Arş. Gör. Mehmet GÜMÜŞTAŞ

Transkript

1 Arş. Gör. Mehmet GÜMÜŞTAŞ

2 Genel olarak kromatografi, çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla, sabit bir faz arasından değişik hızlarla hareket etmeleri esasına dayanır.

3 İlk defa 1906 yılında bir Rus botanikçi Tswett tarafından kullanılmıştır. Yaptığı çalışmada yapraklardaki pigmentleri ayırmayı CaCO 3 kolon ve petrol eteri kullanarak başarmıştır. Bu çalışmalardan sonra kromatografi, 1952 ve 1960 yıllar arasında hızlı bir şekilde gelişerek analitik teknikler arasında önemli bir yer almıştır.

4 Bütün sıvı kromatografik teknikleri arasında en yaygın kullanılanı dağılma kromatografisidir. Bu teknik sıvı-sıvı kromatografi ve sıvı-bağlı faz kromatografisi olmak üzere iki alt sınıfta incelenir. Sıvı-sıvı tekniğinde durgun faz katı yüzeyine fiziksel adsorpsiyonla, bağlı-faz tekniğinde ise kovalent bağlar ile tutturulur. ABSORBSİYON ADSORBSİYON

5

6 HPLC ne amaçla kullanılır? HPLC uçucu olmayan kimyasal ve biyolojik bileşenlerin ayrımı için kullanılır. Örnek olarak İlaç etken maddeler, aspirin, ibuprofen veya asetaminofen Proteinler, yumurtanın beyazı veya kan proteinleri Poimerler gibi organik kimyasallar (polisitiren or polietilen) Gıdalardaki pestisit ve vitaminler Birçok doğal bileşen, ginseng, bitkisel ilaçlar, bitki ekstraktları Sıcaklık ile kararlılığını kaybeden bileşenler, trinitrotoluen (TNT), enzimler NOT: Eğer uçucu bir bileşik ile çalışacaksak (bir gaz veya petroldeki bir hidrokarbon türevi), Gaz kromatografi sistemi tercih edilmelidir.

7 Kromatografik ayırmada maddeler birbiriyle karışmayan iki faz arasında dağılırlar. Fazlardan birine hareketli (mobil) faz, diğerine ise durgun faz (stasyoner faz) denir. Karışımdaki her maddenin hareket hızı (t R ), maddenin hareketli veya mobil faza olan ilgisine göre belirlenir. Hareketli faza daha çok ilgisi olan maddeler daha hızlı hareket ederler. Kolondan çıkan her maddenin konsantrasyon profili, pik olarak adlandırılır. Piklerin oluşturduğu tabloya da kromatogram adı verilir.

8 Bir kromatogram neye benzer? Her bir sinyal pik olarak adlandırılır B Örneğin enjekte edildiği zaman A C Zaman min

9 HPLC nin uygulanışı İlaç endüstrisini baz aldığımızda, dozaj formlarında bulunan aktif bileşenin kalite kontrolü hayati önem taşımaktadır ( ). HPLC sistemi bu aktif bileşen veya dozaj formunun içerisinde bulunan, ilacın sentezlenmesinden veya bozunmasından kaynaklanan safsızlıkların ( ) tespiti için kullanılabilir. Bu noktada yapılan kalite kontrol hastanın güvenliğini sağlamaktadır.

10 1. adım: Tabletin uygun çözücüde çözünmesi

11 2. adım: Ayrım Kolon Sabit Faz Partikülleri Bileşenlerin ayrımı kolonda gerçekleşir Kolon, çelik bir borudan oluşan içi silika jel ile doldurulmuş bir yapıdan oluşur.

12 Kolon Çözünen karışım kolona enjekte edilir. Sabit Faz Partikülleri

13 Kolon Sabit Faz Partikülleri

14 Hareketli Faz Kolon boyunca sıvının (metanol ve su karışımı gibi) hareket etmesi için bir basınç uygulanır Bu sıvı karışımına hareketli faz denir.

15 Hareketli Faz Hareketli faz, sabit faz boyunca ilerleyerek, enjekte edilen numuneyi taşımakla görevlidir. Farklı bileşenler, kolonda farklı hızlarda ilerlerler.

16 Hareketli Faz Bunun anlamı bileşenlerin kolon çıkışına farklı zamanlarda hareket etmesi demektir.

17 3. Adım: Bileşenlerin miktarlarının tayin edilmesi Bileşenler ayrıldıktan sonra, karışım içerisindeki bileşenlerin miktarlarının tayini için UV ışık kaynağından faydalanılır Işığın madde tarafından absorblanması, madde miktarı ile orantılıdır diyebiliriz Örneğin madde miktarını 2 katına çıkarırsak, madde 2 kat daha fazla ışığı absorblayacak demektir.

18 Dedektör ışığın yoğunluğunu ölçmekle görevlidir. Işık geöişindeki azalma dedektörde bir cevap oluşturur ve buna da pik denir. Detector

19 4. Adım: Bileşenlerin nicel olarak tayini Öncelikli olarak temel maddeye ait pik görülmekte Görüntüyü yaklaştırdıkça küçük pikler gözükmeye başlamaktadır.bu sinyaller safsızlıklara aittir. Hasta sağlığı açısından bu safsızlıklar belirlenen limitlerin altında olmak zorundadır.

20 HPLC sistemine genel bakış Genel olarak 5 kısımdan oluşur Pompa Enjektör Kolon Dedektör Kaydedici Bu kısımlardan bazıları çalışılacak bileşene göre değişiklik gösterebilir Agilent 1200 Infinity SK Sistem

21 HPLC sisteminin parçaları Pompa Pompanın görevi sıvının sistemde dolaşımını sağlamaktır. Dakikada akan ml cinsinden gösterilir. HPLC için normal bir akış 1-2-mL/dk aralığındadır. Maksimum 400 bar. UHPLC pompaları ile bar. Bir deney esnasında, pompa değişmeyen, sabit bir akış sağlıyorsa bu sisteme isokratik sistem denir. Fakat hareketli fazda analiz esnasında değişimler gerçekleşirse çalışılan sisteme gradient sistem adı verilir.

22 1260 Infinity Izokratik pompa Çalışma prensibi AIV: Active inlet valve OBV: Outlet ball valve

23 1260 Infinity Çoklu pompa Çalışma prensibi Damper Pump outlet Purge valve Mixer To waste Outle t Valve Mixing Chamber Outle t Valve From solvent bottle Inlet Valve Seal Piston Seal Piston Inlet Valve From solvent bottle Pump head A Pump head B

24 İzokratik Gradient ve Isokratik Koşulların Kıyaslanması Çözücü bileşimi hep sabittir Basit ayrımlar için idealdir Kalite kontrol departmanlarında sıklıkla tercih edilir. Gradient Hareketli faz bileşimi zamanla değişim gösterir. Kompleks karışımların ayrımı için idealdir. Bilinmeyen karışımlarda metod geliştirmek için tercih edilir. En yaygın kullanılan şekli doğrusal artan gradient tir.

25 Neden gradiente ihtiyaç duyuyoruz? Herbisitlerin ZORBAX StableBond-C18 kolon kullanılarak ayrımı Izokratik 70% su/30% Asetonitril 1,2 1, Kolon: 8 ZORBAX SB-C x 150 mm, 5 µm Hareketli faz: A: H 2 O 0.1% TFA, ph 2 Akış Hızı: Sıcaklık: 35 C Örnek: Not: Son pikin alıkonma süresi 70 dakikadır 8 B: Asetonitril 1.0 ml/min 1. Tebuthiuron 2. Prometon 3. Prometryne 4. Atrazine 5. Bentazon 6. Propazine 7. Propanil 8. Metolachlor Gradient 20 60% Asetonitrile/su Not: Son pikin alıkonma süresi 25 dakikadır Time (min) Time (min) Time (min) Time (min)

26 Enjektör sistemleri Enjektör: Manuel enjeksiyon valfi Genellikle enjekte edilen numune hacimleri mikrolitre (µl) arasındadır. Sistemdeki yüksek basınca dayanıklı olmalıdır. Günümüzde oto örnekleyiciler analizcilerin zaman kaybını en aza indirecek şekilde tasarlanmaktadır. Oto örnekleyici sistemi

27 Enjektör bölmesi hakkında bilinmesi gerekenler Enjeksiyon hacmi aralığı: 0.1 µl den 100 µl ye kadar enjeksiyon yapılabilir. Farklı enjektörler kullanılarak bu miktar arttırılabilir. Enjektör bölmesi: Farklı hacimdeki vialler kullanılabilir. Carryover (Bulaşma): Numunenin enjeksiyonlar arasında bulaşmasını ifade eden bir terimdir. En aza indirmek için yıkamalar yapılabilir. Numune kapasitesi: Oto örnekleyicinin plaka tipine göre değişir. Kesinlik: Enjeksiyon hacimlerinin tekrarlanabilirliğini ifade eder. Doğruluk: Kesin olarak alınan numune hacminin doğru değere yakınlığıdır.

28 Kolon bölmesi C arasında ayarlanabilmektedir. Kolon, ısıtıcı bloklar arasına yerleşir. Kromatografik sistemin kalbi olarak nitelendirilir. Ayrım, bileşenlerin fiziksel veya kimyasal özelliklerine göre gerçekleşir. Partikül boyutu küçüldükçe, uygulanan basınç artar.

29 Kolon Analizler için doğru kolon seçimini yapmak çok önemlidir. HPLC de kullanılan kolon tipleri Analitik: iç çapı (i.d.) mm; uzunluğu mm Preparatif: i.d. > 4.6 mm; uzunluk mm Kapiler: i.d mm; boyları değişkendir Nano: i.d. < 0.1 mm, ya da < 100 µm Kolon bağlantı materyalleri Paslanmaz çelik En çok tercih edilen bağlantı ekipmanı türüdür, yüksek basınca dayanıklıdır. Cam (Biomoleküller için kullanılır) PEEK polimer (Baınca daha az dayanıklıdır fakat kullanımı daha pratiktir.)

30 Kolon partikülleri Kolonlar genellikle poroz silica partikuller ile doldurulurlar En cok kullanılan ebatlar 5 μm, 3.5 μm, ve 1.8 μm Yüksek basınç altında dolum yapılmalıdır. Bu yüzden bir çok kişi hazır kolon kullanır Kolon dolgu materyali Bir bileşiğin alıkonma zamanı partikül büyüklüğüne, yapısına ve kimyasına göre değişiklik gösterir.

31 Kolon seçimi Çözücü Hekzan Mod Normal faz Molekül ağırlığı < 2,000 Organik MeOH / MeOH:H 2 O veya ACN / ACN:H 2 O THF Ters Faz (RP) HILIC ( polar bileşikler için) Jel permasyon Sulu faz Iyonik olmayan Iyonik Ters Faz HILIC Ters Faz Organik Jel permasyon Molekül ağırlığı> 2,000 Sulu faz Jel permasyon Ion-değişim kromatografi Ters Faz(Daha büyük partiküllü kolon ile)

32 Ayrım şekilleri Temelde 4 yöntem kullanılır Ters Faz Normal Faz Iyon değişim kromatografi Boyut eleme kromatografi

33 Ters Faz Mevcut bileşenlerin 90% ından fazlası için kullanılabilir. Apolar, polar, iyonlaşabilen veya iyonik bileşenler için kullanılabilir. Kolon apolar özellik gösterirken (C18, C8, C3, phenyl) hareketli faz polar özellik gösterir. (tampon) + su ile karışabilen organik çözücü ( metanol veya asetonitril) 10 sulfa tipi ilacın ayrımı

34 Normal Faz 10% kadar bileşik için tercih edilebilecek bir yöntemdir. Aşağıdaki durumlarda kullanılabilir: Suya karşı hassas bileşikler izomerler Kiral analizler Kolon polar (e.g., silika jel, cyanopropylbonded, amino-bonded) özellik gösterirken hareketli faz apolar olmalıdır. (hekzan, iso-oktan, methilen klorür, ethil acetate gibi). Source: Application # EN

35 Normal-faz kromatografide, polarlığı en az olan bileşen kolondan ilk önce çıkar; hareketli fazın polarlığı arttıkça elüsyon zamanı azalır. Ters-faz tekniğinde ise, aksine, polarlığı en çok olan bileşik kolondan ilk önce çıkar ve hareketli fazın polarlığı arttıkça elusyon zamanı artar.

36 Polaritesi yüksek olan bileşik kolonu önce terkeder.

37

38 Dedektör Kolonu terk eden bileşenleri görebilmemizi sağlar Ayrılan moleküllerin miktarını belirlememizi sağlar Dedektörden geçen maddeler bir kaydedici yardımıyla kaydedilerek, zamana karşı dedektör cevabına ait bir grafik oluştururlar buna da kromatogram denir. En çok kullanılan dedektörler Spektroskopik Floresans Kırılma indisi

39 UV Absorbsiyonuna dayanan Spektroskopik dedektör UV dedektör DAD dedektör

40 Zaman t Ayrım t r2 -t r1 Pik genişliğiw b1,2 t r2 -t r1 t r2 -t r1 Mukemmel Ayrim Kabul edilebilir bir ayrim

41 h t r1 t r2 t ri Alıkonma zamanı W 1/2 Yari yükseklikteki pik genişliği Taban pik genişliği W bi W 1/2 W b1 W b2 t

42 Ayrım Gücü Ayrım gücü, kolonun pikleri ayırma kapasitesini ifade eder. Etkin tabaka sayısına (N), seçiciliğe (a) ve kapasite faktörüne bağlıdır (k) Rs değeri 1.5 ve üzeri olursa pikler birbirinden kesin olarak ayrılmıştır diyebiliriz.

43 Ayrım gücünü hesaplamak için R s 1 4 N a 1 k a 1 k Etkinlik Seçicilik Kapasite faktörü Ayrım gücünün artması aşağıdaki koşullar ile sağlanır Bunlardan en önemlisi seçiciliktir. Seçicilik parametresindeki ufak bir değişimin ayrıma etkisi çok büyük olur Alıkonma zamanını etkisi k değeri küçük olduğunda önem taşımaktadır. Etkinlik ise kolonun ayrım gücünü ve yeni olduğunu ifade eder.

44 Etkin tabaka saysının hesaplanması (N) N tr 16 W b 2 N 5 r.54 W 1/ 2 t 2 Yüksek tabaka sayısı daha hızlı, simetrik ve keskin piklerin elde edileceğini gösterir. Kolonun etkinliği Kolon uzunluğuna Kolon dolgu partiküllerinin boyutuna bağlıdır

45 Tabaka ne demek? R s ~ 1 4 N R s ~ 1 4 Lc H ~ 1 4 Lc h d p L C d p h Kolon uzunluğu Partikül büyüklüğü 1 tabakanın yüksekliği Yüksek tanaka sayısı: Keskin ve dar piklerin oluşmasını Daha iyi bir tayini Bileşenlerin birbirinden daha güzel ayrılmasını sağlar

46 Kapasite faktörü(k) æ k = t -t r 0 ç è t 0 ö ø Kapasite faktörü, maddelerin bağıl alıkonmasının bir ifadesidir. Hesaplanması için maddelerin alıkonma zamanlarının yanı sıra ölü zamanın da (t 0 ) belirlenmesi gerekir. t 0- kolonda tutunamayan maddenin alıkonma zamanını ifade eder. Urasil, KBr gibi maddeler ölü zaman belirteci olarak kullanılabilir Kapasite faktörünü: Sabit faz Hareketli faz etkiler.

47 Seçicilik (α) a k k 2 1 a k 1 k 2i Seçicilik ilk bileşene ait alıkonma zamanı ikinci bileşene ait alıkonma zamanı Birbirini takip eden iki pik arasındaki ayrımın ifadesidir. α=1 olduğunda iki pik birbirinden ayrılamaz ve birleşerek kolonu terk eder. α yı etkileyen faktörler: Hareketli faz Sabit faz Sıcaklıktır

48 N, α ve k nın ayrım gücüne etkisi

49 Kolonun ayrım gücüne etkisi

50 ph etkisi

51 Organik çözücü yüzdesi azaldıkça alıkonma zamanı uzamaktadır!!!

52 Sıcaklığın etkisi