İnvazif Mantar Enfeksiyonlarında Diğer Tanı Yaklaşımları Dr Beyza Ener Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi 17.03.2015
Mantar Enfeksiyonunun Etiyolojik Tanı Mikroskobik inceleme ile etkeni gösterme Besiyerlerinde etkeni üreterek çoğaltma ve gösterme Antijen-antikor reaksiyonları ile gösterme Metabolit-substrat ilişkisi ile gösterme Nükleik asitleri kullanarak etkeni gösterme (DNA nın anlaşılması ve gen dizilerinin öğrenilmesi) Yeni yöntemlerle proteinleri gösterilmesi (proteomiks)
Tanıda Nükleik Asitler Hibridizasyon Amplifikasyon
Hibridizasyon
Yüzey (Filtre) Hibridizasyon (DNA Micro Array)
Amplifikasyon Yöntemleri «Polimarase chain reaction» (PCR) Nucleic Acid Sequence- Based Amplification (NASBA) İzotermal mrna amplifikasyon yöntemi Latent ya da eski enfeksiyon yerine aktif enfeksiyon İzotermal ve mrna olması nedeniyle kontaminasyon az Mantarlarla ilgi az veri var Kerry Mullis 1985
PCR Testleri için Önemli Basamaklar PCR formatının seçilmesi Uygun klinik örnek seçimi Örnekten DNA ekstraksiyonu Primer seçimi İnternal kontrolün kullanılması Multipleks PCR (Amplifikasyondan sonra tanımlama)
PCR Klasik PCR PCR-ELISA Nested PCR Real-time PCR TaqMan FRET Yaklaşık 20 yıldır çalışılıyor
PCR için Örnek Seçimi Doku Steril vücut sıvıları (BOS vb.) Bronkoalveolar lavaj (BAL) Kan fraksiyonları (serum, plazma, tam kan) Tam kan=serum Costa C, et al. Real-time PCR coupled with automated DNA extraction and detection of galactomannan antigen in serum by enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of invasive aspergillosis. J Clin Microbiol 2002; 40: 2224 27. Tam kan>serum Loeffler J, et al. Comparison between plasma and whole blood specimens for detection of Aspergillus DNA by PCR. J Clin Microbiol 2000; 38: 3830 33. Anti-koagulan inhibisyonu Örnek miktarı Örneğin nakli
DNA ekstraksiyonu Kandaki miktar az Kandidoz > Aspergilloz Aspergilloz da <10 CFU/ml Örnek miktarını yüksek tutmak Elüsyon miktarını düşük tutmak Kontaminasyon önemli (yaklaşık %3) Negatif ve pozitif ekstraksiyon kontrollü kullanmak gerekir
DNA ekstraksiyonu Farklı yöntemler In-house yöntemler Ticari kitler Qiagen QIAmp Tissue Kit [Hilden, Germany] ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep (Zymo Research) Otomatik ticari teknikler MagNA Pure LC (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) Eritrosit ve lökositlerin eritilmesi Hücre duvarının uzaklaştırılması Hücre zarının uzaklaştırılması Proteinlerin çöktürülerek uzaklaştırılması ve DNA nın saflaştırılması Saflaştırılan DNA nın toplanması (elution)
DNA ekstraksiyonu Hücre duvarının uzaklaştırılması Kimyasal Dilue alkalide kaynatma Enzimatik Zymolase Rekombinant lyticase Mekanik Cam boncuklar Donma-çözme Sonikasyon Likit nitrojende parçalama Enzimatik-mekanik
DNA ekstraksiyonu Hücre zarının uzaklaştırılması Sodium dodecyl sulphate, beta-mercaptoethanol, EDTA Proteinlerin çöktürülerek uzaklaştırılması ve DNA nın saflaştırılması Phenol-chloroform Saflaştırılan DNA nın tutulması Alkol, magnetik boncuklar vs
rrna operonu Hem korunmuş hem değişken dizileri bulundurur Gen bankalarında bu bölge dizilerine ulaşmak kolay Çok tekrarı var (10 2 kopya/hücre) trna ve sitokrom b kodlayan mitokondri genleri Hedef Seçimi
Hedef Seçimi 18S rrna bölgesi panfungal İnsan 18S rrna ile homology Yalancı pozitif Block-based/Sybr Greenbased Uygun probe gerektirir 28S rrna bölgesi cinse özgü diziler ITS bölgeleri daha çok türe özgü Identifikasyonda Genel yaklaşım pan-fungal primer kullanıp, cins ya da türe özgü probe ile tanımlama yapmak
PCR=Aspergilloz Tam kan/serum >40 çalışma Duyarlılık ve özgüllük değişken %43 100 %64 100 PCR pozitifliğinin belirlenmesi Tek örnek 2 örnek Mengoli C, et al. Use of PCR for diagnosis of invasive aspergillosis: systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis 2009; 9:89 96. BAL Çalışma sayısı çok Duyarlılık ve özgüllük değişken %36-100 /%70 100 Ticari DNA ekstraksiyon protokolleri daha başarılı
İnvazif Aspergilloz GM vepcr Beraber kullanmak duyarlılığı, özgüllüğü bozmadan yükseltiyor Avni T et al. J Clin Microbiol 2012; 50:3652 3658. Ampirik antifungal kullanımı ile karşılaştırıldığında maliyet-etkin Morrissey CO, et al. Lancet Infect Dis 2013;13:519 528.
Aspergillus PCR Antifungal Tedavi DNA salınımının kinetiği Miçelin parçalanması ile salınıyor Antifungal kullanımı= Kan PCR duyarlılık Kaspofungin ve posakonazol etkiliyor Amfoterisin B etkilemiyor Antifungal kullanımı=bal PCR duyarlılığı Tek ilaçtan etkilenmiyor Antifungal tedavi esnasında negatifleşmeme kötü prognoz
Aspergillus PCR meta analiz Meta analiz (Kan) Mengoli C, et al. Lancet Infect Dis 2009 Duyarlılık %75, Özgüllük %87 (çift serum) Duyarlılık %88, Özgüllük %75 (tek serum) Meta analiz (BAL) PLoS One 6:e28467 Sun W et al. PLosOne 2011; 6:e28467 Duyarlılık %91, Özgüllük %92
PCR=Kandidoz >30 çalışma var Duyarlılık ve özgüllük değişken % 56.2-100 - %54-100 Gerçek pozitif ve gerçek negatif olgu tanımlarının çok değişken olması Yeni çalışmalarda duyarlılık ve özgüllük %95 / %92
Candida PCR meta analiz Avni T et al. JCM 2011 meta analiz Toplam duyarlılık %95, toplam özgüllük %92 olarak bulunmuş Proven/probabale hastalarda %85 pozitiflik Kan kültürü %29-46
PCR=Kandidoz Kan kültürlerinden tanımlamada C. glabrata Direnç genlerinin belirlenmesinde FKS1 Ekinokandinler ERG 11 aşırı ekspresyonu Azoller ERG11 mutasyonu Azoller CDR 1, CDR2, MDR 1 - Azoller
Meta analizler Duyarlılk Özgüllük Galaktomannan %78 %81 BDG (Aspergillus) %77 %85 PCR (Aspergillus) %75 %87 Mannan-Antimannan %83 %86 BDG (Candida) %64 %84 PCR (Candida) %95 %92
UK-Irish Fungal PCR Consensus Group White PL et al. A Consensus on Fungal Polymerase Chain Reaction Diagnosis? JMD 2006; 8: 376-384 2001 yılında 7 merkez ile kuruluyor IFI tanısında güvenilir ve tekrarlanabilir PCR temelli bir yöntem oluşturmak Kullanılan moleküler yöntemlerin çok merkezli olarak denenmesi için kontrol panelleri oluşturularak merkezlere dağıtılıyor Farklı ekstraksiyon yöntemleri Candida için 3 farklı, Aspergillus için 5 farklı amplifikasyon yöntemleri deneniyor Tam kanda miktarları belirlenmiş (0-10 5 ) Candida blastosporlar Tam kanda miktarları belirlenmiş (0-10 5 ) Aspergillus konidyaları Aspergillus DNA sı LightCycler (LC; Roche, Lewes, UK) Corbett Rotor-Gene (CR; Corbett Research LTD, Cambridge, UK) TaqMan (TQ; Applied Biosystems, Warrington, UK)
UK-Irish Fungal PCR Consensus Group White PL et al. A Consensus on Fungal Polymerase Chain Reaction Diagnosis? JMD 2006; 8: 376-384 Ekstraksiyon yöntemlerinden mekanik veya enzimatik olarak hücre duvar yıkımı yapan yöntem Löeffler J, et al. Automated extraction of genomic DNA from medically important yeast species and filamentous fungi by using the MagNA Pure LC system. J Clin Microbiol 2002, 40:2240 2243 Löeffler J, et al. Compari-son of different methods for extraction of DNA of fungal pathogens from cultures and blood. J Clin Microbiol 1997, 35:3311 3312) Tam kan gönderilerek yapılan deneylerde Candida için denenen bütün ekstraksiyon ve amplifikasyon yöntemleri benzer 10 CFU/ml belirleyebiliyor Aspergillus testlerinde farklı sonuçlar alınıyor Ekstrakte edilmiş DNA yollanıyor İki yöntem öne çıkıyor Aspergillus primer + Aspergillus spesifik LC hidroliz probu Pan-fungal primer + Aspergillus spesifik TQ hidroliz probu
UK-Irish Fungal PCR Consensus Group White PL et al. A Consensus on Fungal Polymerase Chain Reaction Diagnosis? JMD 2006; 8: 376-384 LC (7 merkez ) RG (3 merkez) TQ (2 merkez) Pan-fungal primer (18S rrna) Aspergilus özgül TQ hidroliz probe >500 konidya/ml 25-50 konidya/ml 10-20 konidya/ml Aspergilus özgül primer (28S rrna) Aspergilus özgül LC hidroliz probe 100 konidya/ml 25 konidya/ml 10 konidya/ml
UK-Irish Fungal PCR Consensus Group Önerisi
European Aspergillus PCR Initiative (EAPCRI) çalışma grubu [International Society for Human and Animal Mycoses (ISHAM)] 2006 yılında kuruluyor Avrupa dan, orta doğu ve Avustralya dan katılan merkezler Standart Aspergillus PCR yöntemi geliştirmek Bu yöntemin klinik çalışmalarla validasyonunu sağlamak EORTC/MSG tanı kriterlerine alınmasını sağlamak
8 çekirdek laboratuvar, 16 yeni laboratuvara kalite kontrol panelleri gönderiliyor İki kez tam kan kan panelli (2007 ve 2008), bir kez DNA panelli (2007) gönderiliyor 11 farklı PCR protokolü uygulanıyor DNA panelleri ile çok uyumlu sonuç alınıyor Ancak tam kan kullanıldığında uyum %50 azalıyor
Ekstarksiyon yöntemi önemli >3ml EDTA lı tam kan Eritrosit ve lökositlerin parçalanması Seramik ya da asit ile yıkanmış cam boncuklarla (710-1180µm) hücre duvarı uzaklaştırılması Ticari kitler DNA nın purifikasyonu için kullanılabilir Elüsyon <100 µl Negatif ve pozitif kontrollerin kullanılması Amplifikasyon yöntemi çok önemli değil
PCR a Dayalı Moleküler Tanı Bütün dünyada tek bir PCR formatının kullanılması gerçekçi değil Minimal information for publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE) Herhangi bir real-time quantitative PCR (qpcr) deneyi tasarlama ve uygulayarak raporlama için gerekli fikir ve öneri oluşturmak. Böylece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar almak
Diğer Mantarlar Pneumocystis jirovecii pnömonisi Kültürü yapılamıyor Boyama yöntemlerinin duyarlılığı düşük Yüksek riskli hastalarda %22 kolonizasyon Real time PCR Meta analiz Duyarlılık %99; özgüllük %90 Lu Y et al. J Clin Microbiol 2011; 49:4361 4363 Mukormikoz olguları Fusarium, Scedosporium enfeksiyonları
Multipleks PCR Aynı örnekte değişik mantarları tespit etmek Pan-fungal primer ile çoğaltma Tanımlama Dizi analizi Özgül problarla erime eğrisi analizi Septifast: Ticari multipleks PCR sistemi Yeterli sayıda veri yok Pahalı
Ticari PCR Sistemleri MycAssay Aspergillus (Myconostica, Ltd) 15 farklı Aspergillus türünü belirleyebiliyor 18S rrna genlerine özgü primer ve probe kullanıyor MycAssay Pneumocystis
Proteom analizi Gaz-likit kromotografi klasik 2D-PAGE ve MS MALDI-TOF gibi yeni yöntemler
MALDI-TOF Daha çok identifikasyonda kullanılmakta >%90 konvasiyonel yöntemlerle uyumlu Antifungal duyarlılık yapılabiliyor Ancak direkt kullanımı ile ilgili yayınlar
Farklı Yöntemler SERRS= Surface enhanced resonance raman spectrofotometry T2 Nuclear magnatic resonance
SONUÇ Klasik yöntemler halen altın standart Duyarlılık düşük ve yavaş Serolojik testler standart kitler olduğu için karşılaştırma yapmak kolay olduğundan tanı kılavuzlarına eklenmiş PCR testlerini standart bir kit şekline sokmak kolay değil, bu nedenle kılavuzlara eklenmemiş Ancak bazal kurallar büyük oranda oluşturulmuş durumda ve bu kuralarla göre yapılan çalışmalarda klinik karşılaştırma yapmak mümkün Yeni yöntemler henüz daha çok yeni