ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Tetranychus urticae KOCH (ACARI:TETRANYCHIDAE) NİN DEĞİŞİK POPULASYONLARININ SENTETİK PYRETROİDLİ İLAÇLARA KARŞI MEYDANA GETİRDİĞİ DİRENCİN İZLENMESİ Fatma Zehra AKGÜNLÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI ANKARA 2005 Her hakkı saklıdır

ÖZET Yüksek Lisans Tezi Tetranychus urticae KOCH (ACARI:TETRANYCHIDAE) NİN DEĞİŞİK POPULASYONLARININ SENTETİK PİRETROİDLİ İLAÇLARA KARŞI MEYDANA GETİRDİĞİ DİRENCİN İZLENMESİ. Fatma Zehra AKGÜNLÜ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. M. Oktay GÜRKAN Adana, Isparta, Diyarbakır, Mardin ve Urfa dan farklı kültür bitkiler üzerinden toplanan 11 farklı T. urticae Koch populasyonlarının bazı sentetik pyrethroidlere (bifentrin, fenpropathrin, lamda-cyhalothrin) karşı meydana getirdiği direnç bioassayleriyle incelenmiştir. Rezüdi biyoassay (petri kabı- ilaçlama kulesi) ile bifentrin, fenpropathrin, lamda-cyhalothrin uygulanarak tüm populasyonların LC 50 ve LC 90 değerleri belirlenmiştir. Standart hassas (GSS) populasyon ile karşılaştırılarak bulunan direnç oranlarının dağılımı LC 50 değerlerine göre bifentrin, fenpropathrin, lamda-cyhalothrin için sırasıyla 1.396-7.957, 1.055-8.698, 2.293-48.952 kat düzeylerinde olmuştur. En yüksek direnç oranı lambda-cyhalothrin e karşı BEYDOM populasyonunda yaklaşık 49 kat olarak bulunmuştur. Fenpropathrine karşı ise, yaklaşık 9 kat ile AKSU populasyonu en yüksek düzeyde dirençli olarak belirlenmiştir. Bifentrine karşı SEN populasyonu 7.957 katla en çok direnç gösteren populasyondur. Biyokimyasal analizlerde T. urticae nin esteraz enzimi elektroforetik yöntemle ve kinetik mikroplate assay yöntemleri ile incelenmiştir. Kesin bir ilişki saptanamamıştır. En yüksek esteraz aktivitesi 7.875 mod/min/µg protein olarak SAR populasyonunda ölçülmüştür. 2005, 41 sayfa ANAHTAR KELİMELER:, Tetranychus urticae, iki noktalı kırmızı örümcek, insektisit direnci, bifentrin, fenpropathrin, lambda-cyhalothrin, esteraz enzimi i

ABSTRACT Master Thesis MONITORING OF RESISTANCE OF THE DIFFERENT POPULATIONS OF Tetranychus urticae KOCH (Acari:Tetranychidae) TO SYNTHETIC PYRETHROID INSECTICIDAE Fatma Zehra AKGÜNLÜ Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Protection Supervisor: Prof. Dr. M. Oktay GÜRKAN The resistance developed by 11 different T. urticae Koch populations collected from Adana, Isparta, Diyarbakır, Mardin and Urfa against sentetic pyretroids were investigated according to the diagnostic dose bioassays. LC 50 and LC 90 values in whole populations were detected by applying bifentrin, fenpropathrin and lamda-cyhalothrin with residue bioassay (petri dishes- spray tower). The distribution of resistance ratio detected comparing with standart susceptible (GSS) populations were found 1.396-7.957, 1.055-8.698, 2.293-48.952 times for bifentrin, fenpropathrin, lamda-cyhalothrin, respectively according to the LC 50 vaules. The highest resistance ratio were found in BEYDOM population approximately 49 times against lambda-cyhalothrin. The AKSU population were found at the highest resistance approximately 9 times against fenpropathrine. SEN population is the most resistant one with a value of 7.957 times that developed resistance against bifentrine. The esterase enzyme activity of T. urticae was investigated by electrophorectic method and kinetic microplate assay in biochemical analysis. No certain relation was detected. The highest esterase activity was detected in SAR population with a value of 7.875 mod/min/µg protein. 2005, 41 pages Key Words: Tetranychus urticae, two spotted spider mite, insecticide resistance, bifentrin, fenpropathrin, lambda-cyhalothrin, esterase enzyme ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR ii

Tarımsal üretimde, ürün verimini ve kalitesini arttırmak için kullandığımız kimyasal ilaçlara karşı tarımsal zararlılarda meydana gelen direnç günümüzün en büyük problemlerinden biridir. Bu çalışmada topladığımız farklı populasyonlarda sentetik pyretroitlere karşı geliştirilen direncin belirlenmesine yönelik olarak biyoassay ve biyokimyasal analizler yapılmıştır. Öncelikle danışman hocam Prof. Dr.M. Oktay GÜRKAN a bu konuda bana araştırma olanağı sağladığı ve çalışmalarım boyunca yapmış olduğu katkı ve önerileri için teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca çalışmalarımda yardımını gördüğüm Yrd. Doç. Dr. Recep AY a, Araş. Gör. Hilal AYDIN a teşekkürü bir borç bilirim. Çalışmalarımın her safhasında desteklerini esirgemeyen, sabır ve yardımlarından dolayı aileme, bana yardımcı olan değerli arkadaşlarım Gülay BERİŞ e ve Şebnem TÜZE ye şükranlarımı sunarım. Fatma Zehra AKGÜNLÜ Ankara, Ocak 2005 iii

İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii ÖNSÖZ VE TEŞEKKÜR... iii SİMGELER DİZİNİ... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ... viii 1. GİRİŞ... 1 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI... 4 3. MATERYAL ve YÖNTEM.... 10 3.1. Materyal... 10 3.1.1. Tetranyhus urticae Koch populasyonları... 10 3.1.1.1. Tetranyhus urticae populasyonlarının seçimi ve orjini... 10 3.1.1.2. Tetranyhus urticae populasyonlarının yetiştirilmesi... 11 3.1.2. Kullanılan ilaçlar... 13 3.2. Yöntem... 16 3.2.1. Biyoassay çalışmalar... 16 3.2.1.1. İlaç konsantrasyonlarının hazırlanması... 16 3.2.1.2. İlaçların uygulanması... 17 3.2.1.3. İstatistiksel değerlendirmesi... 18 3.2.2. Biyokimyasal çalışmalar... 18 3.2.2.1. Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ile esteraz enziminin 18 incelenmesi.... 3.2.2.2. Kinetik Karboksil Esterase Aktivite Ölçümleri... 20 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA... 21 4.1. Biyoassay Sonuçları... 21 4.2. Biyokimyasal Analiz Sonuçları... 28 4.1.2. Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ile esteraz enziminin 28 incelenmesi... 4.2.2. Kinetik Karboksilesteraz Aktivite ölçümleri... 32 5. SONUÇ... 36 iv

KAYNAKLAR... 37 ÖZGEÇMİŞ... 41 v

SİMGELER DİZİNİ ACh Asetilkolin AChE Asetilkolinesteraz cm Santimetre dk Dakika g Gram kdr Knock down Resistance L Litre LC 50 LC 90 M mg mm ml O.D. PAGE TEMED Tris WHO µl Mikrolitre Lethal konsantrasyon-50 Lethal konsantrasyon-90 Mol Miligram Milimol Mililitre Otical Density Poliakrilamid jel elektroforez N, N, N /, N / - tetrametyyl(ethylenediamine) Tris(hydroxymethyl)aminomethane World Health Organization vi

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 3.1. Tetranyhus urticae populasyonlarının yetiştirildiği yetiştirme kapları... 12 Şekil 3.2. Tetranyhus urticae populasyonlarının üstünde çoğaltıldığı bulaşık bitkiler... 12 Şekil 3.3. Lethal konsantrasyon belirleme denemelerinde kullanılan petriler... 17 Şekil 4.1. Tetranyhus urticae nin populasyonlar arası esteraz izozimlerinin PAGE elektroforez bant sistemleri... 28 Şekil 4.2. Tetranyhus urticae nin populasyonlar arası esteraz izozimlerinin PAGE elektroforez bant sistemleri......... 29 Şekil 4.3 Tetranyhus urticae nin populasyonlar arası esteraz izozimlerinin PAGE elektroforez bant sistemleri....... 29 Şekil 4.4. Kule populasyonunun tür içi esteraz izozimlerinin PAGE elektroforez bant sistemleri......... 30 Şekil 4.5. Hacı populasyonunun tür içi esteraz izozimlerinin PAGE elektroforez bant sistemleri.............. 30 Şekil 4.6. Sen populasyonunun tür içi esteraz izozimlerinin PAGE elektroforez bant sistemleri......... 31 Şekil 4.7. Urfa populasyonunun tür içi esteraz izozimlerinin PAGE elektroforez bant sistemleri... 31 Şekil 4.8. Beyfas populasyonunun tür içi esteraz izozimlerinin PAGE elektroforez bant sistemleri...... 32 vii

ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 4.1. Tetranyhus urticae populasyonlarına uygulanan bifentrinin LC 50 ve LC 90 değerleri ve istatistiki analiz sonuçları... 23 Çizelge 4.2. Tetranyhus urticae populasyonlarına uygulanan fenpropathrin LC 50 ve LC 90 değerleri ve istatistiki analiz sonuçları... 24 Çizelge 4.3. Tetranyhus urticae populasyonlarına uygulanan lamdacyhalothrin LC 50 ve LC 90 değerleri ve istatistiki analiz sonuçları.. 26 Çizelge 4.4. Tetranyhus urticae populasyonlarında Kinetik Karboksilesteraz Aktivite Ölçümleri... 34 Çizelge 4.5. Tetranyhus urticae populasyonlarında bireysel Kinetik Karboksilesteraz Aktiviteleri... 35 viii

1. GİRİŞ Ülkemizde tarımsal üretim önemli bir ekonomik kaynaktır. Nüfusun hızlı ve sürekli artması tarıma daha fazla önem verilmesini ve birim alandan daha fazla verimin elde edilmesini gerektirmektedir. Günümüzde tarımsal üretimin en önde gelen sorunlarından birisi tarımsal zararlılar ve bunların mücadelesidir. Polifag bir zararlı olan Tetranychus. urticae tüm dünyada ve ülkemizde görülen önemli bir zararlıdır. T. urticae pamuk tarlalarında, pek çok sebze ve süs bitkisinde zarar meydana getirmektedir. Üzerinde yaşadığı bitkinin yaprak özsuyunu emerek yaprağın sararmasına neden olmaktadır. Bitkinin klorofil miktarını % 20-40 oranında azaltmaktadır. Özümlemenin azalmasıyla ürün verimini % 40-60 oranında düşürüp kalitesizleşmesine neden olmaktadır. Başta Ege, Akdeniz, Güneydoğu ve Trakya olmak üzere ülkemizin her yerinde görülmektedir (www.kkgm.gov.tr). Bazı virüslerin taşınmasında etkin bir rol almaktadır. T. urticae nin çok sayıda döl vermesi ve gelişmesini kısa sürede tamamlaması ilaçlara karşı direnç oluşturmasına sebep olmaktadır. Özellikle seralarda bu türün insektisitlere dayanıklılık kazanması önemli bir problem olarak ortaya çıkmaktadır. Tarımsal zararlılarla mücadelede en çok kullanılan yöntem kimyasal savaşım yöntemidir. Uygulaması kolay ve çabuk sonuç alınması daha çok tercih edilmesine neden olmaktadır. Kimyasal mücadelenin avantajlarının yanında birçok dezavantajı da bilinmektedir. Dezavantajlarının başında hedef alınan organizma dışındaki doğal faunayı etkilemesi gelmektedir. Pestisitler kimyasal yapılarından dolayı zehir etkilerini çeşitli düzeylerde tüm canlılarda ve çevrede göstermektedir. Faydalı böceklerin, arıların, kuşların, evcil hayvanların, balıkların ve insanların pestisitlerden etkilenmesi, akut veya kronik olarak zehirlenmesi söz konusu olmaktadır. Günümüzde pek çok pestisitin çevreye vermiş olduğu zarardan dolayı kullanımlarına sınırlama getirilmiş veya kullanımdan tamamen kaldırılmıştır. Kimyasal ilaçların önemli dezavantajlarından biri de hedef zararlıların ilaçlara direnç kazanmasıdır. Ürünlerdeki zararlı populasyonu arttıkça, üretici ekonomik zarar eşiğini dikkate almadan zararlı populasyonunu düşürebilmek için yoğun bir şekilde ilaçlamaya başvurmaktadır. Sonuç olarak zararlılarda ilaçlara karşı dayanıklılık oluşmakta ve dayanıklı böcekler kontrol altına alınamamaktadır. Bu durumun sonucunda üretici ilaçlama sayısını ve dozunu 1

arttırmakta ve dirençli populasyonların oluşmasını teşvik etmekte aynı zamanda da insan ve çevre sağlığına zarar vermektedir. Direnç; pestisitin önerildiği zararlıların populasyonunda yanlış depolama, hatalı uygulama, uygun olmayan çevre koşulları gibi problemler dışında bir hassasiyet kaybetmesi olarak (Ünal ve Gürkan 2001) ya da normal bir populasyonda bireylerin çoğunun letal dozda canlı kalma yeteneği geliştirmesi olarak tanımlanabilmektedir (Ffrench-Constant and Roush 1990). WHO (Dünya Sağlık Örgütü) insektisit uzmanlar komitesi 1957 de insektisitlerde direnci, bir türün normal populasyonunda bireylerin çoğunu öldürdüğü ispatlanan bir insektisit dozunu, aynı böceğin diğer bir populasyonunun tolere etme yeteneğinin gelişmesi olarak tanımlamaktadır (Brown 1958). Böceklerde insektisitlere karşı görülen dayanıklılığı bildiren makale ilk kez A. L. Melander adındaki bir araştırıcı tarafından 1914 yılında yayımlanmıştır. Makalede 1908 yılında San jose Kabuklu bitinin inorganik bir insektisit olan kükürte karşı dayanıklılık geliştirdiği açıklanmıştır. 1914-1946 yılları arasında toplam 11 dirençli populasyon daha belirlenmiştir. 1947 yılında klorlandırılmış hidrokarbon DDT ye karşı dayanıklı karasinek populasyonunda belirlenmiştir (Forgash 1984). Günümüzde 540 türün bir ya da birden fazla pestisite karşı dayanıklılık kazanmış olduğu belirtilmektedir (Anonymus 2002). İnsektisitlere karşı böceklerde oluşan Moleküler düzeyde direncin tiplerini temel olarak davranışsal (öldürücü dozdan kaçma) ve fizyolojik (öldürücü dozda yaşama yolları arama) direnç olarak tanımlayabiliriz. Fizyolojik direnç metabolik detoksifikasyonun artırılması (veya metabolik hareketin azaltılması), hedef yeri duyarsızlığının azaltılması gibi mekanizmalardan oluşmaktadır. Metabolik direnç ilk olarak DDT ye dirençli karasineklerde belirlenmiştir (www.cips.msu.edu). Organik fosforlulara ve sentetik pyretroidlilere karşı oluşan direnç yine bu mekanizma ile oluşmuştur. Metabolik direnç laboratuar koşullarında belirlenebilir. Piretroit kökenli insektisitler geniş spektrumlu olmaları ve memelilere zehirliliklerinin ihmal edilebilir düzeyde olması sebebiyle pek çok zararlının mücadelesinde yaygın bir 2

şekilde kullanılmaktadır. Bu durum piretroitlere karşı direncin gelişmesine sebep olmaktadır. Piretroidlere karşı görülen direnç metabolik detoksifikasyonun artırılmasında Sitokrom P450 Mono-oksijenaz aktivitesinin artması ve esteraz seviyesindeki değişiklik; hedef yeri duyarsızlığında ise sodyum kanalı mutasyonu şeklinde ortaya çıkmaktadır (Carino ve Feyereisen 1989). Hidrolazlardan esteraz enzimler gibi enzimler sentetik piretroidli insektisitlerin metabolizmasında önemli bir role sahip olan enzimlerdir. Dirençli ve hassas ırklar karşılaştırıldığında dirençli ırklarda enzim aktivitesinin yüksek olması, hassas böceklerde ise daha düşük seviyelerde bulunması bir enzimin aşırı üretilmesinden kaynaklanmaktadır. Genel bir ifade ile, hidrolizin kuvvetlendirilmesi piretroid direncinin önemli bir mekanizması olarak kabul edilmektedir (Soderlund 1997). Böceklerde piretroid insektisitlere karşı görülen dirence knockdown direnç (kdr) adı verilmektedir. Bu direnç tipi böcek esteraz ve mono-oksijenaz enzimlerinin aktivitesini engelleyen sinerjistlerden etkilenmeyip, böceklerde sinir sisteminin duyarlılığının azalmasına sebep olmaktadır. Kdr tüm piretroid insektisitlerin böcekler üzerindeki etkinliğini azaltmaktadır. Kdr nin erken dönemlerde belirlenmesi ve karakterizasyonu direnç yönetimi stratejilerinin geliştirilmesinde büyük önem taşımaktadır. Bu direnç tipi ilk kez 1950 yıllarında Musca domestica da belirlenmiştir (Lee et al 2000). Dünyada özellikle son 30 yıldır insektisitlere dayanıklılık konusunda gerek biyokimyasal gerekse moleküler biyoloji alanında oldukça detaylı araştırmalar yapılmaktadır. Ülkemizde ise bu konuyla ilgili yapılan araştırmalar sınırlıdır. Yapılan bu çalışmada ülkemizin önemli zararlılarından biri olan T. urticae nin sentetik piretroidlere karşı göstermiş olduğu direnç, biyokimyasal ve biyoassay yöntemlerle incelenmiştir. 3

2. KAYNAK ARAŞTIRMASI Kırmızı örümceklerin insektisitlere karşı dayanıklılığıyla ilgili olarak yapılan kaynak araştırması böcekleri de içerecek şekilde genişletilerek, rastlanmış olan kaynaklar tarihsel akış içinde aşağıda verilmiştir. Dayanıklılığın biyokimyasal çalışmalarla belirlenmesine temel olan ilk araştırma Gomori (1953) tarafından yapılmış ve aryl-esterleri hidrolize etme kapasitesine dayanan esteraz aktivitesinin belirlenmesi için kolorimetrik bir metot geliştirmiştir. Smıssaert (1965), T. urticae nin hassas ve dirençli populasyonları dişilerinin homojenatları ile NA- hidroliz oranları arasındaki farkın istatistiki olarak önemli olduğunu bulmuştur. Benzer sonuçları diyapozdaki hassas ve dirençli populasyonların dişi ve erkeklerinden de elde etmiştir. Georghiou (1980), 1975 yılına kadar toplam 364 olan dayanıklı böcek ve akar türlerinin sayısının 1978 yılında yeniden güncellendiğini ve bu sayının 414 e çıktığını ilave etmektedir. Dennehy et al. (1983), San Joaquin vadisinde pamukta zararlı olan T. urticae populasyonlarının dicofol direncini incelemek için tarla ve laboratuar çalışmaları yapmışlardır. Laboratuar da T. urticae populasyonlarının hassas ve dirençli olanlarını tanımlamışlardır. Slide-dip metodu ile 5,7 kat, rezidü bioassay ile 544 kat direnç saptamışlardır. Dennehy et al. (1987), Kaliforniya da pamuk üretim alanlarında zararlı olan dicofol a dirençli Tetranychus türlerinde direnç frekansını tahmin etmek için kolay bir uygulama yöntemi olan petri kabı uygulama yöntemini geliştirmişlerdir. Bu yöntem ile belirledikleri ayırıcı doz olan 56,2 ppm lik dicofol ile dirençli ve hassas bireyleri kolayca ayırt edebildiklerini belirlemişlerdir 4

Moores et al. (1988), organik fosforlu ve karbamatlı insektisitlere karşı AChE duyarsızlığının böceklerde tek tek karakterize edilmesi ve izlenmesi ile ilgili olan hızlı bir yöntem geliştirmişlerdir. Doksan altı böceği mikroplate içerisinde aynı anda homojenize ederek ve bölümler halinde diyagnostik konsantrasyonda insektisit varlığında ve yokluğunda asetilkolin ile birlikte kolorimetrik olarak ölçmüşler, reaksiyonları mikrobilgisayara bağlı olarak kinetik mikroplate reader ile izlediklerini bildirmişlerdir. Bazı inhibitörler bireylerde ve ırklarda duyarsızlık profilini ortaya koymak için aynı böceğe karşı test edilmiştir. Doyle ve Knipple (1991), sodyum kanallarında olası değişiklikleri inceleyebilmek için 4 takımı temsilen 7 böcek türü ve bir Arachnidae dan sodyum kanal genleri izole edilerek DNA sekans analizini yapmışlardır. Yapılan bu çalışmalarda Drosophila melanogaster in parasodyum kanalı geninin IS5-6 bölgesinden elde edilen amino asit dizilimleri ile bu çalışmadan elde edilen aminoasit dizilimleri karşılaştırılmış ve sadece serine ve threonine aminoasitlerinin yer değiştirdiği belirlenmiştir. Bu metodun diğer böcek türlerinde de pek çok sodyum kanalı genlerinin karakterizasyonunda kullanılmasında spesifik bilgiler elde elde edilebileceğini bildirmişlerdir. Goka et al. (1992), T. urticae populasyonunda polyakrilamid jel elektroforez kullanarak esteraz, PGI (glucoisomerase), G-6PD (glucose-6-phosphatedehydrogenase) nin genetik varyasyonlarını çalışmışlardır. Esterase ve PGI bazı populasyonlarda polimorfik olmasına karşın, G-6PD nin bütün populasyonlarda monomorfik olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca PGI nın allel dağılımında coğrafik bir dağılım saptayamamışlardır. Kasamatsu (1992), fenpropatrinle selekte edilmiş T. urticae neslinde tetradifon duyarlılığına karşı negatif ilişkiyi araştırmıştır. Fenpropatrin ile yüzden fazla uygulamaya maruz bırakılan T. urticae nin (FS) birçok böcek ilacına ve sentetik pyretroite karşı çapraz direnç durumunu araştırmıştır. FS nesli flucythrinate, fluvalinate, cypermethrin ve fenvalerate gibi sentetik pyretroidlere karşı, çapraz direnç 5

göstermemiştir. Sonuçlar, nesillerde fenpropatrin direnci ile tetradifonun zehirliliği arasında negatif bir ilişki olduğunu belirtmiştir. Dennehy et al.(1993), akarisitlerin akarlara karşı kontakt etkisini ölçmek için microimmersion (MI) adlı yeni ve kullanışlı bir yöntem tanımlamışlardır. Microimmersiyon biyoassay i 25 lik gruplar halindeki akarları vakum altında küçük pipet başlıklarına koymayı, 30 sn. boyunca 35 µl test solüsyonunda bekletmeyi ve bireyleri bölünmüş hücrelerdeki temiz yaprak yüzeyine koymayı içermektedir. MI nın hassas T. urticae bireylerine karşı amitraz, bifentrin, chloropyrifos ve dicofol ün uygulanmasında formüle edilmiş ve teknik akarisitlerde aynı sonucu vermiş ve konvensiyonel rezidü biyoassayler de olduğu gibi LC 50 değeri hesaplanabilmiştir. MI nın diğer biyoassay metotları arasındaki en büyük farklılığının MI nın probit doğrusu eğiminin daha büyük olduğunu bildirmişlerdir. Tsagkarakou et al. (1996), Yunanistan kökenli T. urticae nin methyl-parathion (44 fold) ve methomyl (8-fold) a karşı direnç mekanizmasını; sinerjistlerin etkilerini ve çeşitli enzimlerin kinetik özelliklerinin hassas referans ırklar ve dayanıklı ırklar üzerindeki etkilerini araştırmışlardır. Sinerjist olarak esteraz ve glutation s-transferazı inhibe etmek için S, S, S-tributil fosforotritohate; sitokrom P450 monooksigenazı inhibe etmek için piperonyl butoxide kullanılmıştır. Akarlar tek tek incelendiğinde esteraz allozimlerinin iso-elektrik noktalarının farklı olmadığını ve her iki ırkda da glutation s- transferaz aktivitesinin aynı olduğu bulunmuştur. 2 sitokrom P450 monooksigenaz grubunun aktiviteleri karşılaştırılmıştır. Dayanıklı ve hassas ırkların ikisinde de 7- ethoxyresorufin-o-diethylase aktivitesinde çok fazla fark gözlenmemiştir. AChE ın kinetik karakteristiği şunu göstermiştir; AChE in paraoxon ve methomyle dayanıklı ırk, hassas ırka göre daha az duyarlı bulunmuştur. Goka ve Takafuji (1997) phosphoglucoisomerase (PGI) ve malete dehydregenase (MDH) enzim farklılıklarını poliakrlamid jel elektroforez ile yedi Tetranychus türleri arasında ayrım yapmak için çalışmışlardır. PGI ve MDH nin çalışılan türlerin hepsinde tek bir locus üzerine kodlandığını belirtmişlerdir. PGI T. pierci, T.urticae ve T. 6

kanzawai de polimorfik ve dimorfik enzimdir, aynı zamanda her iki enzimde tek bir bant üzerine fiske olmuştur. Araştırmacılar her iki enziminde Tetranychus türlerinin sınıflandırılmasında kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Jansson et al. (1997), eklembacaklılara karşı insektisit ve akarisit etkilerini belirlemek için üç metod uygulamışlardır. T. urticae ye karşı air brush(a) ve ilaçlama kulesi(b) metodunu kullanmışlardır. Trichlorfon, mevinphos, fenvalerate, lambda-cyhalothrin ve abamectin etken maddeleriyle çalışmışlardır. T.urticae ye karşı abamectini, fenvalerate ve lambda-cyhalothrin den 23,833(a)-33,217(b) kat ve 1,933(a)-2,417(b) kat(lc 50 ) daha güçlü bulmuşlardır. Abamectini, mevinphos ve trichlorfondan sırasıyla 4,817(a)- 6,989(b) kat ve 87,250(a)-121,555(b) kat daha toksik bulmuşlardır. T. urticae ye karşı LC 50 değerleri ilaçlama kulesi ve air brushta farklı olarak bulunmuştur. Fakat bu farklılıklara rağmen biyoassaylerde öldürme değerleri açısından büyük farklılıklar görülmemiştir. Casida ve Quistad (1998), dayanıklılığın oluşmaması için en etkili yöntemin seleksiyon baskısını azaltmak ve sınırlı sayıdaki yeni ve kullanışlı kimyasal maddeleri korumak olduğunu belirltmektedirler. Araştırıcılar, insektisit kullanımının dikkatli bir şekilde planlanmasının ve zararlı populasyonlarındaki dayanıklılık genlerinin (ilişkili enzim veya kanalların) devamlı izlenmesinin gerekli olduğuna değinmektedirler. Moores et al. (2000), böceklerde ve akarlarda bireysel olarak organik fosforlulara ve karbamatlı insektisitlere karşı AChE duyarsızlığının varlığını incelemek için hassas bir yöntem açıklamaktadırlar. Bu yöntemin bireysel olarak Bemicia tabaci ve T. urticae de AChE duyarlılığını kolaylıkla karakterize ettiğini belirtmektedirler. Farklı lokasyonlarda bireysel grupları, bu dayanıklılık mekanizmasının varlığını araştırmak için test etmişlerdir. Elde edilen bulguların, Arizona dan alınan B. tabaci populasyonun da yeni bir duyarsız AChE varyantını ortaya çıkardığını bildirmektedirler. 7

Ay (2001), farklı alanlardan toplanan pamuk bitkisi üzerinden 9 farklı T. urticae populasyonunun bazı ilaçlara karşı dayanıklılığını biyoassay ve biyokimyasal yöntemlerle incelemiştir. Rezidü biyoassay ile dicofol, bromopropylate ve bifenthrin uygulanarak tüm populasyonlarda LC 50 ve LC 90 değerlerini belirlemiştir. Denemeye alınan populasyonlardan sadece üç populasyonun bifentrine karşı direnç gösterdiğini belirlemiştir. Devine et al. (2001), İngiltere de tebufenpyrad etken maddeli pestiside direnç göstermiş çeşidi T. urticae (TUK4) ye Japonya dan getirilen METİ-akarisit direnç referans populasyonlarla yaptıkları çalışmada 4 METİ-akarisitle (tebufenpyrad, pyridaben fenpyroximate, fenazaquin) direnci incelemişlerdir. Microimmersiyon denemesindeki bu bileşiklerin TUK4 için dayanıklılık faktörlerini sırasıyla 46, 346, 168 ve 77 olarak belirlemişlerdir. Sonuçların Japon METİ-akarisit dayanıklı referans çeşidi ile benzerlik gösterdiğini incelemişlerdir. Yang et al.(2001), Oligongchus pretensis ve T. urticae Koch. karşılaştırmalı hassaslık ve muhtemel detoksifikasyon mekanizmaları sinerjistlerle veya onlarsız değerlendirmişlerdir. Oligongchus pretensis, T. urticae ye göre organofosfat dimethoate ye 112 kat ve her iki pyretroidli insektiside (bifentrin ve λ cyhalothrin) 24 kat daha hassas bulunmuştur. O. pretensis için bütün sinerjistlerin [Triphenlyl fosfat (TPP), Diethyl maleate (DEM), Piperonly butokside (PBO)] iki pyretroidli insektisidin zehirliliğini büyük ölçüde arttırdığını fakat dimethoate te sinerjistik hiçbir etki görülmediğini belirtmişlerdir. T. urticae için üç sinerjistin de bifenthrinin zehirliliğini arttırdığını, λ cyhalothrinin zehirliliği TPP ve PBO ile, dimethioate nin ki ise yalnız TPP ile yükseldiğini belirlemişlerdir. Stumpf ve Nauen (2002), T. urticae nin Hollanda (NL-00), Kolombiya (COL-00) ve Brezilya (BR-000) ırklarının abamectine dayanıklılığını belirlemek için diagnostik yöntemi kullanmışlardır. Abamectine dayanıklılık bu ırklarda sitokrom P450 monooksigenazla ilgili olarak bulunmuştur. NL-00 ve COL-00 ın MFO aktivitelerinin abamectine dayanıklılıkta GSS ten daha fazla olduğunu belirlemişlerdir. 8

Yang et al. (2002), Oligongchus pretensis ve T. urticae de insektisitlere karşı hassasiyette gözlenen farklılıkları ve detoksifikasyon enzim aktivitesindeki değişiklikleri laboratuar ortamında incelemişlerdir. Her iki akar türünün birbirini takip eden 3 dölü pyretroit insektisitlerden bifentrin ve λ-cyholothrine veya bir organikfosforlu insektisite (dimethoate) maruz bırakılmıştır. 10 kez ilaca maruz kalmadan sonra bifentrin, λ cyhalothrin ve dimethoate e karşı hassasiyetin T. urticae de sırasıyla 4.5, 5.9, 289.2 kat ve O. pretensis te ise 14.8, 5.7, 104.7 kat azaldığı belirlenmiştir. O. pretensis in 3 dölüne karşı kullanılan bifentrin ilaçlamalarından sonra bu türde dimethoate e 88.9 kat dayanıklılık ve T. urticae nin 3 dölüne karşı kullanılan dimethoate ilaçlamalarından sonra bifentrin e 15.9 kat direnç oluştuğu belirlenmiştir. Bu sonuçlar dimethoate ve bifentrin arasında çapraz direnç olabileceği sonucunu çıkarmıştır. Bifentrin, λ cyhalothrin ve dimethoate e maruz kalmış O. pretensis teki hassasiyet azalması, genel esteraz aktivitesinde sırasıyla 4.7, 3.0 ve 3.6 katlık artışla ilişkilendirilmiştir. Bu T. urticae için 1.3 ve 1.1 kat olarak belirlenmiştir. Böcek ilaçlarına karşı duyarlılıktaki azalma glutathione s-transferaz, 1-chloro-2,4- dinitrobenzene deki karşılıklı aktivitedeki azalma ile ilişkilendirilmiş fakat bu böcek ilacının dayanıklılığı etkilemediği belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar bu akarlarda esterazların, pyretroitlere karşı dayanıklılığın oluşmasında önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Erdoğan (2003), farklı bölgelerden toplanılan Bemisia tabaci (beyaz sinek) nin iki organik fosforlu ve iki sentetik pretroitli insektisite karşı dayanıklılığı, biyoassay ve biyokimyasal yöntemlerle incelemiştir. Bu populasyonlara karşı elde edilen biyoassay sonuçları tüm insektisitlere karşı yüksek dayanıklılık oranlarını ortaya çıkarmıştır. Biyokimyasal analizler, toplan tüm beyaz sinek populasyonlarının asetilkolinesteraz duyarsızlığı bakımından standart populasyon ile benzer olduklarını göstermiştir. Hem biyoassay hem de biyokimyasal analiz sonuçlarına göre yüksek esteraz enzim aktivitesinin, piretroitlilere karşı görülen dayanıklılıkta olası dayanıklılık mekanizmasının olduğu ve duyarsız AChE ın ise organikfosforlulara dayanıklılıktan sorumlu ana mekanizma olduğunu belirtmiştir. 9

3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal Çalışmanın ana materyalini iki noktalı kırmızı örümcek, T. urticae Koch. populasyonları ile tarım ilaçlarından sentetik pyretroitli akarisit-insektisit olan bifentrin, fenpropathrin ve lamda-cyhalothrin oluşturmaktadır. Biyoassay çalışmalarında ilaçlama kulesi (sprey tower) (burkards marka, manifacturing Co. Ltd.), steromikroskop, plastik petriler, aseton (merck), Triton X-100 (sigma), parafilm, ince (0 numara) uçlu fırça, 1, 5, 10 ml lik pipet, 50 ve100 ml lik cam şişeler, 50,100 ml lik ölçü silindirleri ve bunun gibi materyaller kullanılmıştır. Biyokimyasal çalışmalarda ise elektroforez seti (Pharmasia GE-2/4), hassas terazi (Sartorius), çoklu homojenizer (Burkhard ), manyetik karıştırıcı, tek ve çok kanallı mikropipetler, değişik cam ve plastik malzemeler gibi materyaller kullanılmıştır. 3.1.1. Tetranycus urticae Koch populasyonları 3.1.1.1. Tetranycus urticae populasyonlarının seçimi ve orijini T. urticae populasyonları, ülkemizde yoğun ilaçlama yapılan 11 farklı yerden toplanmıştır. Bu örneklerin toplanma yerleri; Senirkent, Beyobası (fasulye), Beşikçiköyü, Şarkikaraağaç, Aksu sera, Beyobası (domates), Hacıveliler, Adana, Mardin-Kızıltepe, Urfa, Kuleönü dir. Kontrol amaçlı kullanılmak üzere (İngiltere) den standart hassas (German susceptible stains, GSS), T. urticae populasyonu getirtilmiştir. Bu populasyon 1965 yılından itibaren Rothamsted Experimental station laboratuarında yetiştirilmektedir ( Dennehy et al. 1993). 10

Çizelge 3.1. Tetranycus urticae örneklerinin toplandığı yerler ve yıllar Populasyonun adı Örneklerin toplandığı yer Toplandığı yıl GSS SEN BEY. FAS. BEŞ SAR AKSU ADN BEY.DOM. HACI KIZIL URFA KULE Rothamsted Experimental Station Isparta Senirkent Fasulye üretici serası Antalya-Gazipaşa Beyobası Fasulye üretici serası Antalya Kumluca Beşikçiköyü Fasulye üretici serası Isparta Sarkıkaraağaç fasulye üretici serası Isparta Aksu Domates üretici serası Adana domates üretici tarlası Antalya-Gazipaşa Beyobası fasulye üretici serası Antalya Kumluca Hacıveliler fasulye üretici serası Mardin- Kızıltepe pamuk üretici tarlası Urfa-Harran pamuk üretici tarlası Isparta Kuleönü-fasulye üretici serası 2002 2003 2003 2003 2003 2002 2003 2003 2003 2003 2003 2002 3.1.1.2. Tethranycus urticae populasyonlarının yetiştirilmesi T. urticae örnekleri sebze ve pamuk bitkileri üzerinden toplanmıştır. T. urticae bireylerinin bulaşık olduğu yapraklar koparılarak kese kağıtlarına konmuş ve buz kutularında A.Ü. Ziraat Fakültesine getirilmiş ve böcek yetiştirme odasında kültüre alınmıştır. Konukçu bitki olarak fasulye bitkisi kullanılmıştır. Kültür devamlılığı 10X10 cm boyutlarındaki kasetlerde sağlanmıştır (Şekil 3.1). T. urticae populasyonlarının birbirine bulaşmaması için yetiştirildikleri oda uygun hale getirilmiştir. Bunun için 40X50 cm boyutlarında içi su dolu tepsiler konulmuş ve tepsilerin içine 30X30X50 cm boyutların plastik kutular yerleştirilmiştir. Bu kutuların içersine fasulye saksıları konulmuş ve üzerlerine T. urticae populasyonları bulaştırılmıştır (Şekil 3.2). Kültürler 11

26±2 oc sıcaklıkta % 50-60 orantılı nem ve flourasan lambalarla 16 saatlik ışıklandırma, 8 saatlik karanlık sağlanan koşullarda yetiştirilmiştir. Şekil 3.1. Tetanychus urticae populasyonlarının yetiştirildiği yaprak yetiştirme kapları Şekil 3.2. Tetanychus urticae populasyonlarının üstünde çoğaltıldığı bulaşık bitkiler 12

3.1.2. Kullanılan ilaçlar Denemede sentetik pyretroitli insektisit-akarisit kullanılmıştır. Özellikle yoğun olarak kullanılan ilaçlar tercih edilmiştir. Bifenthrin Kimyasal ismi(iupac): (2-methyl-1, 1-biphenyl-3-y1)-methyl-3-(2-chloro-3,3,3-trifluoro-1- propenyl)-2,2-dimethyl cyclopropanecarboxylate Kimyasal yapısı: Toksisitesi: Toksisite sınıfı: Kaynama noktası: Suda çözünürlüğü: Çözülebildiği solventler: LD 50 375 mg/kg dır(sıçanlar için). 2. sınıf 68-70.6 o C 0.1 mg/l Metilen klorid, aseton, kloroform, eter ve toluen ile çözülebilir. (www.jsmone.com) 13

Etkili madde renksiz ve katı haldedir. Geniş spekturumlu bifentrin etkili bir insektisitakarisittir. Bifentrin inde aralarında bulunduğu sentetik pyretroitler sinir sistemi veya kaslar üzerinde etkilidir (O brien 1971). Bifentrin sinir membranında potasyum ve sodyum kanallarının kapanmasını sağlayarak potasyum ve sodyum hareketini bloke ederek etkisini göstermektedir. Sera da yetiştirilen süs bitkilerindeki ve dış koşullarda pamuk zararlısı Heliothis armigera ya, mısır, bağ ve hububat zararlılarına karşı önerilmektedir (Toros et al. 1999). Talstar EC 100 ticari ismiyle ülkemizde satışa sunulmuştur (Tarım ve Köyişleri Bakanlığı 2002). Denemelerde bu ticari preparat kullanılmıştır. Lambda-cyhalothrin Kimyasal ismi(iupac): [1α (S),α (Z)]-(±)- cyano (3- phenoxyphenyl) methyl 3-(2-chloro- 3,3,3- trifluoro-1- propenyl)-2,2- dimethylclopropanecarboxylate dır. Kimyasal yapısı: C 23 H 19 ClF 3 NO 3 Toksisitesi: LD 50 79 mg/kg dır(sıçanlar için). Toksisite sınıfı: II. sınıf Kaynama noktası: Suda çözünürlüğü: Çözülebildiği solventler: 49.2 o C 0.005 mg/l Aseton, metanol, toluen, hexan, ethyl-acetat (www.jsmone.com) 14

Etkili madde renksiz ve katı haldedir. ICI Bitki Koruma Bölümü tarafından 1980 yılında geliştirilmiştir. 15-25 o C de 6 haftadan fazla süreyle stabil kalabilmektedir. Deyme ve mide etkili, sistemik olmayan bir insektisittir. Repellent etkiye sahiptir (Anonymous 2002). Yaprak bitleri, thrips, Lepidoptera ve Coleoptera larvalarına karşı kullanılan geniş spektrumlu bir insektisit olup aynı zamanda halk sağlığı açısından önemli olan böceklere karşı da kullanılmaktadır (Toros et al. 1999). Ülkemizde ruhsatlı olan Sıvı formülasyonlar: Karate5 EC, Karate 2.5 EC, Kung-Fu 5 EC, Tekvando 5 EC, Gradal 5 EC, Tactic 5 EC, Maestro 5 EC, Tomcat, Sumosa 5 EC, Tornado 5 EC, suda dağılabilen granül formülasonlar: Ecco 5 WG, Karate max, mikrokapsul süspansiyon formülasyon: Karate zeon dur (Tarım ve Köyişleri Bakanlığı 2002). Denemelerde Maestro 5 EC kullanılmıştır. Fenpropathrin Kimyasal ismi(iupac): (RS)-α-cyano-3-phenoxybenzyl 2,2,3,3- tetramethylcyclopropanecarboxylate. Kimyasal yapısı: C 22 H 23 NO 3 Toksisitesi: Toksisite sınıfı: Erime noktası: LD 50 66.7-70.6 mg/kg dır(sıçanlar için). 2. sınıf 45-50 o C Suda çözünürlüğü: 14.1 mg/l (25 o C de) Çözülebildiği solventler: Ksilen, siklohegzanon, metanol (www.alanwood.net) 15

Etkili madde sarı-kahverenkli katı haldedir. Karthrin ve Meothrin ticari isimleriyle piyasaya tanıtılan bu preperat, pamuk, süs bitkileri, asma, sebze ve diğer ürünlerdeki akarlar ile diğer zararlılara (örneğin beyaz sinek, lepidoptera larvaları, yaprak galeri güveleri, yeşil kurt vs.) karşı repellent etkili akarisit ve insektisit özellikte olup, kontakt ve mide etkili bir sentetik piretroid tir. Ülkemizde EC formülasyonunda ruhsatlı olarak bulunan preparatlar: Meothrin % 20 EC, Korthrin 20 EC, Agrothrin dir (Tarım ve Köyişleri Bakanlığı 2002). Denemede kullanılan preparat Meothrin % 20 EC dir. 3.2. Yöntem Denemeler LC 50 ve LC 90 değerlerinin belirlendiği biyoassay çalışmaları ve dirençle ilişkili esteraz enzimi aktivitesinin belirlendiği biyokimyasal çalışmalar olmak üzere iki ayrı bölümden oluşmuştur. 3.2.1. Biyoassay çalışmaları T. urticae populasyonlarının seçilen ilaçlara göstermiş olduğu LC 50 ve LC 90 değerlerinin belirlenmesi için kuru rezüdi yöntemi kullanılmıştır. 3.2.1.1. İlaç konsantrasyonlarının hazırlanması İlaç konsantrasyonları saf su ile seyreltilerek stok solüsyonları hazırlanmıştır. Bu şekilde hazırlanan stok solüsyondan yapılan tüm seyreltmelerde ve kontrolde de saf su kullanılmıştır. Populasyonların LC 50 ve LC 90 değerlerinin belirlenmesi için populasyonlara en az 6 farklı doz uygulanmıştır. Hazırlanan dozlar ilaçlara ve populasyonların duyarlılık düzeylere göre değişmiştir. 16

3.2.1.2.İlaçların uygulanması İlaçların uygulanmasında Ay (2001), Kabir ve Chapman (1997) ve Campos et al. (1997) dan alınan kuru rezidü yöntemi kullanılmıştır. İlaç konsantrasyonları hazırlandıktan sonra ilaçlama kulesinde 9 cm çapındaki plastik petrinin alt ve üst kapağına 2 ml olmak üzere toplam 4 ml ilaçlı sıvı püskürtülmüştür. Uygulama yapılan petriler yaklaşık 1 saat kurumaya bırakılmıştır. Denemeye alınacak T. urticae bireylerinin bulunduğu fasulye yaprakları fırçalanarak akarların yapraklardan ayrılması sağlanmıştır. Petrilerin her birine bir fırça yardımıyla 25 adet dişi birey bırakılmış ve kapağı kapatıldıktan sonra etrafı parafilmle sıkıca sarılmıştır (Şekil 3.3). Daha sonra bu petriler 26±2 o C sıcaklıkta % 50-60 orantılı nem ve florasan lambalarla 16 saatlik ışıklandırma, 8 saatlik karanlık sağlanan koşullara sahip yetiştirme odasına bırakılmıştır. Denemelerde en az 1 kontrol 6 farklı ilaç konsantrasyonu kullanılmıştır. Denemeler 3 tekerrürlü olarak yürütülmüş ve her bir doz için 75 birey olmak üzere bir LC 50 değerinin belirlenmesi için 525 dişi T. urticae bireyi kullanılmıştır. Şekil 3.3. Lethal konsantrasyon belirleme denemelerinde kullanılan petriler 17

3.2.1.3. İstatistiksel değerlendirilmesi T. urticae populasyonlarının 24 saat sonra elde edilen ölüm sayımlarından yararlanılarak POLO-PLUS bilgisayar paket programında (LeOra Software 2002) LC 50 ve LC 90 değerleri belirlenmiştir. Denemeye alınan bütün tarla populasyonları için belirlenen LC 50 ve LC 90 değerlerinin, hassas populasyon için belirlenen LC 50 ve LC 90 değerlerine oranlaması ile her ilaç için populasyonların duyarlılık kaybı ve direnç oranları belirlenmiştir. 3.2.2. Biyokimyasal çalışmalar 3.2.2.1. Poliakrilamid jel elektroforez ( PAGE) ile esteraz enziminin incelenmesi Elektroforez yönteminde kullanılan çözeltiler : 1.Barbitone Buffer ; 5.0 g tris base, 27.6 g barbiton 5 L destile suda çözülür. a. Küçük porlu jel: A karışımı; 60 ml akrilamid (% 40 lık), 32 ml bis-akrilamid ( % 2 lik), 12 mg potasyum ferrisiyanid, 2.837 g tris HCL, 0.534 g tris base, 180 µl TEMED, 250 ml destile suda çözülür. B karışımı; 224 mg amonyum persülfat 30 ml destile suda çözülür. A ve B yi karıştırdıktan sonra havası alınıp taze hazırlanmış 40 ml %1.6 lık Triton X-100 (100 ml suda 1.6 g ısıtılarak çözündürülmüş) bu karışıma eklenir. b. Büyük porlu jel : C karışımı; 3.75 ml akrilamid (% 40 lık), 18.75 ml bis-akrilamid ( % 2 lik), 180 mg tris HCL, 33 mg tris base, 35 µl TEMED 45ml destile suda çözülür. 18

D karışımı; % 0.004 riboflavin ( 100 ml suda 4 mg riboflavin). Bu karışım her hafta taze olarak hazırlanır. C karışımı ve 7.5 ml riboflavin ( % 0.004w/v)karıştırılır ve 7.5 ml % 1.6 lık Triton X-100 eklenir. Koşturma işlemi : 4 o C de soğutularak 1.5 saat süre ile 250 volt da yapılır. Boyama Solüsyonu : 200 ml 0.2 M ph 6 olan fosfat bufferda 400 mg fast blue RR koyulup filtre edilir. Daha sonra 4 ml 30 mm α- naftil asetat (aseton içinde) eklenir. Esteraz enzim bant sistemini belirlemek için poliakrilamid jel elektroforez yöntemi kullanılmıştır. Jel dökme standı hazırlandıktan sonra küçük porlu poliakrilamid jel dökülür ve cam plakaların üst kısmında büyük porlu poliakrilamid jeli dökmek için yaklaşık 2 cm lik boşluk bırakılır. Küçük porlu jel döküldükten sonra jelin üst yüzeyinin düzgün olması için henüz polimerize olmamış jelin üzerine saf su ilave edilir. Yaklaşık 30 dakika polimerize olması beklenir. Ve bu sürenin sonunda jel üzerindeki su boşaltılarak büyük porlu jel standına aktarılır. Taraklar yerleştirildikten sonra büyük delikli jelin polimerize olması beklenir. Jel hazırlandıktan sonra mikroplate hücrelerinde supernatant ile tek tek ezilmiş olan akarlar her bir jel hücresine 10 mikrolitre supernatant gelecek şekilde verilir. Daha sonra jel dökme standı elektroforez tankına yerleştirilir. Alt ve üst tank Barbiton Buffer ile doldurulur. Koşturma işlemi 250 voltta 1,5 saatte yapılır. Koşturma sırasında elektroforez tankının etrafı buz kalıplarıyla kaplanarak ortam sıcaklığı yaklaşık 4 o C de tutulur. Koşturma tamamlandıktan sonra jel boya solüsyonunda 30 dakika bekletilir. % 7 lik asetik asit içinde fiske edilir. Daha sonra saf su ile yıkanarak fotoğrafı çekilir. 19

3.2.2.2. Kinetik Karboksilesteraz Aktivite Ölçümleri Kinetik Karboksil esteras aktivitesi α naphtyl acetate kullanılarak mikroplaka okuyucuda ölçülmüştür( Stumpf ve Nauen 2002 ). 20 adet ergin dişi %0.1 Triton X-100 içeren 100 µl sodyum fosfat buffer (0.1M,pH 7.5 ) içinde eppendorf tüplerde ezilmiştir. Bu homojenat 10000g ve +4 o C da 5 dakika santrifüj edildikten sonra supernatant enzim kaynağı olarak kullanılmıştır.supernatant 10 kez seyreltilmiş ve bundan 50 µl mikroplakanın hücrelerine konulmuştur. Denemeler 3 tekrarlı olarak yapılmıştır. Deney 200 µl substrat solüsyonunun eklenmesiyle başlatılmıştır. Substrat solüsyonu 30 mg Fast blue RR tuzunun 50 ml 0.2 M sodyum fosfot buffer da çözülmesi ve bu karışıma 500 µl 30 mm α naphtyl acetate ın ilavesiyle elde edilmiştir. Ölçümler, 23 o C ve 450 nm de 20 dakika süreyle yapılmıştır. Protein ölçümleri Bradford yöntemiyle yapılmıştır. Karboksil esterase aktivitesi mod/min/mg protein olarak hesaplanmıştır. 20

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bu çalışma 2002-2004 yılları arasında A.Ü.Z.F. Bitki Koruma Bölümünde yürütülmüştür. Değişik bölgelerden, farklı konukçu bitkilerden toplanan 11 T. urticae populasyonu yetiştirilmeye alınmıştır. Bu populasyonların sentetik pyretroitlere karşı hassasiyetleri standart hassas populasyon (German susceptible strains ) GSS ile karşılaştırılarak değerlendirilmiştir. Lethal konsantrasyon çalışmalarına ek olarak, bu populasyonların carboxylesteraz enzimi düzeyleri biyokimyasal yöntemlerle incelenmiş ve sentetik pyrethroidlere dirençle bu enzim grubu arasında ilişki olup olmadığı araştırılmıştır. 4.1. Biyoassay Sonuçları Biyoassay çalışmalarında tüm populasyonların bifentrin, fenpropathrin ve lamdacyhalothrin e karşı göstermiş oldukları direnç LC 50 ve LC 90 düzeylerine göre belirlenmiştir. Denemeye alınan populasyonların bifenthrine karşı göstermiş oldukları direnç düzeyleri çizelge 4.1. de gösterilmiştir. GSS, SEN, BEY.FAS., BEŞ, SAR, AKSU, ADN, BEY.DOM., HACI, KIZIL, URFA, populasyonların da belirlenen bifenthrin LC 50 değerleri sırasıyla 2.061, 16.399, 7.045, 9.146, 9.828, 10.085, 2.877, 13.336, 8.903, 7.194, 2.932 ppm olarak belirlenmiştir. Populasyonların yine aynı sıraya göre bifentrin LC 90 değerleri de 6.052, 37.008, 45.021, 24.989, 42.502, 31.116, 9.434, 58.669, 23.462, 13.526, 10.591 ppm olarak tespit edilmiştir. Sonuçlardan da anlaşılabileceği gibi bütün tarla populasyonlarında belirlenen bifentrin LC 50 değeri hassas populasyonda belirlenen bifentrin LC 50 değerinden daha büyük bulunmuştur. Tarla populasyonlarının hassas populasyona oranla LC 50 değerlerine göre duyarlılık kayıpları incelendiğinde; bifentrine karşı populasyonlar sırasıyla SEN 7.957, BEY.DOM. 6.471, AKSU 4.893, SAR 4.769, BEŞ 4.438, HACI 4.320, KIZIL 3.464, BEY.FAS. 3.420, URFA 1.423, ADN 1.396 kat direnç göstermişlerdir. LC 90 değerine göre ise BEY.DOM 9.694, BEY.FAS.7.439, SAR 7.022, SEN 6.115, AKSU 5.141, BEŞ 4.129, HACI 3.376, KIZIL 2.234, URFA1.750, 21

ADN 1.559 kat direnç göstermişlerdir. Bu sonuçlara göre denemeye alınan tarla populasyonlarını karşılaştırırsak, bifentrine karşı elde ettiğimiz LC 50 ve LC 90 değerlerinin benzerlik gösterdiği anlaşılmaktadır. Elde edilen tarla populasyonlarına ait LC 50 ve LC 90 değerlerinin hassas GSS populasyonuna ait LC 50 ve LC 90 değerine oranlanması ile dayanıklılık oranları hesaplanmıştır. Buna göre yaklaşık 8 kat ile SEN populasyonunda bifenthrin e karşı en fazla hassasiyet azalması görülmektedir. T. urticae populasyonlarının fenpropathrine karşı göstermiş olduğu duyarlılık düzeyleri çizelge 4.2 de özetlenmiştir. Populasyonların fenpropathrine karşı LC 50 değerleri incelendiğinde; GSS, SEN, BEY.FAS., BEŞ, SAR, AKSU, ADN, BEY.DOM., HACI, KIZIL, URFA, KULE populasyonları sırasıyla 19.165, 91.066, 101.570, 26.282, 84.395, 166.704, 20.227, 92.893, 24.391, 39.583, 21.204, 88.878 ppm olarak bulunmuştur. Aynı populasyon sıralamasıyla fenpropathrin LC 90 değerleri ise sırasıyla 1568.180, 162.490, 346.275, 120.600, 159.302, 254.218, 129.351, 277.753, 89.650, 64.354, 147.729 ppm olarak bulunmuştur.tarla populasyonlarının LC 50 değerleri hassas GSS ten oldukça yüksek değerler alırken, LC 90 değerleri GSS in altında değerler almıştır. Çizelge 4.2 de populasyonların dayanıklılık oranları incelenirse, LC 50 değerleri GSS e göre daha dayanıklı ancak LC 90 değerlerinin GSS ten daha fazla duyarlılık gösterdiği görülmüştür. LC 50 deki dayanıklılık oranı bakımından değerler sırasıyla AKSU 8.698, BEY. FAS.5.300 ve BEY. DOM.4.847, SEN 4.752, KULE 4.638, SAR 4.404, KIZIL 2.065, BEŞ 1.371, HACI 1.273, URFA 1.106 ve ADN 1.055 kat olarak bulunmuştur. 22

Çizelge 4.1. Tetanychus urticae populasyonlarına uygulanan bifentrinin LC 50 ve LC 90 değerleri ve istatistiki analiz sonuçları Populasyon n* Eğim± SE GSS (hassas) 525 2.739 ±0658 SEN 525 3.626±0.431 BEY.FAS. 525 1.591±0.214 BEŞ 525 2.936±0.359 SAR 525 2.015±0.243 AKSU 525 2.619±0.303 ADN 525 2.484±0.274 BEY.DOM. 525 1.991±0.274 HACI 525 3.045±0.354 KIZIL 525 4.674±0.668 URFA 525 2.298±0.279 LC 50 (ppm) (0.95) güven aralığı 2.061 1.466-4.290 16.399 13.759-19.274 7.045 3.390-10.815 9.146 7.338-11.033 9.828 6.960-12.735 10.085 7.527-12.682 2.877 2.172-3.601 13.336 9.417-17.704 8.903 6.741-11.157 7.194 6.307-8.092 2.932 2.386-3.558 *n: kullanılan birey sayısı ** Tarla Populasyonu LC 50 veya LC 90 / Hassas Populasyonu LC 50 veya LC 90 LC 90 (ppm) (0.95) güven aralığı LC 50 Duyarlılık kaybı** LC 90 duyarlılık kaybı** 6.052 3.263-30.654 - - 37.008 30.356-48.854 7.957 6.115 45.021 29.712-89.681 3.42 7.439 24.989 19.484-37.081 4.438 4.129 42.502 32.766-60.150 4.769 7.022 31.116 24.816-41.378 4.893 5.141 9.434 7.109-14.715 1.396 1.559 58.669 38.664-130.592 6.471 9.694 23.462 17.763-37.642 4.320 3.376 13.526 11.526-17.424 3.464 2.234 10.591 7.957-16.233 1.423 1.750 23

Çizelge 4.2. Tetanychus urticae populasyonlarına uygulanan fenpropathrin LC 50 ve LC 90 değerleri ve istatistiki analiz sonuçları Populasyon n* Eğim± SE GSS (hassas) 525 0.670 ±0.166 SEN 525 5.096±0.944 BEY.FAS. 525 2.406±0.367 BEŞ 525 1.937±0.240 SAR 525 4.645±0.894 AKSU 525 6.993±1.042 ADN 525 1.590±0.174 BEY.DOM. 525 6.148±1.005 HACI 525 1.213±0.315 KIZIL 525 3.610±0.480 URFA 525 2.658±0.304 KULE 525 5.807±1.049 LC 50 (ppm) (0.95) güven aralığı 19.165 8.114-185.100 91.066 64.144-108.264 101.570 83.077-120.991 26.282 12.951-39.386 84.395 69.127-95.348 166.704 148.403-184.120 20.227 10.899-30.710 92.893 62.774-115.021 24.391 14.395-36.995 39.583 21.145-53.786 21.204 14.103-27.814 88.878 77.717-98.299 LC 90 (ppm) (0.95) güven aralığı LC 50 Duyarlılık kaybı** LC 90 duyarlılık kaybı** 1568.180 169.351-919700.224 - - 162.490 132.715-286.352 4.752 0.103 346.275 257.716-576.310 5.300 0.220 120.600 79.951-262.811 1.371 0.076 159.302 137.249-211.277 4.404 0.101 254.218 226.065-304.111 8.698 0.162 129.351 81.368-279.824 1.055 0.082 150.117 119.996-333.320 4.847 0.095 277.753 151.098-817.083 1.273 0.177 89.650 65.263-189.910 2.065 0.057 64.354 47.218-112.412 1.106 0.041 147.729 129.018-189.250 4.638 0.09 n* kullanılan birey sayısı ** Tarla Populasyonu LC 50 veya LC 90 / Hassas Populasyonu LC 50 veya LC 90 24

T. urticae populasyonlarının lambda-cyhalothrine karşı göstermiş olduğu duyarlılık düzeyleri çizelge 4.3 te özetlenmiştir. Populasyonların lambda-cyhalothrine karşı LC 50 değerleri incelendiğinde; GSS, SEN, BEY.FAS., BEŞ, SAR, AKSU, ADN, BEY.DOM., HACI, KIZIL, URFA, KULE populasyonları sırasıyla 4.443, 87.368, 85.678, 15.979, 95.211, 92.365, 10.189, 221.937, 98.311, 69.065, 13.532, 133.743 ppm olarak bulunmuştur. Aynı populasyon sıralamasıyla lamda-cyhalothrin LC 90 değerleri ise sırasıyla 4.129, 322.785, 280.600, 65.378, 187.024, 135.225, 34.908, 400.289, 1641.147, 191.272, 76.423, 256.395 ppm olarak bulunmuştur. BEY.DOM. un gösterdiği direnç oranı LC 50 48.952 ile oldukça yüksek bulunmuş; HACI 22.127, SAR 21.429, AKSU 20.789, SEN 19.664, BEY.FAS.19.284, KIZIL 15.544 la direnç oranıyla direnç sınırı olarak kabul edilen 4 katın üzerine çıktığı görülmüştür (çizelge 4.3). BEŞ 3.596, URFA 3.045, ADN 2.293 kat direnç göstermiştir (Çizelge 4.3). LC 90 değerlerinde ise dayanıklılık oranının çok daha yüksek olduğu da görülmektedir. Özellikle HACI populasyonunun 397.468 ile oldukça yüksek bir değer aldığı görülmektedir. 25

Çizelge 4.3. Tetanychus urticae populasyonlarına uygulanan lambda-cyhalothrin LC 50 ve LC 90 değerleri ve istatistiki analiz sonuçları Populasyon n* Eğim± SE GSS (hassas) 525 1.29 ±0.23 SEN 525 2.258 BEY.FAS. 525 2.487 BEŞ 525 2.09±0.2 SAR 525 4.371 AKSU 525 7.741 ADN 525 2.396±0.27 BEY.DOM. 525 5.003 HACI 525 1.05±0.18 KIZIL 525 2.90±0.33 URFA 525 1.74±0.17 KULE 525 4.534+-0.708 LC 50 (ppm) (0.95) güven aralığı 4.443 2.85-13.97 87.368 67.495-108.471 85.678 62.143-107.427 15.979 9.55-22.467 95.211 61.818-113.215 92.365 83.943-100.197 10.189 7.76-12.812 221.937 117.216-262.906 98.311 68.22-154.74 69.065 48.70-89.97 13.532 8.24-19.37 133.743 112.660-159.236 *n: kullanılan birey sayısı ** Tarla Populasyonu LC 50 veya LC 90 / Hassas Populasyonu LC 50 veya LC 90 26 LC 90 (ppm) (0.95) güven aralığı LC 50 Duyarlılık kaybı** LC 90 duyarlılık kaybı** 4.129 14.03-1776.70 - - 322.785 233.519-562.224 19.664 78.175 280.600 200.508-571.830 19.284 67.958 65.378 45.91-109.488 3.596 15.834 187.024 149.798-398.460 21.429 45.29 135.225 121.899-160.172 20.789 32.750 34.908 27.12-48.56 2.293 8.454 400.289 332.075-880.984 48.952 96.945 1641.147 702.47-8277.610 22.127 397.468 191.272 138.31-357.88 15.544 44.586 76.423 49.71-156.84 3.045 18.509 256.395 203.719-406.403 30.102 62.096

Pyretroitli ilaçlara karşı akarlar ve T.urticae de direnç konusunda yapılmış çok fazla çalışma bulunmamaktadır. Çalışmamızda ele alınan üç sentetik pyretroitli aktif madde hem kırmızı örümceklere, hem de böceklere karşı yaygın olarak kullanılmaktadır. Bioassay çalışmaları çeşitli agroekosistemlerden toplanan populasyonlarda hassas populasyona oranla değişik düzeylerde hassasiyet farklılıkları olduğunu ortaya çıkartmıştır. En yüksek düzeyde hassasiyet azalması lambda-cyhalothrin e karşı belirlenmiştir. Bu ilaca karşı BEYDOM populasyonu yaklaşık 49 kat dirençli gözükmektedir. Bunu 30 kat ile KULE, 22 kat ile HACI populasyonu izlemektedir. Fenpropathrine karşı ise, yaklaşık 9 kat ile AKSU populasyonu en yüksek düzeyde dirençli olarak belirlenmiştir. BEYDOM populasyonu bu aktif maddeye karşı yaklaşık 5 kat ile ikinci sıradadır. BEYDOM bifenthrine karşı yaklaşık 6 kat ile yine ikinci sıradadır. SEN populasyonu bu aktif maddeye karşı en yüksek dirence sahip populasyondur. Direnç oranı yüksek populasyonlarda hesaplanan doz-ölüm doğrularının eğimlerinin yüksek oluşu bu populasyonların bireylerinin direnç bakımından oldukça homojen tepkiler verdiğini göstermektedir. Birçok çalışmada elde edilen verilere göre akarlarda sentetik pyrethroitlere direncin seleksiyon baskısıyla hızlı olarak arttığı belirlenmiştir. Mesela Varroa jacobsoni ve sentetik pyretroitlerle ilişkili ilk raporlar kullanılmaya başlandıktan yaklaşık 4 yıl sonra tarla koşullarında 10 kata kadar çıkmıştır (Frank 1995). Boophilus microplus isimli kene hayvancılık alanında ekonomik öneme sahip bir zararlıdır, 1992 de bu populasyonda saptanan 5.7 kat deltamethrin direnci, 1995 de 97.7 kata çıkmıştır (Beugnet et al. 1995). Bir avcı akar olan Typhlodromus pyri nin Yeni Zelanda daki populasyonlarında ilk kez 1978 de direnç görülmeye başlanmış, tarla koşullarında 1990 a kadar devam eden seleksiyon sonucunda bu faydalı akarda permethrin ve cypermethrine karşı 41 kat direnç saptanmıştır. Biyoassay çalışmalarından elde ettiğimiz sonuçları değerlendirirsek yoğun ilaç kullanımının kırmızı örümceklerde sentetik pyretroitlere karşı direnç gelişimine neden olduğu görülmektedir. 27