Beta-Talasemi Taşıyıcılarında Beta-Globin Gen Mutasyon Tipi ve Hematolojik Fenotip Arasındaki İlişki

Beta-Talasemi Taşıyıcılarında Beta-Globin Gen Mutasyon Tipi ve Hematolojik Fenotip Arasındaki İlişki Sevilay ÖNEY *, Zeynep ÖZTÜRK **, Alphan KÜPESİZ ***, İbrahim KESER ****, M. Akif YEŞİLİPEK ***** Beta-Talasemi Taşıyıcılarında Beta-Globin Gen Mutasyon Tipi ve Hematolojik Fenotip Arasındaki İlişki Amaç: BBu çalışma beta-talasemi taşıyıcılarında belirlenen mutasyon tipinin hematolojik parametreler üzerine olan etkisini belirlemek amacıyla yapıldı. Gereç ve Yöntem: Çalışmaya Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Talasemi Tanı, Tedavi ve Araştırma Ünitesi tarafından takip edilen, taşıyıcılıkları HPLC ile belirlenen, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Moleküler Genetik Laboratuvarında RDBH ve DNA dizi analizi ile mutasyonları tanımlanan 4 heterozigot talasemi taşıyıcısı (36 erkek ve 4 kadın) araştırmaya alındı. Sonuçlar: Çalışılan 4 bireyin mutasyon tipleri IVS I-110 (G A), IVS II-45 (C G), IVS I-1 (G A), Cod.39 (C T), IVS I-6 (T C), IVS II-1 (G A), Cod 5 (-CT), Cod (-AA) ve Cod 44 (-C) olarak belirlendi. Olguların 45 inde b + mutasyonu (IVS I 110, IVS I 6, IVS II 45) ve 39 unda ise b 0 mutasyonu (IVS I 1, Cod 39, Cod 44, Cod 5, IVS II 1) saptandı. b + grubunda hematokrit değeri daha yüksek bulundu (p=0,042). Hb F ve değerlerinin ise b 0 grubunda daha yüksek olduğu görüldü (sırası ile p=0.044 ve p=0.001). IVS I-6 mutasyonu taşıyan bireylerde hem Hb F hem de düzeylerinin, diğer mutasyon tiplerine göre istatistiksel olarak farklı olduğu bulundu. Sonuç olarak, beta-globin gen mutasyonlarını heterozigot taşıyan bireylerde, Hb A2 ve Hb F düzeyleri bireyin mutasyon tipine göre değişmektedir. Literatürde % 0-14 arasında bildirilen Hb F düzeyi bizim çalışmamızda % 0-.9 olarak bulunmuştur. Sonuçta beta-talasemi taşıyıcılığında genotipin hematolojik fenotip üzerine etkili olduğu, daha fazla olgunun çalışılması ile toplumumuza yönelik elde edilecek verilerin klinik bakımdan önemli olduğu düşüncesindeyiz. Anahtar kelimeler: Beta-talasemi taşıyıcılığı, beta-globin geni, mutasyon, genotip, fenotip The Relationship Between Mutation Type of Beta-Globin Gene and Hematological Phenotype in Beta-Thalassemia Carriers Aim: This study was conducted to determine the effect of the mutation type at beta-globin gene on the hematological parameters in beta-thalassemia carriers. Materials and Methods: Eighty four patients (36 males and 4 females) were included to our study. All of patients were diagnosed for betathalassemia carrier by HPLC and beta-globin gene mutations using RDBH and DNA sequencing in the Thalassemia Unit and Medical Genetics, Faculty of Medicine, Akdeniz University. Results: The mutation types of beta-globin gene were IVS I-110 (G A), IVS II-45 (C G), IVS I-1 (G A), Cod.39 (C T), IVS I-6 (T C), IVS II-1 (G A), Cod 5 (-CT), Cod (-AA) and Cod 44 (-C) in the patients investigated. Of patients 45 have had the b + mutions (IVS I 110, IVS I 6, IVS II 45) and 39 had the b 0 mutations (IVS I 1, Cod 39, Cod 44, Cod 5, IVS II 1). Hematocrit level was found to be increased in b + group (p=0,042). Hb F and Hb A2 were found to be higher in b 0 group than b + group (p=0.044 and p=0.001, respectively). Hb F and levels were statistically different in IVS I-6 heterozygous than other mutation types. In conclusion, Hb F and levels vary in patients who have the heterozygous carrier for betaglobin gene mutation according to mutation type. Hb F level was lower (0-.9 %) in our study than reported (0-14 %) in the literature. As a results, we suggest that genotype for beta-globin gene mutation effects the hematological phenotype, further studies should be planned to obtain the more data for clinical using and our population. Key words: Beta-thalassemia carrier, beta-globin gene, mutation, genotype, phenotype * Akdeniz Üniversitesi Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu, Öğr. Gör. ** Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı, Talasemi Tanı, Tedavi ve Araştırma Ünitesi, Biolog *** Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı, Talasemi Tanı, Tedavi ve Araştırma Ünitesi,Yrd. Doç. Dr. **** Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Doç. Dr. ***** Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı, Talasemi Tanı, Tedavi ve Araştırma Ünitesi, Prof. Dr. 23

GİRİŞ Talasemi, bir ya da daha fazla globin zincir (α, β, γ, δβ, γδβ, δ ve εγδβ) sentezinin azalması ile karakterize hemoglobin bozukluğudur. Beta-talasemi, beta-globin genindeki mutasyonlar nedeni ile beta-globin sentezinin azalması (β + ) veya hiç sentezlenmemesi (β 0 ) sonucunda oluşur. Heterozigot β-talasemide, tek bir β-talasemi aleli (β + ya da β 0 ) kalıtılmaktadır. Beta-talasemide, homozigot olgular transfüzyon bağımlılığı gerektiren ağır bir anemi, heterezigotlar ise hafif anemi hipokromik mikrositik kırmızı küre, HbA 2 ve Hb F düzeyinin değişken olarak yükselmesi ile karakterizedir. Heterozigot bireylerdeki artışı genellikle % 3,5-5,5 arasında seyrederken, nadir olarak görülen % 6,5 un üzerindeki yüksek düzeyine ise β promotor bölgesindeki regulatör elementlerin delesyonu neden olur. Heterozigot bireylerin hematolojik fenotipleri çok çeşitlilik gösterebilir; bazı heterozigotların kan tabloları tipik heterozigot talasemi olmasına rağmen leri normal olabilmektedir (1). Bu bireylerin çoğunluğu β talasemi ile birlikte kalıtılması sonucunda oluşur. Sessiz betatalasemilerde ise β-globin üretiminde çok az bir eksiklik vardır ve bu nedenle heterozigot bireyler belirgin hematolojik fenotip göstermezler (2,3). Bu olguların OEH (Ortalama Eritrosit Hacmi), OEHb (Ortalama Eritrosit Hemoglobini), HbA 2 ve HbF değerleri normal olduğu için rutin tarama yöntemleriyle belirlenemezler. Dominant olarak kalıtılan β talasemi mutasyonlarını taşıyan heterozigot bireyler ise taşıdığı bu mutasyonun öncü kırmızı kürelerde inklüzyon cisimciklerini oluşturabilecek ürünlere yol açmasından dolayı hastalık fenotipi oluşabilir ve genellikle orta şiddette anemi, splenomegali ve talasemik kan tablosu ile talasemi intermedia fenotipi gösterirler (4,5). Talasemiler dünyada en yaygın olarak görülen tek gen hastalığıdır. Seksen milyonunu beta talasemi taşıyıcılarının oluşturduğu yaklaşık 20 milyon talasemi taşıyıcısı bulunmaktadır. Beta globin geni, 11. kromozomun kısa kolu üzerinde bulunur ve üç ekzon ile iki intron bölgesinden oluşur. Genel olarak iki tür β talasemi tipi vardır; β 0 ve β +. Nadiren bu iki alelden daha hafif seyreden bir form da β ++ olarak gösterilir ve β zincir üretiminde minimal eksikliğe yol açar. β talasemi taşıyıcıları β 0 veya β + olsun klinik olarak asemptomatiktir. Hipokromik mikrositik kırmızı küreler ile karakterize hafif bir anemi, de ve değişken düzeylerde Hb F de artış söz konusu olabilir. Ancak daha önce de açıklandığı gibi heterozigotlar çok çeşitli olabilir; tamamen fenotipik olarak sessiz olabildikleri gibi ağır anemi ile seyreden tipleri de vardır. Bu olgularda mutasyon tipine bağlı olarak hematolojik parametrelerde, Hb A 2 ve Hb F düzeylerinde değişiklikler gözlenebilmektedir. Yapılan çalışmalarda β 0 talasemi tipine sahip bireylerin OEH değerlerinin β + tipine sahip olanlardan daha düşük seyrettiği gösterilmiştir (6). Skarmoutsou ve ark. () ise retikulosit, ve Hb F seviyelerini β 0 talasemi heterozigotlarında daha yüksek bulmuşlardır. Türkiye genelinde yapılan çalışmalar, nüfusumuzun ortalama % 2,1 nin β talasemi taşıyıcısı olduğunu ve bu oranın bazı bölgelerde % 10 u bulduğunu ortaya koymuştur (-10). Bugüne kadar moleküler düzeyde yapılan çalışmalar ile dünyada beta-talasemiye neden olan 200 den fazla mutasyon belirlenmiştir. Bunlardan 40 farklı mutasyon tipi Türkiye de rapor edilmiştir. Ülkemizde en sık rastlanılan β-talasemi mutasyonları; IVS I 110 (% 40), IVS I 6 (%.14), IVS I 1 (%.14) ve IVS II 45 (% 4.2) dir (11,12). Bu çalışmamızda amaç heterozigot bireylerde Türk populasyonundaki yaygın mutasyon tipleri ile hematolojik parametrelerin değişkenliğini karşılaştırmaktır. 24

GEREÇ ve YÖNTEM Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi, Talasemi Tanı, Tedavi ve Araştırma Ünitesi tarafından takip edilen, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Moleküler Genetik Laboratuvarında mutasyonları tanımlanan yaşları 3 yaş ile 42 yaş arasında değişen 4 heterozigot talasemi taşıyıcısı incelemeye alındı. Olguların 36 sı erkek, 4 i kadındı. Taşıyıcı bireylerin kanları K3-EDTA lı tüpe alındı ve eritrosit indeks parametreleri otomatik kan sayım cihazı ( Beckman Coulter LH 50) ile belirlendi. Hemoglobin A 2 ve Hb F düzeyleri β-thalassemia Short Programı kullanılarak (Bio-Rad Variant) yüksek basınçlı sıvı kromotografisi (HPLC) yöntemi ile belirlendi. Beta-Talasemi mutasyonları ise bölgemizdeki yaygın 22 mutasyonu gösteren RDBH (Reverse Dot-Blot Hybridization) (ViennaLab, Beta-Globin StripAssay), ARMS (Allele refractory mutation system), REA (Restriction Enzyme Analyse) ve gerektiğinde DNA Dizi Analizleri ile belirlendi (13,14). Elde edilen sonuçlara iki grup arasındaki farkın anlamlılığını ortaya koymak için Ki-kare ve t-testleri uygulandı. BULGULAR Beta globin gen mutasyonu için heterozigot olan bu 4 bireyin mutasyon tipleri IVS I-110 (G A), IVS II-45 (C G), IVS I-1 (G A), Cod.39 (C T), IVS I-6 (T C) IVS II-1 (G A), Cod 5 (-CT), Cod (-AA), Cod 44 (-C) olarak bulundu. Bu mutasyon tiplerinin hastalara göre dağılımları Tablo 1 de gösterilmektedir. DNA dizi analizi ve diğer yöntemler kullanılarak b-globin geninin mutasyon tipleri belirlenmiştir. 45 örnekte b + mutasyonu (IVS I 110, IVS I 6, IVS II 45) ve 39 örnekte b 0 mutasyonu (IVS I 1, Cod 39, Cod 44, Cod 5, IVS II 1) saptanmıştır. Tablo 2 de heterozigot talasemi olguların mutasyon tipleri ve ve Hb F yi içeren hematolojik bulguları gösterilmektedir. Eritrosit göstergelerinin (Hb, KK, OEH, OEHB) istatistiksel analizi b + ve b 0 talasemi mutasyonlarını içeren grup değerleri arasında belirgin farklılıklar göstermemiştir. Ancak hematokrit değerleri b + grubunda daha yüksek olarak bulunmuştur (p=0,042). Hb F ve değerlerine baktığımızda ise iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmektedir. Hb F ve değerlerinin her ikisi de b 0 grubunda daha yüksek olarak bulunmuştur (sırası ile p=0.044 ve p=0.001). IVS I-6 mutasyonunu b ++ olarak Tablo 1. Olguların mutasyon tip ve yüzdelik dağılımları. Mutasyon Mekanizma Sayı % IVS I.110 (G A) Cod 39 (C T) IVS II.45 (C G) IVS I.6 (T C) IVS I.1 (G A) Cod 5 (-CT) Cod (-AA) Cod 44 (-C) IVS II.1 (G A) Çerçeve kayması Çerçeve kayması Çerçeve kayması 30 11 6 5 4 34.9 12. 9.3 9.3.14.14 6.9 5.1 4.65 25

Tablo 2. Seksen dört heterozigot talasemi bireyin mutasyon tipleri ve hematolojik parametrelerinin ortanca değerleri. Mutasyon Tipi n Hb (g/dl) Htc KK (milyon/mm 3 ) Ret OEH (fl) OEHB (pg/hücre) OEHBK (g/dl) RDW HbA2 HbF β + IVS 1-110 IVS 2-45 IVS 1-6 β 0 Cod.39 IVS 1-1 Cod 5 Cod. Cod.44 IVS II-1 30 11 6 4 4 11.6 (.-14.6) 10. (.4-13.3) 11.6 (-13.4) 10.60 (.5-14.49) 10.60 (9-13.29 10.9 (9.9-13.4) 10.15 (.1-11.3) 10.4 (10.1-12.9) 10.00 (.5-10.9) 36.35 (2.4-46.5) 34.60 (22.5-46.5) 3.40 (23.1-39.9) 32.0 (26-44.3) 34.00 (2.1-41.2) 33.4 (29.1-36.4) 30.95 (25.9-35.) 33.1 (30.2-3.) 30.20 (26.3-33.) 5.4 (4.1-) 5.65 (3.33-6.64) 5.25 (3.36-6.45) 6.0 (3.95-.14) 5.61 (4.4-6.4) 5.515 (4.09-5.96) 4.60 (3.9-5.959 5.21 (5.03-5.) 5.30 (4.2-6.0) 1.63 (0.2-2.6) 1.2 (0.4-2.15) 1.3 (0.5-2) 1.0 (0.1-3.01) 2.5 (1.3-4.4) 1.325 (1-1.65) 1.0 (0.6-1.4) 1.95 (1.43-2.31) 0. 0. 62 (5.5-3.6) 61.40 (55.4-4) 69.00 (62-3.1) 60.0 (54.5-9.2) 60.60 (5.-0.2) 59.5 (56.4-9) 61.50 (60.2-63.) 63.5 (60-64.6) 61.60 (50-63.) 19. (1.3-22.) 20.00 (1.3-25.2) 20.90 (20.-22.1) 19.10 (1.5-31.2) 20.30 (1.9-21.9) 19.2 (1.-32.) 19.0 (19-20.2) 20.4 (20.2-22) 20.00 (16.4-20.6) 31.9 (30.4-33.5) 32.0 (31.2-34.1) 30.30 (30.2-33.5) 32.60 (30.5-36.6) 32.10 (23.2-34.2) 32.2 (30.-36.) 31.0 (31.532.2) 33. (31.9-34.2) 32.40 (32.3-33) 15. (13.4-20.) 16. (15.1-1.1) 1.1 (14.6-3.1) 15.5 (14.2-19.5) 15.9 (13.-19.2) 15. (14.-1) 1.5 (16.2-19) 15.4 (14.2-16.3) 16.1 (.-1.6) 5 (3-6.41) 4.60 (4.1-5.1) 3.90 (2.-4.6) 5.00 (4.3-6.1) 5.60 (4.2-.1) 5.6 (4-6) 5.0 (4.1-6.) 5.55 (4.9-5.) 5.0 (4.3-.1) 0.4 (0-3.) 2.00 (1.2-2.) 0.60 (0.5-0) 3.00 (1.-.9) 1.0 (0.5-1.) 0. (0-2.1) 3.50 (1.5-.9) 3.15 (0-.4) 0.0 0.0 OEH: Ortalama eritrosit hacmi, OEHb: Ortalama eritrosit hemoglobini, OEHBK: Ortalama eritrosit hemoglobin konsantrasyonu; KK: Kırmızı küre; RDW: Kırmızı küre dağılım genişliği. ele aldığımızda ise bu olguların değerleri b + ve b 0 gruplarından daha düşük olarak bulunmuştur (p=0,001 ve p=0,001). Hb F açısından ise IVS I-6 grubunun Hb F değeri her iki gruptakinden daha düşük olmasına rağmen istatistiksel olarak b 0 grubu ile farklı bulunmuş ancak b + ile farklı bulunmamıştır (sırası ile p=0,029 ve p=0,05). Mutasyon tiplerini IVS I-6 mutasyonu taşıyan olgular ile yönünden tek olarak karşılaştırdığımızda ise değerleri Cod 44 mutasyonunu taşıyan olgular hariç (p=0,06) diğer mutasyonları taşıyan olgulardan istatistiksel olarak farklıdır (IVS 1-110, p=0,001; IVS II-45, p=0,011; Cod, p= 0.00; IVS I-1, p=0,009; IVS II-1, p=0,030; Cod 39, p=0.001; Cod 5, p=0,009) ve ortalama Hb A 2 değeri 3. ile en küçük değeri almıştır. TARTIŞMA Heterozigot beta talasemili olguların mutasyonları ile hematolojik parametreleri arasındaki ilişki konusunda yayınlanan çalışmalarda değişik sonuçlar bildirilmiştir. Bu mutasyonlar b polipeptid zincirlerini değişken düzeylerde düşürerek heterezigot beta talasemilerde hematolojik fenotipin, homozigot beta talasemilerde ise klinik fenotipin şiddetini oluşturur (15,16). Hafif mutasyonların daha iyi klinik seyir gösterdiği bildirilmiştir (15,1). Kırmızı küre sayısı talasemi minörlü olgularda genellikle yüksektir. Mikrositozu olan anemik bir kişide 5 milyon/mm 3 üzerinde KK sayısının b-talasemi minor için uyarıcı olduğu kabul edilmektedir (1,19). Olgularımızda KK sayılarının 3.33.14x10 12 /L arasında ve ortalama 5.46x10 12 /L bulunması bu bilgileri desteklemektedir. Yüksek sayıda olmalarına karşın KK ler küçük ve Hb içeriği düşüktür. İki olgu dışında (1 olgu Cod 39, 1 olgu Cod 5) olgularımızın tümünde OEH ve OEHb değerleri normalin altında bulunmuştur. Ortalama OEH 63.3 fl (50 9.32 fl), OEHb ise 20.43 pg (16.4-32. pg) olarak bulunmuş olması her iki parametrenin toplum taramalarında güvenilir bir yardımcı kriter olduğunu göstermektedir. Bir diğer parametre olan retikülosit sayısının Hb düzeyi ile korelasyon gösterdiği öne sürülmüştür (20). Ancak çalışmamızda böyle bir ilişki kurulamamıştır. Demir eksikliği ile talasemi mi- 26

norun ayrımında RDW nin %16 nın üzerinde olmasının demir eksikliği lehine olduğunu ileri süren yazılar olmasına rağmen olgularımızın 35 inde (% 41) RDW bu değerin üzerinde, ortalama % 16.63 (, 34,1) bulundu (21). RDW değerindeki bu oran demir eksikliğine de bağlı olabilir. Ancak olgularımız demir eksikliği yönünden değerlendirilmedi. Hb elektroforezinde nin yüksek olması talasemi minör için esas tanısal özelliktir. Çalışmamızda iki olgu dışında tüm değerleri normalden yüksek bulunmuştur. Olgularımızın Hb A2 düzeyleri % 2. ile %.1 arasında ortalama % 4.96 idi. düzeyi ile mutasyon tipi arasında ilişki olabileceği bildirilmiştir (). Bizim çalışmamızda da ağır mutasyon tipine sahip olguların değerleri daha yüksek olarak bulunmuştur (Tablo 2). Heterozigot bireylerdeki artışının nedeni tam olarak bilinmemekle birlikte birkaç faktör ile ilişkili olabileceği düşünülmektedir; a zincirlerin normalde b zincirleri ile d lara göre daha kolay bağlandığını ancak b eksikliğinde büyük bir olasılıkla a zincirlerinin d zincirleri ile bağlanma olasılığının artacağı ve bundan dolayı artışı gözlenebileceği şeklinde yorumlanmıştır (22). Ortamdaki b zincir miktarı azaldıkça diğer bir ifade ile talasemi formu ağırlaştıkça serbest kalan a zincirleri daha fazla sayıda d ile birleşecek ve böylece düzeyi de ağır mutasyon tiplerinde daha da yüksek olacaktır. Bunun gibi birçok varsayımın öne atılması d -globin zincir üretim regulasyonunun b talasemideki karmaşıklığını göstermektedir. İki olguda olduğu gibi Hb A2 düzeyi normal olabileceği de akılda tutulmalıdır. Heterozigot talasemi olgularında Hb A2 gibi Hb F düzeyleri de mutasyon tiplerine göre farklılık göstermektedir. Çalışmamızda Hb F değerleri b 0 grubunda daha yüksek olarak bulunmuştur (p=0.044). Literatürde % 0-14 arasında bildirilmiş olan Hb F düzeyleri olgularımızda % 0-,9 arasında ortalama % 2,64 bulunmuştur. Önceki çalışmalarla (23,24) benzer olarak olgularımızın yarısı normal değerlerde diğer yarısı ise hafif yükseklikte Hb F değerlerine sahip olarak bulunmuştur. Macaulay (24) çok az olgunun %4-15 arasında bir değerde Hb F düzeyi içerdiğini bunların ise b talasemi ile birlikte HPFH (hereditary persistence of fetal hemoglobin) genine de sahip olmasından dolayı olduğunu ileri sürmüştür. Çalışmamızda 6 olgumuzda Hb F % 4 ün üzerinde bulunmuştur. Olgularımız HPFH açısından araştırılmamıştır. Bu yükseklik HPFH ye de bağlı olabilir. Nitekim b 0 ve b + mutasyon tipine sahip iki talassemi taşıcısı bireyde Hb F değerleri sıra ile 24.2 ve 26.2 olarak bulunmuş ve bu olgular HPFH olarak düşünülmüş ve çalışmaya alınmamıştır. Ancak altı Hb F yüksekliğinin altısının da b 0 mutasyon tipini taşıyan olgularda görülmesi b 0 olgularında Hb F in mutasyon tipi ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Beta talasemi heterozigotlarında Hb F in mutasyon tipleri ile ilişkili olduğunu bildiren bazı çalışmalar da yayınlanmıştır (25,26). Hb F in etnik kökenlere göre de farklılık gösterebildiği unutulmamalıdır. Sonuç olarak gerek önceki çalışmalar gerekse bizim çalışmamızdaki veriler değerlendirildiğinde beta talasemi taşıyıcılarında genotipin fenotip üzerindeki etkisinin kaçınılmaz olduğu düşünülebilir. Ancak konu ile ilgili çok merkezli geniş çalışma grupları ile yapılacak araştırmalara gereksinim vardır. KAYNAKLAR 1. Oner R, Birben E, Acar C et al. Molecular analysis of Turkish beta-thalassemia heterozygotes with normal levels. Hemoglobin 2000; 24(3):195-201. 2. Moi P, Faà V, Marini MG et al. A novel silent beta-thalassemia mutation in the distal ACCC box affects the binding and responsiveness to EKLF. Br J Haematol 2004; 126:1-4. 3. Maragoudaki E, Kanavakis E, Trager-Synodinos J et al. Molecular, haematological and clinical studies of the -101 C->T substitution in the β-globin gene promoter in 25 β-thalassaemia intermedia patients and 45 heterozygotes. Br J Haematol. 1999; 10:699-06. 4. Thein SL. Is it dominantly inherited beta thalassaemia or just a beta-chain variant that is highly unstable? Br J Haematol 1999; 10(1):12-21. 2

5. Thein SL. Structural variants with a beta-thalassemia phenotype. In: Steinberg MH, Forget BG, Higgs DR, Nagel RL, eds. Disorders of Hemoglobin: Genetics, Pathophysiology, and Clinical Management. Cambridge,UK: Cambridge University Press, Cambridge, UK; 2001; 342-355. 6. Rund D, Filon D, Strauss N, Rachmilewitz EA, Oppenheim A. Mean corpuscular volume of heterozygotes for beta-thalassemia correlates with the severity of mutations. Blood 1992; 9:23-43.. Skarmoutsou C, Papassotiriou I, Traeger- Synodinos J et al. Erythroid bone marrow activity and red cell hemoglobinization in iron sufficient beta-thalassemia heterozygotes as reflected by soluble transferrin receptor and reticulocyte hemoglobin in content. Correlation with genotypes and Hb A(2) levels. 2003; :631-6.. Cavdar AO, Arcasoy A. The incidence of ß-thalassemia and abnormal hemoglobins in Turkey. Acta Hematol 191; 45(5):312-. 9. Oner R, Altay C, Gurgey A, Aksoy M et al. Beta-thalassemia in Turkey. Hemoglobin 1990; 14(1):1-13. 10. Aulehla-Scholz C, Basaran S, Agaoglu L et al. Molecular basis of beta-thalassemia in Turkey: Detection of rare mutations by direct sequencing. Hum Genet 1990; 4:195-. 11. Akar N, Cavdar AO, Dessi E, Loi A, Pirastu M, Cao A. Beta thalassaemia mutations in the Turkish population. J Med Genet 19; 24(6):3-9. 12. Tadmouri GO, Başak AN. β-thalassemia in Turkey; A review of the clinical epidemiological molecular and evolutionary aspects, Hemoglobin 2001; 25(2):22-239. 13. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N et al. Analysis of any point mutations in DNA. The amplification refactory mutation system (ARMS). Nucleic Acid Res 199; 1:2503-16. 14. Sanger F, Coulson AR. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol 195; 94:441-46. 15. Rosatelli C, Leoni GB, Tuveri T et al. Heterozygous beta-thalassemia: relationship between the hematological phenotype and the type of beta-thalassemia mutation. Am J Hematol 1993; 42(4):40. 16. Cao A, Galanello R, Rosatelli MC. Genotype-phenotype correlations in beta-thalassemias. Blood Rev 1994; (1):1-12. 1. Vrettou C, Kanavakis E, Traeger-Synodinos J et al. Molecular studies of beta-thalassemia heterozygotes with raised Hb F levels. Hemoglobin 2000; 24(3):203-20. 1. Schrier, Stanley L. 5 Hematology, IV Hemoglobinopathies and Hemolytic Anemias, ACP Medicine Online, Dale DC, Federman DD, Eds. WebMD Inc. New York, 2000. 19. Beyan C, Kaptan K, Ifran A. Predictive value of discrimination indices in differential diagnosis of iron deficiency anemia and beta-thalassemia trait. Eur J Haematol 200; (6): 524-6 20. Mazza U, Saglio G, Cappio FC, Camaschella C, Neretto G, Gallo E. Clinical and haematological data in 254 Cases of β-thalassemia trait in Italy. Br J Haematol 196; 33(1):91-9 21. Demir A, Yarali N, Fisgin T, Duru F, Kara A. Most reliable indices in differentiation between thalassemia trait and iron deficiency anemia. Pediatr Int 2002; 44:612-6. 22. Huisman THJ, Carver MFH, Baysal E. A Syllabus of Thalassemia Mutations. 199; p 309. published by The Sickle Cell Anemia Foundation in Augusta, GA, USA. 23. Pootrakul, P, Wasi P, Na-Nakorn S. Hematological data, n 312 cases of β-thalassemia trait in Thailand. Br J Haematol 193; 24:03. 24. Knox-Macaulay HH, Weatheral DJ, Clegg JB, Pemprey ME. Thalassemia in the British. Br Med J 193; 3(52):150-5. 25. Lemsaddek W, Picanço I, Seuanes F et al. Spectrum of beta thalassemia mutations and HbF levels in the heterozygous Moroccan population. Am J Hematol. 2003; 3(3):161-. 26. Kutlar A, Kutlar F, Gu LG, Mayson SM and Huisman TH. Fetal hemoglobin in normal adults and β-thalassemia heterozygotes. Hum Genet 1990; 4(1):106-10. 2