KATI FAZ EKSTRAKSIYONU Kadir ARISOY Ahmet ŞENER C.B.Ü. FenEdeb.Fak., Kimya Böl., MANİSA Y.Y.Ü. FenEdeb.Fak., Kimya Böl., VAN ÖZET Bu makalede katı faz ekstraksiyonuyla ilgili bilgiler derlenmiştir. Katı faz ekstraksiyonunun tanıtılması, amaçları, gelişmesi, prensipleri ve seçilmiş örnekler üzerinde uygulamaları sunulmuştur. DISPOSABLE KROMATOGRAFİ (TEK DOZLUK KROMATOGRAFİ) Çeşitli kromatografi tekniklerinin ve analitik spektrometrelerin kullanılışından bu yana, son 1020 senedir teknolojik gelişmelerdeki aşırı hız şaşırtıcıdır. Gelişmiş alet kullanımı, otomatik örnekleyiciler, yayınlanmış analizler, daha hızlı veri değerlendirilmesi verimliliği artırmakta ve fiyatları düşürmektedir. Analitik aletler kullanılmadan önce örnekler analiz için hazır hale getirilmek zorundadır. Bu işlem genellikle zor ve zaman alıcıdır. Katı faz ekstraksiyonu (SPE), hazırlık basamaklarını daha hızlı, daha kolay ve daha otomatikleşebilir yapar. Bu metod bilimsel gelişmeye büyük katkı sağlamıştır (1). KATI FAZ EKSTRAKSİYONUNUN AMAÇLARI Örnek, analizden önce tanınmasına, ölçülmesine ihtiyaç duyulmayan bileşenlerden temizlenmelidir. Daha sonra ise analize uygun şekle çevrilmelidir. Bir fabrikanın çıkış borularından toplanan bir numuneyi ele alalım; Sulu ve analiz edilmeleri gereken eser halde yağ ve gres ihtiva eden örnekteki alg ve yosunlar uzaklaştırılmalıdır. Ayrıca örnek, ihtiyaç duyulan analiz metodu için freon13 gibi bir çözücüde hazırlanmış olmalıdır. Daha sonra örnek deriştirilmelidir. Deriştirme işlemi çevreyle ilgili ölçümlerde veya insanda yapılan analizlerde çok kritiktir. Her iki durumda da ölçümlerin örnek zenginleştirilmeden yapılması gerekir. Bunun için spesifik ve duyarlı metotlar gereklidir. KATI FAZ EKSTRAKSİYONU (SOLID PHASE EKSTRACTION, SPE)'NUN GELİŞMESİ 1978 yılına kadar çözücü değiştirme, örnek deriştirme ve örnekten arzu edilmeyen bileşenlerin uzaklaştırılması için sıvısıvı ekstraksiyonuna ihtiyaç duyulmaktaydı. Örnek, karışmayan çözücülerle bir ayırma hunisinde elle sallanmakta ve ayrılmaktaydı. Bu işlem kişilerin becerilerine bağlıydı. Ayrıca tehlikeli çözücüler de sık sık kullanılmaktaydı. Bütün bunlara karşın çok ta seçici değildi. Sıvısıvı ekstraksiyonunun diğer dezavantajları, sallama ile oluşan ve ayrılması zor emülsiyonlar, tek dozluk atıklar ve çeşitli cam madde ihtiyacıdır. Kullanılan iki sıvının birbiri içinde çözünmemesi gerekir. Bu ise kullanılabilecek çözücü sayısını sınırlar. Örneğin, metanol, ekstraksiyon için ideal bir çözücü olabilir. Fakat su ihtiva eden özel bir örnekte iki ayrı sıvı faz teşkil etmek yerine karışabilirler. Sıvıkatı ekstraksiyonu olarak bilinen SPE'nin dezavantajları daha azdır. Organik fonksiyonel grupların bağlandığı genellikle poröz silikadan ibaret katı yüzey, taşıyıcı faz olarak kullanılır. Bazı bileşenler bu katı yüzey üzerinde alıkonulabilirler (2). Bu olay sıvısıvı ekstraksiyonundakine eşittir. Ama daha seçici ve inceliklidir. Bir çözücüde çözünürlük ve çözünmezlik sıvısıvı ekstraksiyonunda kullanılan özelliklerdir. Katı faza kimyasal bağlanma sıvısıvı ekstraksiyonundaki olayla karıştırılmamalıdır. SPE çözünmezlik ihtiyacını elimine eder. İlaveten, destek katısı molekülün ölçülerini zorlayarak onu ekstrakte edebilir. Eğer destek katısı poröz ise ve molekül, gözeneklere girmek için büyükse zorlukla alıkonulabilir. Böyle durumlarda büyüklükler karşılaştırılmalıdır. Çoğu organik molekül, çevreleriyle hidrojen bağı, dipolar etkileşmeler veya elektrostatik (iyonik) çekim gibi birkaç farklı yolla etkileşebilir. Bu etkileşmelerin mekanizmaları Şekil1'de gösterilmiştir. Katı faz bağlama sürecinin dikkatlice incelenmesiyle, bu etkileşimler, belirli bir bileşikler dizisi için bu yüzeye özel bir ilgi vermek üzere hassas bir şekilde ayarlanabilir. Birçok yollarla bu sıvı kromatografinin ayırıcı gücünü ve sıradan hazırlama tekniklerinin hızını, örnek hazırlama aşamasına getirir.
Çevre Dergisi Silika Temel Van cici Waak Kuvvetleri Silika Temci Bağlanmış Fonksiyonel Grup ( C8 ) HPLC de otomatik olarak kullanılmak üzere on kartuşlu kasetler üretildi. Laboratuvar robotları için kartuşlar da hizmete sunuldu (Zymate Systame, Zymark Corp., Massatchussets). Bir havana dökülen hacimli absorban, hem ilgilenilen bileşikler için bir absorplayıcı olarak hem de katı örneklerin öğütülmesi için bir aşındırıcı olarak kullanılır. Bu alanda en heyecan verici gelişmelerden biri Empore firmasının ürettiği ekstraksiyon diskidir. Bu disk PTFE liflerinden dokunmuş kumaş içinde silika partikülleri içermektedir. Ortaya çıkan SPE diski, bir süzücü diskin birçok fiziksel özelliğine ve görünüşüne sahiptir. Fakat bir sıvı örneğinden sadece fiziksel değil aynı zamanda kimyasal bir esasa dayalı olarak bileşikleri ayırdetme yeteneğine sahiptir. Örnek Dipolar Çekim veya Hidrojen Bağı Adaptör V r '"" \ ' ' j 1.. Ar.aiitichetr, Bone: Eiuî [ ji EksıraksJyor. J.VÛİOİH! KH l 'Örnek / T. Anaiitichem Bond Elin Ekstraksivor. Kolonu Siiika Temel Elektrostatik Çekim Örnek Analiliclıem Rond Etııt Ekstraksiyon Kotontı Santrifüj Tüpü OCON(CH 3 ) 2 Şekil1: a) Nonpolar çekimler b) Polar çekimler c) İyonik çekimler KATI FAZ EKSTRAKSİYON KARTUŞU NEDİR? 1978 yılında VAKIAN firması kimyasal bağlı, birkaç yüz miligram silika içeren tek dozluk kartuşları üretti. Ekstraksiyon birimi, içinde absorplayıcı bulunan üstü açık bir şırınga kabı şeklindedir ve bir örnek rezervuarı olarak hareket eder. Bu birim, örneği, absorbanın üzerine göndermek suretiyle kullanılabilir (Şekil2) veya şekildeki gibi bir düzenekle vakum uygulanır. İlk kartuşlar Bond Elute kartuşlarıydı. Ondan sonra çeşitli tiplerde kartuşlar ortaya çıktı. Şekil2: Örneklerde pozitif basınç kullanılması SPE'NlN PRENSİPLERİ En yaygın karşılaşılan SPE absorbanı, yüzeyi bir organik moleküller tabakasıyla kaplanarak modifiye edilmiş poröz silika (SiC>2 jeli) esası üzerine kurulmuştur. Silika yüksek derecede polardır ve suyla çok iyi ıslanır, higroskopiktir ve sık sık ılımlı bir su çekici olarak kullanılır. Bununla beraber silika, üzerine hidrofobik materyal bağlamakla etkili bir şekilde su geçirmez olmaktadır. Ördek tüylerinde bulunan ve onun ıslanmasına engel olan silikon muhtevalı bir orga TEMMUZAGUSTOSEYLUL 199 SAYI: 12
nik bileşik, silika üzerine bu amaçla bağlanmıştır. Bu şekilde hazırlanmış absorbanı, bu bileşiği.sudan ekstrakte etmekte kullanmak için sulu numuneyle etkileşmeye hazırlamak gerekir. Bu iş genellikle absorban yatağı içinden metanol veya benzer bir çözücü geçirmekle yapılır. Metanol, bağlanmış organik tabakaya nüfuz ederek su ve diğer moleküllerin absorbanın yüzeyine temastan ziyade bağlı faz içine diffüzyonunu sağlayacak bir ortam hazırlar. Bir defa etkileşmeye hazır hale getirildikten (şartlandırıldıktan) sonra fazla çözücü su veya örneğe benzer bir sıvıyla yıkanarak uzaklaştırılır. Bir numune şartlandırılmış kolona tatbik edilir ve vakum yardımıyla kolondan geçirilirse bu esnada, numunede bulunan diğer maddeler (matriks) den ziyade absorbanla daha kuvvetle etkileşen türde maddeler yüzeyde tutulmaya meylederler. Daha karmaşık ekstraksiyonlarda, numunenin uygulandığı şartlarda absorban üzerinde kalabilen yabancı maddeleri, uygun çözücüler kullanarak yıkama ile uzaklaştırmak mümkündür. Vakum, absorbam kurutmak için örneğin tatbikinden sonra da de ŞARTLANDIRMA İlgilenilen bileşiğin tutulmasını sağlamak için, örnek uygulanmadan önce absorbanın çözücü ile yıkanması YIKAMA A İstenmeyen bileşiklerin kolondan /ikama ile uzaklaştırılması Şekil3: Katı faz ekstraksiyonunun temelleri V V ALIKOYMA 9 Adsorplanmış hedef bileşik İstenmeyen matris bileşenleri A Diğer arzu edilmeyen matris bileşik ÇÖZEREK ALMA Geride kalan, istenmeyen bileşikler Temizlenmiş ve deriştirilmiş analiz için hazır haldeki bileşikler vam ettirilebilir ve böylece son ekstraktm arzu edilmeyen sudan kurtulması sağlanır (3). Bir toplama kabı vakum manifolduna bağlanarak yerleştirilir ve birkaç mililitre AcOEt gibi bir organik çözücü tatbik edilir. Absorbandan geçen çözücü daha sonra ya doğrudan doğruya bir analitik cihaz içine enjekte edilir veya farklı bir ortamda tekrar çözmek üzere kuru azot akımıyla kurutulur. Buna benzer bir işlem, içme suyundaki dioksan seviyesini, ölçmek için kullanılmaktadır. U.S. EPA'nın dioksanın toksisitesini ve insan sağlığı bakımından risklerinin tahmin ve değerlendirilmesi, basit ve hızlı bir metotla yapılmaktadır (metot513). Bu işlemlerde Empore katı faz ekstraksiyon diskleri kullanılmıştır. SPE işleminin şematik bir gösterimi Şekil3'te verilmiştir. KROMATOGRAFİNİN ÖRNEK HAZIRLAMA BASAMAĞINA GETİRİLMESİ Ekstraksiyonun ana konuları, yani örnek yoğunlaştırılması (deriştirilmesi) ve çözücü kullanım ve israfını, işlemciye bağlı hatayı, canı malzemeye ve temizliğe harcanan para ve zamanı azaltmaya da yardım eder. Hedefleri büyük ölçüde ekstraksiyonla sınırlandırma da mümkündür. Mesala bir lipit karışımındaki komponentleri ayırmak için sık sık bir aminopropil bağlı faz kullanılır. Bir lipit karışımının gliserid, fosfolipit, kolesterol, yağ asidi ve diğer sınıflar gibi bütün fraksiyonları tek bir faz üzerinde ayrıştırılabilir (). Bu işlem Şekil ve Tablo1, Tablo2 ve Tablo3'te izah edilmektedir. Bu işlem, her bir sınıfın bağlı fazla hidrojen bağı yapma yeteneklerinin farklılığından dolayı meydana gelir. Bu nedenle, monogliseritler (iki hidroksil gruplu) absorbana bağlı bir hidrojenle bir digliseritten (bir hidroksil gruplu) veya bir trigliseritten (serbest hidroksil yok, sadece ester bağının polarlığıyla zayıf bir polar etkileşme mümkün) daha kuvvetli bir etkileşim yapabilir. Numuneyi aminopropilli bir kolona tatbik edip, daha sonra her bir fraksiyonun hidrojen bağı yapma ihtiyacını artan şekilde sağlayabilen çözücü karışımlarıyla kolonu yıkamakla, orijinal karışımın bileşenleri, her bir yıkamada kantitatif olarak ekstrakte edilebilir. Bü
Çevre Dergisi tün bunlar pahalı HPLC ekipman veya narin HPLC kolonlarına ihtiyaç duyulmaksızın yapılır. Ayırma işlemi çabuk, basit ve dikkat çekecek kadar sıhhatlidir. SPE merhem, krem esaslı parfüm ve ilaçlarda ve tabii ürünlerde kapsamlı olarak kullanılmaktadır. O OÜR RCOOH YAĞ ASİTİ OCR po o RCO?0 i H FOSFOLİPİTLEH f? R O KOLESTEROL DİCLİSERİT TRİCLİSERİT O OCR MONOGLlSERİT R 1 22 KARBON KOLESTERİL ESTER *2* Çözücü B l Çözücü A i SON GELİŞMELER Bir örnekle bir tür etkileşme gösterebilen bazı bağlı fazlar, diğerleriyle daha az güçlü ama yine de önemli etkileşmeler gösterebilir. Bir misal, kuvvet katyon değiştirici veya SCX sorbenttir. Fonksiyonel grup, inorganik ve organik katyonlarda değiştirme kabiliyetinde olan bir sülfonik asit anyonudur. Bağlı fazın seçiciliği veya iyonu bir diğerine tercihinin incelenmesi gösterir ki; Bağlı faz organik katyonları inorganik katyonlardan daha kuvvetle alıkoyar. Bu, sülfonik asit fonksiyonel gruplu, benzenden türemiş SCX fazının rasgele hidrofobik etkileşmeler yapabilme yeteneği sebebiyledir. Yani, organik katyonların bir yerine iki etkileşme mekanizmasıyla tutulabilmesinin neticesidir. Çözücü Lıpıd D E G H F B C Kolesteril Ester Trigliserit Digliserit Monogliserit Serbest Yağ Asidi Fosfolipitler Yeıliden Elde No. Kontaminasyon No. Edi ImcYüzdesi Yüzdesi 98.9±.7 98.±5.3 96.1+.9 96.7+2.5 1001.1 101.±7.8 97.3±5.3 20 16 7 17 12 8 1.16±0.92 2.03±1.78 Eser Eser 1.13+0.7 1.96 1.15 5 7 2 2 Çözücü H l ü> Kurutma 0> Hekzan Saklanır NH,(2) ;ı ir fiti) Saklanır \ ir ( c J Saklanır l Çözücü G \ l Çözücü F ir ir ir <M ] Saklanır C C ) S>kl "" r C : CE : Kolesteril Ester MG : Monogliserit DG : Digliseril TG : Trigliserit FA : Yağ Asidi PL : Fosfolipit Şekil: a) Plazma lipitleri ve dokusunun temel yapıları b) Lipit sınıflarının ayrılması Tablo 1: Bond Elut Prosedürü İle Lipid Sınıflarının Saf Bir Şekilde İzole Edilmesi. Bu, bizi karışık modlu (hidrofobik ve iyon değiştirici) bağlı fazları gelişmesine götürür. Cocain / benzoilecgonine'in ekstraksiyonu karışık modlu ekstraksiyona tam bir örnektir (5). Zarar verici maddeler ihtiva ettiği zannedilen bir ürün numunesi önceden şartlandırılmış bir karışık modlu kolondan geçirilir. Bu pek sulu numunenin deiyonize su ve 0.1 M HC1 çözeltisi ile yıkanması ile işlem sürdürülür. Ta ki suda kuvvetle çözünen veya tam olarak inorganik olan türlerin (üre, tuzlar, protein, şeker v.s.) kolondan yıkanırken, drug ve metabolitin hidrofobik kuvvetlerle absorban üzerinde tutulduğu noktaya kadar sürdürülür. Daha sonra metanol tatbik edilir. Hidrofobik maddeleri çözme kapasitesindeki metanol, henüz kolonda kalan bütün tüleri çıkarır ( lipit, yağ asidi, bir miktar nonpolar peptit, kolesterol). Son olarak biraz Ct^CV izopropil alkol (NH/^OH h) artık analiti yürütmek için uygulanır. Amonyum iyonu cocain ve benzoilecgonine katyonuyla yer değiştirir ki onlar iyon değiştirici uçlarda tutulmuşlardı. Sonuç, tam ve basit yıkamadır. Bu prosedür 10 ng/ml den daha düşük kantitatiflik sınırlarında ve 0.999 korelasyon katsayılı bir lineerlikle sonuç verir (6).
Koles.Est. Trigliserit Digliserit Yağ Asiti Fosfolipit Diğer TLC Bond Elute Standart TLC 11.8 17. 19.6 0.38 19.0 31.6 17.1 19.5 22.7 0. 21.5 18.8 16.3 19.1 21.5 22.3 20.9 >35.6 >26.5 20.2 16.0 1.17 Bond Elute Standart 3.1 26.0 26.7 12.0 35.5 27.0 27.3 10.1 Tablo 2: Lipit Sınıflarının Ayrılması ve Yeniden Elde Edilmesi İçin Bond Elute ve TLC Metotlarının Karşılaştırılması. Bu gelişmenin bir sonraki basamağı, tek bir ekstraksiyon kolonuyla catecholaminlerin ve onların asidik ve bazik metabolitlerinin tayinini yapabilmelidir ve gerçekleştirilmiştir. Ekstraksiyon işlemi diğer metotlara nispeten hızlı ve basittir (7). Diğer heyecan verici gelişmeler, mevcut bağlı fazların yeni kullanım yollarının keşfini kapsar. Kuvvetli katyon değiştiriciler poli alkenleri karbonkarbon çift bağı sayılarına göre ayırma vasıtası olarak kullanılmaktadır (8). Planar cisdiolleri, amino alkolleri veya diamino bileşiklerini ekstrakte etme kapasitesindeki bir absorban fenil boronik asit fonksiyonel grubu kullanılarak geliştirildi (9). Yüksek derece polar absorbanlar kullanılarak 60 ve 70 karbonlu molekülleri ayırma işlemleri gerçekleştirildi (10). SPE'NİN GELECEĞİ SPE kullanıcıları potansiyel ekstraksiyonları meydana getirerek ve daha spesifik fazlar kullanarak ayırma güçlerinin hepsini gerçekleştirmenin henüz sadece başındadırlar. Otomasyon, analitik kimya laboratuvarlarında gittikçe daha fazla yer almaktadır. SPE, otomatik hazırlama tekniklerine çok uygundur. Birkaç ekipman parçası, kimyacının 10 ila 2 hatta daha fazla numuneyi tek defada işlemesine imkan sağlar. Bu durum numune hazırlama basamağını otomatik örnek inceleyicisinin hızına uygun hale getirir. Son olarak, santrifüjün ekstraksiyonda kullanılması, her bir ekstraksiyon için standart sapmaların düzgünleşmesi ile neticelenmiştir. Çünkü kolon içindeki akış, 20002005 rpm ye duyarlı bir santrifüjle, 115 in Hg'lık vakumlarda çalışan bir vakum manifolduyla yapılandan daha hassas bir şekilde kontrol edilebilir. SPE tamamlayıcı bir teknik olarak kullanıldığı zaman, süper kritik akışkan kromatografisinin, mevcut az sayıda örneği sınıflandırma ve sıvı örnekleri tam olarak inceleyememe kusurlarını yenmede pekala yardım edebilir. Adı Çözücüler Kullanılan Yağlı Lipit Çeşidi Miktar Ekstr.Mik. A 2:lKloroform:2Propanol.07 ml ml Bütün nötral lipitler B Dietil eter içinde %2'lik 2.86 ml asetik asit C Metanol 5.1 ml D Hekzan 0.01 ml ml ml Yağ asitleri Fosfolipit esterleri E %ldietüeter%10metilen 0.37 ml 8mL Trigliserit kloriir(hekzanda) F %5'lik etil asetat 0.315 8mL+mL 16mL+mL (hekzanda) G %15'lik etil asetat 0.616 ml 8mL Digliserit (hekzanda) H 2:1 kloroform:metanol.3 ml ml Monogliserit Tablo 3: Bond Elute ile Lipit Sınıflarının İzolasyon ve Temizlenmesinde Kullanılan Çözücüler. SONUÇ Şimdilerde bazı araştırıcılar sadece pahalı bir analitik enstrumunla değil, SPE esaslı, geliştirilmiş bir ekstraksiyonla da düşük pg/ml seviyesinde LSD'yi arıyorlar (11,12). İlaçların zararı ve tedavileri ile kirlilik kontrolü üzerinde hassasiyet arttıkça, bilinmelidir ki, örnek hazırlamada SPE, hızı ve düşük kantitatiflik sınırı nedeniyle çokça kullanılacaktır. ABSTRACT The knowledge is collected about the solid phase extraction process. The giving information for SPE and also knowledge of aims, developments and principles of SPE were presented on chosen samples. KAYNAKLAR 1. Van Horne, K.C., Ed., "Handbook of Sorbent Extraction Technology" Analytichem International, Harbour City, CA, (1985). 2. Long A.R.,et.al., J. Liq. Chromatogr. 12 (19), 16011612, (1989). 3. Alfred A. and Eichelberger J.W., "Methods for the Determination of Organic Compounds in Drinking Water (Supplement 1)", Env. Monitoring Systems Lab., U.S.EPA, Cincinnati, OH, 3363, (1990).. Kaluzny, M.A., et.al., J.Lipid Res., 26, 13510, (1985). 5. "Ekstraction of cocaine and benzoylecgonine from urine using Bond Elute Certify", Analytichem Application Note M797 (Vanan Sample Preparation Products, Harbour City), (1990). 6. Johnson, K. and Uhrich M., "Benzoylecgonine: Identification and Quantitation with ITS 0", Finnigan MAT Corp.San Jose, CA, (1990). 7. Dixit V. and Dixit V. M., "Sample preparation for the analysis of catecholamines and their metabolites in human urine", J.Liq.Chrom., 1 (1), 27792800, (1991). 8. Christie W.W., J.Lipid Res., 30, 171173, (1989). 9. Schmid, R. and Pollak A., "Proceedings of the Second Annual International Symposium on Sample Preparation And Isolation Using Bonded Silicas", Analytichem International Inc., Harbour City, CA, (1985). 10. Burke, M., Dept.of Chemistry, Univ. of Arizona, Tucson (Private Conversation). 11. Schep, R.A., Submitted to J.Anal.Tox., (1991). 12. Simpson, N., "Solidphase extraction", Int. Chromatog. Lab., Vol:ll,713, (1992).