Tokat Merkez ve İlçelerinde İnsan ve Sığırlarda Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü (KKKA) Prevalansının ELİSA Yöntemiyle Belirlenmesi Önem YÜCE Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Doç.Dr.Şaban TEKİN 2008 Her Hakkı Saklıdır
T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ Tokat Merkez ve İlçelerinde İnsan ve Sığırlarda Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü (KKKA) Prevalansının ELİSA Yöntemiyle Belirlenmesi Önem YÜCE TOKAT 2008 Her hakkı saklıdır
Doç.Dr.Şaban TEKİN danışmanlığında, Önem YÜCE tarafından hazırlanan bu çalışma 18/04/2008 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalı nda Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan : Doç.Dr.Şaban TEKİN İmza : Üye : Yrd.Doç.Dr.Ahmet BURSALI İmza : Üye : Yrd.Doç.Şener BARUT İmza : Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof.Dr.Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü
Tez Beyanı Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim. Önem YÜCE
TEŞEKKÜR Çalışmalarım sırasında her türlü desteğini benden esirgemeyen değerli hocam Doç.Dr. Şaban TEKİN e, sayın Yrd.Doç.Dr. Ahmet Bursalı ya, her zaman her konuda destek veren sevgili aileme ve çalışmamda emeği geçen tüm arkadaşlarıma sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
i ÖZET YÜKSEK LİSANS TEZİ Tokat Merkez ve İlçelerinde İnsan ve Sığırlarda Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü (KKKA) Prevalansının ELİSA Yöntemiyle Belirlenmesi Önem YÜCE Gaziosmanpaşa Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç.Dr.Şaban TEKİN Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Virüs ü Bunyaviridae ailesinden Nairovirus genusundadır. Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Afrika, Asya ve Doğu Avrupa da oluşan kene kaynaklı bir hastalıktır. Virüs, kanamalı ve ateşli bir hastalığa neden olur. KKKA insanlarda %10-50 arası ölüm oranına sahiptir. İnsanlarda enfeksiyon ya direk olarak kontamine doku ve kanla temasla ya da kene ısırığıyla olur. Bu çalışmada sığırlarda ve farklı risk gruplarında bulunan insanlardaki KKKA seroprevalansı IgG ELİSA yöntemi kullanılarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak çalışmada seropozitif sığır serumuna rastlanmamıştır. İnsanlarda ise endemik bölgede hayvancılık yapanlar (%23.2) ve hasta yakınlarının (%22.8) seroprevalansının kene ile ısırılanlara (%10.4) göre daha yüksek olduğu saptanmıştır. Yıl, 2008; Sayfa, 36 Anahtar Kelimeler: KKKA, KKKAV, Seroprevalans, Tokat i
ii ABSTRACT Master Thesis Determination of Crimean-Congo Haemorrhagic Fever Virus Prevalance in Human and Cattle by Using ELİSA in Tokat Center and Vicinity Önem YÜCE Gaziosmanpasa University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Assoc.Prof.Dr. Şaban TEKİN Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) Virus is a member of the genus Nairovirus in the family of Bunyaviridae. CCHF is a tick-borne disease which occurs in regions of Africa, Asia, and Eastern Europe. The virus causes diseases associated with bleeding disorder and fever. CCHF has a fatality range between %10-50 in human. Humans are infected with this virus by direct contact with contaminated blood or tissues or the bite of ticks. Several hudreds of CCHF cases were reported in Tokat, Turkey since 2002. In this study, seroprevalance of the CCHF in cattle and humans from various risk groups were determined by ELİSA. Sera from cattle and humans were examined for the presence of anti-cchf IgG. In this study seroprevalance of the CCHF was examined by the method of IgG ELİSA in domestic livestock blood samples; relatives of patients(rp) (%22.8), people working with animals (PWA) (%23,1)and people had tick bites (PTB) (%10.4). Analysis of the results indicated that PWA and RP had significantly higher CCHF prevalance. Year, 2008; Pages, 36 Keywords: CCHF, CCHFV, Seroprevalance, Tokat ii
iii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET....i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR....iii ŞEKİLLER DİZİNİ...vi ÇİZELGELER DİZİNİ...v 1. GİRİŞ VE LİTERATÜR ÖZETİ... 1 1.1. Tarihçe...1 1.2. Dünyada ve Türkiye deki Yayılımı ve Salgın Lokasyonları...2 1.2.1. Dünyadaki Yayılımı ve Salgın Lokasyonları... 2 1.2.2. Türkiye deki Yayılımı ve Salgın Lokasyonları... 5 1.3. Hastalığın Taşınma Yolları...6 1.3.1. İnsandan İnsana Taşınma Yolları... 6 1.3.2. Keneden İnsana Taşınma Yolları... 7 1.3.3. Hayvandan İnsana Taşınma Yolları... 7 1.3.4. Hayvandan Keneye Taşınma Yolları... 8 1.3.5. Keneden Keneye Taşınma Yolları... 8 1.4. KKKA Virüsünün Yapısı, Özellikleri ve Patojenitesi...8 1.4.1. KKKA Virüsünün Yapısı... 8 1.4.2. Kırım Kongo Kanamalı Ateş Virüsünün Özellikleri... 10 1.4.3. Virüsün Patojenitesi ve Diğer Özellikleri... 11 1.5 Virüsün Doğal Döngüsü ve Temel Bulaşma Yolları...13 1.6 Keneler ve KKKA Virüsü...14 1.7 KKKA Virüsü Tanı Testleri...15 1.7.1. Organizma Tanımlama Testleri... 15 1.7.2. İmmunoassay Testleri... 16 1.7.2.1. ELİSA (Enzyme-linked İmmunosorbent Assay)... 16 1.7.2.1.1. Direct ELİSA... 17 1.7.2.1.2. İndirect ELİSA... 18 1.7.2.2. İndirect İmmunoflorescence Assay (IFA)... 18 iii
iv 1.7.2.3. Reversed Passive Hemagglutination ( RPHA ) Test... 18 1.7.3. Moleküler Tanı Testleri... 19 1.7.4. KKKA Hastalığından Korunma Yolları... 19 1.7.4.1. Virüse Maruz Kalmanın Minimuma İndirilmesi ya da Tamamen Korunma Sağlanması... 19 1.7.4.2. Kene Kontrolü... 19 1.7.4.3. Omurgalı Kontrolü... 19 1.7.4.4. Bariyer Kullanımı... 20 1.7.4.5. Aşılama... 20 2. MATERYAL VE METOD... 21 2.1. Materyal...21 2.1.1. Kullanılan Kimyasallar... 21 2.1.2. Kullanılan Cihazlar... 22 2.2. Metod...22 2.2.1. Solüsyonların Hazırlanması... 22 2.2.2. Test Prosedürü... 23 2.2.3. Test Uygulama Dizaynı... 24 3. ARAŞTIRMA SONUÇLARININ YORUMLANMASI... 26 4. KAYNAKÇA.......30 iv
v KISALTMALAR DİZİNİ Kısaltma IgG IgM KKHA KKKA Açıklama İmmunoglobulin G İmmunoglobulin M Kırım Kongo Hemorajik Ateşi Kırım Kongo Kanamalı Ateşi v
vi ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa Şekil:1.1 KKKA hastalığının dünyadaki yayılımı.......1 Şekil 1.2 KKKA hastalığının Türkiye deki yayılımı...5 Şekil 1.3 Bunyaviridae familyasına ait virüslerin replikasyon döngüleri...9 Şekil 1.4 KKKA virüsünün yapısı...10 Şekil 1.5 Bunyaviridae ailesine ait virüsler...11 Şekil 1.6 KKKAV nün metabolik etkileri...12 Şekil 1.7 Kenelerin hayat döngüsü...13 Şekil 1.8 Kenenin Yaşam Evreleri...15 Şekil 1.9 Sandwich ELİSA...17 vi
vii ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge Sayfa Çizelge 1.1 1984-2006 yılları arasında dünyada görülen KKKA vakalarının % mortalite oranları... 3 Çizelge 1.2 2002-2004 yılları arasında KKKA hastalığının Türkiye deki dağılımı 6 Çizelge 1.3 Kenelerin sistematikteki yeri...14 Çizelge 2.1 ELISA plate.24 Çizelge 2.2 Risk Gruplarında KKHA prevalansı...26 vii
1.GİRİŞ VE LİTERATÜR ÖZETİ Kırım Kongo Kanamalı Ateşli hastalığı Bunyaviridae ailesinden Nairovirus genusundaki Kırım Kongo Kanamalı Ateş Virüsü (KKKAV) nün (Crimean-Congo Haemorrhagic Fever Virus, CCHFV) sebep olduğu, sert keneler tarafından bulaştırılan ateşli ve kanamalı bir hastalıktır. Hastalık günümüzde Afrika nın pek çok bölgesinde, Asya da ve Avrupa da görülmekte olup insanlarda ölüm oranı %10-50 arasında değişmektedir. Hastalık aynı zamanda evcil ve yabani memeliler ve kuşlarda da görülmekle birlikte ölüme sebep olmamaktadır. Bu yüzden zoonoz (hayvanlardan insanlara geçen enfeksiyon) bir hastalıktır (Bossi ve ark., 2004; Burt ve Swanepoel, 2005). 1.1.Tarihçe KKKA nin tarihteki ilk varlığına 12y.y. da bugünkü Tacikistan da rastlanmıştır. Hastalık, karatavuklara parazitlenen bir kene tarafından bulaştırılan, insanlarda idrarda, rektumda, dişetlerinde ve karın boşluğunda kanamalara yol açan hemorajik bir hastalık olarak tanımlanmıştır (Yashina ve ark., 2003; Ergonul, 2006). Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) bu yüzyılda ilk kez 1944 ve 1945 yılı yaz aylarında Batı Kırım steplerinde çoğunlukla ürün toplamaya yardım eden Sovyet askerleri arasında görülmüştür. Hastalığa Kırım Hemorajik Ateşi adı verilmiştir (Chamberlain ve ark., 2005; Ergonul 2006). Bu tarihten sonra 1956 yılında Zaire de ateşli ve kanamalı bir hastadan izole edilen virüs Kongo virüsü olarak adlandırılmıştır. 1969 da ise Kongo virüsü ile Kırım hemorajik ateşi virüslerinin aynı virüs olduğu belirlenmiş ve Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü olarak yeniden adlandırılmıştır (Bakır ve ark. 2005; Ergonul, 2006)
2 1.2. Dünyada ve Türkiye deki Yayılımı ve Salgın Lokasyonları 1.2.1. Dünyadaki Yayılımı ve Salgın Lokasyonları KKKA Hastalığı Afrika, Batı Asya, Ortadoğu ve Avrupa da görülmüştür. Ayrıca Bulgaristan, Makedonya, Pakistan, Irak, Afganistan, İran, Kosova, Kazakistan, Sahra altı Afrika ülkeleri, Rusya, Yugoslavya, Yunanistan, Arap Yarım Adası, Dubai, Kuveyt, Çin ve Moritanya da KKKA salgınları bildirilmiştir(şekil1.1)(çizelge 1.1). 2002 yılının bahar ve yaz aylarından itibaren Tokat başta olmak üzere ülkemizin bazı illerinde görülmüş ve yapılan çalışmalar sonucu hastalığın K.K.K.A. olduğu saptanmıştır (Bakır ve ark. 2005; Ergonul, 2006, Garcia ve ark., 2006). Şekil 1.1 KKKA hastalığının dünyadaki yayılımı (Anonim, 2007a) 2
3 Çizelge 1.1 1984-2006 yılları arasında dünyada görülen KKKA vakalarının % mortalite oranları (Suleiman ve ark., 1980; Schwarz ve ark., 1996; van de Wat ve ark., 1985; Altaf ve ark., 1998; Papa ve ark., 2002B; ; Nabeth ve ark., 2004; Whitehouse,2004; Chinikar ve ark., 2006; Ergonul, 2006; Ozkurt ve ark., 2006) Ülke Adı Zaman Olgu Sayısı Mortalite(%) Afrika 1984-1994 48 %24 Pakistan 1994 7 %28.5 Kosova 2001 69 %8.6 Moritanya 2003 40 %15 Birleşik Arap Emirlikleri 1979-1994 63 %15.5 Suudi Arabistan 1979 5 %40 İran 1999-2000 2000-2006 287 341 %19.8 %16.7 Türkiye 2002-2004 239 %5.4 Afrika da görülen salgınlar devekuşu kesimleri sırasında gözlenmiştir. (Ergonul, 2006). 1984 te devekuşu kesiminde yer alan çalışanlar enfekte olmuştur. Çevre çiftliklerde yapılan tetkikler sonucu devekuşundan alınan örneklerde %24 oranında virüse karşı antikor oluşumu gözlenmiştir (Hastanın bulunduğu çiftlikte ise 9 kuşun 6 sında antikor oluşumu belirlenmiştir.) (Ergonul, 2006). 1996 yılında deve kuşu mezbahası çalışanlarında 17 hastalık vakası saptanmıştır. Her iki örnekte de enfeksiyon nedeninin ya hayvanların kanlarıyla ya da derilerinin yüzülmesi sırasında birebir temas yoluyla enfekte kenelerden bulaştığından şüphelenilmiştir (Whitehouse,2004). Aynı şekilde Tyberg Hospital da çalışan 7 eleman ise hastalığı henüz teşhis edilmemiş olan vakayla temas sırasında enfeksiyon kapmıştır. 2 hasta, 1 çalışan ölmüş: 4 tanesi ciddi şekilde hastalanmıştır (Joubert ve ark., 1985). Hastanede aynı zamanda virüsün ilk klinik belirtileriyle aynı belirtilere sahip eş zamanlı grip salgını tespit edilmiştir (van de Wat ve ark., 1985). 3
4 Pakistan; Quetta da Aralık 1994 te daha sonra ölen kanamalı hastanın ameliyatına katılan ekipten 3 sağlık çalışanı enfekte olmuştur. Aynı yılda 4 cerrahtan 2 si deriden enfeksiyona maruz kalmıştır (Altaf ve ark., 1998). Kosova da ise 2001 yılı ilkbahar ve yaz mevsimi boyunca virüs ortaya çıkmış; 69 vakadan 6 sı ölümle sonuçlanmıştır (Papa ve ark., 2002b). 2003 te Moritanya Sağlık Bakanlığı nın bildirdiği 35 vakanın 18 i laboratuvar sonuçlarıyla doğrulanmış, 6 vakanın öldüğü saptanmıştır. Virüs salgını hastane acil servisinde toplam 5 i hastane çalışanı, 10 u hasta ve ziyaretçi olmak üzere 15 kişide gözlenmiştir (Nabeth ve ark., 2004). Birleşik Arap Emirlikleri nde ilk vaka 1979 da Dubai de hastanede tespit edilmiştir. Enfeksiyon kaynağı olarak Irak, Kenya ya da Pakistan dan ithal edilen sığırlar gösterilmiştir. Bununla birlikte ana kaynak belirsizdir. 1993 e kadar yeni bir vaka tespit edilmemiştir.1994 te mezbaha çalışanlarında salgın görülmüş, 35 şüpheli sağlık kuruluşlarına başvurmuştur. Ölüm oranı %62 olarak rapor edilmiştir. Ayrıca çiftlik, mezbaha çalışanları ve deri işleme çalışanlarında 28 şüpheli vakadan 16 sında virüs saptanmıştır (Schwarz ve ark., 1996). Geçmiş asemptomatik (hastalık belirtisi göstermeyen) serolojik kanıtlar 291 çiftlik hayvanının 12 sinde ve mezbaha çalışanlarında tespit edilmiştir (Khan ve ark., 1980). Suudi Arabistan; Dubai de Kasım 1979 da hastane salgınıyla ortaya çıkan vakalarda, hasta kaydının yapılmasından hemen sonra 5 vakadan 2 sinde ölüm gözlenmiştir (Suleiman ve ark., 1980). 7 Haziran 2000-14 Ekim 2006 tarihleri arasında İran da 873 şüpheliden 341 vakanın KKKA (+) olduğu doğrulanmış ve doğrulanan 341 hastanın 57 si ölmüştür. 7 Ekim 2000-16 Temmuz 2006 arasında 4181 besi hayvanından alınan serum örneklerinde 1759 serumun IgG (+) olduğu saptanmıştır (Chinikar ve ark., 2006). 1999-2000 yılları arasında yine İran da yapılan bir çalışmada; toplamda 666 vakanın 287 si dışında vakaların tümünde uygulanan testler sonucu IgM ve IgG (+) sonuçlar saptanmıştır. Aynı çalışmanın mevsimsel araştırmalarında ise hastalığın maksimum insidansının Ağustos ve Eylül ayları arasında olduğu belirlenmiştir (Mardani ve ark., 2006). 4
5 1.2.2. Türkiye deki Yayılımı ve Salgın Lokasyonları Başta Karadeniz ve Orta Anadolu olmak üzere (Şekil1.2) Tokat, Sivas ve Çorum gibi illerle birlikte 22 il Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi yönünden risk altındadır. Sağlık Bakanlığı verilerine göre Türkiye de 2002-2006 yılları arasında 736 vaka bildirilmiş ve bunların 36 sı ölümle sonuçlanmıştır. 2006 yılının ilk yarısından beri ise toplam 63 Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi vakası görülmüştür. Yapılan çalışmalar sonucu vakaların %90 ını kene ısırığına maruz kalan, tarım ve hayvancılıkla uğraşan kişilerin oluşturduğu saptanmıştır. Hastalıktan ikinci sırada etkilenen grubu ise sağlık çalışanlarının oluşturduğu belirlenmiştir (Ergonul, 2006). Tokat 820000 Sivas 710000 Giresun 520000 Yozgat 400000 Toplam 2.5 milyon Tokat Giresun Yozgat Sivas Şekil 1.2 KKKA hastalığının Türkiye deki yayılımı ve etkilenen bölgenin toplam nüfusu (Anonim, 2007b) 2002 ve 2003 yılları arasında Kırım Kongo Kanamalı Ateşli Hastalığı ya da benzer viral enfeksiyonlar belirtileriyle 19 vaka tespit edilmiştir. 6 şüphelinin test sonuçları IgM (+) değer göstermiştir. 2 örnekten virüs izolatı elde edilmiştir. İzolatların genetik analizi sonucu Yugoslavya ve Güney Rusya daki izolatlarla benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Türkiye de görülen ilk 19 vakanın 18 i çiftçi, 1 i ise hemşiredir. 19 kişiden 2 si ölümle 5
6 sonuçlanan enfeksiyona maruz kalmıştır. Tüm oran 19 kişide %11 olarak hesaplanmıştır (Karti ve ark., 2004). Genel olarak 2002-2004 yılları arasında Türkiye deki KKKA hastalığı mortalitesinin % 1-13 arasında değiştiği rapor edilmiştir (Çizelge1.2). Hastalığın ortaya çıktığı mevsimlerin ilkbahar ve yaz mevsimleri olduğu saptanmıştır ( Ozkurt ve ark., 2006). Çizelge 1.2 2002-2004 yılları arasında KKKA hastalığının Türkiye deki dağılımı (Ozkurt ve ark., 2006) Ülke adı Bölge Zaman Olgu sayısı Mortalite (%) Türkiye İç Anadolu Karadeniz 2002-2003 35 1 (%2.8) Türkiye Doğu-Karadeniz 2002-2003 19 2 (%10) Türkiye İç Anadolu Karadeniz 2003 92 11 (%12) Türkiye Türkiye geneli 2004 249 13 (%5.2) 1.3. Hastalığın Taşınma Yolları 1.3.1. İnsandan İnsana Taşınma Yolları KKKA hastalığı hastalardan hasta yakınlarına ve sağlık çalışanlarına hasta kanıyla temas edilmesi veya nozokomial yolla bulaşmaktadır (Papa ve ark., 2002a). Virüsün insandan insana taşınma yollarından birinin de hastane, klinik vb. ortamlar olduğu tespit edilmiştir. Enfekte hayvan, insan kanı ya da dokularıyla temas edilmesi virüs taşınmasının diğer yollarından biridir. Çeşitli klinik semptomlar içerir ve yüksek 6
7 mortaliteye sahip olduğu belirlenmiştir (Flick ve ark., 2005). En ciddi enfeksiyon riskinin burun, ağız, dişeti, vajina ve enjeksiyon alanları olduğu belirlenmiştir (Drosten ve ark., 2003). Virüsun anneden çocuğa horizontal transmisyonu da görülmüştür Bu nedenle sağlık çalışanları 1. derece risk grubunu oluşturmaktadırlar (Ergonul, 2006, Saijo ve ark., 2004). 1.3.2. Keneden İnsana Taşınma Yolları KKKAV insanlara başlıca Hyalomma cinsi ixodid kenelerin ısırmasıyla bulaşmaktadır. Özellikle hayvancılığın yoğun olduğu ve kene infestasyonunun fazla olduğu bölgelerde hastalığın kenelerle insanlara bulaşma sıklığının daha fazla olduğu saptanmıştır. Hastalık en çok Hyalomma cinsi kenelerle taşınsa da sadece bu cinsle sınırlı değildir. Rhipicephalus, Dermacentor, İxodes cinsi sert kenelerin ve bazı yumuşak kene türlerinin de bu virüsü taşıdığı gösterilmiştir (Morikawa ve ark., 2002). 1.3.3. Hayvandan İnsana Taşınma Yolları Enfekte hayvan kanı, salgıları veya dokularıyla temas edilmesi KKKA virüsünün insanlara bulaşmasının etkin yollarından biridir (Flick ve ark., 2005; Morikawa ve ark., 2002). Besi ve çiftlik hayvanlarının enfeksiyondan sonra hastalık göstermemelerine rağmen bir hafta süreyle viremik olduğu gözlenmiştir. Bir hafta boyunca hayvanlarla yakın temasta bulunan tarım işçileri, mezbaha çalışanları ve veterinerlerin risk altında olduğu belirlenmiştir (Drosten ve ark., 2003). 7
8 1.3.4. Hayvandan Keneye Taşınma Yolları Olgunlaşmamış kenelerin, virüsü özellikle küçük omurgalılar (kemirgenler) üzerinden beslenerek bulaştırdıkları belirlenmiştir. Küçük omurgalıların bir sefer enfekte olunca gelişimleri boyunca enfeksiyonu taşıyıp daha sonra geniş kitlelere bulaştırabildikleri de edinilen bilgiler arasındadır. Dolayısıyla enfekte hayvanlardan kan emen keneler virüsü almakta ve insan dahil beslendiği diğer konaklara bulaştırmaktadırlar (Nabeth ve ark., 2004). 1.3.5. Keneden Keneye Taşınma Yolları Omurgasızlar arasında virüs yalnızca kenelerde bulunmuştur (Watts ve ark., 1988). Virüs kenelerde transstradial (larvadan nimfe, nimfden erişkine) veya transovarial (anneden yumurtaya) geçiş yapabilmektedir (Whitehouse, 2004). 1.4. KKKA Virüsünün Yapısı, Özellikleri ve Patojenitesi 1.4.1. KKKA Virüsünün Yapısı Virüsun tamamı yaklaşık 100 nanometre (nm) çapında ve sferik görünümdedir. Virüsün viral genomu ve buna bağlı proteinler (nükleoproteinler ve polimeraz) protein kılıfı (kapsid) içinde yer alırken, kapsid bir lipid zarfla çevrilmiştir (Şekil 1.3, Şekil1.4). Bunyaviridae ailesinin diğer üyeleri gibi KKKAV de üç yapısal proteine sahiptir. Bu proteinler virüsün tripartit yani üç segmentli negatif tek zincirli RNA genomu tarafından kodlanmaktadır. Bu segmentler S, M, ve L segmentleridir. S segmenti nükleokapsit proteinini, M segment Gn ve Gc yapısal glikoproteinlerini ve L segmenti RNA bağımlı viral RNA polimerazı kodlamaktadır. Gn ve Gc proteinleri zar glikoproteinleridir ve bu 8
9 viral glikoproteinlerin duyarlı hücrelerdeki reseptör bölgelerini tanımaktan sorumlu olduğuna inanılmaktadır. Duyarlı hücrelerdeki reseptörlere bağlanan virüsler endositoz yoluyla hücre içine alınırlar ve virüs çoğalması sitoplazma içerisinde meydana gelir. Olgunlaşmış virüsler (virionlar) endoplazmik retikulumdan tomurcuklanarak ayrılırlar ve golgi bölgesinde sitoplazmik veziküller içine alınırlar. Buradan da füzyon işlemi ile virüs en dıştaki zarını almış olarak hücre dışına çıkar (Şekil1.3) (Whitehouse, 2004). L ( Large ) Viral RNA polimeraz Lipit membran M ( Medium) Yapısal proteinler (G1 ve G2) Bunyaviridae S ( Small) Nukleokapsid protein (N) Şekil 1.3 KKKA Virüsünün yapısı (Whitehouse, 2004) 9
10 Şekil 1.4 Bunyaviridae familyasına ait virüslerin replikasyon döngüleri (Whitehouse, 2004) 1.4.2. Kırım Kongo Kanamalı Ateş Virüsünün Özellikleri KKKA virüsü Bunyaviridae ailesinden Nairovirus türü içinde yer alan bir virüstür (şekil1.5). Bu virüslerin zarflı ve tek iplikçikli RNA parçacığından oluştukları belirlenmiştir. Yapılan sistematik çalışmaları sonucu Nairovirus lerin 34 türü bulunduğu ve bunlardan sadece 3 türün insanlarda duyarlı hücreler üzerindeki alıcılara tutunarak hücre içerisine alınması sonucu.hastalığa yol açtığı saptanmıştır (Bossi ve ark., 2004). Genetik yapısındaki farklılıklara göre virüs 8 alt gruba ayrılmaktadır ve Türkiye de elde edilen KKKA virüslerinin Rus ve Balkan virüs gruplarına %99 benzerlik gösterdiği belirlenmiştir (Ergonul, 2006). 10
11 Bunyaviridae Bunyavirus Hantavirus Nairovirus Phlebovirus Tospovirus Crimean-Congo hemorrhagic fever virus Dera Ghazi Khan Virus Hughes Virus Group Nairobi Sheep Disease Virus Group Qalyub Virus Group Sakhalin Virus Group Thiafora Virus Group Şekil 1.5 Bunyaviridae ailesine ait virüsler (Whitehouse, 2004) 1.4.3. Virüsün Patojenitesi ve Diğer Özellikleri KKKA virüsü Nairoviruslar içinde en patojen olan virüstür. İnsanlarda enfeksiyon sonrası hastalık yaygın olarak görülmektedir. Virüs glikoproteini kene, omurgalı konakçı seçiminde ve insanlardaki yüksek patojeniteden sorumludur. Viral glikoproteinlerin önemli bir bölümü, hücre içi proteazlarla; küçük bir bölümü de salınan proteazlarla daha küçük parçalara yıkılmaktadır. Viral glikoprotein ve hücresel proteazların etkileşiminin, konakçı seçimi ve patojenitede rol aldığı düşünülmektedir. Virüs temel olarak mononukleer fagositleri, endoteli ve karaciğeri enfekte ederek ağır hemorajiyle seyreden yüksek ateşe neden olmaktadır. Histopatolojik incelemeler; karaciğerde hemoraji nekroz, dalakta lenfosit tüketimi, akciğerde hemoraji, ödem, birçok organda hemoraji ve hücresel nekroz olduğu gösterilmiştir (şekil1.6). 11
12 Şekil 1.6 KKKAV nün metabolik etkileri (Geisberg ve Jahrling, 2004) Virülansının çok yüksek olmasına rağmen KKKA virüsü dış ortamda nispeten dayanıklılığını yitirmektedir. Konak dışında uzun süre varlığını sürdürememektedir. Ultraviole ile hızla öldüğü saptanmıştır. 56 C de 30 dakikada inaktive olmaktadır. Kanda 40 C de 10 gün süreyle yaşayabilmektedir. %1 hipoklorit ve %2 glutaraldehide duyarlı olduğu saptanmıştır. Ortam ph sına duyarlıdır (düşük ph da hızla inaktive olur) (Drosten ve ark., 2003; Kara, 2006). 12
13 1.5. Virüsun Doğal Döngüsü ve Temel Bulaşma Yolları Virüsun ortaya çıkması mevsimsel özelliklere bağlıdır. Hastalık etmeninin döngüsü yabani hayvan-kene arasında geçmektedir. Ekolojik dengenin bozulduğu ve baskın türlerin ortaya çıktığı durumlarda odakların genişlediği tespit edilmiştir. Keneler, hayvanların aksine rezervuardır (Anonim, 2007d). Virüs; kenelerin enfekte hayvanı emmesi sonucunda keneye geçer, kenelerin tüm hayat döngüsü sırasında taşınır ve bulunduğu konakları enfekte eder (Şekil1.7). Kene türünün konak sayısının fazlalığı virüsün diğer canlı gruplarına ve insanlara bulaşma ihtimalini artıran faktörlerden biridir (Ergonul, 2006). Larva I.konakta beslenir Larva yumurtadan çıkar Larva yeni konak arar I. Konak Beslenen larva toprağa düşer Yumurtalar Beslenen dişi erişkin kene toprağa düşer III. Konak Larva nimfe dönüşür Dişi erişkin kene III.konağa yapışır ve beslenir II. Konak Nimf II.konağa yapışır ve beslenir Nimf erişkin keneye dönüşür Şekil 1.7 Kenelerin hayat döngüsü (Anonim, 2007d) 13
14 1.6. Keneler ve KKKA Virüsü Keneler kanla beslenen ve hastalık ajanlarını hayvan ve insanlara taşıyan en önemli Artropod vektörlerdendir. Dünyada tanımlanmış ~900 kene türünden, 6 familyaya (Çizelge 1.3) ait en az 30 tür Türkiye de bulunmaktadır. Hyalomma cinsi keneler Türkiye nin de içinde bulunduğu coğrafyada çok yaygın olarak bulunmakta ve KKKAV taşıyan temel kene cinsini temsil etmektedir. Keneler dünyanın bütün kara parçalarında bulunan ve karada yaşayan eklembacaklıların en kalabalık grubunu oluşturan canlılardır. Yaşamları süresince değişik canlılar üzerinde (küçük kemirgenler, sürüngenler, kuşlar, çiftlik hayvanları veya büyük yabani memeli hayvanlar ve insanlar) zorunlu ektoparazit olarak bulunurlar. Kenelerin beslendikleri konak sayısı genellikle türe bağlı olarak 1-3 arasında değişebilir. Yumurtadan çıkan larvalar ilk konakta kan emdikten sonra nimf haline gelirler. Daha sonra başka bir konağa geçerek veya aynı konak üzerinde beslenerek erişkin kene haline gelirler (şekil1.6) (Watts ve ark.,1988). Keneler KKKA virüsünün asıl rezervuarıdırlar. Virüs kenenin bütün organlarında çoğalır ve kenenin yaşamı boyunca infektivitesini korur (1 yıldan fazla; kışı kenede geçirir). Sahadan toplanan henüz beslenmemiş immatür kenelerde de virüsün bulunması virüsün kenelerde transovarial (anneden yumurtaya) yolla geçebildiğini, enfekte larvaların ergin hale geldiklerinde de virüsü bulaştırması da transstradial (larvadan nimfe, nimfden erişkine) geçiş olduğunu göstermiştir (Şekil1.8) (Ergonul, 2006). Çizelge 1.3 Kenelerin sistematikteki yeri (Anonim, 2007e) Phylum Arthropoda Classis Arachnida Ordo Acarina Family Argasidae (yumuşak keneler) Ixodidae (sert keneler) Genus Ixodes, Hyalomma, Amblyomma, Haemaphysalis, Dermacentor, Boophilus, Rhipicephalus 14
15 ergin dişi ergin erkek ergin dişi larva (üst) larva (alt) nimf (alt) Şekil 1.8 Kenenin yaşam evreleri 1.7. KKKA Virüsü Tanı Testleri KKKA virüsünün tanısı için değişik yöntemler kullanılmaktadır. Bunlardan bazıları aşağıda özetlenmiştir. 1.7.1. Organizma Tanımlama Testleri 1.7.1.1. Mikroskopi Bilinmeyen bir viral hemorajik ateş ajanının tanımlanmasında immünohistokimyasal yöntemleri, hücre kültüründe izolasyon ve elektron mikroskobuyla incelenmesi başarılı sonuçlar getiren metotlardır (Ergonul,2006). 15
16 1.7.2. İmmunoassay Testleri 1.7.2.1. ELİSA (Enzyme-Linked İmmunosorbent Assay) Her mikroorganizmanın kendine özgü antijeni vardır. Bu antijenler saflaştırılır ve spesifik monoklonal antikor üretiminde kullanılır. ELİSA, antijen ya da antikor varlığında kullanılan en yaygın serolojik testtir. Testin iki formu bulunur: numunede antijen varlığını tanımlayan monoklonal antikorları kullanan Direct ELİSA ve numunede spesifik antikor (örn: KKKAV antikoru) tanımlamada kullanılan İndirect ELİSA (Qing ve ark., 2003). Özellikle insan ve hayvanlarda seruma bağlı olarak yapılan teşhislerde ve prevalans araştırmalarında ELISA tekniği yoğun olarak kullanılmaktadır. Bu teknik doğrudan serum, plazma, diğer vücut sıvıları veya hücre homojenizatlarında bulunan viral antijenlerin, bu antijene spesifik enzimle işaretli antikorlarla tespit edilmesine veya seruma viral antijenlere karşı üretilen IgM (enfeksiyonun ilk haftasında yüksek konsantrasyonda sentezlenir ve kısa ömürlüdür) ve IgG (Enfeksiyonun ilerleyen safhalarında yüksek konsantrasyonda üretilir ve uzun ömürlüdür) (Özbal, 2000) gibi immünoglobülinlerin, bu immünoglobülinlere spesifik enzim işaretli antikorlarla tespit edilmesine dayanmaktadır. IgG ve IgM sınıfı immünoglobülinler, hedef hücreleri infekte eden ekstrasellüler virüsleri nötralize etme yeteneğindedirler. Enfeksiyonu olan bir hastanın serumunda enfeksiyonun başlangıcında IgM ve iyileşme döneminde IgG sınıfından etkene özgü antikorlar bulunmaktadır IgM ELİSA (+) sonuç, örnek kaynağında viral enfeksiyon varlığını gösterirken; IgG ELİSA (+) sonuçlar enfeksiyonun geçirildiğini ve virüse karşı immünitenin oluştuğunu ifade eder (Özbal, 2000). KKKA virüsünün insan ve hayvan (sığır, koyun ve keçi) serumları kullanılarak yapılan prevalans araştırmalarında ELISA tekniği yoğun olarak kullanılmıştır (Qing ve ark., 2003). 16
17 1.7.2.1.1. Direct ELİSA Serum veya plazma gibi örneklerde antijen varlığının ve konsantrasyonunun belirlenmesi için kullanılan ELİSA yöntemidir. Direct ELİSA metoduna en iyi örnek Sandwich ELİSA (şekil1.9) ve Rekabete Dayalı ELİSA teknikleridir. Şekil 1.9 Sandwich ELİSA (Anonim, 2007f) Antijen üzerinde birikmeyen epitoplara bağlanacak 2 antikora ihtiyaç vardır. Antikor, kuyucukların dibine inmesini sağlayan katı bir faza tutunur. Antikora bağlanarak kompleks oluşturması için üzerine antijen eklenir. Kompleks oluşumundan sonra bağlanmayan antijenlerin ayrılması için yıkama işlemi yapılır ve deteksiyon antikoru eklenir. Eğer antijen varsa: kuyucuğa yapışan antikor-antijen ve enzim konjuge edilmiş antikor kompleksi oluşur ve renk değişimi gözlenir. Antijen yoksa enzim bağlı antikor yıkanma sonucu uzaklaştırılır ve renk değişimi görülmez. Renk değişimi örnekte antijene varlığını gösterir ve sonuç (+)tir. Renk değişimi yoksa numunede antijen yoktur ve sonuç (-)tir (Donets ve ark.,1982). 17
18 1.7.2.1.2. İndirect ELİSA Serum ve benzeri örneklerde antijene karşı gelişmiş antikorların aranmasında (örn:hiv) kullanılan ELİSA tekniğidir. Antijen ilk önce kuyucuklara absorbe olur. Serum, kuyucuklara eklenen antikorlara karşı antijen içermelidir. Örnekte antikor varsa antijene bağlanma olur. Örnek non-spesifik antikor içeriyorsa antijene bağlanma olmaz. Kuyucuğa absorbe olamayan antikorlar yıkanma sonucu uzaklaştırılır. Eğer antikorlar antijene bağlandıysa bu durum antikor-enzim konjugatı eklenerek tespit edilir. Bu reporter antikorlar genelde IgG olmak üzere immunoglobülinlere bağlanırlar. Eğer örnekte insan serumunda bulunan antikorlar varsa reporter olarak enzim konjuge edilmiş anti-human IgG kullanılır. Örnekte antikor varsa absorbe olan antijene bağlanır ve enzim konjuge edilmiş antikor bu komplekse bağlanır. Numune, bağlanmamış antikorların ayrılması için yıkanır. Son durumda enzim için substrat eklenmiştir. Numunede meydana gelen renk değişimi orijinal antijene karşı antikor varlığına işaret eder (Donets ve ark., 1982). 1.7.2.2. İndirect İmmunoflorescence Assay (IFA) Dokularda bulunan hedef antijen, bu antijene karşı spesifik floresanla işaretli antikorlar kullanılarak tespit edilir ve bir floresan mikroskop yardımıyla antijenin bulunduğu bölge tespit edilir. Bu teknik KKKA vakalarında özellikle kan preparatlarına uygulanarak veya hücre kültürleriyle yapılan araştırmalarda viral teşhiste yaygın olarak kullanılmaktadır (Haferkamp ve ark., 2005). 1.7.2.3. Reversed Passive Hemagglutination ( RPHA ) Test KKKA virüs antijenlerinin tespiti için yapılan testtir. Günler öncesinden ölmüş yeni doğan kobayların beyinlerinde enfeksiyondan 2-3 gün sonra RPHA testiyle KKKA virüs tespiti yapılmıştır (Shephard ve ark., 1988). 18
19 1.7.3. Moleküler Tanı Testleri Moleküler tanı testleri RT-PCR ve one step RT-PCR olmak üzere 2 ye ayrılır. (Drosten ve ark., 2002). 1.7.4. KKKA Hastalığından Korunma Yolları 1.7.4.1. Virüse Maruz Kalmanın Minimuma İndirilmesi ya da Tamamen Korunma Sağlanması Eldiven kullanma, çıplak elle kan vb. vücut sıvılarına dokunmama, yürüyüşe çıkıldığında koruyucu giysi kullanma (Whitehouse, 2004). 1.7.4.2. Kene Kontrolü Evcil hayvanlarda vektör kontrolü en iyi kimyasal kullanımıyla olur. Permethrin emdirilmiş kıyafetler kene ısırmalarına karşı koruma sağlayabilir. Ayrıca sulama ve toprağı sürme, H. a. anatolicum un bulunma yoğunluğunu azalttığı bildirilmiştir (Watts ve ark.,1988). 1.7.4.3. Omurgalı Kontrolü Endemik alanlarda besi hayvanlarına akarisit uygulamasının enfekte kene populasyonunu azalttığı saptanmıştır. Rodent populasyonunun suprese edilmesiyle Avrupa da D. marginatus populasyonunun azaldığı saptanmıştır. Avrupa da yabani tavşan ve kirpi populasyonunun kontrol altına alınmasıyla Hyalomma kenelerinde azalma gözlenmiştir. Kuş populasyonunun kontrolüyle de kene vektörlerinin dağılımının azaldığı belirlenmiştir (Watts ve ark., 1988). 19