TEMEL TIPTAN KL N E. Oksijen toksisitesinin arac molekülleri olarak oksijen radikalleri. Dr. Kamer K l nç 1, Uzm. Asuman K l nç 2

TEMEL TIPTAN KL N E Oksijen toksisitesinin arac molekülleri olarak oksijen radikalleri Dr. Kamer K l nç 1, Uzm. Asuman K l nç 2 Hacettepe Üniversitesi T p Fakültesi Biyokimya Anabilim Dal Profesörü 1, Biyokimya Uzman 2 Oksijen ve Canl lar Atom say s itibar ile %54 gibi bir oranla gezegenimizde en bol bulunan bir element olan oksijen, yaklafl k iki milyar y l kadar önce atmosferimizde, fotosentetik canl lar n faaliyeti sonucu oluflmaya bafllam flt r. Atmosferdeki oksijen birikimini izleyerek oluflan ozon tabakas, özellikle karasal ortamda, daha yüksek yap l canl lar n oluflumu ve evrimine de olanak sa lam flt r. Oksijen bütün canl lar için vazgeçilmez bir element olup; hidrojen, karbon, nitrojen ve kükürt ile birlikte organik moleküllerin temel yap sal atomlar n oluflturur. Organik moleküllerdeki yap sal görevinin yan s ra, aerobik canl lar n enerji metabolizmas ndaki rolü nedeniyle oksijen hayati bir öneme sahiptir. Çok say da hidroksilaz ve oksidaz enzimleri oksijeni substrat olarak kullan p organik moleküllerin yap lar na kat l m n katalizler. Hayvan dokular, kendi yap lar n oluflturan elementlerden sadece oksijeni enzimatik olarak kullanabilirler. Bu nedenle, yap sal görevi d fl nda oksijenin fonksiyonel (enerji metabolizmas ndaki gibi) görevleri de vard r. Bilinen bütün canl türleri, organik moleküllerin içindeki flekli ile oksijene gereksinim duysalar da, serbest formdaki moleküler oksijen her canl türü için ayn anlam ifade etmez: Örne in, aerobik canl lar yaflamlar için mutlaka moleküler oksijene gereksinim duyarlar. Anaerobik canl lar ise büyüme ve ço almalar için oksijene ba ml de ildirler. Fakültatif anaeroblar oksijenin varl n tolere edebilirler; oysa zorunlu anaerobik canl lar sadece oksijensiz ortamda yaflayabilirler. Anaerobik canl lardaki oksijenin toksik etkisinin nedeni, oksijenden kaynaklanan baz reaktif türlerin biyolojik molekülleri oksitlemeleri ve bu reaktif türlere karfl anaerobik türlerde savunma sisteminin bulunmamas d r. Herhangi bir canl türünün aerobik bir ortamda yaflayabilmesi için, oksijeni hiç metabolize etmese bile, oksijenden kaynaklanabilecek reaktif türleri inaktive edecek korunma mekanizmalar na sahip olmas gerekir. Oksijen sadece anaerobik türlerde de il; fakat yaflamlar için mutlaka moleküler oksijene ba ml olan yüksek yap l canl larda da toksik etkilidir ve oksijenin toksik etkileri, atmosferdeki derifliminin üzerine ç k ld kça net bir flekilde ve k sa sürede görülmeye bafllar. Hiperbarik oksijenin bitki ve hayvanlardaki zararl etkileri oksijenin ilk gözlemlenen toksik etkilerindendir. Oksijenin canl lardaki toksik etkileri bafll ca iki tür mekanizma ile gerçekleflir: A. Aerobik canl larda gözlenen oksijen toksisitesinin ilk aç klamas, moleküler oksijenin baz enzimleri inhibe etti i fleklindedir. Gerçekten de oksijen baz enzimleri reaktif türlerinden ba ms z olarak do rudan inhibe edebilir. Örne in nitrojen fiksasyonunu katalizleyen nitrojenaz enzimleri ve C fiksasyonunu katalizleyen enzim olan ribuloz bifosfat karboksilaz, oksijen taraf ndan kompetetif olarak inhibe edilirler. Hayvanlarda oksijen ile indüklenen konvülzyon ile beyinde GABA düzeyleri aras nda bir iliflki vard r. Oksijen, GABA sentezini katalizleyen glutamat dekarboksilaz enzimini inhibe ederek beyin de GABA deriflimini düflürmektedir. B. Oksijenin baz enzimlerde gösterilen inhibitör etkisine ra men, do rudan oksijenin kendisinden kaynaklanan inhibisyon ancak s n rl say da enzimlerde görülmüfltür ve bu tür inhibisyonlar n h z da çok zay ft r. lk kez 1954 y l nda, oksijenin biyolojik sistemlerde görülen toksik etkilerinin oksijeninin baz reaktif türlerinden kaynaklanabilece i ileri sürülmüfltür. Bugün, oksijenin canl lardaki toksik etkisinin Oksijen Radikalleri olarak adland r lan ve oksijenin vücuttaki metabolizmas s ras nda oluflan reaktif türlerden kaynakland bilinmektedir. 110 Hacettepe T p Dergisi 2002; 33(2): 110-118

K l nç, K l nç: Oksijen toksisitesinin arac molekülleri olarak oksijen radikalleri 111 Reaktif Türler Olarak Radikaller Atomlar, proton ve nötronlardan oluflan pozitif yüklü bir çekirdek ve çekirde in etraf nda bulunan negatif yüklü elektronlardan oluflurlar. Elektronlar hem partikül, hem de dalga özelli ine sahip olup; çekirdek etraf nda fl k h z ile hareket ederler. Bu nedenle elektronlar n çekirdek etraf ndaki yeri tam olarak tarif edilemez, yaln zca bulunma olas l n n en fazla oldu u yerden bahsedilebilir. Belirli elektronlar n bulunma olas l n n en yüksek oldu u yer orbital olarak adland r l r. Her orbital z t spinli olmak üzere iki elektron içerebilir. Say lar na göre, farkl enerji seviyesindeki elektronlar, farkl orbitalleri doldururlar. Çekirdekten uzaklafl ld kça elektronlar n enerji seviyeleri artar. s orbitalleri çekirdek etraf nda ve küresel; p orbitalleri elipsoid; d ve f orbitalleri ise karmafl k geometrik flekillerdedirler. Atomlar n çekirde inin çevresindeki elektronlar n bulundu u birinci yörünge bir tane s orbitali (1s), ikinci yörünge s ve p (2s, 2p), üçüncü yörünge s, p, d (3s, 3p, 3d) ve dördüncü yörünge s, p, d, f (4s, 4p, 4d, 4f) orbitallerini içerir. Bir atomda hangi yörüngelerin bulundu u, orbitallerin ne kadar elektron içerdi i ve orbitallere elektronlar n nas l da ld klar atom türüne ba l olarak de iflir. Organik moleküllerin bafll ca atomlar olan H, C, N, O ve S ün elektron konfigürasyonlar fiekil 1 de verilmifltir. Radikaller, d fl orbitallerinde paylafl lmam fl elektron içeren kimyasal türlerdir. Böyle bir kimyasal tür basit bir atom ya da kompleks yap l bir organik molekül olabilir. Her türden kimyasal ve biyokimyasal tepkime daima atomlar n d fl orbitallerindeki elektronlar seviyesinde gerçekleflir. D fl orbitallerde paylafl lmam fl elektron bulunmas söz konusu kimyasal türün reaktivitesini ola anüstü artt rd için, radikaller reaktivitesi çok yüksek olan kimyasal türlerdir. Elementlerin bir k sm, atomik yap lar nda paylafl lmam fl elektron içerdiklerinden, do ada atomlar fleklinde de il; moleküller fleklinde bulunurlar. Örne in hidrojen, karbon, nitrojen, oksijen ve di er baz elementler do ada atomlar fleklinde serbest bulunmazlar. Asalgazlar (soygazlar) gibi elementlerde ise içerebildikleri bütün orbitalleri elektronlarla doyuruldu u için serbest atom fleklinde bulunabilirler ve reaktiviteleri yoktur. Radikaller Nas l Oluflur? çinde bulundu umuz çevrede çeflitli fiziksel etkenler ve kimyasal olaylar nedeniyle devaml bir radikal yap m vard r. Hücresel koflullarda da ciddi bir miktar ve çeflitlilikte radikaller üretilmektedir. Nerede ve nas l üretildiklerine bak lmaks z n, radikaller bafll ca 3 temel mekanizma ile oluflurlar. 1. Kovalent ba lar n homolitik k r lmas ile. Yüksek enerjili elektromanyetik dalgalar ve yüksek s cakl k (500-600 C) kimyasal ba lar n k r lmas na neden olur. K r lma s ras nda ba yap s ndaki iki elektronun her biri ayr ayr atomlar üzerinde kal yorsa, bu tür k r lmaya homolitik k r lma denir ve her iki atom üzerinde de paylafl lmam fl elektron kal r. Organik moleküllerdeki ba lar n heterolitik k r lmas durumunda z t yüklü iyon çiftleri oluflur ve bu türler de reaktiftir. 2. Normal bir molekülün elektron kaybetmesi ile. Radikal özelli i bulunmayan bir molekülden elektron kayb s ras nda d fl orbitalinde paylafl lmam fl elektron kal yorsa, radikal formu oluflur. Örne in askorbik asit, glutatyon ve tokoferoller (E vitamini) gibi hücresel antioksidanlar, radikal türlere tek elektron verip radikalleri indirgerken, kendilerinin radikal formlar oluflur. Glutatyon (GSH) radikalleri indirgerken, kendisinin tiyil radikali (GS. ) oluflur. ki tiyil radikalinin birbiriyle tepkimesi sonucu oluflan tür ise glutatyonun oksitlenmifl (GSSG) formudur. 3. Normal bir moleküle elektron transferi ile. Radikal özelli i tafl mayan bir moleküle tek elektron transferi ile d fl orbitalinde paylafl lmam fl elektron oluflturuluyorsa, bu tür indirgenme radikal oluflumuna fiekil 1. Biyomoleküllerin bafll ca yap sal atomlar n n elektronik konfigürasyonlar Element Atom Elektronik Orbitallere elektronlar n yerleflimi Numaras konfigürasyonu H 1 1s 1 C 6 1s 2 2s 2 2p 2 N 7 1s 2 2s 2 2p 3 O 8 1s 2 2s 2 2p 4 S 16 1s 2 2s 2 2p 6 3s 2 3p 4

112 Hacettepe T p Dergisi neden olabilir. Örne in moleküler oksijenin tek elektron ile indirgenmesi, radikal formu olan süperoksitin (O -. 2 ) oluflumuna neden olur. Bu mekanizma ile radikal yap m biyolojik sistemlerde yayg n olarak gerçekleflti inden canl lar için önemlidir. Canl larda çok say da enzimatik ve enzimatik olmayan tepkimelerle süperoksit üretilir. Süperoksit radikalinin yap m ndaki art fl, oksijenin di er radikal türlerinin ve di er atom merkezli radikallerin oluflumu için tetik fonksiyonu görür. Oksijen ve Oksijen Radikalleri Moleküler oksijen (atmosferik oksijen) d fl orbitallerinde paylafl lmam fl iki elektron içerir. Bu elektronlar, spinleri ayn yönde ve farkl orbitallerde iken minimum enerji seviyesindedirler. Radikal tan m na göre oksijen diradikal yap ya sahip bir moleküldür. Oysa oksijenin reaktivitesi beklenenin aksine çok düflüktür. Diradikal yap ya sahip olan oksijenin herhangi bir molekülle tepkimeye girebilmesi için, tepkimeye girece i molekülün de benzer yap ya (farkl orbitallerde spinleri ayn yönde elektron içermesi) sahip olmas gerekir. Oysa baflta organik moleküller olmak üzere, atom ve moleküller orbitallerinde elektronlar antiparallel ve eflleflmifl olarak içerirler veya paylafl lmam fl elektronlar kovalent ba lara kat lm fllard r. Bunun sonucu oksijenin di er moleküllere olan reaktivitesi son derece k s tlanm flt r. Bu k s tlama spin k s tlamas (spin restriction) olarak adland r l r. Canl lar n oksijeni kullanabilmesi için, oksijene elektron transferi yaparak spin k s tlamas n aflmalar gerekir. Bu ifllem için canl lar geçifl elementleri s n f ndan baz metal iyonlar ndan yararlan rlar. Geçifl elementlerinden Fe, Cu, Mn, Zn, Co ve Mo vücudun gereksinim duydu u bafll ca eser elementler olup, bu elementler d fl orbitallerinde bir veya daha fazla say da paylafl lmam fl elektron içerirler. Canl larda oksijeni kullanan enzimler ya da oksijenle etkileflime giren proteinler, bu elementlerden en az bir tanesini içermek zorundad rlar. Vücudumuzda ve çevremizde sadece oksijenin de il, fakat di er atom merkezli radikaller de oluflabilirler. Oysa özellikle biyolojik sistemlerde radikaller kavram ndan bahsedildi inde daima oksijen merkezli radikaller akla gelir. Bu anlay fl n bafll ca hakl gerekçeleri flunlard r: 1. Di er atom merkezli radikaller difüzyon limitine yak n büyük bir h zla oksijenle tepkimeye girerler ve tepkimede paylafl lmam fl elektron oksijen atomu üzerine kayar; radikalik özellik oksijen atomu üzerinde devam eder. 2. Moleküler oksijen hücrelerde devaml olarak kullan lan bir moleküldür. Oksijeni kullanabilmek için elektron transferi ile spin k s tlamas n n afl lmas gerekir. Bu nedenle de oksijen metabolizmas s ras nda reaktif radikal türlerinin oluflmas kaç n lmazd r. 3. Elektrofilik bir atom olan oksijen, d fl orbitaline elektron alarak biyomolekülleri oksitler, bu s rada kendisinin radikal türleri oluflur. Metal iyonlar oksijenin bu tür oksitleyici etkilerini h zland r rlar. Spin k s tlamas nas l afl l r? : Oksijenin d fl orbital elektronlar n n mevcut durumunun de ifltirilmesi onu reaktif hale getirir ve kullan m na olanak sa lar. Bu amaçla spin k s tlamas iki yolla afl labilir: a) Oksijene elektron transferi ile. Serbest metal iyonlar, çok daha etkili olmak üzere ise proteinlere ba l metal iyonlar arac l ile oksijene bir veya iki elektron aktar m katalizlenebilir. Oksijene fiekil 2. Moleküler oksijenin farkl formlar n n 2p orbital elektronlar n n konfigürasyonu σ *2p π *2p π 2p σ 2p. = 1 g + 1 g Moleküler Oksijen Süperoksit Anyonu Peroksi Anyonu Singlet Oksijen Singlet Oksijen

K l nç, K l nç: Oksijen toksisitesinin arac molekülleri olarak oksijen radikalleri 113 tek elektron transferi ile süperoksit radikali (süperoksit anyonu) oluflur. Spin k s tlamas kalkt için süperoksit, oksijene göre çok daha reaktiftir. ki elektron transferi ile de peroksi (= ) anyonu oluflur. Bu tür ortamdan ald iki proton ile H 2 oluflturur. b) Enerji absorpsiyonu ile de oksijenin spin k s tlamas ortadan kald r labilir. Bu mekanizma ile oksijenin iki uyar lm fl formu oluflur. Singlet oksijen ( 1 ) diye adland r lan oksijenin bu formlar nda d fl orbital paylafl lmam fl elektronlar ndan birisinin spini de iflmifltir. Z t spinli elektronlar ayn orbitalde (delta formu) veya ayr ayr orbitallerde (sigma formu) bulunabilirler. Her iki formun reaktivitesi çok yüksektir. Oksijenin spin k s tlamas afl lm fl formlar fiekil 2 de verilmifltir. fiekilde yaln zca farkl l klar n gerçekleflti i 2p orbitallerinin elektron konfigürasyonlar görülmektedir. Oksijenin enzimatik olarak vücutta kullan m s ras nda, içerdikleri metal iyonlar n n yard m ile, spin k s tlamas bu mekanizmalarla afl l r. Ancak enzimler taraf ndan üretilen reaktif türler normal koflullarda genellikle düflük deriflimde olup, ortama verilen radikaller s n rl d r. Patolojik durumlarda ise enzimatik olarak üretilip ortama verilen ve nonenzimatik tepkimelerle yap lan radikal miktar ndaki art fla ba l olarak oksijenin toksik etkileri görülmeye bafllar. gerçekleflir. Hücresel koflullarda oluflabilen oksijen radikalleri ile oksijen içeren reaktif türlerin önemli olanlar Tablo 1 de görülmektedir. Vücudumuzda oluflabilen radikallerin say s yüzlerce farkl tür fleklinde ifade edilebilirse de, bu radikaller aras nda süperoksit, H 2, nitrik oksit ve hidroksil radikalinin özel yerleri vard r. Hatta bu radikaller içinde süperoksit ve nitrik oksit temel radikaller say labilir. Çünkü süperoksit ve nitrik oksit enzimatik mekanizmalarla, devaml olarak ve önemli deriflimde üretilen radikallerdir. Ayr ca bu iki radikal, biyolojik sistemlerde tan d m z di er bütün önemli radikaller ile radikal yap da olmayan reaktif türlerin oluflumunu bafllatabilecek özelliktedirler. Normal biyokimyasal tepkimeler s ras nda oluflan oksijen radikalleri ile çeflitli biyolojik fonksiyonlar yerine getirmek üzere üretilen nitrik oksitin deriflimleri genellikle çok düflüktür. Düflük deriflimlerdeki reaktif türler, hücrelerin antioksidan sistemleri taraf ndan inaktive edildiklerinden önemli toksik etkilere neden olmazlar. Ancak bu radikallerin yap mlar çeflitli patolojik durumlarda artabilir, ço unlukla da her iki radikal bileflik grubunun oluflumu birbiri ile parallel seyreder. Örne in inflamasyon durumlar nda aktive olan lökositler ayn anda hem oksijen radikallerini Tablo 1: Oksijenden ve nitrik oksitten oluflan bafll ca reaktif türler. Kimyasal olarak radikal yap s na sahip olan türler paylafl lmam fl elektron içeren atom üzerine konulan nokta ile belirtilmifllerdir. Tablonun sa nda verilen nitrojen oksit türlerinin ço u radikal yap s na sahip de illerdir. Nitrik oksitin oksijenli ortamda kendili inden oksidasyonu sonucu oluflan bu türleri, paylafl lmam fl elektron içermeseler bile çok reaktiftirler. Tür Ad 1 Singlet oksijen O. 2 Süperoksit H 2 Hidrojen peroksit. OH Hidroksil radikali ROO. Peroksi radikali ROOOH Hidroperoksit RO. Alkoksi radikali ROOR Endoperoksit HO. 2 Hidroperoksi radikali Tür NO. NO. 2 NO + 2 NO NO + ONOO ONOO. N 2 O 3 N 2 O 4 Ad Nitrik oksit Nitrojen dioksit Nitril katyonu Nitroksil Nitrozil (nitrozonyum iyonu) Peroksinitrit Peroksinitrit radikali Dinitrojen trioksit Dinitrojen tetroksit Canl larda Oksijen Radikallerinin Yap m Oksijen bulunan bir ortamda çeflitli fiziksel ve kimyasal etkenlerle oksijen radikalleri yap labilir. Özellikle oksijenin metabolize edildi i canl larda önemli deriflim ve çeflitlilikte radikal üretimi hem de nitrik oksiti yüksek deriflimlerde sentezlerler. Nitrik oksit, oksijen radikalleri ile tepkimeye girerek veya oksijenli ortamda oksitlenerek, kendisinden çok daha reaktif türlerin oluflumuna neden olur. Oksijen radikallerininin fazla yap m n n neden oldu u

114 Hacettepe T p Dergisi etkilerin toplam oksidan stres diye adland r l r. Oksidan stresi, nitrik oksitin reaktif türlerinden kaynaklanan toksik etkilerden ay rmak mümkün olmad ndan, nitrozatif stres ten ay rmak imkans zd r. Bu bak mdan, oksidatif hasar, süperoksitten kaynaklanan radikaller ile nitrik oksitin reaktif türlerinin neden oldu u hasarlar n bir toplam d r. Süperoksit Canl larda olufltu u ilk gösterilen radikal olan süperoksit, bafll ca flu mekanizmalarla üretilmektedir: 1. ndirgeyici özellikteki biyomoleküller oksijene tek elektron verip kendileri oksitlenirlerken süperoksit radikali oluflur. Hidrokinonlar, flavinler, tiyoller, katekolaminler, ferrodoksinler, indirgenmifl nükleotidler gibi yüzlerce biyolojik molekül aerobik ortamda oksitlenirken süperoksit yap m na neden olurlar. 2. Baflta çeflitli dehidrogenazlar ve oksidazlar olmak üzere, yüzlerce enzimin katalitik etkisi s ras nda süperoksit radikali bir ürün olarak oluflabilir. 3. Mitokondrideki enerji metabolizmas s ras nda oksijen kullan l rken, tüketilen oksijenin %1-5 kadar süperoksit yap m ile sonlan r. Buradaki radikal yap m n n nedeni NADH dehidrogenaz ve koenzim Q gibi elektron tafl y c lardan oksijene elektron kaça n n olmas d r. Beklenilenin aksine, oksijenin mitokondri solunumu s ras nda ba land ve suya indirgendi i sitokrom oksidaz basama nda radikal yap m gösterilememifltir. Sitokrom oksidaz Fe:Cu:Zn:Mg atomlar n 2:2:1:1 oran nda içeren bir protein olup, süperoksit dismutaz, katalaz ve peroksidaz aktivitelerine sahiptir. Bu sayede, sitokrom oksidaz üzerinde süperoksit veya H 2 oluflsa bile, içerdi i enzimatik aktivite sayesinde h zla ortamdan temizlenir. 4. Aktive edilen fagositik lökositler bol miktarda süperoksit üreterek fagozom içine ve bulunduklar ortama verirler. Antibakteriyel etki için gerekli olan bu radikal yap m, daha reaktif türlerin oluflumunu da bafllat r. Bu örnekte görüldü ü gibi radikal yap m baz hücresel fonksiyonlar için gerekli de olabilir. Süperoksitlerin Vücuttaki Ak beti Hücresel koflullarda üretilen süperoksit, oksitleyici veya indirgeyici olarak davranabilir. Ald elektronu metal iyonuna, sitokrom c ye veya bir radikale verirse tekrar oksijene oksitlenir. Oksijenden daha oksitleyici olan süperoksit bir elektron daha al rsa peroksi anyonuna indirgenir: -. + e - = 2H+ H 2 Yukar daki tepkime biyolojik moleküllerin oksidasyonuna neden oldu undan tercih edilmez. Aerobik canl larda süperoksitlerin H 2 e çevrilmesi katalitik aktivitesi çok yüksek bir enzim olan süperoksit dismutaz (SOD) taraf ndan katalizlenir: -. + -. + 2H + SOD H 2 SOD taraf ndan katalizlenen bu tepkime dismutasyon tepkimesi diye adland r l r. Süperoksit, özellikle hafif asidik koflullarda SOD olmadan kendili inden dismutasyonla da H 2 e çevrilebilir. Süperoksit, pk s 4.8 olan zay f bir baz oldu undan, ph n n daha düflük oldu u fagozom içinde daha kolayl kla kendili inden dismutasyonla H 2 oluflturabilir. Nötral ph da enzimatik dismutasyon 10 9 kez daha h zl oldu undan SOD enzimi savunma için mutlaka gereklidir. SOD enziminin yüksek katalitik aktivitesi nedeniyle hücrelerde süperoksit birikimine izin verilmez. Ancak çeflitli patolojik durumlarda süperoksit yap m n n artmas durumunda, süperoksite özgül tepkimeler görülmeye bafllar. Süperoksit metal iyonlar n indirgeyerek ba l olduklar proteinlerden sal n m na neden olur, kofaktörlerin oksidasyon düzeylerini bozar, metal iyonlar n n kat ld hidroksil radikali yap m tepkimelerini h zland r r. Di er radikallere göre daha az reaktif olsa da, süperoksit indirgenmifl nükleotidleri, baz amino asitleri ve antioksidan bileflikleri (glutatyon, askorbik asit, tokoferol) oksitler. Süperoksit hücre zarlar n n hidrofobik ortamlar nda daha uzun ömürlü ve çözünürlü ü daha fazlad r. Zar fosfolipidleri nedeniyle hücre zar yüzeyleri daha asidiktir ve süperoksit burada daha kolayca bir proton alarak hidroperoksit radikalini (H. ) oluflturur. Bu radikal de çok reaktif olup, hücre zarlar nda lipid peroksidasyonunu bafllatabilir ve zarsal antioksidanlar (tokoferol) oksitleyebilir. Hidrojen Peroksit Hidrojen peroksit, oksijenin enzimatik olarak iki elektronla indirgenmesi ya da süperoksitlerin enzimatik/nonenzimatik dismutasyonu tepkimeleri sonucu oluflur. Hidrojen peroksitin pk s 10.6 oldu undan, nötral ve asidik koflullarda net yük tafl maz, biyolojik zarlar kolayca geçebilir. Yap s nda paylafl lmam fl elektron içermedi inden radikal özelli i tafl maz, reaktif bir tür de ildir. Hidrojen peroksitin oksitleyici bir tür olarak bilinmesinin nedeni, Cu, Fe gibi metal iyonlar varl nda hidroksil radikalinin öncülü olarak davranmas d r. Hidrojen peroksit özellikle proteinlerdeki hem grubunda bulunan demir ile tepkimeye girerek yüksek oksidasyon düzeyindeki ferril demir (Fe IV ) ve perferril demir

K l nç, K l nç: Oksijen toksisitesinin arac molekülleri olarak oksijen radikalleri 115 (Fe V ) oluflumuna neden olur. Bu formdaki reaktif demir çok güçlü oksitleyici özelliklere sahip olup, hücre zarlar nda lipid peroksidasyonu gibi radikal tepkimeleri bafllatabilir. Belirtilen potansiyel oksitleyici özelli i nedeniyle biyolojik sistemlerde oluflan H 2 in derhal ortamdan uzaklaflt r lmas gerekir. Bu görevi, hücrelerdeki önemli antioksidan enzimler olan katalaz ve peroksidaz enzimleri yerine getirirler. Hidroksil Radikali Biyolojik ve kimyasal sistemlerde üretilebilen hidroksil radikali (. OH) canl larda iki mekanizma ile oluflabilir: A. yonlaflt r c radyasyonun etkisiyle sulu ortamda su moleküllerinin iyonlaflmas gerçekleflir: 2H 2 O enerji H 2 O + + e - + H 2 O * Uyar lm fl su molekülü (H 2 O * ) homolitik y k m ile; H 2 O + ise bir su molekülü ile tepkimeye girerek bafll ca reaktif radikal olarak hidroksil radikallerini olufltururlar. Bu tepkimeler femtosaniye içinde gerçekleflir ve üretilen. OH, radyasyonun canl lardaki toksik etkisinden sorumlu bafll ca kimyasal türdür. B. Hidrojen peroksitin eksik indirgenmesi ile. OH yap m, vücutta bu radikalin en önemli kayna d r. H 2 in iki elektron ile indirgenmesi ile su oluflurken, tek elektronla indirgenmesi. OH yap m na neden olur. Bu tür indirgenme Fe, Cu gibi metal iyonlar taraf ndan katalizlenir. Askorbik asit, süperoksit gibi indirgeyici bilefliklerin de bulundu u ortamda, oksitlenen metal iyonu tekrar indirgendi inden, H 2 ten. OH yap m sürekli bir duruma gelir: H 2 + Askorbat (veya O -. Fe, Cu 2 ). OH + semidehidroaskorbat Haber-Weiss tepkimesi ya da Fenton tepkimesi olarak adland r lan bu tepkime ile ne kadar. OH oluflaca, vücutta üretilen H 2 deriflimi ve serbest metal iyonunun varl na ba l d r. Süperoksit hem H 2 in öncülü hem de metalleri indirgeyici bir tür oldu undan; süperoksit proteinlere ba l metallerin indirgenip serbest kalmas na da neden olabildi inden, biyolojik koflullarda süperoksit yap m n n artt ortamda. OH üretimi kaç n lmazd r. Fenton tepkimesini katalizleyen en aktif metal iyonlar demir ve bak rd r. Mangan ve kobalt da bu bak mdan aktif olsalar da, vücuttaki deriflimlerinin düflüklü ü nedeniyle demir ile k yasland klar nda çok daha az etkindirler. Serbest metal iyonlar n n vücut s v lar ndaki deriflimi pratik olarak s f r kabul edilir, ölçülemeyecek kadar azd r. Demir, metabolizmas n n her aflamas nda mutlaka ya bir proteine (ferritin, transferrin, laktoferrin gibi) ba l durumda ya da küçük organik moleküllerle ( sitrat, ADP, ATP gibi) kompleks oluflturmufl formda bulunur. Bak r, seruloplazmine s k ba l d r; di er metal iyonlar ise metallotiyoneinlerle birlikte bulunur. Metal iyonlar n n proteinlere ba l formda tutulmalar,. OH yap m n önlemenin en güvenli yoludur. Hidroksil Radikalinin Tepkimeleri: Biyolojik sistemlerin tan d en reaktif tür olan. OH, su dahil ortamda rastlad her biyomolekülle difüzyon limiti h z ile tepkimeye girer. Bu nedenle 10-9 saniyeden daha k sa bir ömre sahiptir. Hidroksil radikalinin tepkimeleri bafll ca: a) Elektron transfer tepkimeleri, b) Hidrojen ç karma tepkimeleri ve c) Kat lma tepkimeleri fleklinde gerçekleflir. Bütün bu tepkimeler,. OH in paylafl lmam fl elektron içeren d fl orbitaline elektron alma ilgisinden kaynaklan r. Kat lma tepkimeleri özellikle elektronca zengin moleküllerle (pürin ve pirimidin bazlar, aromatik amino asitler gibi) gerçekleflir. Hidroksillenmifl bilefliklerin, örne in 8-oksoguanin ve hidroksillenmifl aromatik amino asitlerin biyolojik örneklerde tayini, in vivo koflullarda. OH in ne kadar üretildi i veya radyasyona ne kadar maruz kal nd hakk nda bilgi verir. Hidroksil radikalinin organik moleküllerden hidrojen (bir proton ve bir elektron) atomu alarak suya indirgendi i tepkime hidrojen ç karma tepkimesi olarak bilinir. Bu radikalin kat lma tepkimesi ile biyomolekül oksitlenir ve tepkime de sonlan r. Oysa hidrojen ç karma tepkimesi ile bafllayan. OH in etkisi, zincirleme tepkimeler fleklinde devam eder. fiöyleki: Organik bir molekülden (R) hidrojen ç kar lmas ile karbon merkezli bir radikal (R. ) oluflur. Karbon merkezli radikaller derhal ortamdaki bir oksijen molekülü ile tepkimeye girerek peroksi radikalini (ROO. ); peroksi radikali ise. OH gibi davranarak bir di er organik molekülden (R ) hidrojen ç kararak yeni bir karbon merkezli radikal (R., ) oluflumuna neden olurken, kendisi hidroperoksit (ROOH) formuna indirgenir. Organik hidroperoksit radikal özelli i tafl mad ndan oldukça stabildir. Oluflan yeni karbon merkezli radikal (R. ) ise yukar daki gibi yeni bir tepkime dizisini bafllat r. Organik hidroperoksitler her ne kadar stabil bileflikler ise de, Fe ve Cu gibi metal iyonlar varl nda radikalik tepkimelerle parçalan rlar ve bu tepkimeler s ras nda yeni karbon merkezli radikaller, oksijen radikalleri, karboniller ile sitotoksik aldehitler oluflur: Fe, Cu nrooh RO.,. OH, ROO., ROOR, R., 1, karboniller, aldehitler.

116 Hacettepe T p Dergisi Görüldü ü gibi radikalik tepkimeler stökiyometrik de il, fakat zincirleme tepkimelerdir. Bir tek. OH ile bafllat lan tepkime, her seferinde katlanarak yay lma yetene ine sahiptir. Hücre zar nda gerçekleflebilen bu tür tepkimelere lipid peroksidasyonu denir. Bir noktada bafllat lan tepkime, ortamda uygun bileflikler varsa yay lmaya devam eder. Radikalik tepkimeler; a) oluflan radikallerin antioksidanlar ile indirgenmesi, b) radikallerin birbirleri ile tepkimeleri, c) ortamda tepkimeye girebilecek bileflik kalmamas durumunda ancak sona erer. Buna göre hücresel koflullarda, oluflan radikalin çok erken safhada indirgenmesi, biyomoleküllerin korunmas bak m ndan hayati öneme sahiptir. Her tür biyolojik molekül. OH nin bir hedefi ise de, özellikle elektronca zengin bileflikler seçilen tercihli hedeflerdir. Nükleik asitler, proteinler ve lipidlerde bafllat lan radikalik tepkimelerde binlerce farkl ara ürünler oluflabilir. DNA ile tepkimesi sonucu baz modifikasyonlar, baz delesyonlar, zincir k r lmalar gerçekleflebilir; ileri derecedeki DNA hasarlar tamir edilemedi inden hücre ölümüne neden olur. Proteinler üzerinde oluflan oksidasyonlar yap de iflimine neden olaca ndan, proteinler proteolitik y k ma götürülür. Hücre zar su içermedi inden. OH in bafll ca hedefi ya asitleridir. Zar lipidlerinin peroksidasyonu zar n yap s n bozar ve geçirgenli ini artt r p yine hücre ölümüne neden olabilir. Bütün bu etkiler ne kadar.oh üretildi ine ba l d r ve gerek H 2 ten gerekse de organik peroksitlerden (ROOH). OH yap m ortamdaki serbest metal iyonlar taraf ndan katalizlenir. Metal iyonlar varl nda GSH ve askorbik asit gibi önemli antioksidanlar da prooksidan gibi davranmaya bafllarlar: Fe, Cu ngsh O -. 2, H 2, HO., RS., RSOO., RSOOH, karboniller. Özellikle. OH yap m n katalizlemelerindeki etkileri nedeniyle canl larda metal iyonlar radikal hasarlar ndan birinci derecede sorumludurlar ve bu etkiye sahip olamad klar formda (esas olarak proteine ba l ) tutulmal d rlar. Singlet Oksijen Oksijenin enerjetik olarak uyar lan bu formunda spin k s tlamas n n kald r lm fl olmas nedeniyle reaktivitesi çok yüksektir. Ald enerjiyi çevreye dalga enerjisi fleklinde verip oksijene geri dönebildi inden, oluflumu kemilüminesans ölçümü ile izlenebilir. Bafll ca flu mekanizmalarla vücutta oluflabilir: a) Pigmentlerin (örne in flavin içeren nükleotidler, retinal, bilirubin) oksijenli ortamda fl absorplamas yla, b) Hidroperoksitlerin metaller varl ndaki y k m tepkimelerinde, c) Kendili inden dismutasyon tepkimeleri s ras nda (örne in fagozom içinde), d) Prostoglandin endoperoksit sentaz, baz sitokrom p450 tepkimelerinde, miyelo/ kloro/ laktoperoksidaz enzimlerinin etkileri s ras nda. Singlet oksijen di er moleküllerle etkileflti inde ya içerdi i enejiyi transfer eder, ya da kovalent tepkimelere girer. Özellikle karbon-karbon çift ba lar singlet oksijenin tepkimeye girdi i ba lard r. Bu moleküllerin bafl nda tokoferoller, fenoller, bilirubin, DNA, karotenler, kolesterol, NADPH, triptofan, methionin, sistein ve histidin gibi bileflikler gelir. Doymam fl ya asitleri ile do rudan tepkimeye girerek peroksi radikalini (ROO. ) oluflturur ve HO. kadar etkin bir flekilde lipid peroksidasyonunu bafllatabilir. Nitrik Oksit (NO) Nitrik oksit, yüksek yap l canl larda amaçl olarak ve çok önemli biyolojik fonksiyonlar yerine getirmek üzere üretilen nitrojen merkezli bir radikaldir. Paylafl lmam fl elektron asl nda nitrojen atomuna ait ise de, bu elektronun hem nitrojen hem de oksijen atomu üzerinde delokalize olmas nedeniyle tam radikal özelli i tafl maz. Bunun sonucu, bilinen di er radikallere göre reaktivitesi bask land ndan oldukça uzun ömürlüdür. Yukar da özetlendi i gibi, oksijen radikalleri çok say daki enzimatik ve enzimatik olmayan yollar ile fiziksel/kimyasal mekanizmalarla oluflturulurlar. Oysa vücudumuzda NO sentezini sa layan mekanizmalar son derece k s tl d r. Vücuda giren nitro bilefliklerinin metabolize edilmesi s ras nda oluflan NO bir tarafa b rak lacak olursa, endojen NO oluflturan tek kaynak nitrik oksit sentaz (NOS) enzimleridir. Bu enzimin nöronal (nnos), endotelial (enos) ve indüklenebilir (inos) olmak üzere üç formu vard r; nnos ve enos izoformlar konstitütif enzimlerdir. enos ve nnos enzimleri taraf ndan üretilen çok düflük deriflimdeki NO sinir sistemi ve düz kaslarda hücre içi ve hücreler aras haberci molekül olarak kullan l r. Haberci (messenger) molekül olarak sitoplazmik guanilat siklaz aktive ederek hücrelerde cgmp deriflimini artt r r. cgmp ise çeflitli enzimler arac l ile hücre içi kalsiyum derifliminin düzenlenmesini sa lar. Nitrik oksit sentazlar n indüklenebilir (inos) formu ise baflta fagositik lökositler olmak üzere çeflitli hücrelerde bulunur ve sentezi sitokinler ile bakteriyel toksinler taraf ndan indüklenir. inos enziminin aktivitesi kalsiyumdan ba ms z olup kontrol edilemedi inden, ortamda arjinin bulundu u sürece aktif olup, uzun süreli ve yüksek deriflimde NO sentezini katalizler.

K l nç, K l nç: Oksijen toksisitesinin arac molekülleri olarak oksijen radikalleri 117 Radikal olarak reaktivitesi düflük olan NO, metal içeren merkezler ve radikaller ile büyük bir h zla tepkimeye girer. Özellikle lipid radikallerle (örne in hücre zar nda) tepkimeye girmesi NO e antioksidan bir etki kazand r r. Süperoksit ile NO aras ndaki tepkime ile oluflan peroksinitrit (ONOO - ), hidroksil radikali benzeri aktiviteye sahip olup radikalik tepkimeleri bafllatmaya ilave olarak biyomoleküllerin nitrasyonuna neden olur. Fizyolojik (düflük) deriflimde üretilen NO esas olarak oksihemoglobin taraf ndan nitrata (NO 3- ) oksitlenerek aktivitesi sonland r l r. Oksijen radikallerindeki durumun aksine, nitrik oksiti ortamdan temizleyen herhangi bir özel enzim yoktur. Aerobik ortamda NO stabil de ildir; derifliminin artmas ile oksidasyonu h zlan r. Bu nedenle ortamdaki deriflimi ile kendi ömrü aras nda ters bir orant vard r. Özellikle inos enziminin indüksiyonu s ras nda NO derifliminin artmas ile oksidasyonu da h zlan r ve çeflitli reaktif nitrojen oksit türleri oluflur (Tablo 1). Bu reaktif türler NO in dolayl etkilerinden sorumlu olup; hücresel moleküllerin nitrozilasyonuna, nitrasyonuna, nitrozasyonuna neden olarak proteinlerin/enzimlerin inaktivasyonuna neden olabilirler. Ne Kadar Radikal Yap m? Varolufl ve yaflam m z için mutlaka gerekli bir element olan oksijen, canl lar n yaflam n n sona erdirilmesinde de etkili olan faktörlerin bafl nda gelir. Canl lar n yafllanmas, radikallerin neden oldu u kal c hasarlar n bir birikimi olarak de erlendirilmektedir. Bu aç dan bak ld nda oksijen iki yüzü keskin bir b çak olarak tan mlanabilecek bir moleküldür. Vücudumuzda üretilen radikaller her zaman tehlikeli ve kötü kimyasal türler olarak de erlendirilmemelidir. Oksijenin biyokimyasal tepkimelerde kullan lmas için, reaktif formlar na çevrilmesi zorunludur. Örne in steroid yap daki çok say da bilefliklerin, eikozanoidler gibi biyolojik aktif moleküllerin sentezi; ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu, çok say daki oksidaz ve hidroksilaz enzimlerinin etkileri için ve sitotoksik etkilere sahip hücrelerin fonksiyonlar için radikal yap m olmazsa olmaz bir kofluldur. Oksijen radikalleri gibi, nitrik oksit radikalinin yap m da vazgeçilmez bir biyolojik olayd r. Bu radikallerin ne kadar iyi ya da ne kadar kötü olduklar n belirleyen faktör, nerede ve ne kadar üretildiklerine ba l d r. Biyolojik ihtiyac n üzerinde üretilen radikaller gözlenen toksik etkilerden sorumludurlar. Çevresel faktörler (örne in iyonlaflt r c radyasyon), vücuda al nan çeflitli kimyasal bileflikler, çeflitli enfeksiyonlar, doku travmalar ve say labilecek di er çok say daki patolojik durumlar vücutta radikal yap m nda art fla neden olurlar. Düflük deriflimdeki radikal yap m n n etkileri çok uzun bir süreç sonunda, örne in yafllanma fleklinde görülürken; yüksek deriflimde ve yayg n radikal yap m n n etkileri k sa sürede ve ciddi bir patolojik durum olarak karfl m za ç kar. KAYNAKLAR 1. Halliwell B, Gutteridge J M C Free radicals in biology and medicine, UK. Clarendon press; 1989. 2. Grisham M B, Reactive metabolites of oxygen and nitrogen in biology and medicine, Austin, Texas: R.G.Landes; 1992. 3. Stadtman E R, Protein oxidation in aging and age-related diseases. Ann NY Acad Sci 928:22-38, 2001. 4. Li C, Jackson R M. Reactive species mechanisms of cellular hypoxia-reoxygenation injury. Am J Physiol.cell physiol. 282:C227-241, 2002. 5. Emerit J, Beaumont C, Trivin F. Iron metabolism, Free radicals and oxidative injury. Biomed Pharmacother 55:333-339, 2001. 6. Nagy I Z, On the true role of oxygene free radicals in the living state, aging and degenerative disorders. Ann NY Acad Sci 928:187-199, 2001. 7. Massey V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem 269:22459-22462, 1994. 8. Sonntag C, Schuchmann H P. Pulse radiolysis. Methods in Enzymol 233:1-34, 1994. 9. Freeman A F, Crapo J D. Biology of disease: Free radicals and tissue injury. Lab Invest 47:412-426, 1982. 10. Badwey J A, Karnvsky M L, Active oxygen species and the functions of phagocytic leucocytes. Ann Rev Biochem 49: 695-726, 1980. 11. Reilly P M, Schiller H J, Bulkley G B. Pharmacologic approach to tissue injury mediated by free radicals and the other reactive oxygen metabolites. Am.J.Surgery 161:488-503, 1991. 12. Aust S D, Morehouse L A, Thomas C E. Role of metals in oxygen radical reactions. Free Rad Biol Med 1:3-25, 1985. 13. Darley-Usmar V, Halliwell B. Blood radicals: Reactive nitrogen species, reactive oxygen species, transition metal ions, and the vascular system. Pharm Res 13:649-662, 1996.

118 Hacettepe T p Dergisi 14. Kerr M E, Bender C M, Monti E J. An introduction to oxygen free radicals. Heart Lung 25:200-209, 1996. 15. Novelli G P. Role of free radicals in septic shock. J Physiol Pharmacol 48:517-527, 1997. 16. Murph M P. Nitric oxide and cell death. Biochim Bioph Acta 1411:401-414, 1999. 17. Castranova V. Generation of oxygen radicals and mechanisms of injury prevention. Environ Health Perspect 102 suppl. 10:65-68, 1994. 18. Pryor W A. Mechanisms of radical formation from reactions of ozone with target molecules in the lung. Free Radic Biol Med 17:451-465, 1994. 19. Carlson J C, Sawada, M. Generation of free radicals and messenger function. Can J Appl Physiol 20:280-288, 1995.