BIONEER MARKA ACCUPOWER EBV QUANTATIVE PCR KİTİ PROTOKOLÜ

Transkript

1 BIONEER MARKA ACCUPOWER EBV QUANTATIVE PCR KİTİ PROTOKOLÜ Kullanılan Ekipmanlar : - Bioneer Marka ExiPrep16 Plus Model Tam Otomatik Nükleik Asit Ekstraksiyon Sistemi - Bioneer Marka ExiPrep Viral DNA/RNA Ekstraksiyon Kiti - Bioneer Marka ExiCycler96 Model Real Time PCR Cihazı - Bioneer Marka ExiSpin Model Multi Spin Santrifüj - Bioneer Marka EBV-1111 Diagnostik Kit - Denovix Marka DS-11+ Model Nanodrop Spektrofotometre Cihazı - Arise Marka Elektronik Pipet Seti (1) Ekstraksiyon : ExiPrep16 Plus Tam Otomatik DNA/RNA Ektraksiyon Sistemi Kapı 1

2 (1) ve (2) Numaralı kartuşlar kullanacağınız örnek miktarına göre (En az 1, en fazla 16 örnek) özel delgeçle delindi. Sadece (1) no lu kartuşun örnek gözlerine 200 ul sıvı haldeki örnekleri pipetlendi. (1) ve (2) numaralı kartuşlar tabla üzerinde belirtilen bölümlere konuldu ve tam olarak yerleştiğinden emin olundu. NOT: Tam oturmayan kartuşlar veya düşen uçlar sistemin hareket sensörü ile algılanır, çalışma durur ve hata kodu ekranda görünür. Elüsyon tüpleri (0,2ml lik PCR Tüpleri) ve pipet uçlarını ilgili raklarıyla plakanın yazıyla belirtilen bölümlerine yerleştirildi. Atık kutusu yerleştirildi. Cihazın ön bölümdeki AÇ tuşuna basıldı ve güç bağlantısını tamamlandı. 2

3 200 ul Positif ve Negatif Örnek kullanılarak 50 ul elüsyon hacminde Viral DNA/RNA ekstraksiyonu yapıldı. Kullanılan Kitin Katalog Numarası : K-4271 Kullanılan Örnek Miktarı : 200 ul Seçilen Protokol Numarası : 613 Seçilen Elüsyon Hacmi : 50 ul (2) Kalite ve Konsantrasyon Ölçümü: Elde edilen hasta DNA larının saflık ve miktar tayinleri Denovix Marka DS-11+ Model Mikro Hacimli (Nanodrop) Spektrofotometre ile yapıldı. Denovix Marka DS-11+ Model Mikro Hacimli (Nanodrop) Spektrofotometre Cihaz entegre Android Yazılıma ve 1280x800 HD dokunmatik renkli ekrana sahiptir ve her türlü laboratuvar eldiveni ile kullanıma uygundur. Cihazın entegre formül oluşturucu, hesaplayıcı veya çeviricileri mevcuttur. Ayrıca cihazın Wi-Fi, 8GB Dahili hafızası vardır, kompakt yapıdadır harici bilgisayar kullanımına gerek yoktur, kullanıcı dostu arayüzüne sahiptir ve az yer kaplar. Minimum ölçüm : 2 ng/ul dsdna Maksimum ölçüm kapasitesi : ng/ul dsdna 3

4 Elde edilen DNA ların saflık derecesinin uygunluğu ve konsantrasyonların yeterliliği olduğu kayıt altına alındı. 4

5 (3) Real Time PCR Cihazını Programlama : Real Time PCR çalışmasında Bioneer Marka ExiCycler96 Model Real Time PCR Cihazı ve ExiDiagnosis (Diagnostik Yazılım Versiyon ) kontrol ve analiz yazılımı kullanıldı. File/Design Experiment menüsünden ekrana gelen Hazır Protokol listesinden kitin ismi seçildi ve gerekli bilgiler ilgili alanlara girildi; Ekstraksiyon Robotunda Kullanılan Örnek Miktarı : 200 ul Ekstraksiyon Robotundan Alınan Elüsyon Hacmi : 50 ul Real Time PCR Cihazında kullanılan Örnek Hacmi : 5 ul EBV Kiti için IU Conversion Sabiti :

6 Standartlar ve Negatif kontrol bilgileri otomatik olarak ekrana geldi, Örnek isimleri kayıtlı Excel belgesi seçilip Edit tuşuna basılarak girildi, daha sonra Update butonu ile plaka bilgisi yazılıma aktarıldı ve OK tuşuna basılarak çalıştırma ekranına ulaşıldı. 6

7 Run tuşuna basılarak cihaz çalıştırıldı. (4) Real Time PCR Çalışmasının Analizi Real Time PCR çalışması bittiğinde ilgili dosya ExiDiagnosis (Diagnostik Yazılım Versiyon ) ile açılarak analiz sonuçlarına otomatik olarak ulaşıldı: Amplifikasyon eğrilerinin toplu görünümü: 7

8 Standartların ve Örnek Amplifikasyonlarının, sonuç raporu ile birlikte görünümü: Standart Doğrunun, sonuç raporuyla birlikte görünümü : 8 Çalışma Verimi : % 99 & Doğrusallık (R^2) : 0,9999

9 (5) Sonuç Raporu: Bioneer marka ExiPrep16 Plus Model Tam Otomatik Ekstraksiyon Robotu kullanılarak, positif ve negatif örneklerden kontaminasyon riski olmaksızın, yüksek saflıkta ve diagnostik çalışmalar için yeteri miktarda Viral DNA/RNA ettiği kanıtlanmıştır. Negatif kontrolün (NTC) ve Negatif Örneğin (H1) sonucunun Undetermined (Negatif) olarak bulunduğu, yani ilgili lot numaralı kitlerde ve ekstraksiyon adımında herhangi bir kontaminasyona rastlanmadığı kanıtlanmıştır. Bioneer Marka Diagnostik Tanı kitlerinde kullanılan Internal Kontrollerin ve Standartların belirlenen aralıklarda Ct verdiği (Result Bölümleri) ve sonuç raporunda Valid (Geçerli) olarak tespit edildiği belirlenmiştir. Çalışmanın tamamına bakıldığında, Bioneer markasına ait Ekstraksiyon Kitlerinin, Tanı Kitlerinin ve Real Time PCR cihazının %99 verimle çalıştığı, % 0,9999 doğrusallık katsayısı 1 kopyaya kadar doğru ve güvenilir sonuç verdiği kabul komisyonunun huzurunda kanıtlanmıştır. Saygılarımızla, GEN Plaza Biyoteknoloji Merkezi biyolog@genplaza.com 9