BALIKLARDA VE SULARDA MİKOBAKTERİLERİN PCR-RFLP ANALİZİ İLE İNCELENMESİ

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BALIKLARDA VE SULARDA MİKOBAKTERİLERİN PCR-RFLP ANALİZİ İLE İNCELENMESİ Bülent BAŞ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. K.Serdar DİKER 2011- ANKARA

iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler ii iii v vi vii viii 1.GİRİŞ 1 2.GEREÇ VE YÖNTEM 25 2.1. Gereç 25 2.1.1.Standart Suşlar 25 2.1.2. Örneklerin Toplanması 25 2.1.3. Kullanılan Besiyerleri, Kimyasallar ve Boyalar 27 2.1.3.1. Lowenstein-Jensen Medium Base (Merck,KGaA 64271) 27 2.1.3.2. % 4 NaOH Bileşeni 28 2.1.3.3. Middlebrook 7H9 Broth (Difco) 28 2.1.3.4. Middlebrook ADC Enrichment (BBL) 29 2.1.3.5. Kristal Violet İçermeyen MacConkey Agar (Difco) 29 2.1.3.6. Ziehl-Neelsen Boyama Bileşenleri 30 2.1.4. Bakteriyolojik Muayenelerde Kullanılan Cihazlar 31 2.1.5. PCR Testinde Kullanılan Cihazlar ve Ekipmanlar 31 2.1.6. Primerler 32 2.1.7. Restriksiyon Endonukleaz Enzimleri 32 2.2. Yöntem 32 2.2.1. Nekropsi 32 2.2.2. Direkt Bakteriyoskopi (Ziehl-Neelsen Boyama) 32 2.2.3. Standart Suşların Aktivasyonu 33 2.2.4. İzolasyon ve İdentifikasyon 33 2.2.4.1. Organ Örneklerinden İzolasyon 33 2.2.4.2. Su Örneklerinden İzolasyon 34 2.2.5. İdentifikasyon 34

iv 2.2.5.1. Kristal Violet İçermeyen MacConkey Agar da Üreme 35 2.2.5.2. 68ºC de Katalaz Testi 35 2.2.5.3. Demir Alınımı 35 2.2.5.4. Nitrat Redüksiyon Testi 36 2.2.5.5. Sükroz Kullanımı 36 2.2.6. PCR 36 2.2.6.1. DNA Eldesi (Ekstraksiyon) 36 2.2.6.2. Amplifikasyon 37 2.2.6.3. Nukleik Asitlerin Görüntülenmesi 37 2.2.6.3.1.Agaroz Jel Elektroforezinde Kullanılan Jelin 37 Hazırlanması 2.2.6.3.2.PCR Örneklerinin Elektroforezi ve Görüntüleme 38 2.2.6.4. PCR Saptama Limitinin Belirlenmesi 38 2.2.6.5. RFLP Analizi 39 3. BULGULAR 40 3.1. Nekropsi ve Ziehl-Neelsen Boyama Bulguları 40 3.2. İzolasyon ve İdentifikasyon Bulguları 45 3.3. PCR Bulguları 50 3.4. RFLP-PCR Bulguları 51 3.5. PCR Saptama Limitinin Belirlenmesi 53 4.TARTIŞMA 55 5.SONUÇ VE ÖNERİLER 61 ÖZET 63 SUMMARY 64 KAYNAKLAR 65 ÖZGEÇMİŞ 74

v ÖNSÖZ Balık tüberkülozis i (Fish tuberculosis, Piscine tuberculosis), çeşitli balık türlerinde (tatlı ve tuzlu sularda yaşayan), organ ve dokularda değişik büyüklükte tüberkellerin oluşması ile karakterize olan, kronik ve genellikle sporadik özellikte, bulaşıcı bir infeksiyondur. Son on yılda balık tüberkülozisinin dünya genelinde arttığı rapor edilmektedir. Her ne kadar Mycobacterium marinum, M. fortuitum ve M. chelonae balıklardaki enfeksiyonların başlıca nedenleri olarak düşünülse de yeni türleri de içine alan diğer Non-Tüberküloz Mikobakteri (NTM) türlerinin de balık tüberkülozisi ile ilişkili olduğu ve insanlarda da enfeksiyon yapma potansiyeline sahip olduğu bilinmektedir. Balık tüberkülozisinin etkili bir tedavisi olmamasına karşın değerli balık stokları ve süs balıklarının tedavisi için aktif araştırmalar tüm dünyada yapılmaktadır. Hastalık kültür balıkçılığı sistemlerinde önemli ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bu nedenle ülkemizde pek çalışılmamış ve moleküler düzeyde ilk defa yapılan bu çalışma balık yetiştiriciliğine önemli katkılar sağlayacaktır. Bu ilginç ve orijinal konunun seçilmesinde ve çalışmaların yürütülmesinde büyük katkısını gördüğüm tez danışmanım Prof. Dr. K. Serdar Diker e, tez izleme komitesindeki hocalarım Prof. Dr. Hakan Yardımcı ve Prof. Dr. Rıfkı Hazıroğlu na, çalışmalarım boyunca katkılarını esirgemeyen Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı nın değerli öğretim üyeleri Prof. Dr. Müjgan İzgür, Prof. Dr. Mehmet Akan, Prof. Dr. Ömer M. Esendal, Doç Dr. Barış Sareyyüpoğlu na, emekli öğretim üyesi Prof. Dr. Jale Paracıkoğlu na, çalışmalar süresince yardımlarından dolayı Vet. Hekim Oya Tekin e, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı doktora ve yüksek lisans yapan arkadaşlarıma teşekkürü borç bilirim. Ayrıca, bugüne ulaşmamda sonsuz özveri ile yanımda olan başta annem Saliha Baş olmak üzere tüm aileme ve tezimin her aşamasında desteğini benden esirgemeyen sevgili eşim Sibel Baş a teşekkür ederim.

vi SİMGELER ve KISALTMALAR MÖ Tb NTM LJ ARB ZN m ppm mg kg mm TSA BHIA DNA rrna PCR RFLP GTM HPLC FAME FTS g lt ml M bp g RE CFU Milattan Önce Tüberküloz Non-tüberküloz mikobakteriler Loewenstein Jensen Asido-rezistans bakteri Ziehl-Neelsen Boyama Mikrometre permits per million (milyonda bir parçacık) Miligram Kilogram Milimetre Tryptone Soy Agar Brain-heart İnfusion Agar Deoksiribo Nükleik asit Ribozomal Ribonükleik asit Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism Genotip Mikobakteri Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi Yağ-asidi metil-esterleri Fizyolojik Tuzlu Su Gram Litre Mililitre Molar Base pair mikrogram Restriksiyon enzimi Colony Forming Unit

vii ŞEKİLLER Şekil 1.1. Şekil 3.1. Şekil 3.2. Şekil 3.3. Şekil 3.4. Şekil 3.5. Şekil 3.6. Şekil 3.7. Şekil 3.8. Şekil 3.9. Şekil 3.10. Şekil 3.11. Şekil 3.12. Şekil 3.13. Şekil 3.14. Mikobakterilerin Hücre Duvarı Asido-rezistans (ARB) mikobakterilerin Z-N boyama sonrasındaki görünümü Deri lezyonlu bir balık Karaciğerde tüberküloz odakları Böbrekte tüberküloz odakları. Balıklarda iskelet deformasyonu L-J Besiyerinde Mycobacterium spp. kolonilerinin 3. gündeki görünümü L-J Besiyerinde Mycobacterium spp. kolonilerinin 10. gündeki görünümü L-J Besiyerinde Mycobacterium spp. Kolonileri (A: M. marinum, B: M. fortuitum, C: M. chelonae) Mycobacterium spp. nin Middlebrook (7H9) buyyon daki üremesi Kristal violesiz MacConkey agarda üreme İzole edilen mikobakterilerin 100 bp marker kullanılarak 924 bp büyüklüğündeki bantlarının PCR ile görüntülenmesi. 1. M. marinum (+ kontrol); 2. M. fortuitum (+ kontrol); 3. M. chelonae (+ kontrol); 4.- 18. Mikobakteri izolatları Pozitif kontrollerin ve izole edilen suşların BanI enzimi kullanılarak elde edilen RFLP paternleri. M. moleküler ağırlık marker (GeneRuler, 100bp DNA Ladder, Fermentas, Litvanya); 1. M. marinum (+ kontrol); 2. M. fortuitum (+ kontrol); 3. M. chelonae (+ kontrol); 4.-18. Mikobakteri izolatları Pozitif kontrollerin ve izole edilen suşların ApaI enzimi kullanılarak elde edilen RFLP paternleri. M. moleküler ağırlık marker (GeneRuler, 100bp DNA Ladder, Fermentas Litvanya); 1. M. marinum (+ kontrol) (115bp, 132 bp, 677bp); 2. M. fortuitum (+ kontrol) (115bp, 132 bp, 677bp) ; 3. M. chelonae (+ kontrol) (112 bp, 812 bp); 4.-18. izole edilen mikobakteriler. Saptama limitinin belirlenmesi. M. moleküler ağırlık marker (GeneRuler, 100bp DNA Ladder, Fermentas Litvanya); +. M. cholanea (+ kontrol) (924bp); - Steril distile su (- kontrol); 1-9. 10-1 -10-9 arasındaki sulandırmalar

viii ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Runyon sınıflandırması. Çizelge 1.2. Patojen balık mikobakterilerinin ayırıcı biyokimyasal testleri Çizelge 2.1. İncelenen balıkların orijini, sayıları, yaşları, türleri, yaşam ortamları ve incelenen su örneklerinin sayıları Çizelge 3.1. İncelenen organlarda Z-N boyama bulguları Çizelge 3.2. İncelenen balıklardan izole edilen balık sayısı ve izolasyon yapılan organlar. Çizelge 3.3. Mikobakteri izolatlarının biyokimyasal testler sonucu identifikasyon bulguları

1 1. GİRİŞ Balık tüberkülozis i (Fish tuberculosis, Piscine tuberculosis), çeşitli balık türlerinde (tatlı ve tuzlu sularda yaşayan), organ ve dokularda değişik büyüklükte tüberkellerin oluşması ile karakterize olan, kronik ve genellikle sporadik özellikte, bulaşıcı bir infeksiyondur (Barker ve ark., 1998; Arda ve ark., 2005). Akvaryum balıklarının hemen hemen hepsinde görülebilen, deri ve kas dokusunun yangılanması, aşırı zayıflama ile karakterizedir (Arda ve ark., 2005). Balık tüberkülozisi, Mycobacterium marinum, M. fortuitum ve M. chelonae gibi atipik mikobakteriler tarafından oluşturulan, tatlı su, tropikal, subtropikal, ılıman ve soğuk akuatik ortamlarda tanımlanmış genellikle kronik bir hastalıktır (Zanoni ve ark., 2008; Gauthier ve Rhodes., 2009). Son yıllarda balık mikobakteriyozisinin artışı konusunda bir çok rapor bulunmaktadır (Kent ve ark., 2004; Pate ve ark., 2005). Etimolojik olarak, Mycobacterium, Yunanca mantar (myces) ve küçük çubuk (bakterion) kelimelerinin birleşmesinden köken almaktadır. Tüberküloz eski bir terimdir, köken olarak küçük, patates benzeri ( tuber ), endurasyon yapan anatomik lezyonlar nedeniyle adlandırılmıştır. Hastalığın tüberküloz olarak adlandırılması, 1839 yılında Johann Lukas Schoenlein tarafından yapılmıştır (Iseman, 2002). Tüberküloz yüzyıllardır bilinen bir hastalıktır. Almanya da bulunan ve M.Ö. 8000 yılında tarih öncesi insan iskelet kalıntılarının hastalık izi taşıdığı saptanmıştır (Arslan, 2005). Tüberkülozun klinik bulgularının ve epidemiyolojik özelliklerinin ilk sistematik tanımlanması M.Ö. 400 350 yılları civarında Hipokrat koleksiyonunda kayıtlıdır. İlk olarak Aristo (M.Ö. 354 322) bu hastalığın bulaşıcı olduğunu düşündüren bir paternin farkına varmıştır. Pierre Desault (1675 1737) hastalığın bulaşıcı olduğunu, temel bulaştırıcı unsurun ise

2 balgam olduğunu belirtmiştir. Pierre Charles Alexander Louis diğer nedenlerle ölen hastaların akciğerlerinde latent tüberküloz delillerini bulmuştur. Robert Koch 1882 yılında tüberkülozdan ölen bir hastanın akciğerindeki lezyonlarda basili göstermiş, bunu kültürde üretmiş ve üretilen basil ile deney hayvanlarında tüberküloz oluşturmuştur (Arslan, 2005). Balıklarda ilk mikobakteriyel infeksiyon Bataillon ve arkadaşları tarafından 1897 yılında bildirilmiştir (Ingles ve ark., 1994; Parisot 1958). Bu araştırmacılar sazan balıklarının (Cyprinus carpio) tüberküloz lezyonlarından asido-rezistans basiller izole etmiştir. Kontamine sularda insan tüberküloz basillerinin balıklara adapte olabileceğini düşünmüşler fakat sonradan bunun M. tuberculosis değil M. piscium olduğunu belirtmişlerdir (Parisot 1958). Bu isimle bakteri uzun bir süre Bergey s Manual of Systematic Bacteriology de yer almıştır (Ingles ve ark., 1994). Aranson, 1926 yılında Philadelphia akvaryumundaki tropikal deniz balıklarından ilk balık patojeni olarak kabul edilen Mycobacterium marinum u izole etmiştir (Lewis ve ark., 2003). Bu etkenin başlangıçta yalnızca deniz balıklarını etkilediği düşünülmüş ve bu nedenle bu ismi almıştır (Decostere ve ark., 2004). Fakat sonraki çalışmalarda tatlı su balıklarının da bu etkenden etkilendiği ve hasta oldukları anlaşılmıştır (Ingles ve ark., 1994). 1942 yılında Baker ve Hagan akarsulardaki balıklardan mikobakterileri izole ve identifiye etmiştir. İdentifiye ettikleri mikobakterilere M. platypoecilus adını vermiştir (Passantino ve ark., 2008). İkinci balık patojen mikobakterisi ise 1953 yılında Nigrelli tarafından neon tetra balıklarından (Hyphessobrycon inesi) izole edilen ve 1959 yılında Ross ve Brancato tarafından identifiye edilen Mycobacterium fortuitum dur (Ingles ve ark., 1994; Gauthier ve Rhodes., 2009). Mycobacteriaceae familyası 130 tür içermektedir. Bu cinsin üyeleri klasik ve Runyon sınıfı olmak üzere iki farklı şekilde sınıflandırılır. Klasik sınıflandırma M. tuberculosis komplex (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti), M. leprae ve atipik mikobakteriler olmak üzere üç grupta incelenir. M. tuberculosis komplex ve M. leprae dışında kalan tüm

3 türler Non-tüberküloz mikobakteriler (NTM) olarak veya atipik mikobakteriler olarak adlandırılmaktadır. ( Jacobs ve ark., 2009). Etkenler 1959 yılında Runyon sınıflandırılmasında Loewenstein Jensen (LJ) besi yerindeki üreme hızı, koloni morfolojisi ve pigment üretimine göre 4 grupta toplanmıştır (Kullavanijaya 1999; Yardımcı ve ark., 2006). Grup I- Fotokromojenik ler, ışıkla temas ettikten sonra pigmentli (sarı) koloniler meydana getirirler (Yardımcı ve ark., 2006). Karanlıkta üretildikleri zaman kolonileri pigmentsiz oldukları halde, yapay veya doğal ışıkta 1-8 saat bırakıldıklarında yeniden karanlıkta üretilseler bile portakal sarısı renginde karotenoid pigment oluştururlar (Bilgehan, 2004). Yavaş ürerler, kolonilerin görülebilmesi için 7 günden fazla zamana gereksinim vardır. Bu grupta bulunan türler arasında M. marinum, M. kansasii, M. asiaticum ve M. simiae gibi bakteriler vardır (Yardımcı ve ark., 2006; Fabroni ve ark., 2008). Grup II- Skotokromojenik ler, ışığa bağlı olmadan sarı veya portakal renkli pigmentli koloniler meydana getirirler ve yavaş ürerler. Bu grupta bulunan türler arasında M. gordonae, M. scrofulaceum, M. szulgai ve M. xenopi gibi bakteriler bulunur (Yardımcı ve ark., 2006). Grup III- Nonfotokromojenik ler, karanlıkta uzun süre kaldıklarında bazen soluk renkte pigment oluşturabilirlerse de uzun süre ışıkta tutulsalar bile pigment yapmazlar ya da önceden oluşmuş pigment koyulaşmaz (Bilgehan, 2004). Işıkta çok az pigmentli veya pigmentsizdirler ve yavaş ürerler. Bu grupta bulunan türler arasında M. intracullulare, M. ulcerans, M. terrae gibi bakteriler bulunur (Yardımcı ve ark., 2006). Grup IV- Değişken pigmentasyon gösterenler, hızlı ürerler ve 7 günde koloniler gözle görülebilecek duruma gelirler. Bu grupta bulunan türler arasında M. fortuitum, M. chelonae gibi bakteriler bulunur (Yardımcı ve ark., 2006).

4 Çizelge 1.1. Runyon sınıflandırması ( Kullavanijaya, 1999; Durupınar, 1996) Grup Pigment Büyüme hızı Organizma I Fotokromojen 2-3 hafta M. marinum, M. kansasii, M. asiaticum ve M. simiae II Skotokromojen 2-3 hafta M. gordonae, M. scrofulaceum, M. szulgai ve M. xenopi III Nonfotokromojenik 2-3 hafta M. intracullulare, M. ulcerans, M. terrae IV Değişken 3-5 gün M. fortuitum, M. chelonae Runyon sınıflamasında yer alan etkenler ayrıca, saprofitik mikobakteriler ve tüberküloidler olarak da tanımlanmaktadır. Bu bakterilerin büyük çoğunluğu çevrede (doğada, toprakta ve suda) bol miktarda bulunurlar. Çoğu ya hiç patojen değil ya da potansiyel patojendirler. İmmun sistemi zayıflamış konakta ciddi infeksiyonlara neden olan oportunistik mikobakterilerdir (Yardımcı ve ark., 2006) Önceden M. platypoecilus ve M. anabanti olarak adlandırılan etkenler günümüzde M. marinum olarak, M. ranae olarak adlandırılan etken günümüzde M. fortuitum olarak, M. borstelense ve M. runyonii olarak adlandırılan etkenler ise günümüzde M. chelonae olarak adlandırılmaktadır (Gauthier ve ark., 2009). Mycobacteriaceae familyasına bağlı tek genus olan Mycobacterium genusu içinde, alt türlerle birlikte 2008 Haziran ayında LPSN ( list of prokaryotic names with standing in nomenclature) tarafından yayınlanan listeye göre 130 Mycobacterium türü ve 11 alt türü bulunmaktadır (Gauthier ve ark., 2009). Aerobik, sporsuz, hareketsiz, hafif kıvrık, düzgün çomak veya kokoid şeklinde asido-rezistans 0,2-0,6 x 1.0-10 µm boyutlarında bakterilerdir. Mycobacterium cinsi bakterilerin temel özellikleri, yavaş üremeleri, aside dirençli olmaları, hücre duvarlarında bol miktarda lipid

5 bileşikleri içermeleridir (Eisenstadt ve Hall, 1995; Taalat ve ark.,1998; Yardımcı ve ark., 2006). Şekil 1.1. Mikobakterilerin Hücre Duvarı (Arslan, 2005) Mikobakteriler asido-rezistans bakteriler (ARB) olarak tanımlanırlar. Bu özellik hücre duvarında mikolik asit, peptidoglikan ve arabinomannan ın oluşturduğu tabaka ile ilişkilidir. Anilin boyası bu tabaka ile bağ oluşturarak asit ve alkol etkisine karşın yerinde kalır. Bu özelliği ortaya çıkarmada özel bir boyama yöntemi olan Erlich Ziehl-Neelsen, Asid fast boyama yöntemi kullanılır. Bu boyamada mikobakteriler, mavi zemin üzerinde kırmızı renkte görünürler. Gram boyama ile kolay boyanamamalarına rağmen Gram pozitif olarak kabul edilirler (Durupınar 1996; Yardımcı ve ark., 2006). Genel olarak, Gram pozitif bakterilerin hücre duvarında yaklaşık % 5 yağ ya da lipid tabakası varken bu oran Gram negatiflerde % 20 dir. Mikobakterilerde ise bu oran yaklaşık % 60 civarındadır ( Iseman 2002).

6 Balıklar için patojen olan en önemli Mikobakteri türü, M. marinum dur. Bunun dışında M. fortuitum, M. chelonae, M. smegmatis, M. abscessus, M. neonarum, M. simiae, M. scrofulaceum, M. poriferae, M. nonchromogenicum, M. interjectum, M. shottsii ve M. triplex de diğer etkenler arasındadır (Lewis ve ark., 2003; Toranzo 2005; Ucko ve Colorni, 2005; Zanoni ve ark., 2008). Daha önceleri M. piscium, M. anabanti ve M. salmonophilum un hastalığa neden olduğu bildirilmiş ise de, bu bakterilerin son klasifikasyonda yer almadıkları görülmektedir (Akay ve ark., 1988). Balık tüberküloz olgularından sıklıkla izole edilen ve diğerlerine göre daha patojen olan başlıca 3 tür bulunmaktadır (Arda ve ark., 2005). 1- Mycobacterium marinum M. marinum, asido-rezistans, aerobik, sporsuz, kapsülsüz olup Gram pozitif boyanma özelliğine sahip bir mikroorganizmadır. Mikroorganizma, gliserinli agar veya Loewenstein Jensen besi yerinde ve genellikle yavaş bir üreme gösterir. Bu besi yerleri üzerinde 18-25 C ler arasında 2-3 hafta içinde limon sarısı renginde fotokromojenik karakterde koloniler meydana getirir (Puttinaowarat ve ark., 2000; Arda ve ark., 2005). Işığa bir saat tutulduklarında önce limon sarısı rengini alırlar. Işığa sürekli olarak tutulduklarında ise turuncu-kırmızı renk alırlar (Bilgehan 2004). Mikobakteriler, 0,3-0,7 x 1,0-4,0 µm boyutlarında ve çomakçıklar biçimindedir (Arda ve ark., 2005). Üreaz aktivitesi pozitif, nitrat redüksiyonu negatif, MacConkey agarda üreme negatif, katalaz testi negatif, tween hidrolizi pozitiftir (Hoilt ve ark., 1994; Lin ve ark., 2006). Bakteriyi boyamada Ziehl-Neelsen boyama tekniği kullanılmakta ve mikroskop altında tek tek veya gruplar halinde pembe renkte görülmektedir. (Ingles ve ark., 1994). Balıklarda tüberküloz denildiğinde birincil etken M. marinum akla gelir (Dalsgaard ve ark., 1992; Astrofsky ve ark., 2000). 1990 lı yıllardan bu yana

7 Akdeniz ve Kızıl deniz kıyılarında özellikle deniz levreği, alabalık gibi balıklarda M. marinum önemli problemlere yol açmaktadır (Toranzo, 2005; Ucko ve Colorni, 2005). Bu problemlere Avrupa da kalkan balıklarında sıklıkla rastlanmaktadır. Ayrıca deniz balıkları arasında morina balığı, pisi balığı, çizgili levrek ve Atlantik uskumrusunda da sıkıntı yaratmaktadır (Toranzo, 2005). Deneysel olarak kurbağa, fare, güvercin ve tatlı su balıkları için patojen, tavşan ve kobay için patojen değildir ( Arda, 1974). 2-Mycobacterium fortuitum Mycobacterium fortuitum kompleks; M. fortuitum, M. peregrinum tip 1 ve M. peregrinum tip 2 olmak üzere 3 tür içermektedir (Fabroni ve ark., 2008). M. fortuitum da bir çok yönleri ile (morfolojik, kültürel, fizyolojik, biyokimyasal vb.) M. marinum a benzerlik gösterir. Ancak besiyerinde daha çabuk (1 hafta) ürer ve koloniler krem renkli veya kahverengindedir. Kolonileri 5 günden az bir zamanda yumuşak, tereyağımsı kıvamda, genellikle R tipinde, pigmentsiz oluşur (Bilgehan 2004). Bu etken M. marinum gibi fotokromojenik değildir (Arda ve ark., 2005, Koneman 2006). Daha çok tropikal ve ılık sularda yaşayan balıklarda bildirilmiştir (Decostere ve ark., 2004). Üreaz aktivitesi pozitif, nitrat redüksiyonu pozitif, MacConkey agarda üreme pozitif, katalaz testi pozitif, tween hidrolizi değişkendir (Koneman 2006). 3-Mycobacterium chelonae M. chelonae, pleomorfik olup küçük kok şeklinden, uzun çomak şekillerine kadar biçimler gösterir. Kolonileri 1 hafta olmadan gelişir, S şeklinde ve pigmentsizdir (Bilgehan 2004).

8 Bu mikroorganizmanın iki alt türü bulunmaktadır. Bunlar Mycobacterium chelonae subsp. abscessus ve Mycobacterium chelonae subsp. chelonae dir. Bu iki etkenin ayrımında sitrat kullanıp kullanılmadığına bakılır. Mycobacterium chelonae subsp. abscessus sitrat negatif, Mycobacterium chelonae subsp. chelonae sitrat pozitifdir (Hoilt ve ark., 1994). Bu mikroorganizma da bazı özellikleri yönünden M. fortuitum a benzemektedir. Besi yerlerinde 1 hafta gibi kısa bir sürede ürerler ve fotokromojenik değildirler (Arda ve ark., 2005). Bu etken psikrofilik balıklarda görülmektedir (Decostere ve ark., 2004). Enfekte olan balıkları 12 C ve 18 C sıcaklıklara bırakıldığında 12 C de ölümlerin daha çok ve hızlı olduğu görülür (Arakawa ve ark, 1986) Üreaz aktivitesi pozitif, nitrat redüksiyonu negatif, MacConkey agarda üreme pozitif, katalaz testi pozitif, tween hidrolizi değişkendir (Koneman 2006). Mikobakteriyozis dünyadaki tüm balıkları etkileyebilecek en önemli hastalıklardan birisidir. (Ucko ve ark., 2002; Gauthier ve Rhodes, 2009). Yaklaşık 30 yıl önce Nigrelli ve Vogel, mikobakteriozis e tatlı ve tuzlu sularda yaşayan 200 den fazla balık türünde rastlandığını bildirmiştir. Zaman ilerledikçe yeni türlerin de hastalığa duyarlı olduğu anlaşılmaktadır (Ingles ve ark., 1994; Toranzo ve ark., 2005; Gauthier ve Rhodes, 2009). Genellikle bütün balık türlerinin hastalığa yakalanacağı düşünülmektedir, ancak tropikal akvaryum balıklarının hastalığa daha duyarlı olduğu bildirilmektedir (Ingles ve ark., 1994). Bunun sebebinin balıklarda uzun bir periyotta tutsak yaşamanın vermiş olduğu stres olarak bildirilmektedir. Balıklardan izole edilen mikobakterilerin büyük bir bölümü Mycobacterium marinum dur. Hastalık daha çok deniz balıklarında görülmesine rağmen, M. fortuitum tatlı su balıklarında daha yaygın olarak görülmektedir (Ingles ve ark., 1994). Tatlı su balık ailelerinden olan Anabantidae, Characidae ve Cyprinidae özellikle infeksiyona duyarlıdır (Decostere ve ark., 2004).

9 Hastalığın oluşmasında stres, ısı değişiklikleri, immun sistemin baskılanması, tek yönlü besleme predispozisyonda önemlidir (Arda, 1974; Gauthier ve Rhodes, 2009; Aldabahg ve Tomecki, 2009). M. marinum un adından da anlaşıldığı gibi dünya yüzeyinde bulunan tüm sularda (okyanuslarda, göllerde, nehirlerde, göletlerde, kuyularda, yüzme havuzlarında ve akvaryumlarda) bulunur (Aldabagh ve Tomecki, 2009). Şimdiye kadar alabalık türlerinin yalnızca soğuk sularda yaşayanlarında M. chelonae infeksiyonuna rastlanmıştır. Tatlı suda yumurta bırakılan yerlerle infeksiyon arasında bir bağlantının olduğu bildirilmiştir (Ingles ve ark., 1994). Araştırmacılar, bataklıklardaki mikobakteri sıklığının daha fazla olduğunu ve organizmanın artışının düşük ph, yüksek organik içerik ve ılık su özelliği gösteren çevresel şartlar ile ilişkili olduğunu bulmuşlardır. Diğer bir araştırma düşük tuz yoğunluğunda non-tüberküloz mikobakterilerin sıklığının arttığını belirtmektedir (Floyd ve Yanong, 2002). Etken infekte su ve toprakta 2 yıl veya daha fazla, karkas ve organlarda ise 1 yıl kadar canlılığını sürdürebilmektedir. Organizma, hastalığa hassas olduğu bilinen amphibiyenler ve sürüngenler vasıtasıyla geniş bir yayılım gösterebilir (Ingles ve ark., 1994; Decostere ve ark., 2004). Dünya da AIDS in epidemik hale gelmesi ve immunsupresif tedavilerin başlamasıyla NTM-ilişkili hastalıklar önemli ölçüde artmış ve bu süreçte NTM önemli patojenler haline gelmiştir (Passantino ve ark., 2008). NTM türlerinin birçoğu toprakta, suda, toz taneciklerinde, evcil veya vahşi hayvanlarda, sütte ve diğer besin maddelerinde bulunurlar. İnsanlara çevreden bulaşabilirler veya vücut yüzeyi ve sekresyonlarında kolonize olabilirler. Doğada yaygın olarak bulunmalarına karşın, insan için potansiyel patojen olabilen NTM türleri, belirli coğrafi bölgelerde daha sık görülme eğilimindedirler. Değişik çalışmalardan elde edilmiş verilere göre, NTM türleri tarafından oluşturulan infeksiyonlar, tüm mikobakteriyel infeksiyonların %1-35 ini oluşturmaktadır.

10 Bu aralığın bu kadar geniş olması, bugüne kadar NTM infeksiyonlarına çoğu zaman tanı konamamasına bağlanmaktadır (Alp, 2003). M. marinum enfeksiyonlarında en çok bulaşma, yaralanmalar ve travmalar sonrasında deri yoluyla olmaktadır (Dailloux ve ark., 1999). Akuatik çevredeki bakteri sayısı yüksek veya balığın immun sistemi zayıfsa derideki portantrelerden giriş mümkündür. Vücutta oluşan lezyonlardan etkenler dışarı çıkarak çevreyi ve suları kontamine edebilir. Balıkların kalabalık olduğu havuzlarda bulaşma ve infeksiyon riski çok daha fazladır. Hastalıklı ve ölü balıkların etkeni ve dolayısıyla hastalığı saçmada önemli rolleri bulunmaktadır. Çok kalabalık havuzlarda temasla bulaşmaların olabileceği de bildirilmektedir (Arda, 1974; Harms ve ark., 2003; Arda ve ark., 2005). Kalabalık yetiştirme yapılan ve su kalitesi iyi olmayan sularda hastalığa sıklıkla rastlanır (Arda 1974). Suların hayvan dışkısıyla kontamine olması durumunda etken miktarında artış kaçınılmazdır. Düşük miktarlarda da olsa deniz sularında da etkene rastlamak mümkündür (Dailloux ve ark., 1999). Bulaşmada diğer yol ise oral yoldur; bir balık öldükten sonra popülasyondaki diğer balıklar tarafından yenilmesi sonucunda oral yolla etken vücuda girer. Solungaçlardan etken girişi de muhtemel bir yoldur. Ayrıca M. marinum deneysel koşullar altında su-amiplerini enfekte edebilmektedir. Bu da çevredeki protozoaların da etken için bir konak olabileceği ve akuatik çevredeki balıklar arasında etkeni bulaştırabileceğini ihtimalini düşündürmektedir (Stamm ve Brown, 2004). Yapılan araştırmalar, solungaçlardan ziyade bağırsakların ilk infeksiyon bölgesi olduğunu ortaya koymuştur (Gauthier ve Rhodes, 2009). Balıklara mikobakterilerle kontamine gıdaların verilmesi, mikropla bulaşık akuatik artıkların yenmesi, deri ve/veya solungaçlardaki lezyonlardan etkenlerin içeri girmesi ile infeksiyon meydana gelebilir (Ingles ve ark., 1994; Decostere ve ark., 2004). Etkenin ayrıca vertikal olarak yayılabileceği bildirilmektedir ve Meksika küçük balıklarında (Xiphophorus maculatus) bu bulaşma kanıtlanmıştır

11 (Stoskopf, 1993; Arda ve ark., 2005). Transovarian bulaşmanın vivipar balıklar arasında özel bir önemi vardır. Alabalıklarda ve diğer ovovivipar balıklarda vertikal bulaşma henüz bildirilmemiştir (Noga 2000; Decostere ve ark., 2004). Mikobakteriler, balıkların dışında diğer su organizmalarını da infekte ederler. Çeşitli protozoonların içinde hayatlarını devam ettirip üreyebilirler, böylece balık yemlerinde potansiyel vektörler halinde bulunurlar (Gauthier ve Rhodes, 2009). Dış parazitler deri yolu ile bulaşmada etkilidirler. Su pirelerinin de etkenlerin taşınmasında önemi olduğu bildirilmiştir. Su piresi yiyen balıklarda hastalığın şekillendiği görülmüştür (Decostere ve ark., 2004). Balıklarının dışında diğer soğukkanlı hayvanlarda da hastalık görülmektedir. Kurbağalar, yılanlar ve kaplumbağalar bulaşma siklusunda rol oynayabilmektedirler (Parisot, 1958). Sümüklü böceklerin akvaryum balıkları arasında özellikle öneme sahip bir ara konak olduğu düşünülmektedir (Decostere ve ark., 2004). Yunus balığının ısırmasıyla bulaşmanın olduğu bildirilmiştir (Lim ve ark., 2000). Fareler, güvercinler ve kobaylarda hastalık oluşmaktadır (Parisot, 1958). Yapılan çalışmalarda akarsuların kontaminasyon seviyelerinin tuzlu sulardan daha fazla olduğunu göstermiştir (Dailloux ve ark., 1999). Populasyonlardaki hastalık patlamaları ya da bireysel gözlenen hastalıkların nedeni olarak konakçı immun sisteminin optimal koşullarda olmaması gösterilmiştir. Balıklar için bu uygun olmayan optimal koşullar arasında düşük su kalitesi, sıkışık havuzlar, beslenme yetersizliği gelmektedir (Dailloux ve ark., 1999; Watral ve Kent, 2007; Ramsey ve ark., 2009). Amerika Birleşik Devletleri nde yapılan bir deneysel çalışmada zebra balıklarına M. abscessus, M. peregrinum, M. chelonae ve M. marinum suşları 5x10 4 bakteri/balık olarak intraperitoneal yolla verilmiştir. Balıklar 28 C de 8 hafta süreyle tutulmuştur. Süre sonunda balıklar histolojik ve kültür yönünden

12 incelenmiştir. Sonuç olarak M. marinum izolatları % 100 infeksiyona neden olurken, % 30-% 100 arasında ölüme neden olmuştur. Diğer mikobakteri türleri ise ciddi bir infeksiyona neden olamamışlar, ancak visceral organlarda şiddetli granülomatöz lezyonlara neden olmuşlardır. İzolatların test edildiği bu çalışma göstermiştir ki sağlıklı zebra balıkları için M. marinum oldukça virulent ve patojeniktir (Watral ve ark., 2007; Ramsey ve ark., 2009). İnsan sağlığı ve sıcak kanlı vertebratalar için M. marinum, M. fortuitum ve M. chelonae önemlidir. Çünkü insanlarda el, yüz ve ayaklarda kutan granülomalar meydana gelebilir (Arda ve ark., 2005). Özellikle M. marinum insanların ekstremitelerindeki deri granülomlarının en önemli sebebidir (Mehta ve ark., 2006). Yüzme havuzları bu yönden hem hastalık oluşturma hem de etkeni barındırma bakımından önemlidir (Arda ve ark., 2005). İnfekte sularda yüzen insanlarda salgın halinde deride granülamatöz oluşumlar görülebilir (Jernigan ve Farr, 2000). İnsanlar arasında bulaşma görülmez (Dailloux ve ark., 1999). İnfeksiyonun direkt olarak balık yüzgeçleri ile temas sonucu ya da balık ısırması ile oluşan yaralanmalardan gelişmesine rağmen infeksiyonların çoğu temizleme veya suyunu değiştirme gibi etkinliklerle akvaryuma dokunma esnasında bulaşır (Barker ve ark., 1998). M. marinum infeksiyonları; balıkçılar, veteriner hekimler, balık yetiştiricileri, pet shop sahipleri gibi bazı meslekler için tehlikeli olabilmektedir. (Decostere ve ark., 2004). Balıklarda mikobakteriyozis, akut ya da kronik formda görülebilmektedir. Akut hastalık nadiren görülür, klinik belirtilerin az olması, hızlı bulaşma ve ölüm ile karakterizedir (Ingles ve ark., 1994; Decostere ve ark., 2004). Akut olaylarda ölüm genellikle 16 gün içerisinde meydana gelir (Astrid ve ark., 2004). Akut hastalık oluşumu yüksek oranda bakteri alınmasına bağlı olarak nadiren görülmektedir (Gauthier ve Rhodes, 2009) İnfeksiyon kronik bir karakter gösterdiğinden inkubasyon süresi oldukça

13 uzundur (Arda ve ark., 2005). Klinik belirtiler hayvanların türüne ve ekolojik şartlara bağlı olarak değişiklikler göstermektedir (Ingles ve ark., 1994). Yapılan çalışmalar sonrasında M. marinum 10 7 cfu/g gibi yüksek dozlarda akut veya subakut hastalıklara neden olurken; daha düşük dozlarda kronik hastalıklara neden olur (Gauthier ve Rhodes, 2009). Mikobakteriyozis uzun süre asemptomatik olarak kalır (Toranzo 2005). İnkubasyon periyodu 3 hafta ile 9 ay arasında değişmektedir (Decostere ve ark., 2004). Yoğun etkenle karşı karşıya kalan balıklarda iç organlarda granulomların şekillenmesi 4-8 hafta içerisinde meydana gelmektedir (Astrid ve ark., 2004). Klinik olarak balıklarda, ilerleyen bir zayıflama, iştahsızlık, durgunluk, durgunluğa bağlı olarak balıkların elle kolaylıkla yakalanabilmesi, nefes darlığı, diskolorasyon (renklerinde bozulma), pulların dökülmesi, deri ve yüzgeçlerde ülserler, tek veya çift taraflı ekzoftalmus (veya bazen ileri olgularda gözler içeri doğru da göçebilir), vertebra ve mandibulada deformasyonlar, spinal deformasyon, hareket yavaşlığı, yüzme bozuklukları gözlenebilen semptomlar arasındadır (Yanong ve ark., 2003; Ucko ve ark., 2005; Gauthier ve Rhodes, 2009). İlerleyen olgularda vücut kas sisteminde hemorajik lezyonlar dikkati çeker (Toranzo, 2005). Özellikle akvaryumdaki uzun süreli hasta olan hayvanlarda iskelet deformasyonları da şekillenir (Ingles ve ark., 1994). Ancak bu semptomların hepsini tek bir balıkta görebilmek mümkün değildir (Arda ve ark., 2005). Soğuk suda yaşayan alabalıklarda ölümden başka herhangi bir dış belirti görülmeyebilir (Ingles ve ark., 1994). Hasta balıkların karın kısmı içeriye doğru çöker ve çukur bel denilen semptom oluşur (Arda ve ark., 2005). Ayrıca büyüme geriliği ve seksüel gelişmede yavaşlama görülebilen diğer belirtiler arasındadır (Ingles ve ark., 1994). Hastalıktan korunmada ithal edilen balıkların bir süre (ortalama 3 hafta) karantinada tutulması önemlidir. (Passantino ve ark., 2008). Balıklara

14 iyi bakım-besleme uygulanır ve her türlü stres faktörleri ortadan kaldırılır. İleri derecede hasta balıklar havuzlardan hemen çıkarılmalıdır. Koruma amacıyla mikobakterilere etkili kemoterapötikler varsa yemlere karıştırılarak hayvanlara verilmelidir (Arda ve ark., 2005). Korumada balıklara verilen yemlerin kontamine olmamasına dikkat edilmelidir. Ayrıca ölen balıkların diğer balıklar tarafından yenmemesi için bir an önce uzaklaştırılması gerekmektedir (Ingles ve ark., 1994). Çoğu olguda hastalığın kontrolü için hayvanların özellikle de damızlıkların itlaf edilmesi önerilmektedir ( Stoskopf, 1993; Noga, 2000). 1950 li yıllarda en önemli ekonomik problemlerden biri Pasifik alabalıklarında görülen mikobakteriyozistir. Balıkların beslenmesinde kullanılan balık iç organlarının ve diğer balık ürünlerinin pastörizasyonuna dikkat edilmiş ve hastalığın önüne geçilmiştir (Decostere ve ark., 2004). Balık karkasları yemde protein kaynağı olarak kullanılacaksa, 76 C de 30 dk muamele edilmelidir. Ölü balıklar yakılarak veya sönmemiş kireçle gömülerek imha edilmelidir (Brocklebank ve ark., 2003). M. marinum dezenfektanlara nispeten daha dirençlidir ve çoğu dezenfektanın etkili olabilmesi için daha uzun temas süresine ihtiyaç vardır. % 5 fenol, % 1 sodyum hipoklorit, iodin solüsyonları (yüksek konsantrasyonda) gluteraldehit ve formaldehit etkili olmaktadır (OIE, 2006). Dezenfeksiyon için kullanılan quaterner amonyum bileşiklerine karşı mikobakteriler direnç gösterirler. 10000 ppm (parts per million) (milyonda bir parçacık) kloririn mikobakterileri öldürmede yeterli bulunmuştur. Ayrıca mikobakterilerin %65-80 lik alkollere de duyarlı olduğu bildirilmiştir (Floyd ve Yanong, 2002). Aşılamada M. marinum a karşı Mycobacterium spp. Antijen 85 A (Ag85A) kullanılarak hazırlanmış rekombinant ve DNA aşıları kullanılmaktadır. DNA aşıları yapıldıktan 90 gün sonrasına kadar etkili bir bağışıklık görülmektedir (Pasnik, 2003; Gauthier ve Rhodes, 2009).

15 Hastalıkta sağaltım oldukça güç, pahalı ve uzun zaman gerektirmektedir. Bu nedenle hastalıklı olan hayvanlar genellikle imha edilirler. Hastalıktan etkilenmiş olan balıkların tedavilerinin uygun olmayacağı ve hastalığa yakalanmış olan balıkların imha edilmesi önerilmektedir. Daha sonra hayvanların tutulduğu yerin iyice dezenfekte edilmesi gerekmektedir (Ingles ve ark., 1994; Arda ve ark., 2005; Gauthier ve Rhodes, 2009 ). Yapılan bir araştırmada ticari olarak yetiştirilen balıkların tedavisinin yapılmaması gerektiği fakat değerli ekzotik deniz türlerinin tedavisi için rifampicin ve isoniazid kullanılması tavsiye edilmiştir (Ingles ve ark., 1994). Paranteral yolla doksisiklin veya minosiklin ile beraber sulphisoxazole kullanılması buna ek olarak balıkların sularına tetrasiklin katılmasını önerilmektedir (Van Duijn, 1981; Ingles ve ark., 1994). Kapalı alanlarda yetiştirilen balıklar için 24 saat süresinde litreye 10 mg Chloramin B veya T eklenerek hastalığın kontrol altında tutulabileceği, bu işlemden sonra suyun tamamının değiştirilmesi uygun olacağı bildirilmektedir (Decostere ve ark., 2004). Kemoterapötik maddelerle sağaltım, hem çok zaman almakta hem de tam bir başarı elde edilememektedir. Hastaları sağaltımda bazı antimikobakteriyel preparatlar kullanılabilir. Bu ilaçlar yemlerine katılarak veya banyo tarzında uygulanabilirler (Arda ve ark., 2005). Kıymetli akvaryum balıklarında isoniazid, rifadin, rimactene, streptomisin, klaritromisin, tetrasiklinler veya kanamisin kullanılarak tedavileri yapılmaya çalışılır (Decostere ve ark., 2004). Akut aşamalarda tedavi için tetrasiklin veya kanamisin sülfat içeren banyolar yaptırmak yarar sağlamaktadır (Conroy ve Conroy, 1999). İsoniazid + kanamisin + vitamin B-6 karışımının 30 gün boyunca kullanılması en etkili tedavi olarak görülmektedir. Her 5 galon akvaryum suyuna 1 damla vitamin B-6 katılması önemlidir (Decostere ve ark., 2004).

16 İnsanlarda sağaltımın süresi, infeksiyonun şiddetine, yapmış olduğu bozukluklara ve klinik yanıt gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak 2 haftadan 18 aya kadar değişebilmektedir (Decostere ve ark., 2004, Fabroni ve ark., 2008). Tedavi için aşağıda belirtilen ilaçlar kullanılmaktadır (Clark ve ark., 1990; Thariat ve ark., 2001). 1- Yetişkinlere oral yolla günde 600 mg rifampin verilebilir. 2- Yetişkinlere oral yolla günde 2 defa 100 mg minosiklin verilebilir. 3-10-14 gün boyunca 12 saat arayla trimethoprim-sulfamethoxazole kombinasyonu verilebilir. 160 mg trimethoprim / 800 mg sulfamethoxazole oral yolla verilebilir. 4- Ethambutol günde 4 defa 25 mg/kg oral yolla verilebilir. 5-1 ay süresince siprofloksasin, ethambutol ve klaritromisin kullanılabilir. 6- Minosiklin, rifampin ve ethambutol 9 ay boyunca kullanılmış ve bununla beraber cerrahi işlem de gerçekleştirilmiştir. Yüzeysel hastalığın aksine tendosynovitis ve artritisi kapsayan daha derin infeksiyonlarda genellikle antibiyotik tedavisinin yanı sıra cerrahi müdahale de gerekmektedir (Clark ve ark., 1990). Hastalık insanlarda da görülebilmektedir fakat sıklığı fazla değildir (Lewis ve ark., 2003). Derideki açık yerlerden etken girerek yaklaşık 2-4 hafta içinde lokal enfeksiyonlara neden olabilmektedir (Huminer ve ark., 1986). Vücutta özellikle de eller ve kollarda 3 mm çapında pembe-mor renkli eritematöz nodüller dikkati çeker (Fabroni ve ark., 2008). Sonra nodüller genişleyen ülserlere dönüşebilir. Yakında bulunan lenf yumrularında şişmeler görülebilmektedir (Lewis ve ark., 2003). Lenfadenopati, septik artrit, osteomyelit ve eklemlerde şişme de görülen semptomlar arasındadır (Ucko ve Colorni, 2005). M. marinum deride, periferal derin dokularda granülomatöz lezyonlar oluşturan en iyi bilinen insan patojenidir. M. fotuitum ve M.

17 chelonae immun sistemi baskılanmış kişilerde insan patojeni olarak bilinirler (Gauthier ve Rhodes, 2009). M. marinum da diğerleri gibi immun sistemi baskılanmış insanlarda (örneğin AİDS hastalarında) patojendir, sistemik infeksiyonlara neden olabilir, hatta ilerleyen olgularda ölüme kadar gidebilir (Barker ve ark., 1998). 1939 ve 1951 yıllarında sırasıyla İsviçre ve Amerika da bulunan insanların kullandığı yüzme havuzlarında tüberküloz infeksiyonlarına rastlanılmıştır. Linell ve Norden hastalığa neden olan organizmayı 1954 yılında, halka açık yüzme havuzunu kullanan 80 tane insanda oluşan granülomatöz deri lezyonlarının oluşumu ile birlikte saptamışlardır. Onlar bu etkene M. balnei adını vermişlerdir ancak etken günümüzde M. marinum olarak bilinmektedir. Bu ilk bulgular hastalığın ilk olarak kullanılan yaygın adının yüzme havuzu granüloması olmasına neden olmuştur. Günümüzde ise sanitasyon ve klorlamalar ile bu risk çok nadir oluşmaktadır. Bazen de evlerinde akvaryum ile hobi olarak uğraşan kişilerde su-ilişkili terim olarak kullanılan balık tank granüloması ya da balık bakıcısı hastalığı olarak isimlendirilmektedir (Decostere ve ark., 2004). Hastalığın ev akvaryumlarında ve suyla ilgili aktivitelerde (yüzme, balık tutma, kayıkçılık vb.) görülmesinden dolayı akvaryum granuloması adı bazen kullanılmaktadır. Bazı infeksiyonlar evinde akvaryumu olan balık meraklılarında görülür ve bu nedenle balık meraklılarının parmak sendromu olarak da isimlendirilir (Huminer ve ark., 1986; Smith, 1997; Barker ve ark., 1998; Decostere ve ark., 2004). Balık mikobakteriyozisi önemli bir zoonozdur, etkilenen balıklar ve akvaryum ile uğraşan tüm insanlar için önemli bir risk oluşturmaktadır. Bu nedenle diğer infeksiyonlarda da olduğu gibi, dezenfeksiyon, izolasyon ve sanitasyon kurallarının uygulanması başta gelen koruyucu önlemler arasındadır (Decostere ve ark., 2004).

18 İnsanların hastalıktan korunmak için bazı önlemlerin alınması gerekmektedir. Bu önlemler şu şekilde sıralanabilir (Belic ve ark., 2006; Petrini, 2006; Tsai ve ark., 2006). 1- Deri lezyonu olan balıklarla temas edilmemelidir. 2- Temas edilmesi gerekiyorsa koruyucu eldivenler giyilmelidir. 3- Temas sonrası eller su ve sabunla iyice yıkanmalıdır. 4- Deri lezyonları olan balıklar kesinlikle tüketilmemelidir. 5- Tüketilmesi gerekiyorsa çok iyi pişirilmelidir. 6- Havuzlarda dezenfeksiyon işlemi periyodik aralıklarla yapılmalıdır. İnsanlar su vasıtasıyla nontuberküloz mikobakterilerle sürekli temas halindedirler. Tam anlamıyla eradikasyon mümkün olmasa da özellikle hastanelerde bakteriyel filtre kullanımı, dezenfeksiyon konsantrasyonu ve süresi, su depolarının düzenli temizliği gibi tedbirlerle mikobakteri yoğunluğu azaltılabilir (Dailloux ve ark., 1999). Klinik belirtiler tek başına hastalığın teşhisinde yeterli değildir. Çünkü Frunkulozis, Ülser, Lymphocystis, Çiçek ve Ichthyosporidum hastalıkları da tüberküloza benzer tablo meydana getirebilirler (Arda, 1974; Pasnik, 2003). Nekropside deri ve iç organlarda rastlanılan makroskobik ve histopatolojik bulgular, iç organlardaki nodüller oluşumlar infeksiyon hakkında bir fikir verir. Nekropside, iç organlarda, kaslarda, dölerme organlarında, küçük, fazla sayıda, grimsi-beyaz renkte (1-5 mm çapında) nodüllere rastlanır (Yanong ve ark., 2003; Gauthier ve Rhodes, 2009). Bu nodüller hemen hemen tüm parankim dokularda olmasına rağmen özellikle dalak, karaciğer ve böbrek üzerinde dağınık bir şekilde bulunmaktadır (Ingles ve ark., 1994; Pate ve ark., 2005). Bu nodüller M. tuberculosis in insan akciğerinde oluşturdukları nodüllere çok benzerlik gösterir (Stamm ve ark., 2004). Ayrıca, dölerme organlarında gelişme noksanlığı, anemi ve karında sıvı toplanması da gözlenebilir (Arda ve ark., 2005). İç organların normalden büyük olduğu,

19 peritonitis ve ödem olduğu görülebilir (Arda, 1974; Ingles ve ark., 1994; Pasnik 2003). Mikobakterilerin en iyi boyandıkları boyama yöntemleri asidorezistan boyama yöntemleridir (Bilgehan, 2004). Lezyonlu iç organlardan alınan küçük parçacıklardan, temiz iki lam arasında ezilerek hazırlanan frotiler, Ziehl- Neelsen boyama yöntemi ile boyanırlar. Bu boyama yöntemiyle asidorezistans bakteriler (ARB) mikroskop sahasında mavi boyalı zemin üzerinde pembe renkte çomakçıklar halinde görülmektedirler. (Bilgehan 2004; Arda ve ark., 2005; Toranzo, 2005). ARB ler balık mikobakteriyel granülomlarda sıklıkla görülebilir, fakat birkaç deneysel enfeksiyonun yapıldığı çalışmada granülomlarda ARB lerin tespit edilemediği de bildirilmiştir (Gauthier ve Rhodes 2009; Jacobs ve ark., 2009). Mikobakterilerin yavaş gelişim oranı, daha hızlı gelişen mikropların fazla bulunduğu örneklerden izolasyonlarının zor olduğunu göstermektedir. Dekontaminasyon prosedürü uygulamazsa mikobakteriler görünür hale gelene kadar diğer bakteriler gelişir. Mikrobiyal etkenlerin asit, alkali ve diğer antimikrobiyal ajanlara karşı dirençleri göz önünde bulundurularak bir seri dekontaminasyon işlemi gerçekleştirilebilir. Bu uygulamalar genellikle kontaminantları elimine eder, fakat genelde önemli miktarda mikobakteri ölümüne de neden olabilir (Dailloux ve ark., 1999). M. marinum biyogüvenlik seviyesi açısından 2. derece öneme sahiptir. M. tuberculosis ise biyogüvenlik seviyesi açısından 3. derecede yer almaktadır. Bu da çalışma olanağı açısında M. marinum u daha avantajlı kılar (Gauthier ve Rhodes, 2009). Mikobakteriler aerop bakterilerdir. Ortamda % 5-10 CO 2 nin bulunması üremeyi hızlandırır (Bilgehan, 2004). Nekropsi sonrasında çıkarılan iç organlardan parçalar alınarak homojenize edilip dekontaminasyon işleminden sonra gliserinli agara veya Loewenstein Jensen besi yerine, aerobik

20 koşullarda, 25-30 C ler arasında 2-3 hafta süre ile inkubasyona bırakılırlar (Koneman, 2006). Bunun yanında Dorset ve Petroff yumurta agar, Dubos agar, Sauton s agar, Ogawa yumurta agar, 7H11 agar başarılı bir şekilde kullanılabilmektedir (Clark ve ark., 1990; Durupınar, 1996). Mikobakteriler zaman zaman genel bakteriyolojik agarlarla da izole edilebilmektedir. Bu agarlar arasında Tryptone soy agar (TSA) veya brainheart infusion agar (BHIA) gelmektedir (Ingles ve ark., 1994). Sudan mikobakteri aranmasında standart bir prosedür henüz geliştirilmemiştir (Kamala ve ark., 1994). Yapılan bir çalışmada direkt mikroskopide etken bulunamamasına rağmen yapılan kültür aşamasından 3 hafta sonra etkenin ürediği bildirilmiştir (Thariat ve ark., 2001). M. fortuitum ve M. chelonae gibi daha hızlı üreme yeteneğine sahip etkenler MacConkey agarda üremelerine karşın M. marinum genellikle üremez ve antijenik olarak da diğer iki türden farklıdır (Arda ve ark., 2005). MacConkey de üreme özellikleri 1989 yılında Shotts ve Teska tarafından bulunmuştur (Ingles ve ark., 1994). M. marinum, 2-3 hafta içinde besi yerinin üzerinde sarı renkli, fotokromojenik koloniler oluşturur. Koloniler ışığa tutulursa renk daha belirgin bir hal alır (Arda ve ark., 2005). İlk izolasyonda 37 C de üreme genellikle mümkün değildir fakat pasajlanan etkenler daha sonra bu sıcaklıkta üremeye adapte olabilirler. Üremeleri için genellikle amonyak veya aminoasit gibi nitrojen kaynağı ve gliserol gibi karbon kaynağı kullanırlar, mineral tuzların varlığı da önem taşımaktadır (Ingles ve ark., 1994). Kolonileri ilk üremede düzgün (S tipli) ve nemli, zaman geçtikçe koloniler pürüzlü (R tipli) ve kuru, düz ve kabarık olabilir (Parisot 1958). Bunun nedeni kullanılan agar ve inkubasyon süresidir. Biyokimyasal olarak nitrat redüksiyon testi negatiftir (Ingles ve ark., 1994).

21 M. fortuitum ve M. chelonae ise bir hafta içinde üreme gösterirler ve kolonileri nonkromojeniktir (Arda ve ark., 2005). Kolonilerde krem veya gri renk daha dominanttır fakat sarıdan kahveregine kadar değişen renklerde koloniler oluşturabilmektedirler (Ingles ve ark., 1994). Ancak bu renk formasyonu, besi yerinin bileşimine, inkubasyon sıcaklığına, inkubasyon süresine ve suş karakterine göre de değişiklik gösterebilmektedir (Arda ve ark., 2005). M. fortuitum, 37 C de rahatlıkla ürer fakat psikrofil balık türlerinden izole edilen M. chelonae bu sıcaklıkta üreyemez (Ingles ve ark., 1994). M. chelonae nin eski kültürleri mor renkli koloni oluşturabilme yeteneğine sahiptir (Ingles ve ark., 1994). M. fortuitum ve M. chelonae yi demire ihtiyaçlarına göre, sukroz kullanımlarına göre, nitrat redüksiyonlarına göre ve 37 C de üremelerine göre ayırt edilebilmektedir (Ingles ve ark., 1994). Çizelge 1.2. Patojen balık mikobakterilerinin ayırıcı biyokimyasal testleri (Ingles ve ark., 1994; Koneman, 2006). ( bilinmiyor) M. marinum M. fortuitum M. chelonae 25 C de izolasyon + + + 37 C de izolasyon + Büyüme hızı yavaş hızlı hızlı Pigmentasyon fotokromojen MacConkey de üreme + + Nitrat Redüksiyon testi + Demire gereksinim + Sukrozu kullanma + 68 C de Katalaz + + Biyokimyasal sonuçların yorumlanması çok uzun sürmekle beraber, suşlar arasındaki varyasyonlar nedeniyle zordur ve balıkları enfekte eden türlerin biyokimyasal özelliklerindeki farklılıklar çok azdır (Pate ve ark., 2005;

22 Pourahmad ve ark., 2009). Hastalığın tanısında kullanılan ve indirekt teşhise yarayacak serolojik bir test henüz bulunmamaktadır (Arda ve ark., 2005). Moleküler düzeyde teşhis son dönemlerde sıklıkla kullanılmaktadır. Özellikle latent infeksiyon olgularında balık dokularında patojenik mikobakteri türlerinin hızlı teşhisi için DNA esasına dayanan metotlara gereksinim vardır (Lin ve ark., 2006). Konvansiyonel yöntemlerin uzun zaman alması ve yanlış negatifliğe yol açabilmesi moleküler teşhisin kullanımını artırmaktadır (Pate ve ark. 2005). Bu nedenle balık dokularından ve kanlarından PCR metodu ile hızlı teşhis yoluna gidilmektedir (Toranzo, 2005). Taalat ve ark. (1997) ilk kez PCR-RFLP yöntemini kullanarak M. marinum, M. fortuitum ve M. chelonae türlerini identifiye etmiştir (Taalat ve ark. 1997). 16S rrna geni dışında balıklardaki mikobakteri etkenlerinin moleküler teşhisi için kullanılabilecek hedef genler, 16S-23S internal transcript spacer (ITS), heat shock protein 65 (hsp65), exported repeated protein (erp) ve RNA polymerase B subunit (rpob) genleridir (Pate ve ark., 2005). Genetik Mikobakteri Tiplendirme (GTM), kültüre edilen materyallerden moleküler düzeyde türlerin identifikasyonu için kullanılmaktadır. Test DNA strip teknolojisine dayanır ve 13 mikobakteriyel türün identifikasyonuna olanak sağlar. Prosedür üç aşamada tamamlanır. İlk aşama kültüre edilen materyalden DNA izolasyonudur. İkinci aşama primerler ile amplifikasyon ve son aşama ise ters hibridizasyondur (Pate ve ark., 2005). Pate ve arkadaşlarının (2005) yaptığı çalışmada izole edilen suşlardan bazıları PCR- RFLP ve GTM testiyle de incelenmiş ve her iki testle de cins düzeyinde kültüre yakın sonuçlara varılmıştır. Ancak tür ayrımı açısından PCR-RFLP yöntemi direkt infekte dokularda da çalışmasına rağmen saha örneklerinde güvenilir sonuçlar vermemesi, sadece en önemli birkaç Balık Mikobakteriyozis etkeninde ayrım yapabilmesi ve nisbeten uzun sürmesi nedeniyle başarılı bulunmamıştır. GTM testi ise birkaç saatte sonuç

23 alınabilmesi, çok sayıda Mikobakteri türünü identifiye edilebilmesi nedeniyle başarılı bulunmuştur. Lin ve ark. (2006) tarafından yapılan bir araştırmada, mikobakterilerde bulunan heat shock protein 65 (hsp65) geni amplifikasyon ürünleri PCR Restriksiyon analizi (PRA) metoduyla incelenmiştir. Bu genin BstE2 ve HaeIII enzimleri ile kesilmesi sonrası restriksiyon analizi yapılarak tür düzeyinde 5 örneğin M. marinum olduğu ortaya çıkartılmıştır (Lin ve ark., 2006). Yapılan bir çalışmada M. marinum infeksiyonunun teşhisi için formalin ile fikse edilmiş parafin emdirilmiş biyopsilerden sağlanan klinik örneklere direkt olarak uygulanabilen bir PCR-Reverse-Cross-Blot Hibridizasyon testi geliştirilmiştir (Decostere ve ark., 2004). Ayrıca Senguinetti ve ark. (1998) tarafından yapılan bir çalışmada, 13 farklı türdeki mikobakteri etkenlerinin identifikasyonu kısa sürede yapılmıştır. Bu uygulanan yöntemin geçerliliği konvansiyonel yöntemler, ticari DNA probları, Yüksek Performans Sıvı Kromatografisini (HPLC) analizlerinin sonuçları ile karşılaştığında uyumlu bulunarak doğrulanmıştır. Ayrıca bu yöntem sekans analizi ve restriksiyon enzim prosedürleri ile PCR ürünlerini analiz eden yöntemlere göre de tercih edilen bir metottur. Puttinaowarat ve ark. (2002) tarafından yapılan PCR-Reverse-Cross- Blot Hibridizasyon metodunun Mycobacterium spp. için spesifik olduğu ve bakterileri tür düzeyinde 20 adet mikobakteriye kadar tespit edebildiğini bulmuşlardır. 29 izolatın analiz edildiği metotta 16 tanesi M. fortuitum ve geri kalanları da M. marinum olarak identifiye edilmiştir (Puttinaowarat ve ark. 2002). Bugün geliştirilmekte olan genetik metodlar, HPLC, yağ-asidi metilesterleri (FAME) için kapilar gas kromatografi analizini içermektedir. FAME analizi ile hücre duvarındaki yağ asitlerinin kompozisyonuna göre izolatların türleri belirlenmektedir. HPLC ile izolatların hücre duvarındaki mikolik asitlerin

24 kendine özgü profili belirlene bilmektedir ve bu mikobakterilerin ayrımı için kabul gören bir metottur ( Jacobs ve ark., 2009). Bu tez çalışmasında balıklardan ve sulardan Mycobacterium spp. izolasyonu ve identifikasyonu amaçlanmıştır. Ayrıca hem direkt olarak toplanan materyallerden hem de izole edilen suşlardan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile moleküler tiplendirme amaçlanmıştır. Bu çalışma Türkiye de balıklardan izole edilen mikobakterilerin moleküler yöntemlerle saptanması bakımından orjinallik taşımaktadır.