemik oluşumunu indüklemiştir. Yani, rhbmp-2 implantasyonu endokondral kemik oluşumunu sağlamıştır ancak kıkırdak oluşumu için geçen süre kısalmamıştır. Gerek kırık iyileşmesinde gerekse de embriyolojik kemik gelişimi sırasında osteoblastların mezenşimal öncü hücrelerin farklılaşması sonucu oluştuğu kabul edilmektedir. Osteoblast öncü hücrelerin orijini ise tam olarak bilinmemekle birlikte periostta ve kemik iliği stromasında bulunduğu düşünülmektedir. Kırık iyileşmesinde osteoblastların ilk olarak periost ile kemik arasında gözlenmesi osteoblast öncü hücrelerin periost kaynaklı olduğunu ve lokal olarak salınan sinyallerle osteoblastlara dönüştüğünü göstermektedir (17). Ancak bu çalışmada ektopik bir bölgede BMP tarafından kemik olu- 10

Cilt 12, Sayı 1 ALPASLAN şumunun indüklenmesi osteoblast öncü hücrelerin sadece periost kökenli olmadığını göstermektedir. İnvitro olarak kemik iliği kökenli stromal hücrelerin indükleyici bir maddenin mevcudiyetinde osteoblastlara, aynı zamanda da osteoblastik farklılaşma kapasitesine sahip differansiye olmamış hücrelere dönüştüğü gösterilmiştir (18). Bu çalışmada da kemik oluşumunda rol oynadığı düşünülen stromal hücrelerle differansiye olmamış mezenşimal hücreler arasındaki ilişki elektron mikroskobu düzeyinde gösterilmiştir. rhbmp-2 implantasyonunu takiben yeni damar oluşumu ve mezenşimal hücre proliferasyonunda belirgin bir artış oluşu BMP'nin mezenşimal hücre proliferasyonu ile yeni damar oluşumunu stimüle ettiğini ve daha sonra da kan hücreleri ve mezenşimal hücreler, ayrıca kemik iliği kökenli stromal hücreler ve differansiye olmamış mezenşimal hücreler arasında etkileşime sebep olarak kemik oluşumunu indüklediğini düşündürmektedir. KAYNAKLAR 1. Urist, M.R. : Bone : Formation by Autoinduction. Science (Wash. DC), 150: 893-899, 1965. 2. Reddi, A.H., Huggins, C. : Biochemical Sequences in the Transformation of Normal Fibroblasts in Adolescent Rats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 1601-1605, 1972. 3. Urist, M.R., DeLange, R.J., Finerman, G.A.M. : Bone Cell Differentiation and Growth Factors. Science (Wash. DC), 220 : 680-G8G, 1983. 4. Schweiberer, L., Hallfeldt, K., Mandelkow, H. : Osteoid Induction. Crthopade, 15 (1): 3-9, 1986. 5. Hauschka, P.V., Mavrakos, A.E., lafrati, M.D., Doleman, S.E., Klagsbrun, M. : J. Biol. Chem., 261 (27) : 12665-12674, 1986. 6. Tsutsumi, S.: Purification and Properties of a Growth Factor From Human Bone Matrix, Nippon Seikeigeka Gakkai Zasshi, 61 (11): 1285-1292, 1987. 7. Wozney J.M., Rosen V. Celeste A.J., Mitsock L.M., Whitters M.J., Kriz R.W., Hewick R.M., Wang E.A. : Novel Regulators of Bone Formation : Molecular Clones and Activities. Science, 242 : 1528-1534, 1988. 8. Celeste A.J., lannazzl.i A.. Tevlor R.C., Hewick R.M., Rosen V., Wang E.A., Wozney J.M. : Identification of Transforming Growth Fr.ctnr 3 Family Members Present in Bone-Inductive Protein Purified from Brovine Bone. Proc. Nail. Acad. Sci. USA. 87: 9843-9S47, 1990. 9. Wozney, J.M. : Bone Morphonenetic Proteins and Their Gene Expression. In : M. Noda ed. : Cellular and Molecular Biology of Bone. Academic Press, Inc., San Diego, pp. 131-167. 1993. 10. Rospn, V., Thies, R.S. : The Bone Morphcgenetic Proteins in Bone Formation and Repair. Trends Genet., 3 : 97-102, 1992. 11. Wang E.A., Rosen v\, D'aiess&ndro J.S., Bauduy M., Cordes P., Harada T., Israel D.I., Hewick R.M., Kerns, K.M. LaPan, P., i.uxenberg, D.P., McQuaid, D., Moutsatsos, I.K., Neve, J., Wozney, J.M.: Recombinant Human Bone Mcphogenetic Protein Induces Bone Formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 222C-2224, 1990. 12. Landesman, R.. Reddi, A.H. : Chemotaxis of Muscle- Derived Mesenchymal Cells to Bone Inductive Proteins of Rat. Calcit. Tissue Int., 39 : 259-262. 1986. 13. Foidart, J.M. Reddi, A.H. : Immunofluorescent Lscalization of Type IV Collagen and Laminin during Endochondral Bone Differentiation and Regulation by Pituitary Growth Hormone. Dev. Biol., 75 : 130-136, 1980. 14. Paralkar, V.M., Vukicevic, S., Reddi, A.H. : IGF-beta 1 Binds to Collagen IV of Basement Membrane Matrix: Implications for Development. J. Biol. Chem., 143 : 303-303, 1991. 15. Ekelund, A., Brosio, O., Nilsson, O.S : Experimental Induction of Heterotopic Bone. Clin. Orthop. Rel. Res., 263 : 102-112, 199'. 16. Iwasaki, M., Nakahara, H., Nakase, T., Kimura, T., Takaoka, K., Çaplan, A.I., Ono, K.: Bone IV.orphogenetic Protein 2 Stimulates Osteogenesis but Does Not Affect Chondrogenesis in Osteochondrogenic Differentiation of Periosteum-Derived Cells. J. Bone Miner. Res., 9: 195-1204, 1994. 17. Sandberg, M.M., Aro, H.T., Vuorio, E.I. : Gene Expression During Bone Repair. Clin. Orthop. Rel. Res., 289 : 292-312, 1903. 18. Rickard, D.J., Sullivan, T.A., Shenker, B.J., Leboy, S.P., Kazhdan, I. : Induction of Rapid Osteoblast Differentiation in Rat Bone Marrow Stromal Cell Cultures by Dexcmethasone and BMP-2. Dev. Biol.. 1G1 : 218228, 1994.

G.Ü. Dişhek. Fak. Der. Cilt XII, Sayı 1, Sayfa 13-18, 1995 SÜT DİŞİ KANAL DOLGU MADDELERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ TOKSİSİTE POTANSİYELLERİNİN İN VİTRO Alev ALAÇAM*, Özlem TULUNOĞLU**, Taner KARAOĞLLT İbrahim BURGU**** ÖZET Pedodontide, kök kanal tedavisinde kullanılan kanal dolgu maddelerinden Kalsin, Çinko-oksit öjenol (ZOE), Çinko-oksit öjenol+ glutaraldehit, (ZOE + GA) İyodoform patı (Kri I) ve Vitapex in etkileri in vitro olarak He-La hücre kültürü üzerinde araştırılarak sitotoksik etkileri karşılaştırmalı olarak değerlendirildi. İncelenen materyaller içerisinde Kalsin en az toksik bulunurken bunu Çinko-oksit öjenol, İyodoform patı, Vitapex ve Çinko-oksit öjenol + glutaraldehit izlemekteydi. Anahtar Kelimeler : Kök kanal dolgu maddeleri, Hücre kültürü, Sitotiksik etki. SUMMARY In Vitro Evaluation of Cytotoxic Effects of Primary Teeth Root Canal Filling Materials Five resorbable root canal filling materials Kalsin, Zinc-oxide eugenol, Zinc-oxide-eugenol + glutaraldehyde, lodoform paste (Kri I) and Vitapex were tested in vitro for cytotoxicity on He-La cells and evaluated comparatively. Kalsin was found to be the least toxic root canal filling material followed by Zinc-oxide eugenol, lodoform paste, Vitapex and Zinc-oxide eugenol + glutaraldehyde. Key Words : Root canal filling materials, Cell cultures, Ciytotoxic effects. GİRİŞ Kanal dolgu maddelerinin en önemli özelliklerinden biri de, maddenin insan vücudu üzerindeki biyolojik etkisidir. Dolgular periapikal dokular üzerinde şiddetliden zayıfa doğru sınıflandırılabilecek irritasyona sebep olurlar. Bu nedenle, kök kanal maddelerinin biyolojik veya farmakolojik etkileri çok dikkatli olarak değerlendirilmelidir (4, 5, 21, 24). Süt dişi kanal dolgu patları genellikle periapikal dokularla direkt temas edecek şekilde kullanıldığından seçilen materyalin dokularla biyolojik uyum içinde olması en aranılan özelliklerden biridir (4, 23). Medikal ve dental materyallerin biyolojik uyumluluğunun denenmesinde in vitro toksisite testleri ilk basamak testleridir. Bu amaçla değişik teknikler (1, 7, 21, 20, 15, 18, 16, 23) ve farklı hücre kültürleri (5, 13, 15, 23), kullanılarak çok sayıda çalışma yapılmıştır. Dental materyallerin biyolojik uygunluğunun değerlendirilmesi için önerilen standart yöntemlerle ilgili İNSİ/ADA (1) dokümanında araştırmacılara üç farklı test önerilmekte ve belirli materyaller için farklı test yöntemleri arasından seçim hakkı tanınmaktadır. Önerilen üç test yöntemi membran permiabilitesindeki değişikliklerin (Ağar overlay, Cr Release) ve metabolik değişikliklerin sitokimyasal boyanma ve mikroskobik olarak tespitine (MMipore Filter) dayanmaktadır (9, 23, 24). Spangberg (21) ise dental materyallerin değerlendirilmesinde «simulated cavity» metodundan yararlanılabileceğini bildirmektedir. G.Ü. Dişhekimliği Fak. Pedodonti A.B.D. Doç. Dr. G.Ü. Dişhekimliği Fak. Pedodonti A.B.D. Araş. Gör. A.Ü. Veteriner Fakültesi Viroloji A.B.D. Araş. Gör. A.Ü. Veteriner Fakültesi Viroloji A.B.D. Bask.. Prof. 13

Süt Dişi Kanal Dolgu Maddelerinin Toksisitesi G.Ü. Dişhek. Fak. Der., 1995 In vitro toksisite çalışmalarında hücre kültürlerinde endodontik malzemelerin ilk kullanımları Kerezstezi ve Kellner ile Rappaport ve arkadaşları (12, 19) tarafından gerçekleştirilmiştir. Son on yılda pedodontik endodontide kullanılan materyallerle ilgili sitotoksisite çalışmaları incelendiğinde Kalsim Hidroksit (Ca(OH)), Çinko Oksit Ojenol (ZOE), Kri I patı ile ilgili az sayıda çalışma olduğu gözlenmiştir (6, 14, 24, 29, 30). Bu nedenle çalışmamızda pedodontik endodontide kullanılan kök kanal patlarının sitotoksisitelerinin karşılıklı olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. MATERYAL VE METOD Çalışma Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji A.B.D. Laboratuvarlarında yapıldı. He-La (İnsan serviks karsinoma) orijinli permanent hücre kültürü kullanıldı. Hücre kültürü şişelerinde üremesini tamamlayan He-La devamlı hücre kültürü, % 0.25 Tripsin (GIBCO Paisley, Scottland, U.K.). solüsyonu ilavesinden sonra çalkalanmak suretiyle şişe yüzeyinden ayrıldı. Mevcut hücrelerin tripsin solisyonundan ayrılmaları için, karışım +4 C'de 1000 devirde 10 dakika süre ile santrifüj edildi. Santrifüj tübü tabanındaki hücre pelleti % 10 Fötal Dana Serumu (PAESEL GmbH and Co., Frankfurt, Germany) içeren EAGLE's Minimum Essential Medium (EMEM, GIBCO, Paisley Scottland, U.,K.) hücre üretme vasatında, 150.000 hücre/ml olacak şekilde sulandırıldı. Hazırlanan hücre süspansiyonu 24 gözlü makro hücre kültürü tabletlerine (COSTAR TISSUE Culture Cluster, M.A., U.S.A.) 1 ml/göz olacak şekilde ilave edildi. Tablet üzeri steril, nontoksik, şeffaf bant ile kapatıldıktan sonra, + 5 CO: içeren etüvde 37 Cîde 24 saat süre ile inkübe edildi. Araştırmada kullanılan yöntem Matsumoto ve arkadaşlarının (15) çalışmaları çerçevesinde uygulandı. In vivo olarak apikal foramen ve pe- riapikal dokular üzerinde oluşacak toksisitenin değerlendirilmesinin in vitro olarak benzer bir ortama taşımasını sağlamak amacıyla iç çapı 0.4 mm olan polietilen tüpler kullanıldı. (Tablo 1'de) içerikleri verilen beş süt dişi kanal dolgu patından Vitapeks (Neo Dental Chemical Products Co. Japan) ve İyodoform (Güler Kimya kullanıma hazır durumdaydı. Diğer patlar ise üretici önerilerine uygun olarak hazırlanır hazırlanmaz taze olarak 2 cm uzunluğundaki kateterlere dolduruldu. Her kanal dolgu patı için makro hücre kültürü tabletlerinden 4'er göz kullanıldı. İçleri patlarla doldurulan kateterler, tablet üzerindeki steril, nontoksik, şeffaf bant kullanılarak hücre üretme vasatına daldırıldı. Kanal dolgu patlarının toksisitesini kontrol gurubuyla karşılaştırmak üzere 4 adet göze boş kateter uygulanarak kateter kontrol, 4 adet göz de boş bırakılarak hücre kontrol grupları sağlandı. Tablo 1. Test materyallerinin içerikleri KALSİN! TOZ: Kalsiyum hidroksit Baryum sülfat ÇİNKO OKSİT ÖJENOL TOZ: Çinko oksit LİKİT Gliserin LİKİT: öjenoi ÇİNKO OKSİT ÖJENOL + GLUTARALDEHİT 1 TOZ: Çinko oksit İYODOFORM Toz: İyodoform VITAPEX TOZ Kalsiyum Hidroksit İyodoform LİKİT: Ojenol Giuıaralaldehit (%2 İlk) j LİKİT: Paraklorfenol Kamfır Mentol LİKİT: Silikon yağı Tabletler, % 5 CO2 ihtiva eden 37 C'lik etüvlerde inkübasyona bırakıldı. 12'şer saat aralıklar ile 96 saat kontrol altına alınan örnekler, doku kültürü mikroskobunda toksisite yönünden değerlendirildi. BULGULAR Test materyallerinin toksisite yüzdeleri Tablo II ve Tablo III*de sunulmuştur. Değerlendirme süreci sonunda Kalsin (Aktu Ticaret İzmir) en az toksisite gösteren materyal olarak saptandı. Kontrol gruplarında ve Kalsin grubunda hücre ölü- S

, ; : ; :.. :,, '.,,.: :.. ;.... ;... :. :...., :.,. Cilt 12. Sayı 1 ALAÇAM, TULUNOĞLU, KARAOĞLU, BURGU Tablo 2: Test materyallerinin zamana göre toksisiteleri Kanal Patı S/ı IAT LE R il 2 24 36 48 60 72 84 96 1 KALSİN W 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 2 ZOE 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 4/4 3 ZOE+GA 3/4 3/4 3/4 3/4 4/4 4/4 4 İYODOFORM 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 5 VITAPEX 0/4 0/4 0/4 2/4 4/4 4/4 <atater Kontrol 0/4 0/4 0/4 Hücre Kontrol 0/4 0/4 0/4 mayı 60. saatte hücrelerin tümü ile ölümü izledi (Resim 5). Sonuçlar bu konuda yapılan diğer çalışmaları destekler nitelikte bulundu (14, 21,23,29). Jill Tablo 3: Test 120 100»o 60 40 î ;: ;!; :..SİJİSCŞ İiilİi i Pil Resim 2. ZOE örneğinin 72. saatteki görünümü. Resim 3. İyodoform örneğinin 60. saatteki görünümü. TOKSİSİTE 112 Saat 24 " D 36 " 946 a 60 20 yüzdeleri 0 % materyallerinin toksisite liiiiiif^işiıiia ı 172 84-96 " ZOE+GA I0D0 ViTAPEX mü 96 saatten sonra gözlenirken (Resim 1,6,7). ZOE patında 60 saatte hücrelerde kısmen yuvarlaklaşma ve lizis başlamaktaydı (Resim 2). ZOE'lü az bir farkla lyodoform örnekleri izledi, lyodoform da 60 saatte tüm hücrelerin öldüğü gözlendi (Resim 3). Vitapex gurubunda ise 48 saatte tüm hücreler öldü (Resim 4). ZOE + GA gurubunda 12 saatte başlayan hücresel bozul- lsi İt ^^^B ği : ;!İİIİ1P