Kan kültürü örneklerinde üreyen Candida türlerinin tanımlanmasında MALDI TOFTOF-MS yönteminin değerlendirilmesi Görkem Yaman1, Işın Akyar1, Simge Can2 1Acıbadem Üniversitesi, Tıbbi Mikrobiyoloji AD, İstanbul 2Acıbadem Labmed Klinik Laboratuvarları, İstanbul

MALDI TOFTOF-MS (matriks aracılı lazer dezorpsiyon iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi matrix assisted laser desorption ionisation time of flight mass spectrometry) yöntemi bakteri ve mantarların hızlı ve doğru olarak tanımlanmasına olanak sağladığı için son dönemde klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında daha fazla kullanılmaya başlanmıştır.

1960 lı yılların başlarında 1960 gösterilmiştir. Bu da laser desorption (LD) (LD) ionisation ionisation(lazer (lazer salınımına bağlı iyonizasyon iyonizasyon)) yöntemlerinin kaynağı olmuştur.

Daha sonraki yıllarda, yöntem uçucu olmayan biyopolimerler ve organik makromoleküllerin uçuşunu sağlayacak şekilde geliştirilmiştir. LD nin gerçekten başarılı olması TOF kütle analizörleri LD ile birlikte olması ile sağlanmıştır.

1987 yılında, Michael Karas and Franz Hillenkamp kullanımını devreye sokarak kütle kısıtlamasından kurtulmuşlardır. Bu matriksle birlikte incelenecek olan bir prob ya da metal plak üzerinde karıştırıldıktan sonra lazer ışınları atışı uygulanır. Her bir lazer atımında hemen hemen tam olarak iyonların patlaması sağlanır, böylelikle atımdan atıma verimliliği arttırır. Matrix atrix--assisted laser desorption/ionization (MALDI) (MALDI) bu şekilde bulunmuştur. bulunmuştur.

Daha sonra Koichi Tanaka Tanaka nın yaptığı çalışmalarla biyolojik makromoleküllere de MALDI uygulanabildi. Bu da onun John Fenn ile birlikte 2002 yılında Nobel ödülü kazanmasını sağladı.

MALDI nin mekanizması üç basit basamaktan ibarettir: MALDI Matriksin birbirinden tümüyle ayrılmış analit moleküllerine erişebilmesi için gereklidir. Bu durum analitin stabil olarak ışınlanması için gerekli olan homojen solüsyonun oluşmasını kolaylaştırmaktadır.

Lazer ışını matriks matriks--analit solüsyonu üzerine odaklanır. Lazer sıklığı ile birlikte matriks hızlı titreşimli uyarılara yol açarak katı solüsyonun parçalanmasına yol açar. Yüzeyden fışkıran demetler içerisinde matriks ve tuz iyonlarıyla çevrelenmiş analit moleküllerini içerirler. Matriks molekülleri demetlerden uçarak analiti serbest olarak gaz fazında bırakırlar.

Işıkla uyarılmış matriks molekülleri proton transferi yolu ile analite doğru stabilize olurlar. Bu işlem sırasında analite katyon tutunması da desteklenmektedir. Tipik [M+X]+ (X= H, Na, K etc.) anali analit iyon onları ları oluşmaktadır. Bu iyonizasyon reaksiyonları yüzeyin hemen üzerinde parçalanmış matriks--analit reaksiyon bulutunda gerçekleşmektedir. matriks Oluşan iyonlar incelenmesi için kütle spektrometrisine gönderilmektedir.

Maya türlerinin tanımlanmasında MALDI TOF--MS TOF Görülme sıklığı giderek artan ve özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda kritik seyreden invaziv fungal enfeksiyonların tanısı klinik gözlem ve laboratuvar testlerine dayanmakla beraber kültür ve konvansiyonel tanımlama yöntemleri oldukça karışıktır.

Candida türleri invaziv fungal enfeksiyonların olduğu kadar nozokomiyal ve dolaşım yolu enfeksiyonlarının da en yaygın görülen etkenlerindendir. Çalışmamızda Candida türlerinin rutin tanı amaçlı tanımlanmasında MALDI TOFTOF-MS MS in performansının değerlendirilmesi amaçlanmıştır.

Gereç--Yöntem: Gereç Ocak2010-Aralık 2010 tarihleri arasındaki bir yıl Ocak2010boyunca kurumumuza bağlı 14 hastaneden gelen kan kültürü örneklerinden izole edilen toplam 281 Candida türü ve 3 farklı standart Candida ATCC suşu: Candida lusitaniae ATCC 34449, Candida krusei ATCC 6258 ve Candida albicans ATCC 10231 çalışmaya dahil edilmiştir.

Gram boyama, germ tüp yapılması ve ChromAgar Candida besiyeri kullanılması dışında tüm izolatlar otomatize VITEK 2 YST (Biomerieux, Fransa) panellerine alınarak tür tanımları yapılmıştır.

Bu mikroorganizmalar aynı zamanda Bruker Autoflex III MALDI TOFTOF-MS sisteminde (Bruker Daltonics, Almanya) üreticinin talimatları doğrultusunda tanımlanarak sonuçlar karşılaştırılmıştır.

Maldi--tof MS çalışma yöntemi: Maldi MALDI-TOF MS MALDIMS de çalışılan izolat formik asit ekstraksiyon yöntemi ile polish target olarak adlandırılan metal bir plak üzerine : 300 ul steril distile su içine bakteri kolonisi Üzerine 900 ul etanol eklenir. Vortekslenir Santrijüj edilir süpernatan atılır, işlem bir kez daha tekrarlanır. 50 ul %70 formik asit solüsyonu pellet üzerine eklenir. Bu karışımın üzerine 50 ul asetonitril eklenir karıştırılır. Santrifüjlendikten sonra süpernatandan 1ul polish target üzerine konulur.

Üzerine 2ul bir matriks solüsyonu eklenerek havada kurutulur. Matriks içerisinde :alfa siyano 4 hidroksi sinnamic acid(hcca) ve solvent olarak da trifluoroasetik asit(tfa) ve asetonitril(acn) bulunur. Daha sonra polish target cihaza yüklenir. Cihaz içerisinde lazer ışını verilerek izolat iyonize moleküller haline dönüşür. Uçuşan moleküller bir detektör yardımı ile toplanır. Genellikle, tek yükü olan yalnızca tek bir iyonize tür oluşmakta ve Biotyper Biotyper ile mikroorganizma tiplendirmeleri yapılmaktadır. İşlem ortalama 1313-15 dk içerisinde gerçekleşmekte ve otomatize sistemlerle mikroorganizma tanımlanmasına göre çok daha kısa sürede ve doğru bir şekilde sonuçlanmaktadir.

Bulgular: 281 örnekten 264 264 ü (%94) her iki sistem tarafından da aynı şekilde tanımlanırken birbirinden farklı sonuçlar alınan 17 örnek için 18s ribozomal RNA sekanslama yapılmıştır. Sekanslama sonucunda 17 örneğin 16 16 sı MALDI TOFTOF-MS ile uyumlu tanımlanırken 1 örnek VITEK II ile uyumlu sonuç vermiştir. Sonuç olarak MALDI TOFTOF-MS ile 281 örneğin 280 280 i (%99,6) doğru olarak tanımlanabilmiştir.

Candida türlerinin tanımlanmaları C.albicans C.tropicalis C.glabrata Toplam izolat sayısı 174 42 25 VITEK 2 ile tanımlanan izolat sayısı 172 38 23 MALDI-TOF MS ile tanımlanan izolat sayısı 173 42 25 C.parapsilosis C.krusei C.kefyr 18 10 5 16 9 2 18 10 5 C.dubliniensis C.lambica C.lusitaniae 1 1 4 1 1 1 1 1 4 C.orthopsilosis Toplam 1 281 1 264 1 280

Candida albicans

Candida krusei

Candida metapsilosis

Sonuç: Çalışma sonucunda MALDI TOFTOF-MS yönteminin Candida türlerinin güvenilir, bir şekilde tanımlanmasında kullanılabilecek hızlı bir yöntem olduğu ortaya konmuştur. Bu çalışmada besiyerinde üremiş maya kolonileri kullanılmıştır. Kan kültüründe sinyal alındığında katı besiyerinde üremeyi beklemeksizin kan kültür şişesinden inceleme yapabilmek için çalışmalar sürmektedir. İlk izlenimler başarılı olduğu yönündedir.

Teşekkürler