ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA ALTYAPI PROJESİ KESİN RAPORU AKCİĞER KANSERİNDE METABOLİK (CYP2E1) POLİMORFİZMİN İLAÇ REZİSTANSINDAKİ ROLÜ Proje Yürütücüsü: Prof. Dr. Mümtaz İşcan Yardımcı Araştırıcılar: Doç. Dr. Ahmet O. Ada Dr. Volkan Karacaoğlan Proje No: 10A3336002 Başlama Tarihi: 12. 02. 2010 Bitiş Tarihi: 12. 08. 2012 Rapor Tarihi: 24. 09. 2012 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara- 2012
2 I. PROJENİN TÜRKÇE VE İNGİLİZCE ADI VE ÖZETLERİ AKCİĞER KANSERİNDE METABOLİK (CYP2E1) POLİMORFİZMİN İLAÇ REZİSTANSINDAKİ ROLÜ ÖZET: Sigara dumanı gibi çevresel kimyasal maddelere maruziyet ile oluşan akciğer kanseri gibi önemli hastalıklarda kimyasal maddeleri karsinojenik metabolitlerine dönüştürerek aktifleştiren genlerdeki polimorfizmler hastalığın seyrinde ve kemoterapiye karşı verilen yanıtta belirleyici olabilmektedir. Bireylerde bu polimorfizmlerin en kısa sürede sağlıklı olarak ortaya konması yeni teknikleri kullanarak mümkün olmaktadır. Bu tekniklerin başında gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gelmektedir. Bu yöntem de klasik PCR cihazları yerine teknolojik açıdan çok daha geliştirilmiş ve oluşan ürünün gerçek zamanlı olarak izlenebildiği yüksek çıktılı real time PCR cihazları ile yapılabilmektedir. Bu cihazlar aynı zamanda mutasyonların kopya sayılarının tayinine ve mrna düzeyinde nitel olarak gen ekspresyonlarının saptanmasına yönelik tekniklerin uygulanmasına olanak vermektedir. İlaveten söz konusu cihazlar son zamanlarda oldukça önem kazanan epigenetik çalışmalara da olanak vermesi açısından son derece önemlidir. Bu çalışmamızda da özellikle nitrozamin gibi sigarada bulunan kimyasalların aktivasyonunu sağlayan CYP2E1 gen polimorfizmi ile p53 tümör baskılayıcı gen polimorfizmlerinin saptanmasına yönelik gerçek zamanlı PCR yöntemleri kurulmuş ve akciğer kanseri hastalarının kanlarından izole edilen DNA örneklerinde genotip analizleri yapılmış ve bu sonuçların doğruluğu konvansiyonel PCR/RFLP yöntemleriyle de desteklenmiştir. Sonuçta bu alt yapı projesiyle kurumumuz laboratuarına kazandırılan RT-PCR ile gen polimorfizmlerinin genotip analiz yöntemleri kurulmuş olmaktadır. Bu cihaz yukarıda söz edilen moleküler düzeydeki en son tekniklerin uygulanmasına olanak verdiğinden kurumumuz laboratuarında da bu yöndeki çalışmaların önü açılmış olmaktadır.
3 THE ROLE OF METABOLIC POLYMORPHISM (CYP2E1) IN DRUG RESISTANCE IN LUNG CANCER SUMMARY Exposure to environmental chemicals such as cigarette smoke can cause important health problems such as lung cancer. Inter-individual differences are observed among the patients in response to chemotherapy and overall survival. Recently, one of the important reasons for these inter-individual differences is reported to be due to the polymorphisms of the responsible genes which are responsible for activating environmental chemicals to their carcinogenic intermediates. The cost-effective and accurate determination of these polymorphisms has been reported to be possible with the advent of state of art technologies one of which is the real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. In this technique, the real time PCR instrument which enables the real time detection of the PCR amplicon in real time is used instead of conventional PCR. The RT-PCR instrument also enables the determination of variant copy numbers and quantitative analysis of mrna expressions. In addition, it also enables to study the epigenetics. In this study, the genotyping analysis of the CYP2E1 polymorphism, the gene which activates the chemicals such as nitrosamines in the cigarette smoke, and p53 tumor suppressor gene polymorphisms have been established. The genotype analyses have been performed in the DNA samples isolated from the blood specimens of the lung cancer patients and the results were confirmed by conventional PCR/RFLP methods. Thus, in our laboratory and faculty, for the first time the genotype analysis of these gene polymorphism by real time-pcr have been established by this project. As this equipment enables to implement the above aforementioned molecular techniques it would be possible to plan and perform such studies involving state of art technologies in our laboratory.
4 II. AMAÇ Çeşitli faktörler arasında çevresel kimyasal maddelerin de neden olduğu hastalıklarda bireylerin ilaçlara karşı verdikleri yanıtlar ile yaşam sürelerinde bireysel farklılıklar görülebilmektedir. Bu bireysel farklılığın en önemli nedenleri arasında sorumlu genlerin polimorfizmlerinin önemi son yıllarda öne çıkmaktadır. Bu polimorfizmlerin en kısa sürede sağlıklı olarak ortaya konması yeni teknikleri kullanarak mümkün olmaktadır. Bu ve mrna gen ekspresyon düzeyinin nitel olarak belirlenmesi ve gen mutasyonlarının kopya sayılarının belirlenmesi gibi moleküler biyoloji ve genetik alanındaki tekniklerin uygulanmasına olanak sağlayan araçların başında gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gelmektedir. Tek bir genin polimorfizmine yönelik genotip analizlerinde RT-PCR konvansiyonel PCR dan da aradaki çok pahalı olan kesim enzimlerinin kullanılmasını ve uzun süre beklemeyi gerektiren basamağı da ortadan kaldırdığı gibi çoklu gen polimorfizmlerinin genotiplemelerinin aynı anda analizine de olanak vermektedir. İlaveten son zamanlarda oldukça önem kazanan micro RNA ekspresyonları ve mutasyonları gibi epigenetik çalışmalara da olanak vermesi açısında son derece önemlidir. Bu çalışmamızda da özellikle nitrozamin gibi sigarada bulunan kimyasalların aktivasyonunu sağlayan CYP2E1 geni ve p53 tümör baskılıyıcı gen polimorfizmleri için Real Time-PCR yöntemleri kurularak benzeri çalışmaların önü açılmıştır. Sonuçta bu alt yapı projesiyle laboratuarımıza ve dolayısıyla Eczacılık Fakültesine kazandırılan ilk ve tek Real Time-PCR cihazı ile gen polimorfizm çalışmaları için genotipleme analizlerinin önü açılmıştır. Benzeri çalışmaları yapacak özellikle genç araştırıcıların bu konuda pratik yönden eğitilmeleri ile tez ve projelerinde bu yöndeki çalışmalarını gerçekleştirme olanağı bulabilmeleri sağlanmıştır. III. MATERYAL Qiagen marka Rotor Gene Q 5 Plex + HRM model gerçek zamanlı PCR cihazı yüksek çıktılı genotipleme (mono ve multiplex), gen ekspresyon analizleri ve epigenetik analiz tekniklerinin kullanımına olanak sağlamakladır. Bu aletle yukarıda sözü edilen moleküler biyoloji ve genetik alanında en son kullanılan analiz tekniklerinin hasta ve sağlıklı bireylerin ve ayrıca hayvanların DNA ve RNA gibi örneklerinde kullanımını mümkün kılmaktadır.
5 IV. GELECEĞE İLİŞKİN ÖNGÖRÜLEN KATKILAR Son güncel moleküler düzeydeki çalışmalarda kullanılan tekniklerin uygulanmasına olanak veren Real-Time PCR ın anabilim dalımız ve diğer anabilim dallarındaki birçok genç araştırmacı lisansüstü tezlerinde ve münferit araştırmalarında kullanım olanağı bulacağından bu altyapı bu yönde çok büyük ve önemli katkı sağlayacaktır. Şimdiden RT-PCR yöntemlerine dayalı doktora tezleri yapılmakta olup ileriye yönelik kurumlar arası projeler yürütülmeye de başlanmıştır. İleriye yönelik olarak da lisansüstü öğrencilerinin çalışmaları bu yönde planlanmaktadır. Dolayısıyla kazandırılan bu alet geleceğe yönelik gerek eğitim açısından ve gerekse yeni tekniklerin uygulama olanağını yaratması açısından özellikle genç araştırıcıların iyi donanımlı birer bilim insanı olmaları, yeni teknolojilerden haberdar olmaları, onları kullanabilmeleri, bilimsel verilerin üretim hızında gelişmiş ülkelere ayak uydurabilmeleri ve yayınlamaları yolunda son derece önemli katkılar sağlayacaktır. V. SAĞLANAN ALTYAPI OLANAKLARI İLE VARSA GERÇEKLEŞTİRİLEN PROJELER A. Projeler 1. Türk toplumunda bazı bireylerde CYP1B1 polimorfizminin incelenmesi (Proje no: 10B3336003) A.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi (2010- ) Proje Yöneticisi: Doç. Dr. Ahmet Oğuz Ada (Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalı) Araştırmacı: Uzm. Dr. Bünyamin Yavuz (Sağlık Bakanlığı Keçiören Araştırma ve Uygulama Hastanesi) Araştırmacı: Doç. Dr. Burcu Balam Doğu (Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı) 2. Küçük Hücreli Dışı Akciger Kanserinde GST Polimorfizlerinin mrna ve Protein Ekpresyonları Üzerine Olası Etkilerinin Ortaya Konması (Proje no: 2011/16) Kırıkkale Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi (2011-2012)
6 Proje Yöneticisi: Doç. Dr. Serpil Oğuztüzün (Kırıkkale Üniversitesi Fen edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü) Araştırmacı: Prof. Dr. Mümtaz İşcan (Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalı) Araştırmacı: Doç. Dr. Ahmet Oğuz Ada (Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalı) Araştırmacı: Doç. Dr. Funda Demirağ (Ankara Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Patoloji Bölümü) Araştırmacı: Murat Kılıç (Pamukkale Üniversitesi, Acıpayam Meslek Yüksekokulu) 3. Küçük hücreli dışı akciğer kanserinde CYP izozimlerinin gen ve protein ekspresyonlarının incelenmesi (Proje kabul edildi numara verilecek) Kırıkkale Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi (2012-2013) Proje Yöneticisi: Doç. Dr. Sezgin Çelik (Kırıkkale Üniversitesi, Eğitim Fakültesi, Fen Bilgisi Öğretimi Anabilim Dalı) Araştırmacı: Doç. Dr. Serpil Oğuztüzün (Kırıkkale Üniversitesi Fen edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü) Araştırmacı: Prof. Dr. Mümtaz İşcan (Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalı) Araştırmacı: Doç. Dr. Ahmet Oğuz Ada (Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalı) Araştırmacı: Doç. Dr. Funda Demirağ (Ankara Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Patoloji Bölümü) Araştırmacı: Murat Kılıç (Pamukkale Üniversitesi, Acıpayam Meslek Yüksekokulu) B: Bildiriler 1. Ada AO, Karacaoglan V, Kunak SC, Soydas E, Iscan M. Xenobiotic enzyme polymorphisms in a Turkish population. 9th International ISSX Meeting. 4-8 Eylül 2010, İstanbul, Bildiriler kitabı sf.120.
7 2. Karacaoglan V, Ada AO, Kunak SC, Alpar S, Gulhan M, Kurt B, Iscan M. CYP2E1*5B polymorphism, response to chemotherapy and survival in non small cell lung cancer patients. 9th International ISSX Meeting. 4-8 Eylül 2010, İstanbul, Bildiriler kitabı sf.40. 3. Ada AO, Kunak SC, Soydas E, Karacaoglan V, Iscan M. CYP and GST polymorphisms in a Turkish population. 10th International Symposium on Pharmaceutical Sciences. 26-29 Haziran 2012, Ankara, Bildiriler kitabı sf.464. 4. Karacaoglan V, Ada AO, Kunak SC, Alpar S, Gulhan M, Kurt B, Iscan M. CYP2E1*5B, *6 and *7B polymorphisms, response to chemotherapy and survival in non small cell lung cancer patients. 10th International Symposium on Pharmaceutical Sciences. 26-29 Haziran 2012, Ankara, Bildiriler kitabı sf.478. 5. Can Eke, B., Özdamar E. The association of Glutathione S-transferases with Parkinson s disease. 10th International Symposium on Pharmaceutical Sciences. 26-29 Haziran 2012, Ankara, Bildiriler kitabı sf. 30. C. Bilimsel Makale 1. Iscan M., Ada AO., Karacaoglan V. Xenobiotic/drug metabolizing enzyme polymorphisms: their role in response to chemotherapy and survival in lung cancer. Arch Pharmacy 60: 1062-1080, 2010. 2. Kunak S.C., Ada A.O., Karacaoglan V., Soydas E., Bilgen S., Iscan M. Drug/xenobiotic metabolizing enzyme polymorphisms in a Turkish population. Afr. J Pharm. Pharmacol. 6(27); 2068-2074, 2012. D. Tezler Doktora; 1. Volkan Karacaoğlan: Akciğer kanserinde metabolik (CYP2E1) polimorfizmin ilaç rezistansındaki rolü. (2012): (Doktora yürütücüsü: Prof. Dr. Mümtaz İşcan) 2. Elçin Deniz Özdamar. Parkinson hastalığının sigara kullanımı ile ilişkisinin araştırılması. (devam ediyor. Doktora Yürütücüsü. Prof. Dr. Benay Can Eke)
8 VI. SAĞLANAN ALTYAPI OLANAKLARININ VARSA BİLİM/HİZMET VE EĞİTİM ALANLARINDAKİ KATKILARI Eğitim açısından bu altyapı olanağı anabilim dalımız ve Eczacılık Fakültesinin diğer anabilim dallarından konuya ilgi duyan ve tez ve münferit araştırma yapan genç ve diğer araştırıcılara moleküler düzeydeki en yeni ve güncel teknikleri uygulamaya olanak veren bu cihazı öğrenme ve teknikleri uygulama olanağını da sağlamış olmaktadır.
9 VII. EKLER a) Mali bilanço ve açıklamaları HARCAMA PLANI SIRA NO EKONOMİK SINIFLANDIRMA MİKTARI ÖLÇÜ BİRİMİ TAHMİNİ BEDEL Makine Teçhizat Adı (03.7+06.1+06.3) 1 Real Time PCR 1 adet 59400 2 Yatay elektroforez sistemi 1 adet 826 3 Spin santrifüj 1 adet 826 Sarf Malzemesi Adı (03.2) 1 Oligo Primer 360 baz 1275 2 0,5 ml lik PCR tüpü 1000 adet 59 3 Sarı pipet ucu 5000 adet 89 4 0,5 ml lik santrifüj tüpü 2000 adet 106 5 2 ml lik santrifüj tüpü 1000 adet 71 6 Mikrosantrifüj adaptörü 60 adet 354 7 80-1031 bç aralığı DNA marker (1000ul/paket) 2 paket 448 8 100-1000 bç aralığı DNA marker (1000ul/paket) 1 paket 236 9 25-700 bç aralığı DNA marker (500ul/paket) 3 paket 389 10 Reducta agaroz 200 gram 1180 11 2xPCR master mix (25ul/200reaksiyonluk/paket) 2 paket 520 12 2xProbe qpcr master mix (25ul/200reaksiyonluk/paket) 1 paket 2006 13 2ul+10ul+100ul mikro hacimli pipet seti 1 set 1959 14 200ul mikropipet 1 adet 590 15 Gilson pipet için orijinal 100ul lik filtreli pipet ucu steril 96 adet/kutu 30 kutu 1062 16 Gilson pipet için orijinal 10ul lik filtreli pipet ucu steril 96 adet/kutu 20 kutu 708 17 0,2ml tüpler için 96lı kapaklı rak 5 adet farklı renklerde 10 adet 154 18 Ethidium bromide stok solüsyon 10mg/ml konsantrasyonda 20 ml 137 19 1-200ul sarı pipet ucu 96 adet/kutu 20 kutu 176 20 Taq polimeraz (yükleme boyası hazır) 500ünite/paket 1 paket 377 21 PstI kesim enzimi 3000ünite/paket 1 paket 83 22 RsaI kesim enzimi 5000ünite/paket 1 paket 413 23 8li PCR-strip 0,2ml, flat kapaklarıyla birlikte 240 adet 538 24 0,2 ml lik ince duvarlı flat kapaklı PCR tüpü transparent 1000adet/paket 5 paket 501 25 PCR work up rack 2 adet 106 26 96 well work up rack 0,2ml lik tüpler için 2 adet 71 27 Tris buffer grade 1000g/kutu 1 kutu 142 28 Flouresan işaretli PCR probu 100nmol 4 adet 1988 29 Soğutucu PCR tüplüğü 4 adet 1332 30 2ml tüpler için sabit kapaklı saklama kutusu donmaya dayanıklı 5 adet 188 31 DdeI kesim enzimi 1000ünite/paket 1 paket 938 32 BstUI kesim enzimi 5000ünite/paket 2 paket 2430 1 1 TOPLAM Hizmet Alımı Adı (03.5+03.8+06.6) Seyahat (03.3) 82 698.-TL
10 b) Makine ve Teçhizatın konumu ve ilerideki kullanımına dair açıklamalar Gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) Farmasötik Toksikoloji anabilim dalımız laboratuarında araştırmalar için uygun bir yerde çalışır durumda bulunmaktadır. Şu anda RT-PCR V. SAĞLANAN ALTYAPI OLANAKLARI İLE VARSA GERÇEKLEŞTİRİLEN PROJELER kısmında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi Ankara Üniversitesi Araştırma fonundan alınan proje ile diğer Üniversitelerle ortaklaşa yürütülen projelerde kullanılmaktadır. Ayrıca halen anabilim dalımızda yapılan lisansüstü tezlerinde de kullanılmaktadır. Araştırmaların yanı sıra özellikle genç araştırıcıların eğitimine de önemli katkı sağlamaktadır. İleriye yönelik olarak halen ders aşamasında olan Y.Lisans ve doktora öğrencilerinin tezlerinde bu RT-PCR ın kullanıma olanak veren tekniklerin kullanılmaları da planlanmıştır. İlaveten diğer anabilim dalı araştırıcılarının da bu yönde ilgisi bulunmakta ve lisansüstü tez ve proje araştırmalarında kullanımlarına da açık tutulmaktadır. Moleküler düzeydeki son tekniklerin uygulanmasına olanak vererek araştırmaların kalitesini yükseltmesi açısından bu aletin kurumumuz araştırıcılarının erişebileceği bir konumda bulunması özellikle genç araştırıcıların iyi yetişmelerine yönelik son derece yararlı ve gerekli bir hizmeti oluşturmaktadır. c) Teknik ayrıntılar : -