ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ ALKALİ SOĞUKTA AKTİF PROTEAZ ÜRETİCİSİ BACILLUS sp. SUŞLARININ İZOLASYONU, ENZİM ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE ENZİMİN BİYOTEKNOLOJİK KULLANIM OLANAKLARI BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2011

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ALKALİ SOĞUKTA AKTİF PROTEAZ ÜRETİCİSİ Bacillus sp. SUŞLARININ İZOLASYONU, ENZİM ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE ENZİMİN BİYOTEKNOLOJİK KULLANIM OLANAKLARI YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Bu Tez 03/02/2011 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir......... Prof. Dr. Burhan ARIKAN Doç. Dr. Hatice KORKMAZ Doç.Dr. Fuat BUDAK DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoteknoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FEF2010YL11 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ ALKALİ SOĞUKTA AKTİF PROTEAZ ÜRETİCİSİ Bacillus sp. SUŞLARININ İZOLASYONU, ENZİM ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE ENZİMİN BİYOTEKNOLOJİK KULLANIM OLANAKLARI ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Yıl: 2011, Sayfa: 77 Jüri: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Doç. Dr. Hatice KORKMAZ Doç. Dr. Fuat BUDAK Bu çalışmada değişik ortamlardan izole edilen alkalifilik Bacillus sp. suşlarından alkalin cold aktif proteaz enzimi izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla bakterilerin katı besiyerlerinde üreme ve enzim üretme yetenekleri belirlenmiştir. Ayrıca değişik NaCl konsantrasyonunun ve çeşitli kimyasalların etkisi saptanmıştır. Bacillus sp. suşundan üretilen proteazın SDS-PAGE analizinde 49.5kDa moleküler ağırlığına sahip aktivite bandı elde edilmiştir. Enzimin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık 25ºC olduğu bulunmuş ve enzim 10-80ºC aralığında 30 dakikada %91.32 aktivitesini korumuştur. Enzim, optimum aktivitesini ph 12.0 da gösterirken, 24 saat süreyle 23ºC ph 8.0-12.0 aralığında ortalama %94.14 kalan aktivite ile alkali stabil özellik göstermiştir. NB-16 enzimi %5 NaCI konsatrasyonunda %92.14 optimum aktivite göstermişitir. Enzim aktivitesi β- merkaptoetanol (%159), üre (%122), IAM (%177), PHG (%123) ile önemli düzeyde artarken, SDS (%54) ile aktivitede azalma gözlenmiştir. Bu sonuçlara göre proteaz enzimi, cold aktif, psikrotolerant, alkalifilik ve alkali-stabil özellik göstermektedir. Bu özelliklerinden dolayı cold-aktif alkalin proteaz enzimi gıda işletmeleri, özellikle deterjan ve biyoremesdiasyon gibi bazı endüstriyel uygulama alanlarında kullanılabilir özelliktedir Anahtar Kelimeler: Bacillus sp.nb-16, Alkali cold aktif proteaz I

ABSTRACT M.Sc. THESIS ISOLATION OF COLD-ACTIVE ALKALINE PROTEASE BACILLUS sp. STRAINS, ENZYME PRODUCTION, CHARACTERIZATION, DETERMINATION AND THEIR BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS ÇUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY Supervisor: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Year: 2011, Pages: 77 Jury: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Assoc. Prof. Dr. Hatice KORKMAZ Assoc. Prof. Dr. Fuat BUDAK In this study, the cold alkaline protease enzymes from Bacillus sp. strains isolated from different environments were produced and characterized. For this purpose, different temperatures and ph values of bacteria and enzymes to produce reproductive capabilities on solid plate were investigated.. Besides, different chemicals and NaCl effects on the enzyme activity was determined. Molecular weight of the enzyme from Bacillus sp. NB-16 was estimated as 49.5 kda on SDS-PAGE. The optimum activity was obtained at 25ºC and the enzyme was retained it s activity around 91.32% at the end of 30 minutes between 10-80ºC. The optimum activity was obtained at ph 12.0 The enzyme also presented the alkali-stable properties with a residual activity around 94.14 % at 23ºC between ph 7.0-12.0 for 24 hours. The optimum activity of NB-16 protease has shown 92.14% in the 5% NaCl concentration. β-mercaptoethanol (%159%), urea (122), IAM (177), PHG (123%), stimulated the enzyme activity significantly however SDS (54%) reduced. According to these result, NB-16 enzyme shows cold- active, psychrotolerant, alkaliphile and alkali-stable characters. Due to these properties NB-16 cold-active protease enzyme has capable of using at especially detergent and bioremediation industry processing and food industry. Key Words: Bacillus sp. NB-16, alkaline, cold-active protease, II

TEŞEKKÜR Tez dönemim boyunca hiçbir zaman değerli bilgi ve tecrübelerini esirgemeyen danışman hocam sayın Prof. Dr. Burhan ARIKAN a sonsuz teşekkür ederim. Yüksek lisans eğitimim boyunca ilgi ve desteğini gördüğüm beni yönlendiren destekleyen ve yardımlarını esirgemeyen çok sevdiğim hocam sayın Doç. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ e teşekkürü bir borç bilirim Çalışmalarım ve tez yazım aşamam boyunca desteklerini gördüğüm Moleküler Biyoloji ve Biyoteknoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans ve Doktora öğrencisi arkadaşlarıma ve sayın hocam Yrd. Doç. Dr. Ayşenur KAYA ya teşekkür ederim. Orta öğretim dönemimden bu yana hiç ayrılmadığım arkadaşım Burcu ŞENTÜRK ve Hakan EMLİK e tez dönemimde vermiş oldukları destekten dolayı çok teşekkür ederim Her zaman yanımda olduklarını bildiğim ailemin her bir ferdine eğitim ve öğretim hayatım boyunca bana maddi, manevi her konuda destek oldukları ve her zaman güvendikleri için sonsuz teşekkür ederim. III

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ.........I ABSTRACT.......... II TEŞEKKÜR........... III İÇİNDEKİLER..........IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VIII ŞEKİLLER DİZİNİ...... X SİMGELER VE KISALTMALAR...XII 1. GİRİŞ....1 1.1. Bacillus cinsi.. 2 1.2. Proteazlar... 3 1.3. Soğukta aktif enzimler...........5 1.4. Proteazların Kullanım Alanları.. 8 1.5. Elektroforez...... 10 1.6. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) Sistemi 12 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR. 15 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal..21 3.1.1. Kullanılan Çözeltiler ve Tamponlar. 21 3.1.1.1. NaOH Çözeltisi..... 21 3.1.1.2. Etanol....21 3.1.1.3. Sodyum Fosfat Tamponu ( 100 mm, ph 7.0).....21 3.1.1.4. Sodyum-Fosfat Tamponu...21 3.1.1.5. Glisin-NaOH Tamponu. 22 3.1.1.6. Borax-NaOH Tamponu....22 3.1.1.7. TCA ( Trikloro Asetik Asit)...23 3.1.2 Bakteri Seçimi ve Teşhisinde Kullanılan Besiyerleri...23 3.1.2.1 N1 Agar..23 3.1.2.2. Proteaz Enzimi Üretim Besiyeri (Skimmilk li Besiyeri)...23 IV

3.1.3. Elektroforez İşleminde Kullanılan Çözeltiler..24 3.1.3.1 Solüsyon A (Akrilamid Solüsyonu)...24 3.1.3.2. Solüsyon B (4X)....24 3.1.3.3. Solüsyon C (4X)....24 3.1.3.4. Amonyum Persülfat (AMPS) %10......25 3.1.3.5. Elektroforez Tamponu.......25 3.1.3.6. Örnek Yükleme Tamponu (5X)...25 3.1.3.7. Jel Boyama (Staining) Solüsyonu...25 3.1.3.8. Jelden Boyayı Geri Alma (Destaining) Solüsyonu...26 3.1.3.9. SDS-PAGE nde Zymogam analizleri için Renatürasyon solüsyonları.......26 3.1.3.10. Triton-X100 çözeltisi (Sol-1).. 26 3.1.3.11. Tris-HCI çözeltisi (Sol-2)...26 3.2. Metod.....26 3.2.1. Bakteri İzolasyonu ve Teşhisi...26 3.2.1.1. Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu... 26 3.2.2. Bakterilerin Tanılaması......27 3.2.3. Katı Besiyerinde Proteaz Aktivitesinin Saptanması...27 3.2.4. Bakterinin Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştiği ph aralığının Saptanması...27 3.2.5. Bakterinin Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştiği Sıcaklık Aralığının Saptanması...28 3.2.6. Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma...28 3.2.7. Enzimin Optimum Aktivite Gösterdiği ph Değerinin Saptanması....28 3.2.8. Enzimin Optimum Sıcaklık Aktivitesinin Saptanması...29 3.2.9. Enzimin Sıcaklık Stabilitesinin Saptanması 29 3.2.10. Proteaz Enziminin ph Stabilitesinin Saptanması...30 3.2.11. Faklı NaCl Konsantrasyonlarının Enzim Aktivitesine Etkisi...30 3.2.12. Enzim Aktivitesine İnhibitör, Metal iyonu, Şelatör, Deterjan ve Oksidanların Etkisi..... 31 V

3.2.13. SDS-PAGE Jel Elektroforezinde Moleküler Ağırlık ve Zimogram Analizi.... 31 3.2.13.1. SDS-PAGE Sisteminin Hazırlanması.31 3.2.13.2. Ayırıcı Jel in Hazırlanması (%12 lik).32 3.2.13.3. Dengeleme Jel inin Hazırlanması... 32 3.2.13.4. Enzim Örneklerinin Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi 32 3.2.13.5. Zimogram Analizi...33 4. BULGULAR VE TARTIŞMA..35 4.1. Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu ve Tanımlanması...35 4.2. Bacillus sp. NB-16 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları...35 4.3. Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği ph Değeri ve Aralığına Ait Bulgular.41 4.4. Proteaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerine Ait Bulgular.....43 4.5. Proteaz Enziminin ph Stabilitesine Ait Sonuçlar...45 4.6. Proteaz Enziminin Termal Stabilite Analizlerine Ait Sonuçlar..47 4.7. Enzim Aktivitesi ve Stabilitesine Farklı NaCI Konsantrasyonlarının Etkisi.. 49 4.8 Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal iyonu, Deterjan ve Oksidanların Etkisi..51 4.9. Proteaz Enziminin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi Sonuçları....54 5.SONUÇLAR VE ÖNERİLER. 57 KAYNAKLAR...65 ÖZGEÇMİŞ...77 VI

VII

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. Soğukta Aktif Proteaz Enzimi Optimum ph Değeri...... 41 Çizelge 4.2. Soğukta aktif alkali proteaz enzimi optimum aktivite sıcaklığı...43 Çizelge 4.3. Çizelge 4.4. Çizelge 4.5. Çizelge 4.6. Soğukta Aktif Proteaz Enzimi ph Stabilite Değerleri... 45 Soğukta Aktif Proteaz Enzimi Termal Stabilite Değerleri...47 Enzim Aktivitesine Farklı NaCI Konsantrasyonlarının Etkisi...49 Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal iyonu, Deterjan ve Oksidanların Etkisi.52 VIII

IX

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 4.1. Şekil 4.2. Şekil 4.3. Şekil 4.4. Şekil 4.5. Şekil 4.6. Şekil 4.7. Şekil 4.8. Şekil4.9. Şekil 4.10. Şekil 4.11. Bacillus sp.nb-16 suşunun 10ºC ile ph 6.0-12.0 arasındaki koloni ve aktivite zon çapının görünümü......37 Bacillus sp.nb-16 suşunun 20ºC ile ph 6.0-12.0 arasındaki koloni ve aktivite zon çapının görünümü......38 Bacillus sp.nb-16 suşunun 30ºC ile ph 6.0-12.0 arasındaki koloni ve aktivite zon çapının görünümü...... 39 Bacillus sp.nb-16 suşunun 40ºC ile ph 6.0-12.0 arasındaki koloni ve aktivite zon çapının görünümü....40 Soğukta Aktif Proteaz Enzimne Ait Optimum ph Değeri....42 Proteaz enzimi optimum aktivite sıcaklık verileri...44 Soğukta Aktif Proteaz Enzimi ph Stabilite Değerleri... 46 Soğukta Aktif Proteaz Enzimi Termal Stabilite Değerleri.....48 Enzim Aktivitesine Farklı NaCI Konsantrasyonlarının Etkisi...50 Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal iyonu, Deterjan ve Oksidanların Etkisi. 53 Bacillus sp. NB16 Soğukta Aktif Alkali Protease Enzimi Zimogram Sonucu....55 X

XI

SİMGELER VE KISALTMALAR AMPS : Amonyum persülfat β : Beta EDTA : Etilendiaminotetraasetik asit IAM : Iodoacetomide PMSF : Phenylmethylsulfonyl fluoride LB : Luria Bertani Broth PHG : Phenylgliaksol Rpm : Dakikada Devir Sayısı SDS : Sodyum dodesil Sülfat TEMED : N,N,N,N-Tetrametil etilendiamin TCA : Trikloro asetik asit Tris : 2-Amino-2-Hidroksimetilpropan-1,3-diol XII

XIII

1.GİRİŞ 1. GİRİŞ Biyoteknoloji, çok çeşitli alanlarda gelişme gösteren ve günümüzde moleküler biyolojik yöntemlerinde yaygın şekilde kullanımıyla birlikte, giderek moleküler biyoteknoloji şeklinde değişime uğrayan, çok yeni ve geleceğe damgasını vuracak bir alandır. Ticari alanda kullanılan ürünlerin üretilmesi ile ilgili çalışmaların giderek hız kazanması sonucu, önemi her geçen gün daha da artmaktadır. Dünyada, 1980-1983 yılları arasında sadece 300 küçük biyoteknoloji şirketi çalışma yaparken, bu sayı 1985 yılında sadece Amerika Birkeşik Devletlerinde (A.B.D.) 400 düzeyine ulaşmıştır. Günümüzde A.B.D. de 900, bütün dünyada ise yaklaşık 1200 biyoteknoloji şirketi çalışmalarını çeşitli alanlarda sürdürmektedirler. Örneğin sadece farmasötik alanında 2000 li yıllarda kullanılacak biyoteknolojik ürünlerin toplam değerinin yaklaşık 60 milyar dolar/yıl düzeyinde olacağı düşünülmektedir. Biyoteknoloji kaynaklı çalışmalar A.B.D. de odaklanmış olmakla birlikte, günümüzde, Japonya ve Kanada, biyoteknolojiyi (özellikle moleküler biyoteknolojiyi) stratejik alan kategorisinde değerlendirerek, özel şirketlerin yanı sıra, hükümetler düzeyinde destekleme ve geliştirme kararı almışlardır (Glick ve Pasternak, 1994) Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının çeşitli ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle, biyoteknolojinin endüstriyel enzimlerle ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar, daha da önem kazanmaktadır. Özellikle birkaç ülke dışında diğer ülkelerin bu konuda tamamen dışa bağımlı oldukları görülmektedir. Alkalifilik özellikteki organizmalar, prokaryot, eukaryot, archea gubu içerisinde yer almaktadır. Alkalifiller arasında çok değişik taksonomik guplar olmakla birlikte, bunların bazıları taksonomiye yeni girmişlerdir. Alkaliproteaz üretiminde Halobacterium sp., B. licheniformis, B. megatherium, Aspergillus sp., Micrococcus, Pseudomonas ve Streptomyces türleri vardır (Horikoshi, 1996; Horikoshi,1999; Kumar ve Takagi, 1999). Alkalifiler, bahçe toprağı gibi normal çevresel ortamlardan izole edilebileceği gibi, yüksek alkali özellik gösteren topraklardan da izole edilebilirler. Alkalifilik enzimler endüstriyel uygulamalarda 1

1.GİRİŞ büyük öneme sahiptirler. Dünyada üretilen toplam alkalifilik enzimlerin %30 dan fazlası çamaşır deterjanları içerisine karıştırılarak değerlendirilmektedir (Horikoshi, 1996). Alkaliselülaz, alkaliproteaz ve alkaliamilaz gibi alkalifilik organizmalardan izole edilen enzimler, çeşitli deterjanların içerisine karıştırılmışlar ve biyolojik deterjanlar şeklinde tanımlanmışlardır. Alkalifilik amilaz, selülaz ve proteazlar aynı zamanda endüstrinin diğer birçok alanında da yoğun şekilde değerlendirilmektedirler. Bunlar arasında dericilik, tekstil, gıda endüstrisi, içecek endüstrisi, ekmek ve pasta ürünleri, çeşitli soya ürünlerinin üretimi, protein hidrolizatlarının tatlandırılması, farmasötik endüstrisi ve tıbbi uygulamalar, kimya endüstrisi, atıkların temizlenmesi, nişastadan etanol üretimi gibi kendi içlerinde birer endüstri olan çok değişik alanlar vardır (Rao ve ark, 1998; Igarashi ve ark, 1998; Kumar ve Takagi, 1999). Endüstriyel alanda kullanılan enzimler bitkisel, hayvansal ve mikroorganizma kökenli olmakla birlikte ağırlıklı olarak mikroorganizmalardan izole edilmektedirler. Bunun nedeni, mikroorganizma kaynaklı enzimlerin katalitik aktivitelerinin yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve daha ucuz olmaları, büyük boyutlarda ve yüksek saflıkta elde edilmesi ve ekstrem koşullarda aktivite göstermeleridir. Örneğin mikrobiyal enzimler yüksek ve düşük sıcaklık ve ph değerlerinde aktivite gösterirler (Wiseman, 1987; Horikoshi, 1999) 1.1. Bacillus cinsi Bacillus türü aerop, sporlu basiller ailesinde bulunurlar ve özellikle taze kültürleri, gram pozitif boyanırlar. Vejatatif formları düz, kenarları birbirine paralel, ucu yuvarlak veya künt biten 0.5-1.2μm boyunda basillerdir. Tek tek veya uzun zincirler şeklinde görülürler. Endosporları silindirik, oval, yuvarlak veya böbrek şeklinde olup, türlere göre santral, terminal veya subterminal konumda bulunurlar. Çoğunluğunda katalaz testi pozitiftir. Basillerin çoğu basitrasin, polimiksin, tirosidin, gramisidin ve sirkulin gibi antibiyotikler üretir. Mezofil yaşayanlar çoğunluğu oluştururken, termofil, psikrofiik, asidofil ve halofil cinsler de bulunmaktadır. Bacillus cinsinin hepsi spor oluşturma yeteneğindedir (Gerçeker, 1999; Madigan, 2

1.GİRİŞ 2010). 1.2. Proteazlar Mikrobiyal enzimlerin dünya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığı zaman, alkaliproteaz %25, diğer proteazlar %21, Amilaz %18, Renin %10, Trypsin %3, Lipaz %3 diğer karbonhidrat parçalayan enzimler (selülaz ve ksilanaz gibi) %10, analitik ve farmasötik enzimler %10 şeklinde bir dağılım göstermektedir (Zeman ve Mccrea, 1985; Rao ve ark, 1998). Bakteriyel kökenli proteaz enzimleri nötral ve alkali ağırlıklı enzimler olup, Bacillus cinsindeki organizmalar tarafından üretilmektedirler. Bakteriyal nötral proteazlar ph 5.0-8.0 aralığında optimum aktivite gösterirler ve termotoleranslığı nispeten düşüktür. Termotoleranslıklarının düşük olması gıda ürünlerinin üretilmesi sırasında reaksiyonların kontrol edilebilmesi açısından bir avantajdır. Bazı nötral proteaz enzimleri metalloprotein yapısına sahip olup, aktiviteleri için iki değerlikli metal iyonlarına gereksinim duyarlar. Bakteriyal alkaliproteazlar yüksek ph değerlerinde (ph 10.0 gibi) aktivite göstermeleriyle karakterize olup, substrat sipesifiteleri oldukça geniştir (Rao ve ark, 1998). Bütün proteazlar içerisinde Bacillus türlerinden üretilen alkali proteazlar farklı koşullarda stabilitelerini korudukları için oldukça önemlidir (Joshi ve ark, 2007) Alkaliproteaz üretiminde Halobacterium sp., B. licheniformis, B. megatherium, Aspergillus sp., Micrococcus, Pseudomonas ve Streptomyces türleri kullanılmaktadırlar (Horikoshi, 1996; Horikoshi, 1999; Kumar ve Takagi, 1999). Proteazlar, ekzopeptidaz ve endopeptidaz olmak üzere iki büyük grup içinde sınıflandırılırlar. Ekzopeptidazlar aminopeptidaz ve karboksipeptidaz, endopeptidazlar ise serin, azpartic, cystein ve metalloproteazlar şeklinde gruplandırılırlar. Ekzopeptidazlar, aminopeptidazlar bakteri ve mantarların bulunduğu geniş mikrobiyal gruplar tarafından üretilmektedirler (Watson, 1976). Genel olarak aminopeptidazlar intraselüler enzimlerdir ancak A. oryzae dan üretilen ektraselüler aminopeptidazlar üzerinde tek bir yayın bulunmaktadır (Labbe ve ark, 1974). 3

1.GİRİŞ Aminopeptidazlar E. coli den üretilen büyük proteazlardır (400.000Da). Aminopeptidazlar optimum aktivitesi için Mn +2 veya Mg +2 ve ph 7.5-10.5 ph aralığına ihtiyaç duymaktadır (Marco ve Dick, 1978). Karboksipeptidazlar serine karboksipeptidazlar, metallokarboksipeptidazlar ve cystein karboksipeptidazlar olmak üzere üç gruba ayrılırlar. Serine karboksipeptidazlar Penicillium spp., Sacharomyces spp. ve Aspergillus spp. den izole edilmiş ve substrat spesifikliği benzerdir ancak inhibitör etkisi, moleküler ağırlıkları, stabiliteleri, optimum ph ları gibi özellikleri farklıdır. Metallokarboksipeptidaz Saccharomyces spp.(felix ve Brouillet, 1966) ve Pseudomonas spp. dan (Lowther ve ark, 1995) izole edilmiştir. Aktiviteleri için Zn +2 veya Co +2 gerekmektedir. Endopeptidazlar serine proteazlar, metallo proteazlar, cystein proteazlar ve aspartic proteazlar olmak üzere dört gruba ayrılırlar (Rawlings ve Barrett, 1993) Serine proteazlar aktif bir serine grubunun varlığı ile karakterize edilirler. Serine proteazlar PMSF, DFP, TLCK, 3,4 DCI ile geri dönüşümsüz olarak inhibe olmasıyla bilinmektedir. Bazı proteazlar thiol reaktanları ile örneğin PCMP ile inhibe olmaktadır. Serine proteazlar genellikle nötral ve alkali ph da aktiftir. Bununla birlikte ph 7.0-11.0 aralığında optmumdur. Serine proteazlar geniş substrat spesifikliğine sahip olup esterolitik ve amidaz aktivitesini içermektedir. Moleküler ağırlıkları 18-35kDa arasındadır, Blakeslea trispora dan serin proteaz ın moleküler ağırlığı 126kDa dur (Govind ve ark, 1981). izoelektrik noktaları genellikle ph 4.0-6.0 arasındadır. Serin alkali proteazların geniş alt grupları yüksek alkali ph da aktiftir. Serin alkali proteazlar birçok bakteri, maya, küf ve mantardan üretilirler. Bunlar TPCK, TLCK ile inhibe olmayıp patates proteaz inhibitörü veya DFP ile inhibe olmaktadır. Alkali proteazların optimum ph sı 10.0 civarında ve izolektrik noktası ph 9.0 civarındadır. Moleküler ağırlığı 15-30 kda aralığındadır. Bununla birlikte alkali serin proteazlar birçok bakteri suşlarından örneğin Arthrobacter, Streptomyces ve Flavobacterium spp. den üretilmiştir (Boguslawski ve ark, 1983). Serine proteazların ikinci geniş ailesi Bacillus ların subtilisin ile temsil edilmektedir. Alkali proteazların iki farklı tipi subtilisin Carlsberg ve subtilisin Novo 4

1.GİRİŞ veya bakterial proteaz Nagase (BPN) olarak tanımlanır. Subtilisin Carlsberg B. licheniformis den, subtilisin Nova veya BPN B. amyloliquefaciens den üretilirler. Subtilising Carlsberg deterjanlar içinde genişçe kullanıma sahiptir. Saf enzim proteini için yıllık üretim 500 ton civarındadır. Subtilisin BPN ticari önemi azdır. Her iki subtilisin de moleküler ağırlığı 27.5kDa ama 58 amino asidi ile diğerlerinden farklıdır. Her ikiside benzer özelliklere sahip örneğin optimum sıcaklık 60ºC ve optimum ph 10.0 dır (Phadatare ve ark, 1997) Aspartic asit proteaz lar genellikle asidik proteaz olarak bilinir. Asidik proteazlar pepsin, retropepsin, pararetrovirüs olarak 3 gruba ayrılırlar. Birçok aspartik proteaz maksimum aktiviteyi düşük ph da (ph 3.0-4.5) gösterir ve izoelektrik noktası ph 3.0-4.5 arasındadır. Moleküler ağırlıkları 30-45kDa dur (Sielecki ve ark, 1991). Aspartik proteazlar pepstatin (Fitzgerald ve ark, 1990) tarafından inhibe olmaktadır. Bununla birlikte diazoketon karışımlarına ve bakır iyonlarında bulunan örneğin DAN ve EPNP ye hassastır. Cystein proteazlar prokaryot ve ökaryotların her ikisinde bulunur. Cystein proteazların yaklaşık 20 ailesi bilinmektedir. Cystein proteazlar nötral ph larda optimaldır ancak birkaçı örneğin lysosomal proteazlar asit ph da maksimum aktiviteye sahiptir. Cystein proteazlar sülfidril ajanlara örneğin PCMB ye hassas ama metal-şelatör ajanlardan DFP den etkilenmemektedirler. Metalloproteazlar aktiviteleri için divalent metal iyonlarına ihtiyaç duyarlar. Metalloproteazlar ın yaklaşık 30 familyası bilinmektedir. Bunların 17 tanesi sadece endopeptidazları, 12 tanesi sadece akzopeptidazları ve 1 tanesi herikisini içerir. Metalloproteazlar şelatör ajanı örneğin EDTA ile inhibe olmakta ancak sülfidril ajanı veya DFP ile inhibe olmamaktadır. Alkali metalloproteazlar Pseudomonas aeruginosa ve Serratia spp. den üretilmiştir. ph 7.0-9.0 arasında aktif, moleküler ağırlığı 48-60 kda dur. (Browner ve ark, 1995). 1.3. Soğukta aktif enzimler Mikroorganizmalar düşük sıcaklıklarda işlev yapabilmek ve hayatta kalmak için adaptasyon mekanizması geliştirmiştir, hemen hemen 0ºC sıcaklıkta 5

1.GİRİŞ gelişebilmektedir. Bu mikroorganizmalar psikrofiller ve psikrotolerantlar olmak üzere 2 gruba ayrılmıştır. Psikrofilik mikroorganizmaların gelişimi için optimum sıcaklık 15ºC, maksimum gelişim sıcaklığı 2ºC nin üstünde ve minimum 0ºC dir. Psikrotolerant mikroorganizmalar genellikle 0ºC de gelişmemekte ancak 3-5ºC de gelişebilmektedir. Optimum ve maksimum gelişim sıcaklığının 20ºC nin üzerinde ancak 30ºC nin altındadır. Arktik ve antartik derin denizlerinin ağır koşullarına karşın birçok soğuk uyumlu organizmalar karakterize edilmiş ve antartik okyanusunda bakteri hücrelerinin yoğunlukta olduğu bildirilmiştir. Psikrofiller soğuk çevrelerde örneğin derin denizler, buzullar, dağlık bölge, toprak, temiz veya tuzlu sular ile soğuk kanlı hayvanlar, örneğin balık veya kabuklu hayvanlarda bulunurlar. Genel olarak soğuk uyumlu enzimler düşük ve ılımlı sıcaklıklarda mezofilik benzerlerine göre yüksek spesifik aktiviteye sahiptirler (Antranikian ve ark, 2005) Son zamanlarda soğuk uyumlu organizmadan enzimlerin bildirilmesi önemli ölçüde artmıştır. Çoğu Antartika ve antarctik mikroorganizmalarından üretilmiştir. Sadece çok az soğukta aktif proteazlar deniz mantarlarında incelemişlerdir. Deniz mantarları üzerindeki araştırmalar da çoğunlukla biyoaktif substratlar ve sekonder metabolitler üzerinde durmuşlardır (Hui ve ark, 2009). 0-30 C de soğukta aktif enzimlerin spesifik aktivitelerin onların mezofilik benzerlerinden daha yüksek olduğunu saptamışlardır. Ancak soğuk uyumlu enzimlerle ilgili mevcut veriler düşük termostabilite ve neredeyse her zaman yüksek spesifik aktivite olduğunu göstermiştir (Chen ve ark, 2003). Psikrofillerin düşük sıcaklıklarda yüksek aktivite gösterdikleri ve düşük aktivasyon enerjileri ile enzim sentezledikleri bilinmektedir. 0-20 C enzimatik aktivitelerini sürdürmeleri nedeniyle soğukta aktif enzimler büyük ekonomik değere sahiptir. Bu özelliklerinden dolayı soğukta aktif enzimlerin temel çalışmalar ve endüstriyel kullanım da çok fazla önemini arttırmıştır. Soğuk uyumlu mikroorganizmaların enzimleri önemli enerji tasarrufu oluşturduğundan pratik uygulamalarda çok fazla kullanılmaya başlanmıştır (Morita ve ark, 1998) Düşük sıcaklıklara adapte olmuş mikroorganizmalar ekstremofillerin bir üyesi olup, 0 C de bile üreyebilirler. Literatürde psikrofil bakterilerin optimum 15 C, maksimum 20 C, minimum 0 C veya daha düşük sıcaklıklarda üredikleri 6

1.GİRİŞ bildirilmiştir (Morita ve ark, 1998). Psikrofiller, soğuğa uyumlu (soğuk habitatlara adapte olmuş) mikroorganizmalardır ve bunlar düşük sıcaklıklarda yüksek aktivite gösteren enzimler üretmektedirler. Bu enzimler soğukta aktif (düşük sıcaklıklarda aktif) şeklinde tanımlanırlar (Kulakova ve ark,1999; He ve ark, 2009). Soğukta aktif enzimler 3 genel özelliğe sahiptir. 1. Sıcaklıkla birlikte enzim aktivitesinin düşük sıcaklığa doğru değişmesi, 2. Spesifik aktivitesinin ve fizyolojik verimin düşük sıcaklıklarda mezofilik koşullara göre daha yüksek olması 3. Mezofil sıcaklıkta enzimin termal stabilite sınırının hızlı bir şekilde düşmesi (Morita ve ark., 1998). Soğukta aktif enzimler, derin denizler, yüksek dağlar ve kutuplarda sürekli yaşayan organizmalar tarafından üretilmektedirler. Bu enzimlerin en önemli gubunu düşük termal stabiliteleri ve düşük sıcaklıkta yüksek katalitik aktivite göstermeleri nedeniyle soğukta aktif proteazlar oluşturur. Bu özelliği nedeniyle temizlik deterjanları, deri işletmeleri, gıda endüstrisi ve moleküler biyoloji gibi çok farklı alanlarda kullanılmaktadırlar (Wang ve ark, 2008). Örneğin Novozim firması savinaz markası ile enkapsüle deterjan üretmektedir. Japon bilim enstitüsü CP-58 ve CP-70 patent numaralı iki soğukta aktif proteaz enzimi geliştirmiştir (Quamrul ve Eiichi, 1998). Bir başka Japon firması Cao-corparation deterjanda kullanmak için soğukta aktif proteaz enzimine patent almıştır. Düşük sıcaklıklarda proteinleri hızlı şekilde parçalayan mikroorganizmalar protein içerikli atık suların işlenmesinde gereklidir çünkü bu tür atık su drenajlarının sıcaklıkları (yaklaşık 5 C -25 C) nispeten düşüktür (Joshi ve ark, 2007). Dahada önemlisi soğukta aktif protease enzimlerinin kullanıldığı alanlarda önemli bir enerji tasarrufu sağlanmaktadır (çok pahalı olan ısıtma işlemlerine gerek olmamakta, kış mevsimi boyunca soğuk koşullarda aktivite devam etmekte, reaksiyon veriminde artış sağlanmakta, yüksek sıcaklıklarda ortaya çıkabilecek istenmeyen kimyasal reaksiyonlar minimize edilmekte ve ihtiyaç duyulduğu anda enzim kolayca inhibe edilebilmektedir). Örneğin gıda endüstrisinde sıcaklığa hassas ürün ve substratların orijinalliklerinin değişmesi önlenmektedir. Bunların dışında soğukta aktif proteaz 7

1.GİRİŞ enzimi içecek ve şarap endüstrisi, peynir üretimi, hayvansal gıdaların eldesi ve meyve suyu endüstrisi gibi alanlarda da mezofilik enzimlere karşı iyi bir alternatiftir. Ayrıca soğukta aktif proteazların düşük sıcaklıkta yüksek katalitik aktivite göstermeleri nedeniyle gıda endüstrisinde tatlandırıcı enzimler şeklinde kullanılması da söz konusudur (örneğin, buzdolabında saklanan et ürünlerinin lezzetlerinin artırılmasında) (He ve ark, 2004). Bir başka çalışma ile soğukta aktif soğuk uyumlu enzimlerin sürekli soğuk ortamlardaki organizmalar tarafından üretildiği bildirilmiştir. Antartika buz denizi içinde yaşayan çeşitli soğukta aktif enzimleri üreten bakteriler biyoteknolojik uygulamalar için yüksek bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte psikrofilik bakteri Colwellia sp. den extracelluler soğukta aktif serine proteaz ın karakterizasyonu ve saflaştırılmasının ilk kez bildirildiğine inanmaktadırlar (Wang ve ark, 2005). 1.4. Proteazların Kullanım Alanları Mikrobiyal alkali proteazlar yıkama deterjanları uygulamaları için Bacillus lardan alkali proteaz veya subtilisler ticari uygulamalarda önemli bir paya sahiptir (Ward, 1985). Alkali proteazların protein kaynaklı lekelerin çıkartılması için deterjanlara eklenmesi uygun bulunmuştur (Masse ve Tilburg, 1983). Temizleyici özelliğinden dolayı deterjanlara katılan proteazların kullanımı artmıştır. Buna ek olarak, bu enzimler deterjenlara eklendiğinde düşük sıcaklıklarda yıkamayı mümkün kılmaktadır (Nielsen ve ark, 1981). İdeal olarak proteazlar ve diğer enzimler deterjan formülasyonlarının kullanımında yüksek aktiviteye sahip, geniş ph ve sıcaklık aralığında stabildirler. Bu enzimler uzun raf ömrüne sahip olmalıdırlar (Ward, 1985). Alkali proteazların deterjanlar ile uyumu üzerine çok az yayın bulunmaktadır. Bazı temizlik maddeleri daha az talep edilmektedirler. Örneğin ön yıkama ve kontakt lens temizlik solüsyonları çoğu makine deterjanlarıyla aynı termal stabiliteye sahip olmadığından bu solüsyonlarda pek tercih edilmemektedirler. Ancak denizel gemi kurdu bakterilerinden elde edilen alkali proteazlar düşük sıcaklıklarda kontakt lenslerin temizlenmesinde kullanılmıştır (Greene ve ark, 1989; Greene ve ark, 1996). Enzim 8

1.GİRİŞ deterjan preparatları son zamanlarda Alkazym (Novodan A/S, Copenhagen, Denmark), Terg-a-zyme (Alconox, Inc, New York, USA), Ultrasil 53 (Henkel KGaA, Dusseldorf, Germany) and P3-paradigm (Henkel-Ecolab GmbH, Düsseldorf, Germany) şeklinde marketlerde mevcuttur (Coolbear ve ark, 1992; Kumar, 1997). Alkali proteazlar gümüşün geri alınması için X ray filmlerinin kullanımı biyoproseslerinde uygulama alanı bulmuştur. Kullanılan X-ray filmlerinin jelatin katmanları yaklaşık %1.5-2.0 gümüş içermektedir. Geleneksel uygulamalarda yanan filmlerdeki gümüşü kurtarma önemli bir çevre kirliliği sorununa neden olmaktadır. Böylece bu enzimatik hidrolizler X-raylerdeki jelatin katmanlarındaki sadece gümüşün değil aynı zamanda polyester filmlerinin geri dönüşümünü sağlamaktadır. Bacillus sp. B21-2, Bacillus sp. B189 and B. coagulans PB-77 den alkali proteazlarla X-ray filmleri üzerindeki jelatin katmanlarında gümüş ayrıştırılmış (Ishikawa ve ark, 1993). Kollojenazlar ile alkali proteazlar düşük dozlarda tedavi edici uygulamalarda artan bir biçimde uygulanmıştır. Yeni semi-alkali proteazlar ile yüksek kollojenolitik aktivite Aspergillus niger LCF9 tarafından üretilmiştir (Barthomeuf ve ark, 1992). Benzer şekilde Bacills subtilis 316M dan yüksek elastolitik aktivite ile hazırlanan Elastoteraz; derin apselerin, çıbanların, sivilcelerin, irinli yaraların, yanıkların iyileştirilmesinde tedavi edici uygulamalar için tespit edilmiştir (Kudrya ve Simonenko, 1994). Bitki, balık ve hayvanlardan üretilen hidroliz proteinlerinden alkali proteazlar iyi tanımlanmış peptitleri hidroliz edilebilmektedirler. Ticari alkali proteazlardan Alkalase terminal hidrofobik amino asitler için tercih edilmekle birlikte geniş spesifikliğe sahiptir (Adler-Nissen, 1986). Ayrıca hidrolizatlar moleküler ağırlığı 100kDa geçmemekle birlikte 2-6 amino asit içermektedir (Gonzalez ve ark., 1994). Çok kısa bir süredir B. amyloliquefaciens den elde edilen alkali proteazlar ile nohut proteinlerinden yüksek metionin içeren proteinli hidrolizatların üretilmesi sağlanmıştır (George ve ark, 1997). Çoğunlukla kazein, peynir altı suyu proteini ve soya proteininden elde edilen protein hidrolizatları hipoalerjenik bebek mamaları formülasyonları gibi önemli uygulama alanlarında kullanılmaktadır. Protein hidrolizatları aynı zamanda meyve sularında, alkolsüz içeceklerde ve zengin proteinli 9

1.GİRİŞ diyetlerde takviye olarak kullanılmaktadır (Wilson ve ark, 1994; Adler-Nissen, 1986; Adamson ve Reynolds, 1996; Parrado ve ark, 1991). Proteazlar etlerin yumuşatılmasında, özellikle sığır etinin yumuşatılmasında rol oynamaktadır (Wilson ve ark, 1992). Alkaliproteazlar atıklar ve çeşitli yiyecek endüstri atıklarının yönetimi için potansiyel uygulamalar sağlamaktadır (Shoemaker, 1986; Shih ve Lee, 1993). Dalev enzimatik proseste, B. subtilis ten alkali proteazın kümes hayvanlarına ait tüy atıklarında kullanıldığını ve keratin yapılarının tamamen yıkılmasını sağladığını rapor etmiştir (Dalev, 1994). Kümes hayvanlarının vücut ağırlığının yaklaşık %5 ini tüyler oluşturmaktadır ve kümes hayvanlarının eti yüksek protein kaynağı oluşturabilmektedir. Benzer şekilde diğer birçok keratinolitik alkali proteazlar peptidler veya amino asitlerin üretilmesi için yiyecek endüstrisinde kullanılmaktadır (Lin ve ark, 1996; Dhar 1984; Böckle ve Müller, 1997; Kida ve ark, 1995). Proteaz enzimi, deri endüstrisinde hayvanların cilt ve derilerinin tüysüz olması amacı ile kullanılan bir diğer endüstriyel yöntemdir. Geleneksel olarak bu yöntem sodyum sülfür ve doymuş kireç çözeltisi ile hayvan derisine uygulanan işlem ile gerçekleştirilmektedir. Ayrıca geleneksel yöntemleri uygulamak pahalı olmakla beraber, çevre kirliliği oluşturan kuvvetli bir atık maddesidir. Bu sebeplerden dolayı geleneksel yöntem yerine yardımcı enzimler kullanmak ön plana çıkmaktadır. Eğer deri yüzme işleminde ph ın 12 olduğu alkali koşullar altında proteolitik enzimler dengeli ve etkin bir şekilde bulunabiliyorsa tüysüzleştirme işleminde yardımcı enzimin tercihi mümkün olmaktadır. İlk girişimlerde kullanılan birbirinden tamamen farklı enzimler büyük ölçüde başarısız olmuştur. Fakat doğadaki bazı bakterilerden elde edilen alkalofilikler proteazların tüy giderme yönteminde etkili bir şekilde yardımcı olduğu görülmüştür (Horikoshi ve Akiba, 1982; Sharpe ve Munster, 1986). 1.5. Elektroforez İyonlaşabilir gruplara sahip amino asitler, peptidler, proteinler, nükleotidler ve nükleik asitler gibi biyolojik moleküller, ayırıcı bir ortamın bulunduğu elektriksel 10

1.GİRİŞ alanda, sahip oldukları elektrik yüküne bağlı olarak, anod veya katoda bölgesine göç ederler. Moleküller aynı yüke sahip olsalar dahi, molekül ağırlık farklılığı nedeniyle sahip olunan yükün molekül ağırlığına oranı (yük/kütle) farklı olacaktır. Bu farklılıklar sayesinde solüsyon içindeki iyonlar bir elektriksel alana tabii tutulduklarında moleküllerin göçüne yönelik farklılıklar ortaya çıkar. Elektroforez için gereken gereçler güç kaynağı ve elektroforez tankından oluşur. Güç kaynağı elektrodlar arasında doğru akımın dengeli ve düzgün şekilde akışını sağlayarak elektriksel alanın istenilen özellikte oluşmasını neden olur. Elektriksel alanda sürekli olarak, pozitif yüklü moleküller negatif kutba, negatif yüklü moleküller pozitif kutba doğru göç ederler. Örnekler elektroforezin düzgün gerçekleşmesi için tampon içinde çözülürerek hazırlanmalıdır. Ayrıca elektroforezde istenilen başarının elde edilmesi için ayırıcı ortamın mutlaka elektroforez tamponu ile hazırlanması şarttır. ph değişikliği elektroforezi yapılan molekülün iyonik yükünü değiştirebileceğinden, tampon ph sının stabil tutulması önemlidir. Ayırıcı ortam olarak filtre kağıdı, selüloz asetat, agaroz, nişasta, agar veya poliakrilamid gibi sitemler kullanılabilir. Her sistemin ayırma gücü bir birinden farklılık gösterir. Elektroforez işlemi ayırıcı ortamın konsantrasyonu, ortam sıcaklığı, uygulanan akımın türü ve şiddeti, kullanılan tamponun iyonik gücü, elektroforez süresi, molekül şekli ve ağırlığı gibi parametrelerden etkilenmektedir. Elektrodlar arasındaki akımı genel olarak tampon iyonları az bir kısmı örnek iyonları iletilir. Voltajdaki iletilen toplam yükün artışına neden olur. Sıcaklık artışı elektroforez sırasında direncin düşmesine neden olur. Isı artışı tomponun buharlaşmasına neden olduğunda iyonik gücün değişmesine yol açar. Elektroforez düzeyi örneğin net elektriksel yükü arttıkça artacaktır. Diğer taraftan molekül büyüklüğü arttıkça göç oranı düşecektir. Örnekler aynı molekül büyüklüğüne sahip olsalar bile moleküllerin globüler ya da fibröz oluşu moleküllerin göçünde farklılığa neden olacaktır. Elektroforez işlemi, kullanılan tamponun bileşimi ve iyonik yükünden farklı şekilde etkilenir. Yaygın olarak kullanılan tamponlar agaroz için tris-asetat, trisfosfat ve tris-borat, poliakrilamid için tris-glisin karışımlarıdır. Örnekle bağlanma davranışı göstermeyen tamponlar molekülün göç oranını değiştirirken, 11

1.GİRİŞ karbonhidratların analizinde kullanılan borik asit tamponu moleküle bağlandığı için elektroforezde olumsuzluğa yol açar. Aynı şekilde tamponun iyonik gücü artarsa, tampondan geçen elektrik akımı artacaktır (Aygan, 2008). 1.6. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) Sistemi Proteinlerin molekül ağırlıklarını belirlemede en yaygın kullanılan yöntem poliakrilamid jel elektroforez tipidir. Sodyum dodesil sülfat (SDS) bir anyonik deterjan olup, proteinlere sıkıca bağlanarak proteinlerin denatürasyonunu sağlar. Yaklaşık 1 g proteine 1.4g SDS bağlanır. Proteinler, birim kütle başına sabit negatif elektriksel yük kazanırlar. Yani SDS, protein molekülünde her üç aminoasitlik birime bağlanarak proteinlere homojen negatif bir yük kazandırır. Böylece proteinler yük bakımından eşitlendiği için moleküler ağırlıklarına göre separasyonları geçekleşecektir. Oluşan SDS-protein kompleksi elektroforez sırasında anoda doğru göç ederler. Jelin moleküler elek özelliğinden dolayı belirli bir sürede katettikleri mesafe moleküler ağırlığa göre proteinden proteine farklılık gösterecektir. Moleküler ağırlığı bilinen standart bir protein ile analizi yapılacak örnek aynı ortamda yürütülecek olursa, örnek proteinlerin moleküler ağırlıkları bulunabilir. Standart SDS-PAGE uygulamaları dikey elektroforez şeklinde gerçekleştirilir. Protein örnekleri genellikle ph sı 6,8 olan örnek hazırlama tamponu içinde çözülür. Bu tampon denatüran olarak SDS, disülfit bağlarını indirgeyen b- merkaptoetanol, yoğunluk oluşturan sükroz veya gliserol ve bromfenol mavisi içermektedir. Elektroforez uygulamasında kullanılan jel, genellikle stacking (dengeleme) ve separating (ayırma) jeli olarak iki kısımdan oluşur. Her iki jel de içerdikleri akrilamid konsantrasyonları bakımından birbirlerinden farklılık gösterir. Bu iki jeldeki ph ve konsantrasyon farklılığı sayesinde, protein karışımlarının birbirlerinden ayrılması ve belirgin bandlar oluşması sağlanır (Aygan, 2008). Analiz edilecek örnek, bir izleme boyası ile (Brom-Phenol Blue) birlikte jelin üst kısmında oluşturulan kuyucuklara uygulanır ve sistemden elektrik akımı geçirilir. Örnekteki bileşenlerden daha hızlı hareket eden izleme boyası jelin bitimine 12

1.GİRİŞ ulaştığında akım kesilir, jel protein boyama karakterindeki bir boya ile (Coomassie- Brillant Blue R-250, G-250, gümüş boyama gibi) boyanır. Moleküler ağırlık hesaplamaları yapılacak uygulamalarda jeldeki kuyucuklardan birine marker protein uygulanır. Marker proteinin jelde göç ettiği mesafe, örnekler ile kıyaslanarak moleküler ağırlık Da veya kda olarak saptanır (Kuzu, 2008). Bu çalışmada alkali ph değerlerinde ve düşük sıcaklıkta aktivite gösteren proteaz enzimi sentezleyen üreticilerinin izolasyonu, enzim üretimi ve kısmi saflaştırılmış enzimin karakterizasyonu amaçlanmıştır. 13

1.GİRİŞ 14

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Morita ve ark (1997), 10 C de gelişen Serratia marcescens AP3801 suşunda proteaz aktivitesi saptamışlardır. Enzim iyon değiştirme ve gel filtrasyon kromotogofisi ile besi yerinden saflaştırılmıştır. Enzimin moleküler ağırlığının 58 kda izoelektirk noktasının 6.0 olduğunu saptamışlardır. Enzimde 40 C ve ph 6.5-8 arasında maksimum aktivite gözlemişlerdir. Enzim aktivitesinin 1,10-phenanthroline ile inhibe olması nedeniyle enzimin metalloproteaz olduğunu belirtmişlerdir. Moon ve ark (1994), Bacillus subtilis RM615 suşundan, skimmilk besi yerinde ektraselüler proteaz üretmişlerdir. Saflaştırılan enziminin SDS-PAGE analizi sonunda 28 kda moleküler ağırlığa sahip olduğu saptanmıştır. Enzimin PMSF ve STI ile inhibe olması buna karşılık EDTA, o-fenantrolin, elastatinal, histidin, leopeptin ile aktivitesini koruması nedeniyle enzim serin proteaz şeklinde tanımlanmıştır. AprA enzimi 25ºC de 5M üre ve %1 SDS ile 1 saat muamele edildiği zaman aktivitenin sırasıyla %75 ve % 82 azaldığını bildirmişlerdir. Enzim ph 6.0-12.0 ph aralığında yüksek düzeyde aktivite göstermiştir. İzole edilen enzim 25ºC ve ph 12.0 de 24 saat bekletildiği zaman başlangıç aktivitesinin %85 korumuştur. Enzimin 70ºC ve ph 11.0 de 30 dakika inkübasyondan sonra orijinal aktivitesinin %71 olduğunu bildirmişlerdir. Morita ve ark (1997), somon barsakları, yengeç ve karlı toprak ortamlarından izole edilen bakterilerdeki amilaz, lipaz ve proteaz enzimlerini araştırmışlardır. Çalışmada bir adet amilaz ve lipaz ile üç adet proteaz enziminin karakterizasyonunu gerçekleştirmişlerdir. İzole edilen enzimlerin 30-40 C sıcaklık aralığında hızlıca inaktif olduğunu saptamışlardır. Bu sonuçlara göre izole edilen enzimler soğukta aktif olarak değerlendirilmiştir. Somon barsaklarından izole edilen suş 16S rrna analizi sonucu Flavobacterium balustinum olarak adlandırılmış ve çok iyi bir soğukta aktif proteaz üretisici olduğu belirlenmişlerdir. Suşun en iyi üreme sıcaklığı 20 C olduğu halde suştan izole edilen enzimin 10 C de yüksek katalitik aktivite gösterdiği belirtilmiştir. Venugopal ve Saramma (2007), Bacillus circulans BM15 izole etmişler. 15

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Amonyum sülfat çöktürmesi ile proteaz saflaştırmışlar ve SDS-PAGE ile zimogram analizi sonunda moleküler ağırlığının 30 kda olduğunu bildirmişleridir. Enzimin optimum aktivitesini ph 7.0 ve 40ºC de gösterdiği alkali ph larda (ph 7.0-11.0) stabil olduğu ve 55ºC de 1 saat inkübasondan sonra stabilitesini koruduğu saptanmıştır. Hg +2, Zn +2, Co +2 ve Cu +2 ile enzim aktivitesi tamamen inhibe olurken Ca +2, Mg +2, K + ve Fe +3 ile biraz arttığını bildirmişlerdir. PMSF ve EDTA aktiviteyi inhibe ederken, metalloproteaz inhibitörü 1,10 fenantrolin ile inhibisyon görülmemiştir. Enzimin çeşitli ticari deterjanlar ile SDS, Triton-X100 ve H 2 O 2 kullanılarak 1 saat inkübasyon gerçekleştirildiğinde stabil olduğunu bildirmişlerdir. Dodia ve ark (2007), Mısır ın batısındaki Saurashtra deniz kıyısında alkali proteas salgılayan haloalkalifilik bakteri izole etmişlerdir. Alkali proteazın SDS- PAGE ile moleküler ağırlığının 40 kda olduğunu saptamışlardır. Enzim ph 8.0-13.0 boyunca stabil olduğunu ve optimum ph 9.0-11.0 olduğunu bildirmişlerdir. 0-4M NaCI da stabil olduğunu ve 37ºC de optimum katalizi için 150 mm NaCI ün gerekli olduğunu bildirmişlerdir. Enzim 25-80ºC de aktif olduğunu, saflaştırılan enzimin 37ºC de optimum sıcaklığa sahip olduğu ancak 2 M NaCI varlığında 80ºC ye değişmiş olduğunu bildirmişlerdir. NaCI sadece sıcaklığı değil aynı zamanda substrat afinitesini artırmış olduğunu bildirmişlerdir. Enzimin Ca a bağlı olduğunu ve 2 mm Ca ile 50ºC de maksimum aktiviteye ulaşıldığını bildirmişlerdir. Enizim 37-90ºC de yüksek termostabilite göstermekle birlikte saflaştırılan enzim 50ºC nin üzerinde stabilitesini kaybettiği ve yarı ömrünün 60ºC de 1 M NaCI ve 50 mm Ca +2 ile sırasıyla 30 ve 7 kat arttırdığı bildirilmiştir. Enzim aktivitesinin PMSF ile inhibe olmasıyla enzimin serin tip olduğunu belirtmişlerdir. Aktivitenin %0.2 Tween-80 ve %0.05 Triton X- 100 ile az oranda değiştiğini, SDS ile çok az olarak düştüğünü bildirmişlerdir. Son ve Kim (2003), Bacillus amyloliquefaciens S94 den ekstraselüler proteaz saflaştırmışlardır. Enzim aktivitesinin serin proteazın genel inhibitörü PMSF ile güçlü inhibe olması enzimin bir serin proteaz olduğunu düşündürmüştür. Enzim aktivitesi lösin peptidas inhibitörü bestatin ile inhibe olması enzimin lösin endopeptidaz olduğunu düşündürmüştür. Maksimum proteolitik aktivite farklı 16

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR protein substratlarına karşı ph 10.0 ve 45ºC de (protein substrat) ve ph 8.0 ve 45ºC de (sentetik substrat) meydana gelmiştir. Proteaz ın soğuk uyumlu protein özelliğine sahip olduğunu özellikle düşük sıcaklıklarda 15-45ºC de sentetik substratın hidrolizinin daha aktif olduğunu bildirmişler. Morita ve ark (1998), somon un (Oncorhynchus keta) barsaklarından Flavobacterium balustinum P104 suşunu izole edip besi yerinde proteaz aktivitesini tespit etmişler. İyon değiştirme ve gel filtrasyon kromotogofisi ile besi yerinden saflaştırmışlardır. Moleküker ağırlığı 70 kda olduğunu ve izoelektrik noktasının 3.5 olduğunu tespit etmişlerdir. ph 7.0-9.0 ve 40 C de azokazein doğrultusunda maksimum aktivite gözlemişlerdir. Phenylsulfonyl fluoride ile kuvvetle inhibe olması bu enzimin bir serine proteaz olduğunu düşündürmüştür. Joo ve ark (2000), Periserrula leucophyra dan serine proteaz saflaştırmışlar. Saflaştırılan proteaz enziminin SDS-PAGE ile moleküler ağırlığının 28 kda olduğunu göstermişlerdir. Enzim optimum ph 10.0 olduğunu ve ph 4.0-12.0 arasındada stabilitesini koruduğu bildirmişlerdir. Proteolitik aktivite 45ºC nin üzerinde stabil ancak 50ºC nin üzerine çıkıldıkça stabilite göstermemiştir. Enzim aktivitesi için Ca +2 gerekmemektedir. Çeşitli ağır metaller örneğin Cd +2 ve Mg +2 proteaz aktivitesini etkilememiş, enzim %5 SDS ile inaktif olmamıştır aktivitesini %50 sürdürmüş. Chen ve ark (2003), soğuk uyumlu proteaz MCP-01 i derin denizlerdeki psikrofilik bakteri Pseudoaltermonas sp. SM9913 suşundan elde etmişler. 59 mm lık dört farklı tamponun enzim üzerine etkisi termostabilitesi ve otolizi incelemişler. MCP-01 in otoliz süreci kapiller elektroforez tarafından belirlenmiştir. MCP-01 in termostabilitesi sırasıyla karbonat, tris, fosfat, borat tamponları ile gittikçe artmıştır. Kazein in hidrolizi için en uygun sıcaklıkta aynı oranda artmıştır. Her iki enziminde ticari sıvı ve katı deterjanlara eklenmesinin uygun olduğunu görmüşler ve çok iyi stabilite göstermişlerdir. Zeng ve ark (2003), Pseudomonas DY-A suşundan soğukta-aktif serine alkali protease enzimi saflaştırmışlar. Suşun optimal gelişimi ve proteaz üretim sıcaklığı 10 C olduğunu saptamışlardır. Suş sadece 20 C nin altında proteaz salgılıyor olduğunu bildirmişler. Enzimin 40 C ve ph 10.0 da oldukça aktif olduğunu 17

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR saptamışlardır. Phenylmethyl sulfonylfluoride ve diisopropyl fluorophosphate ile inhibe olduğunu göstermişler. EDTA, EGTA, 1,10-phenanthroline ve 2,2-bipyridyl aktivitede azalma görmüşler. Native PAGE ve SDS-PAGE ile moleküler ağırlının 25 kda olduğunu tespit etmişlerdir. Naidu ve Devi (2005), deterjan endüstrisinde kullanmak için topladıkları topraklardan izole ettikleri proteaz üreticisi mikroorganizmaların Bacillus türleri olduğunu tanımlamışlardır. Pirinç kepeği kullanarak termostabil alkali proteaz üreticisi K-30 izole etmişlerdir. Proteaz aktivitesi 96 saatlik inkübasyondan sonra %1 pirinç kepeği içeren besiyerine %4 lük inokülüm ile ph 9.0 da 55 o C optimum koşullar olduğunu saptamışlardır. Enzim üretimi için nişasta, laktoz, sükroz olmakla birlikte en iyi azot kaynağı et özütü, tripsin, maya özütü olduğunu saptamışlardır. Ektraselüler enzimler birçok ticari deterjanlara uygun ve termostabil olması deterjanlara eklenerek deterjan endüstrisi uygulamalarını düşündürmüştür. Wang ve ark (2005), Colwellia NJ341 suşundan alkali serine protease izole etmişler. Enzimin SDS-PAGE ve MALDI-TOF analizi sonucunda moleküler ağırlığını 60 kda olduğunu göstermişlerdir. İzole edilen enzim optimum aktivitesini 35 C ve ph 5.0-12.0 aralığında göstermiştir. PMSF ile tamamen inhibe olduğunu görmüşler. Chi ve ark (2007), Çin in Qingdao tuz gölü sedimentinden izole ettikleri Aureobasidium pullulans ın yüksek verimde proteaz üretebilmekte olduğunu tespit etişlerdir. 2.5 g çözünür nişasta ve 2.0 g NaNO 3, 100mL denizsuyu içeren ve başlangıç ph 6.0 olan ortamda 24.5ºC 30 saatlik fermentasyondan sonra maksimum enzim üretmişlerdir. Proteaz ın ph 9.0 ve 45ºC çok yüksek aktiviteye sahip olduğunu bildirmişlerdir. Olivera ve ark (2006), ılımlı alkalifilik bakteri olan Bacillus patagoniensis PAT 05 T suşunun ekstraselüler proteolitik aktivite gösterdiğini bulmuşlardır. Suşun yüksek alkali ve tuzlu ortamda geliştiğini ve önemli seviyelerde proteolitik aktivite sergilediğini göstermişlerdir. SDS-PAGE ve zimogram analizi ile moleküler ağırlığının 29.4 kda olduğunu ve izoelektrik noktasının 10.3 ten büyük olduğunu göstermişlerdir. Bunun dışında 2 tane aktivite bandı açığa çıkartmışlardır.. Optimum sıcaklığın yaklaşık 60ºC olduğunu ve maksimum aktiviteyi ph 9.0-12.0 arasında 18

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR gösterdiğini belirlemişlerdir. %10 H 2 O 2, 10mM 1,10 fenantirolin, %1 Triton-X100 ve %1 Tween-20 den etkilenmemiştir. 2 M NaCI de %63, %1 SDS de %73, 10 mm EDTA da %80 den fazla aktivite saptamışlardır. Joshi ve ark (2007), tatlı su gölünden ılımlı soğukta-aktif ektraselülar proteaz üreten bakteri izole etmişlerdir. İzolatın gram (+), çubuk şeklinde organizma olduğu belirlenmiş ve Bacillus cereus MTCC 6840 olduğunu tanımlamışlardır. Maksimum enzim üretimi 25 C ve ph 9.0 da 24 saatte gerçekleşmiştir. Organizmanın maksimum proteaz üretimini desteklemek için azot kaynağı olarak pepton ve maya özütü, karbon kaynağı olarak fruktoz kullanmışlardır. Fe ++ ve Co ++ enzim aktivitesini stimüle etmiştir. Ca ++, Cu ++, K +, Mg ++ ve Mn ++ farklı derecelerde inhibe etmiştir. NaCI, SDS ve aseton da proteazın son derece stabil olduğunu bulunmuşlardır. EDTA ve PMSF ile muamele sonucunda enzim aktivitesinde önemli bir kayıpsaptamışlardır. Enzimin optimum katalitik aktivitesini 20 C ve ph 9.0 da gösterdiğini saptamışlardır. Wang ve ark (2008), Psikrofil bakteri olan Pseudoalteromonas NJ276 suşundan ekstraselüler soğukta aktif proteaz saflaştırmışlar. Saflaştırılan enzimin SDS-PAGE ile moleküler ağırlığının 28 kda olduğunu göstermişlerdir. Enzimin optimum aktivitesini ph 8.0 ve 30 C de gösterirken ph 7.0-9.0 arasında stabil olduğunu saptamışlardır. Enziminin PMSF ile tamamen inhibe olduğu belirtmişlerdir. Metal tuzları ile kısmen inhibe olduğu ve 0-3M NaCl konsantrasyonlarına yüksek derecede toleranslı olduğunu bildirmişlerdir. Haddar ve ark (2009), Bacillus mojavensis A21 den 2 deterjana stabil alkali serin proteazlar (BM1 ve BM2) saflaştırmışlardır. BM1 ve BM2 enzimlerinin SDS- PAGE ile moleküler ağırlıklarının sırasıyla yaklaşık 29 ve 15.5 kda olduğunu tespit etmişlerdir. Her iki enzimde optimum aktiviteyi 60 o C de göstermiştir. 19

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 20

3.MATERYAL VE METOD 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Çalışmada materyal olarak bakteri izolasyonu ve identifikasyonunda kullanılan kimyasallar, toprak örneklerinden izole edilmiş Bacillus sp. bakterileri kullanılmıştır. Ekipman olarak su banyosu, UV Visible spektrofotometre, soğutmalı santrifuj, PAGE elektroforez sistemi ve otoklav kullanılmıştır. 3.1.1. Kullanılan Çözeltiler ve Tamponlar 3.1.1.1. NaOH Çözeltisi Besiyerlerinin ph sını ayarlamak ve tampon çözeltilerin hazırlanması amacı ile 0.2 N ve 2 N NaOH çözeltisi kullanılmıştır. 3.1.1.2. Etanol Sıvı besiyerlerinde üretilen enzimlerin çöktürülmesi amacı ile daha önceden soğutulmuş %96 lık soğuk etanol kullanılmıştır. 3.1.1.3. Sodyum Fosfat Tamponu (100 mm, ph 7.0) Çöktürme sonucu elde edilen enzimin çözülerek sıvılaştırılması için kullanılmıştır. 3.1.1.4. Sodyum-Fosfat Tamponu Enzimin ph 6.0-8.0 arasındaki aktivite değerinin saptanmasında kullanılmıştır. Tamponun hazırlanmasında 0.2 M NaH 2 PO 4 ile 0.2 M Na 2 HPO 4.7H 2 O ve distile sudan uygun hacimlerde alınarak karıştırılır ve istenilen ph değerine sahip yeni 21