3. ÇEVRE MİKROBİYOLOJİSİ LABORATUARINDA KULLANILAN CİHAZLAR VE MALZEMELER Bu kısımda mikrobiyoloji laboratuarı çalışmalarında kullanılan çeşitli cam malzeme, alet ve cihazların özellikleri kısaca anlatılacaktır I. OPTİK ALETLER Büyüteç: Büyütme güçleri düşük ( 5-15 defa) olan bir sap takılmış veya takılmamış olan merceklerdir. Bakteri kolonilerinin incelenmesinde kullanılır. Genellikle gözden 20-25 cm uzakta tutularak ve objeye yakınlaştırıp uzaklaştırmak suretiyle uygun pozisyonda inceleme yapılır. Mikroskoplar: Çevre Mühendisliği mikrobiyolojisinin kapsamı içinde mikroorganizmaların çoğu çok küçük olduklarından çıplak gözle görülemezler. Görülebilmeleri için çok fazla büyütülmeleri gerekir. Bu büyütmeyi bize sağlayan mikroskop, mikrobiyolojik çalışmalarda en çok kullanılan, vazgeçilmez bir alettir. Genel anlamda mikroskop, küçük cisimleri büyüterek görünümlerini sağlayan merceklerden yapılmış bir alet olarak tarif edilebilir. Sözcük olarak latince; MICROS (Küçük) ve SKOPEIN (Müşahade etme) kelimelerinin birleştirilmelerinden meydana gelmiştir. - Işık Mikroskobu Bunlarda büyütme optik mercekler sistemiyle elde edilir. Başlıca çeşitleri şunlardır: 1. Aydınlık Saha Mikroskobu (Işık Mikroskobu) 2. Karanlık Saha Mikroskobu 3. Floresans Mikroskobu 4. Faz Kontrast Mikroskobu 5. Ultraviyole Mikroskobu - Elektron Mikroskobu İsminden de anlaşılacağı üzere, büyütme ışık dalgaları yerine elektromanyetik alanlar bulunmaktadır. Virüslerin incelenmesinde kullanılır. Bununla birlikte bakterilerin, mantarların, protozoaların ince yapılarının ve organellerinin incelenmesinde de kullanılır.
Bizim üzerinde duracağımız, daha çok çalışmalarımızda kullanacağımız "ışık mikroskobu" dur. Işık Mikroskobu: Görünür ışığı kullanarak yaklaşık 40 3000 defa büyütebilen kompleks bir mercekler sistemidir. Rutin olarak mikrobiyoloji laboratuarlarında, mikroorganizmaların incelenmesinde ve öğrenci uygulamalarında kullanılır. Özel bir ışıklandırma sistemine ihtiyaç göstermeyen yani güneş ışığı veya elektrik lambası ışığı ile çalışan mikroskoplardır. Çalışırken başarılı sonuç elde edebilmek için mikroskop ve ışık mümkün olan en iyi koşullarda kullanılmalıdır. Bundan dolayı mikroskop kullanılması ve bakımı için yeterli bilgiye sahip olmak önemlidir. Işık mikroskobu başlıca üç kısımdan oluşmaktadır: - Optik kısım - Aydınlatma kısmı - Mekanik kısımı Şekil 1. Işık mikroskobunun şematik görünümü 1. Optik kısım: Mikroskobun preparatta bulunan cisimleri uygun bir şekilde aydınlatan ve cisimden büyütülmüş bir görüntü veren kısımdır. Objektif ve oküler' den oluşur. Bunlar birer mercek sisteminden yapılmış olup, mikroskobun en kıymetli parçalarıdır. a) Objektifler: Çeşitli büyüme kapasitelerine sahip olan objektifler birçok mercekten meydana gelmiş olup, kapalı bir madeni sistem içinde bulunurlar. Objektifler büyütme amaçlarına göre 4 veya 5 adet olabilirler. Optik kısmın yerleştirilmiş ve orta ekseni etrafında dönebilen bir tablaya (revolver) büyütme güçlerinin artış sırasına göre vidalanmışlardır.
Üzerlerine de büyütme oranlarını bildiren, 10x, 40x, 90x veya 100x gibi rakamlar ile her objektifin nümerik açıklığını ( N.A ) ifade eden 0.30, 0.75, 1.00 ve 1.25 sayılar bulunur. Objektiflerin büyütmeleri arttıkça alt uçlarındaki merceğin göründüğü açıklık çapı da küçülür. Mikrobiyolojik amaçlar için kullanılan mikroskoplarda iki türlü objektif vardır. - Kuru objektifler - İmmersiyon objektifler Kuru objektifler: Bu objektiflerin odak uzaklığı kısadır ve odaktan biraz aşağıda olan cisimden gerçek, ters ve büyütülmüş bir görüntü verir. Objektifler, mikroskop tüpünün altına yerleştirilmiş ve orta eksen etrafında dönebilen bir tabla (revolver) deliklerine vidalanarak ve Kuru objektifler nispeten daha az büyüktürler. Üzerlerine de büyütme oranlarını bildiren, 10x, 40x, 90x veya 100x gibi rakamlar ile her objektifin nümerik açıklığını (N.A.) ifade eden 0.30, 0.75, 1.00 ve 1.25 gibi sayılar bulunur. Objektiflerin büyütme dereceleri arttıkça alt uçlarındaki merceklerin göründüğü açıklık çapı da küçülür. Kuru objektifler büyütme güçlerine göre küçük ve orta büyütmeli olmak üzere iki çeşittir. - Küçük Büyütmeli (kuru) Objektif ( 10x ): Gözetleme pozisyonuna getirilir ve preparatın üzerine indirilir. Kaba ayar düğmesi ile objektifler yükseltilerek görüntü odaklanır ve ince ayar düğmesi ile de netleştirilir. Diyaframla ışık şiddeti kontrol edilir. - Orta Büyütmeli (kuru) Objektif (40x): Küçük büyütmeli objektiften revolverin döndürülmesi ile mikroskoptaki görüntü orta büyütmeli objektifle odaklanır.eğer görüntü tam olarak görünmüyorsa, kaba ayar ile objektifler biraz aşağıya indirilerek görüntü ayarlanır. Yani objektif, lam ile arada küçük bir aralık kalıncaya kadar yavaşça indirilir. Objektif lama dokundurulmaz. Okülerden bakıp net bir görüntü elde edilinceye kadar objektif yavaşça yukarıya doğru kaldırılır, ince ayar ile görüntüyü netleştirme işlemi tamamlanır. Görüntüde netleşme olmadığı takdirde yükseltme işleminin hızlı yapılmasından dolayı ilk bakıştaki işlemler tekrarlanır. Hiç bir zaman okülerden bakarken objektifi aşağıya doğru indirerek görüntüyü netleştirmeye çalışılmamalıdır. İmmersiyon Objektifi (90x ve 100x): Bunlar daha büyük büyütme elde etmek için yapılmışlardır. Ancak bu tip objektiflerde kullanılan merceklerin odak noktalan ve yan çapları çok küçük olacağından, immersiyon objektiflerle çalışırken iyi bir inceleme yapmak, resolusyonu arttırmak için, preparat ile objektif arasına sedir yağı (immersiyon yağı) konur. Sedir yağının kırılma (refraksiyon) indeksi (1.535), lamınki ile yakın değerde olduğundan,
kondansörden gelerek lamdan geçen ışınlar kırılmadan sedir yağından düz olarak geçerek içeri girerler. Eğer sedir yağı kullanılmazsa, obje ile objektif arasında hava bulunacağından bunun kırma indeksi 1.00 olduğundan lamdan geçen ışık, objektife girmeden tekrar yanlara doğru kırılacak ve objektife az ışık girecektir. Buda iyi ve net bir görüntü sağlamaz. Sedir yağı kullanınca çok daha aydınlık bir saha elde edilir. İmmersiyon objektifi kullanırken görüntüyü netleştirme işlemi orta büyütmeli objektiflerin aynısıdır. Yalnız burada resolusyonu arttırmak için preparat ile objektif arasına immersiyon temas edinceye kadar dikkatlice indirilir. Immersiyon objektiflerinin çalışma aralığı son derece küçük olduğundan ilk başlarda görüntünün netleştirilmesinde güçlük çekilebilir. Objektif lama değdirilmeden biraz daha indirilir. Okülerden bakılarak, ince ayar ile objektifi yükselterek görüntü netleştirilir. Yağ filmini bozduğu veya görüntü bulunmaksızın objektif lamın üzerinde 2-3 mm' den fazla yükseldiği takdirde yukarıdaki ilk işlemler tekrarlanır. Görüntü yeri belirlenip netleştirildiğinde, optimum ışıklandırma için diyafram aralığı ayarlanır. Objektifin amaçları 1. Objenin herhangi bir yerinden gelen ışınları birleştirmek. 2. Bu ışınlan odak noktasında toplamak. 3. Odak noktasında oluşan imajı büyütmektir. b)oküler: Optik kısmın gözle bakılan ve tüpün üst kısmına konulan parçasını oluşturur. Okülerde de büyütmesine göre numaralar (7x, 10x) bulunur. Okülerin görevi: objektif tarafından oluşturulan obje imajını büyütmek ve objektifin bazı hatalarını düzeltmektir. Oküler genellikle 2 ve bazen 3 mercekten oluşur. Bazı mikroskoplarda tek oküler bulunur. Buna monoküler, çift oküler varsa, buna da binoküler mikroskop denir. Binoküler sistemde başlığın sağa sola dönmesi ve eğik olması nedeniyle de, monoküler sisteme oranla, daha rahat ve kolay bir bakış sağlar. Büyütme: Mikroskobun büyütmesi, objektifler üzerindeki numaralar ( 10x, 40x, vb. )ile oküler üzerindeki sayıların ( 7x, 10x...) çarpımına eşittir: Örneğin: Objektifi 100x ve oküler 10x ise objenin büyümesi 100 x 10= 1000' dir.
Nümerikal apertür ( N.A.) : Bir mikroskobun numerikal apertürü (aralığı), bunun resolusyon kuvvetinin bir ölçüsünü ifade eder. Bu açıklık ne kadar fazla olursa resolusyon kuvveti de o kadar fazla olur. Nümerikal aralığı büyük olan objektifler sedir yağı ile kullanılan immersiyon objektifleridirler. Resolusyon: Bu terim, birbirine çok yakın olan iki cismin bir mercek tarafından ayırt edebilme yeteneğini ifade eder. Resolusyon aynı zamanda, ışığın dalga uzunluğu ve N.A. ile 2. Aydınlatma Kısmı Lam üzerine konan objeyi aydınlatmak için ışık kaynağı, bu ışığı obje üzerine doğru yansıtan veya yönlendiren ayna ve ışığı üzerinde toplayan kondansörden oluşur. a) Işık Kaynağı: Mikroskoplarda objeyi aydınlatmak için genellikle elektrikle çalışan, mikroskobun dışında veya içine monte edilen ışık kaynakları kullanılmaktadır. Işık kaynağının bulunmadığı durumlarda güneş ışığından da yararlanılır. Detaylı inceleme ve hassas bir çalışma için elektrik ışığı iyi sonuç verir. Preparatı aydınlatmak ve iyi bir ışık ayarı yapmak için kondansör kullanılır. b) Ayna: Mikroskop üzerine monte edilmiş, bir yüzü konkav (içbükey) ve diğer yüzü düz olan aynalar, ışık kaynağından gelen ışınları kondansöre ve dolayısıyla obje üzerine yansıtırlar. Konkav yüz daha fazla ışık topladığı için immersiyon objektifıyle çalışmalarda kullanılır. Bazı mikroskoplarda ışık kaynağı tam kondansörün altına monte edildiği için ayna bulunmayabilir. Bazılarında ayna mikroskobun içine monte edilmiştir. c) Filtre: Kondansörün altında bulunan özel ve halka şeklindeki yere ışık kaynağından gelen ışınları süzen mavi, yeşil, mat filtreler konarak iyi görüntü sağlanmaya çalışılır. d) Diyafram: Lambadan gelen ışığı gereğine göre az veya fazla oranda kondansöre girmesini sağlamak için kondansörün altında diyafram bulunur, immersiyon çalışmalarında diyafram tam açılarak içeri fazla ışık girmesi ve objenin aydınlatılması sağlanır. Buna karşılık hareket muayenelerinde ise diyafram gereği kadar kapatılarak iyi bir kontrast (görüntü) sağlanır. e) Kondansör: Bir mikroskopta kondansörün esas görevi, ışığı obje üzerinde toplamak ve yeterince aydınlatmaktır. Genellikle 2 mercekten oluşan kondansörler bir düğme (kramayer) ile aşağı yukarı iner çıkarlar ve ışığın iyi bir fokus (odak) olmasını sağlarlar. 3. Mekanik Kısım Bu kısım; gövdeyi oluşturan, dayanıklı metalden yapılmış olup, tüp, kol, hareket vidaları, tabla ve ayak dan meydana gelir. Aydınlatma ve optik kısmında taşıyıcısıdır.
Kol: Optik kısımların bağlandığı ve mikroskobun tutularak taşınmasında kullanılan kısmıdır. Hareket vidaları: Bunlar, mercek sistemini veya tablayı aşağı, yukarı hareket ettirerek, preparatın objektife yaklaşmasını veya uzaklaşmasını sağlayan büyük ve küçük vidalardan oluşmuştur. Makro vida olarak adlandırılan büyük vida kaba ayarı yapmaya, mikrovida olarak adlandırılan küçük vida ise netlik ayarı yapmaya yarar.genellikle iç içe iki vida halinde monte edilmiş olup, dıştaki büyük olan vida makro vida, içteki küçük olan vida ise mikro vidadır. Tabla: Preparatın yerleştirildiği, ortası delik olan kısımdır. Işık kaynağından gelen ışık, bu delikten ve preparattan geçerek objektife ulaşır. Tabla üzerinde preparatın tutunmasını ve hareket ettirilmesini sağlayan şaryo adı verilen sürgü sistemi bulunmaktadır. Şaryonun vidaları ile preparat yukarı - aşağı, sağa - sola hareket ettirilebilir. Ayak: Mikroskobun üzerine oturduğu ve onun dik durmasını sağlayan en alttaki taban kısmıdır. Mikroskobun Temizliği Ve Özel Önlemler Oküler ve objektif merceğini temizlemek için mercek kağıdı kullanılır. Mikroskop kullanılmaya başlamadan önce, mercekler mercek kağıdı ile silinir, ilk önce mercekleri çizebilecek büyük partikülleri temizlemek için mercek üzeri kağıt ile yumuşak bir şekilde süpürülür. Bundan sonra mercek yüzeyinde kalmış herhangi bir yağ kalıntısı varsa bu temizlenir. Her kullanımı mütakip mercekler aynı şekilde temizlenir. Immersiyon objektifi üzerinde kurumuş immersiyon yağını veya mikroskop tablası üzerindeki herhangi bir döküntüyü temizlemek için %30 ksilen (ksilol) - %70 alkol çözeltisi veya benzen kullanılır. Ksilen objektifin merceklerini tutan yapıları erittiğinden çok az miktarda kullanılmalıdır. İnceleme bittikten sonra preparat antiseptikli çözelti içine atılır yada sonra incelemek istenirse bir petri kutusu içinde saklanır. İmmersiyon yağı (sedir yağı) ile çalışırken mikroskobu eğmeyiniz. Aksi halde yağ aşağıdaki mekanik sistemlere akarak hareketi zorlaştırır. Mikroskobu Kırmaktan Kaçınmak İçin Hiç bir zaman mikroskoba zor kullanmayın. Eğer herhangi bir şey doğru çalışmıyorsa kendi kendinize yerine yerleştirmeye çalışmayınız. Hemen laboratuar sorumlusunu çağrınız.
Objektiflerin hiçbir zaman lama dokunmasına izin vermeyiniz. Asla kaba ayar düğmesiyle görüntüyü netleştirmeye çalışmayınız. Farklı mikroskopların oküler veya objektiflerini hiç bir zaman değiştirmeyiniz. Kesinlikle objektiflerin yerlerini değiştirmeyiniz.