1. KROMATOGRAFİ Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve saflaştırılması yöntemidir. İlk kez Rus botanikçi Mikhail Semyonovich Tsvet (1903) tarafından bitki pigmentlerinin renk ayrımında kullanılmıştır. Kullandığı kolonda renkli bantlar oluştuğu için bu ayırma yöntemine kromatografi demiştir. Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır. a. Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir "katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından" oluşur. b. Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur. c. Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide "yüzey tutunması veya adsorpsiyon" ile "çözünürlük" olguları temel etkileşim türlerini oluştururlar. Şayet sabit faz bir "katı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz arasında "yüzey tutunması (adsorpsiyon)" etkileşimi gerçekleşir. 1.1. Kromatografinin Sınıflandırılması 1.1.1. Ayrılma Mekanizmalarına Göre, Adsorpsiyon Kromatografisi Partisyon Kromatografisi İyon Değiştirme Kromatografisi Jel Filtrasyon (Moleküler Eleme) Kromatografisi İyon Çifti Kromatografisi Afinite Kromatografisi 1.1.2. Uygulama Biçimine Göre Düzlemsel Kromatografi Kağıt Kromatografisi İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) Kolon Kromatografisi Gaz Kromatografisi (GC) Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) 1.1.3. Faz Tiplerine Göre Sıvı Kromatografisi Sıvı-Katı Kromatografisi
Sıvı-Sıvı Kromatografisi Gaz Kromatografisi Gaz-Sıvı Kromatografisi Gaz-Katı Kromatografisi 2. GAZ KROMATOGRAFİSİ Gaz kromatografisi, bir karışımda gaz halinde bulunan veya kolayca buharlaştırılabilen bileşenlerin birbirinden ayrılması için kullanılan yöntemdir. Bu yöntemde ayrılma, bileşenlerin farklı katı yüzeylerdeki farklı adsorpsiyon ilgilerine göre gerçekleşir. Numunede bulunan bileşenler bir cihazla spektrum haline getirilir ve bu spektrumda bulunan her pik ayrı bir bileşeni gösterir. Gaz Kromatografisi Cihazı genel anlamda 5 bölümden oluşmaktadır. I. Enjeksiyon II. Enjeksiyon Bloğu III. Fırın ve Kolon IV. Dedektör V. Sinyal kaydedici ve Gazlar I. Enjeksiyon Numunenin hazırlanıp enjeksiyon bloğuna gönderilmesi işlemine denir. İki tür enjeksiyon yapılmaktadır. a. Manuel Enjeksiyon: Numunenin, enjeksiyon bloğuna elle gönderilmesi işlemidir. Gerek enjeksiyon miktarının doğru ayarlanamamasına, gerekse alıkonma zamanındaki kaymalara sebep olabileceği için oldukça kullanışsız bir yöntemdir. b. Otomatik Enjeksiyon: Analizi yapılması istenen numunelerin 2 veya 20 ml lik vaillere koyularak otomatik sıvı örnekleyicilerle (autosampler, headspace sampler) enjeksiyon bloğuna gönderilmesi işlemidir. Alıkonma zamanındaki ve enjeksiyon miktarındaki sapmalar minimumdur. Kalibrasyon çalışmalarında yüksek verim elde edilir. II. Enjeksiyon Bloğu Analizi yapılan organik bileşiğin, manuel enjeksiyon veya otomatik sıvı örnekleyicilerle enjekte edildiği yerdir. Numune burada gaz haline geçerek taşıyı gaz vasıtasıyla kolon içerisine yönlendirilir. Enjeksiyon bloğunun sıcaklığı, numunelerin gaz
haline geçtiği sıcaklığa göre ayarlanmalıdır. Bu sıcaklık da genel olarak 200 o C nin üzerindedir. Enjeksiyon bloğunda önemli olan diğer bir husus da, enjekte edilen numunenin ne kadarının kolona yönlendirileceğidir. Yüksek konsantrasyonlu numuneler için split modu kullanılırken, enjekte edilen numunenin tamamının yönlendirilmesi için ise splitless modu kullanılır. Enjeksiyon bölümü fırın içerisindedir. Ancak ayrı bir ısıtma sistemi ile ısıtılır. Sıcaklık ölçümü ve kontrolü thermocoupel kullanılarak yapılır. Enjekte edilecek maddelerin türüne göre sıcaklık -50 ile 400 C olarak ayarlanabilir. III. Fırın ve Kolon Fırın: Gaz kromatografisinin en önemli bölümlerindendir. Kolonun sıcaklık değişimini sağlamakla görevli olup; sıcaklığı kolonun sıcaklık kapasitesiyle uyumlu olarak 300-350 o C ye kadar çıkarabilmektedir.
Kolon: Numunenin, yürütücü faz yardımıyla ayrışmasını sağlayan, bu ayrışmaları belli fiziksel özelliklere göre sıralayan (örneğin molekül ağırlığına göre) özel dolgu maddeleriyle kaplı kılcal boru sistemidir. Gaz kromatografisinde kullanılan kolonlar bakır, alüminyum, nikel, paslanmaz çelik ya da cam olabilir. Ancak cam kolonlar, kırılgan olmaları ve cihaza bağlanma zorlukları gibi dezavantajlara sahip olmalarına karşın inert olmaları bakımından daha çok tercih edilir. Özelliklerine göre kapiler ve dolgulu kolon olmak üzere ikiye ayrılır. Dolgu kolonlarda kolon boyu ve çapı amaca ve doldurulacak sabit faza göre seçilir. Ancak birçok yapımcı firma ortak standart çap ve uzunluklarda kolon imal etmektedirler. Genellikle kolon boyları 1-2-4 metre, iç çap 1/4, 1/8 inç, dış çap ise 2-4 mm olarak standardize edilmiştir. Kılcal kolonlarda kolon boyu 5-100 m arasında olup, iç çap da 0.32-0.53 mikrometre arasındadır. Bu kolonlar doğrudan cam yerine özel koşullarda hazırlanmış fused silica adı verilen camlardan yapılmaktadır. IV. Dedektör Kolondan gelen organik bileşiklerin tür ve miktarının belirlenmesine önemli rol oynamaktadır. Detektör kullanım amacı, kolondan gelen gazın kompoziyonunu incelemektir. Elektronik bir aygıt olan detektör, sensörleri yardımıyla sürekli olarak hareketli fazı izleyip sürekli bir sinyal oluşturur. Bu elektronik sinyal bir yazıcı veya bilgisayarda baseline ( temel çizgi ) olarak kaydedilir. Zamana karşı elekronik sinyaldeki değişimin çiziminden madde miktarını veya derişimini veren kromatogram adı verilen grafik elde edilir. Numunenin hassasiyetine göre çeşitli dedektörler mevcuttur. Yaygın olan dedektörleri şu şekilde sıralayabiliriz; o Katarometre o Alev İyonlaşma Dedektörü
o Elektron Yakalama Dedektörü o Termoiyonik İyonizasyon Dedektörü o Alev Fotometrik Dedektör o Fotoiyonizasyon Dedektörü o Atomik Emisyon Dedektörü o Helyum İyonizasyon Dedektörü o Elektrokimyasal Dedektörler o Kütle Spektrometresi Dedektör Tipi Uygulanabilir Örnekler Hassasiyet (Algılama) Termal iltkenlik (TCD) Alev iyonizasyon (FID) Nitrojen fosfor (NPD) Elektron yakalama (ECD) Atomik emisyon (AED) Fotoiyonizasyon (PID) Kütle spektrometre (MSD) Evrensel Hidrokarbonlar N, P içeren örnekler Halojenli hidrokarbonlar Element seçici Gaz ve buhar bileşikler Ayarlanabilir örnek 500 pg/ml 1 pg/s P: 10-12, N: 10-11 (g/ml) 5 fg/s 1 pg 0.002-0.2 μg/l 0.25-100 pg Alev İyonizasyon Dedektörü (FID): Organik parametrelerin analizi için en kullanışlı dedektörler arasındadır. Duyarlılığı, tekrarlanabilirliği, hassasiyeti yüksek olup, ölü hacmi oldukça düşüktür. Organik parametrelere karşı oldukça duyarlı olmasına karşın, su, formik asit, bazı inorganik gazların (SO2, NO2...gibi) ve soygazların büyük bir bölümüne karşı oldukça duyarsızdır.
Elektron Yakalama Dedektörü (ECD): Adından da anlaşılacağı üzere elektronegavitesi yüksek olan bileşiklere karşı oldukça duyarlıdır. Bu özelliğinden dolayı oldukça popüler hale gelmiştir. ECD dedektörlerinin ölçümlerinde X ışınları referans alınmıştır. Düşük enerjili β ışını ile elektron ve iyon üretilir. Bu üretim için ilk önce gümüş sarımla absorbe edilmiş trityum kullanılmıştır. Ancak ilerleyen zamanlarda yüksek sıcaklıklara çıkma gereksiniminden dolayı 63 Ni kullanılmaya başlanmıştır. Çünkü trityum, hidrojenin radyoaktif izotopu olduğu için yüksek sıcaklıklarda kararsız hale gelmektedir. Kolondan gelen akım, bu beta üreticilerinden geçirilerek iyonlaştırılıp elektron haline getirilir. Elektronlar da akımı düşüreceğinden dolayı, oluşan sinyal kaybı ölçülüp kaydedilir. ECD dedektörü, FID dedektörü kadar yüksek hassasiyete sahiptir. Fakat çalışma aralığı FID kadar geniş değildir. Özellikle halojenli bileşiklere, peroksitlere, nitro gruplarına ve kinonlara karşı aşırı derecede duyarlıdır. Klorlu tarım ilaçlarının analizinde (pestisit, herbisit, insektisit) öncü durumdadır.
Kütle Spektrometre (MS) Dedektörü: Şimdiye kadar kullanılan dedektörler arasında, her anlamda en güçlü dedektör konumundadır. Bileşik ayrımını kütle taramasına göre yapmaktadır. Örnek, kolondan çıkarak transfer hattından geçirilip kütle spektrometresine ulaşır. Burada elektron-impact iyon kaynağı tarafından iyonlarına ayrıştırılır. Bu işlem sırasında örnek, enerjili elektronlar tarafından bombardımana maruz kalır ve elektrostatik kuvvetler molekülün elektron kaybederek iyonlaşmasını sağlar. Bu iyonlaşmadan sonra maddeler kütle/yük oranına göre sıralamaya sokulur, alıkonma zamanları belirlenir ve kütle analizörü tarafından da moleküllerin türü saptanır. En yaygın kütle analizörü, gaz haline gelmiş moleküller üzerinde yüksek elektrik alan oluşturan ve bu sayede uzun sure tutunmasını sağlayan Quadrupole dür. İyon kanı analizöründe üç tane elektrot bulunur. Merkez elektrot halka; üst ve alt elektrotlar da yarım küre şeklindedir. İyonizasyon ve kütle analizi aynı yerde gerçekleşir. Ayrılan iyonlar bir iyon dedektörüyle ölçülür. Kullanımı en yaygın olan dedektör, sürekli dinod tip bir iyon dedektörü olan elektron multiplierlerdir.
V. Sinyal Kaydedici ve Gazlar Analizin en son aşaması olup; verilerin saklanması, değerlendirilmesi ve sonuçlandırılması için gerekli olan bölümdür. Dedektörden gelen sinyallerin anlık olarak kaydedilmesi ve oluşan piklerin oluşturulan kalibrasyona göre hesaplanması sağlanır. Özel yazılımlarla desteklenen sinyal kaydediciler; metot oluşturma, sıcaklık ayarları, akış hızları vb gibi analizi etkileyen bütün parametrelerin de kontrolünü sağlayabilmektedir. Kromatografi yönteminde, hareketli faz olarak kullanılan maddeler; analizi yapılan kimyasallarla hiçbir şekilde etkileşime girmemeli, bileşiklerin yapısını bozmamalıdır. Özellikle Gaz kromatografisinde hareketli (yürütücü) faz olarak helyum ve azot gazı kullanılmaktadır. Azot gazı genellikle make up gazı olarak tercih edilmektedir. FID dedektörlerinde bu gazlara ek olarak, dedektördeki alevi yakmak için kuru hava ve hidrojen gazları kullanılmaktadır. www.insanvecevre.com