EGE ÜNVERSTES FEN BLMLER ENSTTÜSÜ (DOKTORA TEZ)

I EGE ÜNVERSTES FEN BLMLER ENSTTÜSÜ (DOKTORA TEZ) EGE BÖLGES NDEK ÇETL SICAK SU KAYNAKLARINDAN THERMUS GENUSU BAKTERLERN ZOLASYONU, MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE DENTFKASYONU VE -GALAKTOSDAZ AKTVTESNN SAPTANMASI Nermin SARIGÜL Biyoteknoloji Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: 614.0207 Sunu Tarihi: 25 Nisan 2007 Tez Danımanı: Prof. Dr. Rengin ELTEM Bornova-ZMR 2007

II

III Yapmı Olduum Tez Çalımamı Hiçbir Zaman Hakkını Ödeyemeyeceim Ablam Güngör SARIGÜL e Sevgi ve Saygılarımla thaf Ediyorum

IV

III Nermin SARIGÜL tarafından DOKTORA TEZ olarak sunulan gelitirilmi Ege Bölgesi ndeki çeitli sıcak su kaynaklarından Thermus genusu bakterilerin izolasyonu, moleküler yöntemlerle identifikasyonu ve - galaktosidaz aktivitesinin saptanması balıklı bu çalıma, E. Ü. Lisansüstü Eitim ve Öretim Yönetmelii ile E. Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eitim ve Öretim Yönetmelii ile E. Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eitim ve Öretim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan deerlendirilerek savunmaya deer bulunmu ve 25/04/2007 tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oy birlii ile baarılı bulunmutur. Jüri Üyeleri mza Jüri Bakanı :Prof.Dr. Rengin ELTEM Raportör Üye :Doç.Dr. Bahattin TANYOLAÇ Üye :Prof.Dr. Abdurrahman Üsame TAMER Üye :Doç.Dr. Güven ÖZDEMR Üye :Yard.Doç. Dr.Uur SIDAL

IV

V ÖZET EGE BÖLGES NDEK ÇETL SICAK SU KAYNAKLARINDAN THERMUS GENUSU BAKTERLERN ZOLASYONU, MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE DENTFKASYONU VE - GALAKTOSDAZ AKTVTESNN SAPTANMASI SARIGÜL, Nermin Doktora Tezi, Biyoteknoloji Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Prof.Dr. Rengin ELTEM 25 Nisan 2007, 344 sayfa Thermus genusu termofilik bakteriler arasında en iyi bilinen genuslardan biridir. T. aquaticus dan üretilen termostabil DNA polimeraz enzimi PCR teknolojisinin ve rekombinant DNA çalımalarının gerçekletirilmesini salamıtır. Bu nedenle Thermus genusu bakterilerin Ege Bölgesinden izolasyonu sadece biyolojik çeitlilik verisinin salanması yönünden deil aynı zamanda bu bakterilerin enzimlerinin biyoteknolojik potansiyelleri nedeniyle de önemlidir. Ege Bölgesi ndeki sıcaklıkları 55-95 0 C ve ph deerleri 6,0-9,5 arasında deien 6 ildeki 11 sıcak su kaynaının (9 tanesi kaplıca, 2 tanesi jeotermal enerji tesisi) toplam 32 örnekleme noktasından biyofilm ve su karıımını içeren örnekler toplanmıtır. Ön zenginletirme ileminden sonra toplam 69 bakteri suu izole edilmitir. Gram s boyama, endospor boyama, niastanın hidrolizi, katalaz, üreaz, sitokrom oksidaz, nutrient brothda büyüme ve peptidoglikan analizi gibi çeitli biyokimyasal test ve boyamalarla 40 potansiyel Thermus izolatı seçilmitir.

VI Tanımlama, genetik olarak akrabalık ve biyo-çeitlilik çalımaları için potansiyel Thermus izolatlarının 16S rdna sekansları kullanılmıtır. 16S rdna amplifikasyonu 8F ve 1492R universal primerleri kullanılarak yapılmıtır. 4 sekanslama primeri seçilmitir; 8F, 1492R, 515F ve 1115R ve sekans reaksiyonları Orta Dou Teknik Universitesi Merkez Laboratuvarına yaptırılmıtır ve ham sekans çıktıları eposta aracılıı ile tarafımıza gönderilmitir. Her bir izolat için gönderilen 4 adet kısmi 16S rdna ham sekans verileri Bioedit Sequence Alignment Editor programı ile tek bir sekans dizisi haline getirilmitir. Gen Bankası nukleotid blast ilemi ile en yakın türler belirlenmitir. Tüm izolatların sekans benzerlii ise ClustalW1.8 multiple sekans alignment programı kullanılarak gerçekletirilmitir. Mega 3.1 programı ile neighboor joining methoda göre filogenetik dendogram oluturulmutur. Oluturulan aacın güvenilirlii bootstrap 500, 1000 ve 2000 ile deerlendirilmitir. 22 Thermus oshimaii, 9 Thermus scotoductus, 5 Thermus antranikianus, 3 Thermus thermophilus ve 1 Thermus sp. Ege TB 34 suu tanımlanmıtır. Termofilik mikroorganizmalardan salanan termostabil - galaktosidaz enzimi, mezofilik olanlar ile kıyaslandıında düük laktozlu süt ürünlerinin üretiminde oldukça avantajlıdır. 60 0 C de veya daha yüksek sıcaklık derecelerinde aktif olan termostabil enzimler yüksek sıcaklıklarda pastörizasyon ilemi yapılırken aynı zamanda laktoz oranınında düürülmesine olanak salamaktadır. Endüstriyel önemi nedeni ile tanımlanan Thermus sularının -galaktosidaz aktiviteleri incelenmitir. Termostabil -galaktosidaz üretiminin indükleme ve sonlandırma zamanları her Thermus suu için büyüme erisinin ve kilenme sürelerinin çıkarılması ile belirlenmitir. kilenme süreleri T. oshimai için 50-164 dakika,

VII ortalama 81 dakika; T. scotoductus için 59-116 dakika, ortalama 78 dakika; T. thermophilus için 46-68 dakika, ortalama 54 dakika, T. antranikianus için 51-86 dakika, ortalama 68 dakika; Thermus sp. Ege TB 34 için 138 dakika olarak hesaplanmıtır. Tüm Thermus sularında -galaktosidaz enzim aktivitesi belirlenmitir. 70 0 C de en yüksek ve en düük enzim aktiviteleri Thermus oshimai Ege TB 2 ve Thermus oshimai Ege TB 9 sularında sırasıyla 81082 Unit/g kuru hücre, 1128 Unit/g kuru hücre eklinde belirlenmitir. Anahtar Kelimeler: Thermus spp., 16S rdna, filogeni, biyoçeitlilik, - galaktosidaz

VIII

IX ABSTRACT ISOLATION AND IDENTIFICATION OF THE GENUS Thermus FROM VARIOUS HOT SPRINGS IN AEGEAN REGION BY MOLECULAR BIOLOGY METHODS AND DETERMINATION OF -GALACTOSIDASE ACTIVITY SARIGÜL, Nermin phd in Biotechnology Department Supervisor : Prof.Dr. Rengin ELTEM 25 th April, 2007, 344 pages The Thermus is one of the most known genus in thermophilic bacteria. Thermostabil DNA polymerases from Thermus aquaticus made PCR feasible and induced a powerfull technology that complemented recombinant DNA studies. Isolation and identification of one of the most important thermophilic bacteria Thermus is not only important for enrichment of data on biodiversity of Ege Region but also for their enzymes biotechnological potential. Samples of biofilm and water mixture for Thermus isolation were taken at 32 sampling point with temperature ranging from about 55-95 0 C and ph ranging from 6.0-9.5 in 11 sampling area (9 hot springs and 2 geothermal power plants runoff water) in 6 province, Ege Region. After enrichment and isolation studies 69 bacterial strains were isolated from all of the samples. After some biochemical tests and stains such as Gram s stain, endospor stain, starch hydrolysis, catalase, urease, cytochrome oxydase, growth on Nutrient Broth and peptidoglycan analysis, 40 potential Thermus strains were selected.

X 16S rdna sequences were used for identification and determination of genetic relationships and diversity of potential Thermus isolates. Amplification of 16S rdna was carried out with universal eubacteria primers 8F and 1492 R. Four sequencing primers were selected; 8F, 1492 R, 515F and 1115 R and 16S rdna sequencing reactions were carried out by METU Central Laboratory and than raw sequence data were sent by email to us. Partial 16S rdna raw sequence data were imported into the BioEdit Sequence Alignment Editor and a contiguous consensus sequence generated. Using blastn against GenBank database, the nearest relatives of these consensus sequence were identified. The multiple sequence alignments tool in ClustalW 1.8 was used to analyse sequence similarity. The phylogenetic dendogram constructed using the neighboor joining method as implemented in Mega 3.1. Confidence in the tree topology was determined by using 500, 1000 and 2000 bootstrapped trees. 22 Thermus oshimai, 9 Thermus scotoductus, 5 Thermus antranikianus, 3 Thermus thermophilus and 1 Thermus sp. Ege TB 34 strain were identified out of 40 Thermus strains. Thermostable -galactosidase from thermophiles have significant advantages in the production of low lactose dairy products, compared to mesophilic enzymes. The thermostable enzymes, active at or above 60 0 C, should enable the hydrolysis process to be conducted during milk pasteurization at high temperatures. Because of its industrial importance, thermostable -galactosidase activities of Thermus species were detected. For determination of induction and termination time for thermostable -galactosidase production the growth rate and generation time were detected for each Thermus isolates. The range of doubling times 50-164 minutes, average 81 minutes, for T. oshimai; 59-116 minutes, average 78 minutes, for

XI T. scotoductus; 46-68 minutes, average 54 minutes, for T. thermophilus; 51-86 minutes, average 68 minutes, for T. antranikianus; and 138 minutes for Thermus sp. Ege TB 34 were calculated. -galactosidase enzyme activity were detected in all Thermus strains. The highest and the lowest enzyme activities of two strains, Thermus oshimai Ege TB 2, Thermus oshimai Ege TB 9 were determinated respectively; 81082 Unit/g dried cell, 1128 Unit/g dried cell at 70 0 C. Keywords: Thermus spp., 16S rdna, Phylogeny, Biodiversity, - galactosidase

XII

XIII TEEKKÜR Doktora çalımam süresince göstermi olduu ilgi ve danımanlık için Sayın hocam Prof. Dr. Rengin ELTEM e; örnekleme alanlarının belirlenmesinde yapmı olduu katkı ve yardımlar için Dokuz Eylül Üniversitesi öretim üyelerinden Doç. Dr. Gültekin TARCAN a; çalımalarım süresince yapmı olduu objektif deerlendirmeler, doru yönlendirmeler ve her türlü yardımları için Celal Bayar Üniversitesi Öretim Üyeleri nden Sayın Prof. Dr. Abdurrahman Üsame TAMER e; karılatıım her sorunun gideriminde yardımlarını esirgemeyen ve laboratuvar imkanlarını rahatlıkla kullanmamı salayan Ege Universitesi Biyomühendislik Bölümü öretim üyelerinden Sayın Doç. Dr. Bahattin TANYOLAÇ ve Sayın Doç. Dr. Kemal KORKMAZ a; yapmı olduu yardım ve deerli katkıları için Sayın Lokman VARILI ya; çalımalarımda kendi laboratuvar imkanlarını kullanmamı salayarak yaptıkları yardım ve katkılarının dıında göstermi oldukları samimi dostluk ve ev sahiplii için zmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü nde görev yapan arkadalarım Sayın Burcu OKUKLU, Sayın Oylum ERKU ve Sayın Mert SUDAIDAN a içten teekkürlerimi sunarım. Doktora çalımam süresince yardımlarını esirgemeyen, sürekli motivasyon salayarak çalıma isteinin canlı tutulmasını salayan sevgili arkadalarım Sayın Özlem MAMOLU, Sayın Zeynep AKBAL, Sayın Arzu YILDIRIM, Sayın Filiz ALTAN, Sayın adiye HAYTA ve Sayın Tuba ADIYAMAN KOLTUKSUZ a çok teekkür ederim. Göstermi oldukları sevgi, ilgi ve her türlü destek için Aileme sonsuz sevgi ve teekkürlerimi sunarım.

XIV

XV ÇNDEKLER Sayfa ÖZET... V ABSTRACT...IX TEEKKÜR...XIII EKLLER DZN... XXII ÇZELGELER DZN... XXXII KISALTMALAR DZN...XXXIV 1. GR... 1 2. LTERATÜR ÖZET... 5 2.1 Termofilik Mikroorganizmalar... 5 2.1.1 Termofilik Tanımı... 5 2.1.2 Termofilik Mikroorganizmaların Özellikleri... 7 2.1.2.1 Arkea... 8 2.1.2.2 Bakteria... 12 2.1.3 Termofilik Prokaryotların Ekolojisi... 14 2.1.3.1 Bakteriaya özgü termal alanlar... 14 2.1.3.2 Termofilik Arkealara özgü termal alanlar... 17 2. 1.3.3 Termofilik Bakterianın ekolojileri... 18 2.1.3.4 Termofilik prokaryotların çeitlilii... 21

XVI ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 2.1.3.5 Termofilik prokaryotların evolusyonu...21 2.1.3.6 Termofilik prokaryotların kültüvasyonu...24 2.1.4 Termofilik Mikroorganizmaların ve Enzimlerinin Biyoteknolojik Potansiyeli...26 2.1.4.1 Termostabil Enzimler...26 2.2 Thermus Genusu Bakteriler...36 2.2.1 Hücre Yapısı ve Kompozisyonu...36 2.2.2 Fizyoloji ve Metabolizması...38 2.2.3 Taksonomi ve dentifikasyon...41 2.2.4 Thermus Enzimlerinin Termal Stabilite Özellikleri ve Uygulama Alanları...44 2.2.4.1 Termal Stabilite...44 2.2.4.2 Thermus Enzimleri...50 3. Materyal ve Metot...59 3.1 Materyal...59 3.1.1 Sıcak Su Örnekleri...59 3.1.2 Kullanılan Besiyerleri, Çözeltiler ve Kimyasallar...64 3.1.2.1 Nitsch s iz elementleri...64 3.1.2.2 Castenholz basal tuzları (10X)...64

XVII ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 3.1.2.3 Thermus ortamı... 65 3.1.2.4 Thermus ruber ortamı... 66 3.1.2.5 Enzim üretiminde kullanılan Thermus ortamı... 66 3.1.2.6 Thermus+niasta ortamı... 67 3.1.2.7 Thermus suları için nutrient agar... 67 3.1.2.8 Christensen üre agar... 68 3.1.2.9 Gram s boyama da kullanılan kimyasallar... 68 3.1.2.10 Endospor boyamada kullanılan kimyasallar... 70 3.1.2.11 Sitokrom oksidaz testinde kullanılan maddeler... 70 3.1.2.12 H 2 O 2 solüsyonu... 70 3.1.2.13 Çeperde diaminopimelik asit (DAP)-ornitin analizinde kullanılan bileenler... 71 3.1.2.14 Bakteriyal genomik DNA izolasyonunda kullanılan malzemeler... 71 3.1.2.15 Genomik DNA nın temizlenmesinde kullanılan kimyasallar... 72 3.1.2.16 PCR reaksiyonlarına giren bileenler... 72 3.1.2.17 Agaroz jel elektroforez için kullanılan malzemeler... 73

XVIII ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 3.1.2.18 -Galaktosidaz Enzim Aktivite Tayininde Kullanılan Bileenler...74 3.1.3 Kullanılan Cihazlar...75 3.1.3.1 Mettler toledo AL204 tartı...75 3.1.3.2 ph metre...75 3.1.3.3 Hot plate ve manyetik karıtırıcı...75 3.1.3.4 Otoklav...75 3.1.3.5 nkübatör...76 3.1.3.6 Çalkalamalı nkübator...76 3.1.3.7 Mikroskop...76 3.1.3.8 Liyofilizatör...76 3.1.3.9 Santrifüj...76 3.1.3.10 Su Banyosu...77 3.1.3.11 Spektrofotometre...77 3.1.3.12 Agaroz jel elektroforez için kullanılan aletler...77 3.1.3.13 PCR reaksiyonu için kullanılan aletler...78 3.2 Metot...78 3.2.1 Örneklerin Toplanması...78 3.2.2 Termofilik Bakterilerin zolasyonu...78

XIX ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 3.2.3 Gram s Boyama... 79 3.2.4 Endospor Boyama... 79 3.2.5 Nutrient Agar Besiyerine Ekim... 80 3.2.6 Sitokrom Oksidaz... 80 3.2.7 Niastanın Hidrolizi... 80 3.2.8 Üreaz Aktivitesinin Belirlenmesi... 81 3.2.9 Katalaz Aktivitesinin Belirlenmesi... 81 3.2.10 Çeperde Diaminopimelik asit (DAP) ve Ornitin Analizi... 81 3.2.11 Potansiyel Thermus zolatlarından DNA zolasyonu... 82 3.2.12 zole Edilen Bakteriyal Genomik DNA ların Kontrolü... 83 3.2.13 Genomik DNA larda Saptanan Kirliliklerin Giderilmesi... 85 3.2.14 16S rdna Fragmentinin Amplifikasyonu çin Uygun Primerlerin Seçilmesi ve Balanma Sıcaklıının Hesaplanması... 86 3.2.15 PCR Ürünlerinin Nükleotid Dizisinin Belirlenmesi... 87 3.2.16 Nükleotid Dizisi ile Tür Tayininin Yapılması... 88 3.2.17 Filogenetik Dendogramın Oluturulması... 88

XX ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 3.2.18 Thermus Sularına Ait Büyüme Erisinin Belirlenmesi...88 3.2.19 -Galaktosidaz Enzimi Üretimi...88 3.2.20 -Galaktosidaz enzimi aktivite tayini...89 3.2.21 Thermus Sularının Liyofilizasyon Yöntemi ile Saklanması...91 4.BULGULAR VE TARTIMA...92 4.1 Çeitli Sıcak Su Kaynaklarından Potansiyel Thermus zolatlarının zolasyonu ve Tür Tayini...92 4.1.1 Thermus zolasyonlarının Yapılacaı Örnekleme Alanlarının Seçilmesi...93 4.1.2 Potansiyel Thermus zolatlarının Çeitli Morfolojik ve Biyokimyasal Testler ile Belirlenmesi...100 4.1.3 Potansiyel Thermus zolatlarının Moleküler Biyoloji Yöntemleri Kullanılarak Tür Tayininin Yapılması...109 4.1.4 Potansiyel Thermus izolatlarına ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin çoaltılması...110 4.1.5 Potansiyel Thermus zolatlarına Ait ve Çoaltılmı Olan 16S rrna yı Kodlayan Bölgenin Baz Sırasının Belirlenmesi...121

XXI ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 4.1.5.1 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 2 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 123 4.1.5.2 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 4 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 126 4.1.5.3 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 8 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 129 4.1.5.4 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 9 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 132 4.1.5.5 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 13 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 135 4.1.5.6 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 14 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 138 4.1.5.7 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 18 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 141

XXII ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 4.1.5.8 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 19 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...144 4.1.5.9 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 20 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...147 4.1.5.10 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 23 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...150 4.1.5.11 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 24 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...153 4.1.5.12 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 26 ya ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...156 4.1.5.13 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 27 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...159 4.1.5.14 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 30 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...162

XXIII ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 4.1.5.15 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 31 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 165 4.1.5.16 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 33 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 168 4.1.5.17 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 34 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 171 4.1.5.18 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 35 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 174 4.1.5.19 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 36 ya ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 177 4.1.5.20 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 37 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 180 4.1.5.21 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 38 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 183

XXIV ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 4.1.5.22 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 40 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...186 4.1.5.23 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 41 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...189 4.1.5.24 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 42 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...192 4.1.5.25 zolat EGE TB 44 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...195 4.1.5.26 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 45 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...198 4.1.5.27 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 46 ya ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...201 4.1.5.28 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 47 ya ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...204

XXV ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 4.1.5.29 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 48 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 207 4.1.5.30 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 49 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 210 4.1.5.31 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 51 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 214 4.1.5.32 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 52 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 217 4.1.5.33 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 55 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 220 4.1.5.34 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 57 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 223 4.1.5.35 zolat EGE TB 59 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini... 226

XXVI ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 4.1.5.36 Potasiyel Thermus izolatı EGE TB 60 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...229 4.1.5.37 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 61 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...232 4.1.5.38 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 62 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...235 4.1.5.39 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 63 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...238 4.1.5.40 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 68 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi ve tür tayini...241 4.1.6 Tanımlanan Thermus Türlerinin Akrabalık likilerinin Belirlenmesi ve Filogenetik Dendogram Oluturulması..251 4.1.7 Tanımlanan Thermus Sularının 16S rrna yı Kodlayan Baz Dizisindeki Farklılıklarının Belirlenmesi...260 4.1.7.1 Tanımlanan Thermus oshimai sularının tür içi sekans dizisi farklılıklarının belirlenmesi...261

XXVII ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 4.1.7.2 Tanımlanan Thermus scotoductus sularının tür içi sekans dizisi farklılıklarının belirlenmesi... 277 4.1.7.3 Tanımlanan Thermus antranikianus sularının Tür çi Farklılıklarının Belirlenmesi... 283 4.1.7.4 Tanımlanan Thermus thermophilus sularının Tür çi Farklılıklarının Belirlenmesi... 287 4.2 Tanımlanan Thermus Sularının -Galaktosidaz Enzim Aktivitelerinin ncelenmesi... 289 4.2.1 Thermus Sularının Büyüme Erilerinin Çıkarılması ve kilenme Sürelerinin Hesaplanması... 293 4.2.1.1 Thermus antranikianus sularına ait büyüme erilerinin çıkarılması ve ikilenme sürelerinin hesaplanması... 299 4.2.1.2 Thermus sp. EGE TB 34 suuna ait büyüme erisinin çıkarılması ve ikilenme süresinin hesaplanması... 300 4.2.1.3 Thermus oshimai sularına ait büyüme erilerinin çıkarılması ve ikilenme sürelerinin hesaplanması... 301 4.2.1.4 Thermus scotoductus sularına ait büyüme erilerinin çıkarılması ve ikilenme sürelerinin hesaplanması... 304

XXVIII ÇNDEKLER (Devamı) Sayfa 4.2.1.5 Thermus thermophilus türlerine ait büyüme erilerinin çıkarılması ve ikilenme sürelerinin hesaplanması...305 4.2.2 -galaktosidaz Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi...306 4.2.2.1 -galaktosidaz üretimi...306 4.2.2.2 -galaktosidaz aktivitesinin belirlenmesi...309 5. SONUÇ VE ÖNERLER...321 6.KAYNAKLAR DZN...323 7.ÖZGEÇM...340

XXIX EKLLER DZN ekil Sayfa ekil 2.1 Termofilik prokaryotların T opt ve ph opt deerelerine göre daılımı.... 18 ekil 2.2 16Sr RNA sekanslarına göre canlıların sınıflandırılması... 22 ekil 2.3 16Sr RNA sekanslarına göre canlıların sınıflandırılması ve Genusların Gösterilmesi... 23 ekil 2.4 Kompostlama ve sıcaklık deiimleri... 33 ekil 3.1 Ege Bölgesi ve civarındaki sıcak su kaynakları... 60 ekil 3.2 Örneklerin toplandıı alanların genel görünümü... 63 ekil 4.1 Potansiyel Thermus izolatlarına uygulanan bazı testler ve boyamalar... 103 ekil 4.2 Potansiyel Thermus izolatlarına ait genomik DNA ların agaroz jel elektroforezde görünümü... 110 ekil 4.3 Primerlerin balanma bölgeleri Thermus thermophilus XM e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin baz sırası üzerinde gösterilmesi... 111 ekil 4.4 Potansiyel Thermus izolatlarının ait, çoaltılmı 16S rrna yı kodlayan DNA parçasının agaroz jel elektroforezde görünümü... 120 ekil 4.5 Potansiyel Thermus izolatlarının ait, genomik DNA ları temizlendikten sonra çoaltılmı 16S rrna yı kodlayan DNA parçasının agaroz jel elektroforezde görünümü... 121 ekil 4.6 zolat EGE TB 2 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 123

XXX EKLLER DZN (Devamı) ekil ekil 4.7 ekil 4.8 ekil 4.9 ekil 4.10 ekil 4.11 ekil 4.12 ekil 4.13 ekil 4.14 ekil 4.15 Sayfa zolat EGE TB 2 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin Gen Bankası nükleotid blast sonucu...125 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 4 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...126 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 4 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...128 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 8 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...129 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 8 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...131 Potansiyel Thermus izolatı zolat EGE TB 9 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...132 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 9 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...134 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 13 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...135 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 13 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...137

XXXI EKLLER DZN (Devamı) ekil ekil 4.16 ekil 4.17 ekil 4.18 ekil 4.19 ekil 4.20 ekil 4.21 ekil 4.22 ekil 4.23 ekil 4.24 Sayfa Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 14 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 138 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 14 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 140 zolat EGE TB 18 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 141 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 18 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 143 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 19 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 144 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 19 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 146 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 20 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 147 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 20 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 149 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 23 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 150

XXXII EKLLER DZN (Devamı) ekil ekil 4.25 ekil 4.26 ekil 4.27 ekil 4.28 ekil 4.29 ekil 4.30 ekil 4.31 ekil 4.32 ekil 4.33 Sayfa Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 23 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...152 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 24 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...153 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 24 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...155 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 26 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...156 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 26 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...158 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 27 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...159 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 27 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...161 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 30 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...162 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 30 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...164

XXXIII EKLLER DZN (Devamı) ekil ekil 4.34 ekil 4.35 ekil 4.36 Sayfa Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 31 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 165 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 31 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 167 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 33 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 168 ekil 4.37 ekil 4.38 ekil 4.39 ekil 4.40 ekil 4.41 ekil 4.42 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 33 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 170 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 34 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 171 zolat EGE TB 34 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 173 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 35 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 174 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 35 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 176 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 36 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 177

XXXIV EKLLER DZN (Devamı) ekil ekil 4.43 ekil 4.44 ekil 4.45 ekil 4.46 ekil 4.47 ekil 4.48 ekil 4.49 ekil 4.50 ekil 4.51 Sayfa Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 36 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...179 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 37 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...180 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 37 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...182 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 38 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...183 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 38 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...185 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 40 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...186 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 40 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...188 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 41 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...189 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 41 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...191

XXXV EKLLER DZN (Devamı) ekil ekil 4.52 ekil 4.53 ekil 4.54 ekil 4.55 ekil 4.56 ekil 4.57 ekil 4.58 ekil 4.59 ekil 4.60 ekil 4.61 Sayfa Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 42 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 192 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 42 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 194 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 44 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 195 zolat EGE TB 44 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 197 zolat EGE TB 45 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 198 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 45 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 200 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 46 ya ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 201 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 46 ya ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 203 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 47 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 204 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 47 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 206

XXXVI EKLLER DZN (Devamı) ekil ekil 4.62 ekil 4.63 ekil 4.64 ekil 4.65 ekil 4.66 ekil 4.67 ekil 4.68 ekil 4.69 ekil 4.70 Sayfa Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 48 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...207 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 48 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...209 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 49 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...210 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 49 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...213 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 51 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...214 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 51 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...216 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 52 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...217 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 52 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...219 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 55 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...220

XXXVII EKLLER DZN (Devamı) ekil ekil 4.71 ekil 4.72 ekil 4.73 ekil 4.74 ekil 4.75 ekil 4.76 ekil 4.77 ekil 4.78 ekil 4.79 Sayfa Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 55 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 222 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 57 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 223 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 57 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 225 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 59 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 226 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 59 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 228 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 60 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 229 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 60 a ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 231 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 61 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi... 232 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 61 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu... 234

XXXVIII EKLLER DZN (Devamı) ekil Sayfa ekil 4.80 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 62 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...235 ekil 4.81 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 62 ye ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...237 ekil 4.82 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 63 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...238 ekil 4.83 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 63 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...240 ekil 4.84 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 68 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisi...241 ekil 4.85 Potansiyel Thermus izolatı EGE TB 68 e ait 16S rrna yı kodlayan bölgenin kısmi sekans dizisinin gen bankası nükleotid blast sonucu...243 ekil 4.86 Ege Bölgesindeki çeitli sıcak su kaynaklarından tanımlanan Thermus sularının % daılım oranı...245 ekil 4.87 Tanımlanan Thermus türleri ile referans kültürler için oluturulan filogenetik dendogram Bootstrap 500...252 ekil 4.88 Tanımlanan Thermus türleri için oluturulan filogenetik dendogram (Bootstrap 1000)...253 ekil 4.89 Tanımlanan Thermus türleri ile referans kültürler için oluturulan filogenetik dendogram (Bootstrap 1000)...254

XXXIX EKLLER DZN (Devamı) ekil Sayfa ekil 4.90 Tanımlanan Thermus sularının allign oldukları bölgenin seçilerek referans kültürler ile beraber oluturulan filogenetik dendogram (Bootstrap 1000)... 259 ekil 4.91 Tanımlanan Thermus oshimai türlerinin 16S rrna yı kodlayan DNA fragmentlerinin sekans dizilerindeki tür içi farklılıklarının belirlenmesi... 276 ekil 4.92 Tanımlanan Thermus scotoductus türlerinin 16S rrna yı kodlayan DNA fragmentlerinin sekans dizilerindeki tür içi farklılıklarının belirlenmesi... 282 ekil 4.93 Tanımlanan Thermus antranikianus türlerinin 16S rrna yı kodlayan DNA fragmentlerinin sekans dizilerindeki tür içi farklılıklarının belirlenmesi... 286 ekil 4.94 Tanımlanan Thermus thermophilus türlerinin 16S rrna yı kodlayan DNA fragmentlerinin sekans dizilerindeki tür içi farklılıklarının belirlenmesi... 289 ekil 4.95 Tanımlanan Thermus sularının ikilenme süreleri... 298 ekil 4.96 Thermus antranikianus sularına ait büyüme erileri... 300 ekil 4.97 Thermus sp.ege TB 34 suuna ait büyüme erisi... 301 ekil 4.98 Thermus oshimai sularına ait büyüme erileri (1)... 301 ekil 4.99 Thermus oshimai sularına ait büyüme erileri (2)... 302 ekil 4.100 Thermus scotoductus sularına ait büyüme erileri... 304 ekil 4.101 Thermus thermophilus sularına ait büyüme erileri... 305 ekil 4.102 Thermus sularına ait -galaktosidaz aktiviteleri... 313

XL

XLI ÇZELGELER DZN Çizelge Sayfa Çizelge 2.1 Prokaryotlardaki balıca metabolik grupların maksimum büyüme sıcaklıkları... 7 Çizelge 2.2 Bakteria ve Arkeanın Kıyaslanması... 10 Çizelge 2. 3 T max >65 C 0 olan bazı termofilik Arkeanın listesi... 11 Çizelge 2. 4 T max >65 C 0 olan bazı termofilik Bakteria... 13 Çizelge 2. 5 Çeitli endüstriyel termofilik enzimler ve uygulama alanları... 35 Çizelge 2.6 Thermus genusuna ait 5 türün ve Rhodothermus marinus un genel özellikleri... 42 Çizelge 2. 7 Çeitli Thermus enzimleri ve termal stabiliteleri... 49 Çizelge 2.8 Ticari olarak çeitli bakterilerden üretilen DNA polimeraz enzimleri.... 53 Çizelge 2.9 Thermus genusundan elde edilen restriksiyon endonukleazlar ve kesim bölgeleri... 56 Çizelge 3.1 Örneklerin toplandıı sıcak su kaynakları, kaynakların genel özellikleri ve izolat kod numaraları.... 61 Çizelge 4.1 Örneklerin toplandıı sıcak su kaynakları, kaynakların genel özellikleri ve izolat kod numaraları.... 96 Çizelge 4.2 Potansiyel Thermus izolatlarının belirlenmesi amacı ile yapılan çeitli test ve boyamaların sonuçları... 101 Çizelge 4.3 Potansiyel Thermus izolatlarının belirlenmesi amacı ile yapılan bazı biyokimyasal testler ve sonuçları... 104 Çizelge 4.4 16S rrna yı kodlayan DNA fragmentinin amplifikasyonu için kullanılan universal primerler... 111

XLII ÇZELGELER DZN (Devamı) Çizelge Sayfa Çizelge 4.5 Tanımlanan Thermus türleri ve kod numaraları...244 Çizelge 4.6 Tanımlanan Thermus türlerinin izole edildii alanlar...248 Çizelge 4.7 Tanımlanan Thermus türlerinin izole edildii alanların ph ve sıcaklık aralıkları...251 Çizelge 4.8 Thermus sularının inkübasyon zamanına göre okunan absorbans (660nm) deerleri...295 Çizelge 4.9 T. antranikianus sularına ait ikilenme süreleri...300 Çizelge 4.10 T. oshimai sularına ait ikilenme süreleri...302 Çizelge 4.11 T. scotoductus sularına ait ikilenme süreleri...304 Çizelge 4.12 T. thermophilus sularına ait ikilenme süreleri...306 Çizelge 4.13 Thermus sularının -galaktosidaz enzim aktiviteleri...310 Çizelge 4.14 Elde ettiimiz en yüksek -galaktosidaz enzim aktivitesi ile daha önce çeitli aratırmacılar tarafından elde -galaktosidaz aktivitelerinin karılatırılması....318

XLIII KISALTMALAR DZN Açıklama DAP Diaminopimelik asit Orn Ornitin Bp Baz çifti TAE Tris Asetat Edta Tamponu TE Tris Edta Tamponu 16S rdna 16S rrna yı kodlayan DNA fragmenti

1 1. GR Biyolojik çeitlilik ya da biyoçeitlilik; gezegenimizin yaayan tüm canlılarıdır ve sadece tür çeitliliini deil aynı zamanda tür içindeki sular arasındaki çeitlilii de içermektedir. Biyolojik çeitliliin korunması insan neslinin devamı ve tüm dünyanın bütünlüünün korunması açısından önemlidir. Bitkiler, hayvanlar ve mikroorganizmalardaki büyük genetik çeitlilik insanlıın daha iyi koullarda yaaması için gerekli olan materyal, gıda ve ilaçların üretimi için oldukça deerlidir (Young, 1999). Ekstrem çevrelerde yaayan bütün mikroorganizmaların sahip oldukları enzimler ve metabolik yol izleri; yüksek sıcaklık, tuz konsantrasyonu gibi fiziksel koullarla baa çıkabilecek ve bulunabilen besinleri kullanabilecek ekilde optimize olmutur. Bu nedenle ekstrem çevreler bizler için, biyoteknolojik araçlar olarak kullanım potansiyeli yüksek olan benzersiz fizyolojik özellikler salarlar. Örnein Dou Afrika daki Rift Valley deki bir soda gölünden 1992 yılında izole edilen ve tanılanan bir Bacillus türünden bir selülaz enzimi elde edilmitir. Bu enzim (puradax cellulase), Genencor firması tarafından ticari hale getirilmitir. Aynı firma tarafından 1999 yılında Kenya daki bir soda gölünden izole edilen yeni bir Streptomyces türüne ait yeni bir selülaz enzimi (IndiAge Neutra) ticari hale getirilmitir. Bu enzimler kotların talanmı görünümünün oluturulmasında kullanılmaktadır (www.genencor.com; Wilson, 2004) Ekstrem çevrelerden biri olan yüksek sıcaklık derecelerindeki çevrelerde yaama yetenei olan canlılar biyoteknolojide kullanılabilirler. Termofilik kaynaklı enzimlerin kullanımına yönelik pek çok uygulama vardır ve bu enzimlerin özellikle termal stabiliteleri dikkat çekmektedir. u anda

2 termofilik mikroorganizmalardan bu enzimlerin saflatırılması ve özellikleri hakkında çok sayıda aratırma mevcuttur. Termal stabilite bu proteinlerde beklenen doal bir özelliktir, bununla beraber bu proteinler mezofilik olanlarla kıyaslandıında katotrofik ajanlara karı daha direçlidir. Yüksek sıcaklıklarda substrat çözünürlüü ve enzim reaksiyon hızı artar (Kim ve ark. 2006). Ülkemizin çeitli bölgelerinde çok sayıda sıcak su kaynaı bulunmaktadır. Bu kaynaklar ülkemizde enerji eldesi, pek çok hastalıın tedavisi, sera ısıtma sistemleri gibi farklı alanlarda kullanılmaktadır. Ancak içerdii biyolojik çeitlilik yeterince bilinmemektedir. Sıcak su kaynakları gibi ekstrem çevrelerde yaayan mikroorganizmaların sahip olduu enzimler atıkların arıtımından, gıda sanayine kadar çok sayıda alanda uygulama alanı bulmaktadır (Hough ve Danson, 1999; Feitkenhauer ve ark., 2003 ). Potansiyel kullanım alanları nedeni ile ekstrem çevresel koullarda yaayabilen mikroorganizmalar son yıllarda büyük önem kazanmıtır. Bu mikroorganizmalardan Thermus genusu bakteriler yüksek sıcaklıklarda yaayabilme özellikleri nedeniyle dikkat çekmitir. Yüksek sıcaklıklarda yaayabilmeleri aynı zamanda bu sıcaklık derecelerinde aktif enzimlere sahip olabilecekleri fikrini dourmustur. Daha sonra yapılan aratırmalar ile ilk olarak 1969 yılında Brock ve ark. tarafından Yellowstone National Park dan izole edilen ve tanılanan Thermus aquaticus un DNA polimeraz enzimi (Taq DNA polimeraz) izole edilmi ve bu sua patent alınmıtır (Sharp ve Williams, 1995). Thermus genusu bakterilerden sadece polimeraz enzimleri deil çok sayıda farklı enzimler de izole edilmitir. Bunlardan bazıları; -galaktosidaz (Maciunska ve ark., 1998), -galaktosidaz (Fridjonsson ve ark., 1999), fosfoenolpiruvat karboksilaz (Nakamura ve ark., 2002), aqualisin I (Terada

3 ve ark., 1990; Kim ve ark., 1997; Oledzka ve ark., 2003), dihidropirimidinase (Abendroth ve ark., 2002), D-hydantoinase (Abendroth ve ark., 2002), 3- isopropilmalat dehidrogenaz (Numata ve ark., 1999); -L-fukosidaz (Eneyskaya ve ark., 2001); lipaz (Dominguez ve ark., 2004); manganez katalaz (Kagawa ve ark., 1999); NADH oxidase (Radoi ve ark., 2007), amilomaltaz (Fujii ve ark., 2007), 4--glukanotransferaz (Park ve ark., 2007), fosfogliserat kinaz (Lee ve ark., 2006), RNA polimeraz (Kuznedelov ve ark. 2006); hekzokinaz (Bae ve ark., 2005) ve alkalin fosfatazdır (Gong ve ark., 2005). 1969 yılında Brock tarafından Thermus genusu (Thermus aquaticus YT-1 tip tür) ilk kez tanımlandıında, yapılan tür tanımlama çalıması sadece biyokimyasal ve morfolojik özelliklerine dayanmaktaydı (Brock ve Freeze 1969). Ancak günümüzde tanımlanmı 15 Thermus türlerini klasik yöntemler tür seviyesinde tanılamaya, biyokimyasal testlere verdikleri yanıtların tür içinde bile farklılık göstermesi nedeni ile imkan yoktur. Bu ekilde yapılacak bir çalıma ile belki genus seviyesinde tanılama yapılabilir. Son yıllarda daha kesin bilgi vermesi nedeni ile bakteri tanılamasına yönelik çalımalar moleküler biyoloji yöntemlerine göre yapılmaktadır. Degryse ve ark. (1978) nın yaptıı çalımada, biyokimyasal testlere göre tanılanmaya çalıılmıtır. Bu çalımada Thermus thermophilus HB8 suu da dahil olmak üzere tüm sular (I, Z05, ZA, YTI, HB8) fizyolojik testlere ve morfolojik özelliklerine göre T. aquaticus olarak tanımlanmıtır. Ancak moleküler biyoloji yöntemleri ile bu sular birbirinden ayırt edilmektedir ve günümüzde T. aquaticus suu olarak sadece YT1 suu kabul edilmektedir. Bu nedenle özellikle bakterilerin tanılanmasına yönelik çalımalarda moleküler biyoloji yöntemleri kullanılmalıdır.

4 Günümüzde organizmalar arasında filogenetik akrabalıklar hakkındaki kantitatif bilgiler onların DNA sekansları karılatırılarak elde edilmektedir. Bakteriyal çeitlilik çok fazla sayıda olduundan bu yöntem birbiri ile benzer olan bakteri türlerinin karılatırılmasında oldukça yararlıdır. 1987 lerde Carl Woese tarafından öncülük edilen Ribozomal RNA sekanslarının karılatırılması önemli bir identifikasyon yöntemidir. Ribozomal RNA hücresel yapıya sahip bütün organizmalarda bulunmakta ve bu sekans, evolüsyonun geliimi boyunca çok yava deiiklie uramaktadır. Bu sebeple de birbiriyle açık bir ekilde akraba olan organizmaların karılatırılması için ideal bir marker olarak i görmektedir. Çalımamızda Ege Bölgesi ndeki çeitli sıcak su kaynaklarından öncelikle Thermus genusuna ait bakterlerin izolasyonu ve daha sonra izole edilen Thermus genusuna ait izolatların 16S rrna yı kodlayan DNA sekans dizisine göre tanımlanması ve bölgemizdeki Thermus çeitliliinin belirlenmesi amaçlanmıtır. Bu çalımada ayrıca tanımlanan Thermus sularının özellikle süt ve süt ürünleri endüstrisinde kullanım alanı bulan ve biyoteknolojik olarak önemli enzimler arasında yer alan termostabil -galaktosidaz enzim aktivitelerinin belirlenmesi de amaçlanmıtır. Yapılacak çalımalar sonucunda elde edilen sonuçların Türkiye nin biyolojik çeitlilik envanterine ve bundan sonra yapılacak olan biyoçeitlilik çalımalarına önemli bir katkı salayacaı ümit edilmektedir. Ayrıca izole edilecek olan Thermus sularının biyoteknolojik olarak deerlendirilebilecek önemli gen kaynakları olabilecei düünülmektedir.

5 2. LTERATÜR ÖZET 2.1 Termofilik Mikroorganizmalar 16Sr RNA sekanslarına göre canlılar 3 domaine ayrılmaktadır, bunlar; ökarya, bakteriya, arkea dır (Woese, 1987). Bununla beraber, sıcaklık ile ilikilerine göre yaayan organizmaların sınıflandırılması biyolojik sistematiin en önemli elementlerinden biri olduu için her zaman dikkat çekmitir. Mikroorganizmalar klasik olarak sıcaklık isteklerine göre; psikrofilikler, mezofilikler ve termofilikler olmak üzere üç gruba ayrılırlar (Kristjansson, 1995). 2.1.1 Termofilik Tanımı Her organizmanın büyüyebildii ve çoalabildii belli sıcaklık aralıkları vardır; T min deerinde büyüme balayabilir ve büyüme yaklaık olarak 15-25 0 C optimum büyüme sıcaklıına kadar artar (T opt ), daha ileriki 5-10 0 C den T mak deerine kadar ise çoalmada genellikle hızlı bir düü olur ve bu deerin üzerinde büyüme meydana gelmez. Bu üç sıcaklık deeri Kardinal sıcaklıklar olarak tanımlanır ve her mikrobiyal tür ya da su için spesifiktir. Kardinal sıcaklık derecelerine balı olarak farklı grupları tanımlamak için pek çok giriimde bulunulmutur. Tabi ki, her zaman bazı üst üste gelmeler ve istisnalar vardır ve hala günümüzde bir fikir birlii yoktur. Geçen birkaç yıl içinde, termofilik tanımı daha yüksek sıcaklık derecelerini kapsamı ve yeni tanımlamalar önerilmitir (Kristjansson, 1995).

6 Geleneksel olarak T mak >50 0 C olan organizmaların termofilik olarak isimlendirildii söylenebilir. Brock un termofilik sınırının 55 0 C den 60 0 C ye çıkarılması yönündeki fikri iki temel delile dayanmaktadır. lki, bu sıcaklıın altındaki deerler genellikle doal çevrelerde mevcuttur, üzerindeki deerler ise bir takım jeotermal aktiviteler ve özel durumlar sonucunda olumaktadır. kincisi, bu sıcaklık deerlerinin üzerinde yaayan ökaryotik organizma bilinmemektedir, bu yüzden, bu sıcaklık deerleri sadece bir prokaryotik dünyadır. Bu sıcaklık dercesi, yaamın olduu bilinen sıcaklık aralıklarının tam orta deeri olacaktır (-10, 110 0 C) (Kristjansson, 1995). Termofilik aralıın daha ileri kısımlara ayrılmasına gerek vardır ve nispeten basit bir ekilde; 55-60 0 C den 80-85 0 C ye kadar termofilik ve 80-85 0 C den yukarıdaki sıcaklık derecelerindekileri ekstrem termofilik prokaryotlar olarak ayrılabilirler. Bu ayırım Thermotogales dıındaki tüm bilinen termofilik bakterileri, termofilik aralıa ve termofilik arkeaların çounu hipertermofilik aralıa yerletirir (Çizelge 2.3-2.4) (Kristjansson, 1995). Çizelge 2.1 de termofilik prokaryotlarda temel metabolik gruplar her gruptaki maksimum büyüme sıcaklıı ile gösterilmitir. Birçok durumda grup içerisinde bu sıcaklık derecesinde yaayabilen tek bir tür bulunmaktadır ve genellikle grupta sadece bir termofilik üye bulunmaktadır (Kristjansson, 1995).

7 Çizelge 2.1. Prokaryotlardaki balıca metabolik grupların maksimum büyüme sıcaklıkları (Kristjansson, 1995; Madigan ve Martinko, 2006). Organizma T max ( 0 C) Bakteriler Actinomisetler 62 Fotosentetik Oksijenik Siyanobakteriler Anoksijenik yeil bakteriler Aerobik Kemolitotrofik Hidrojen Okside Edenler Kükürt Okside Edenler Azot Okside Edenler Demir Okside Edenler Heterotrofik Anaerobik Nitrat Redükleyici Denitrifiye Edici Sülfat Redükleyici Demir Redükleyici Fermente Edici Clostridia Thermotoga 73 70 80 80 <60 55 85 80 80 85 100 80 90 Arkealar Halofilik 55 Metanojenik 97 Kükürt Metabolize Edenler Aerobik Kemolitotrofikler Heterotrofikler Anaerobik Kemolitotrofikler Heterotrofikler 96 90 113-121 105 2.1.2 Termofilik Mikroorganizmaların Özellikleri Termofilik mikroorganizmalar Arkea ve Bakteria olmak üzere iki grupta incelenebilir.

8 2.1.2.1 Arkea Arkealar Çizelge 2.1 de ekoloji ve fizyolojileri bakımından benzersiz olmaları nedeni ile bakterilerden ayrı gruplandırılmıtır. Halofilikler hiçbir bakterinin büyümek için adapte olamadıı, az bulunan doymu tuz çözelti habitatlarında yaarlar. Ekstrem halofiliklerin 55 0 C ye kadar sıcaklıklarda yaayabilen bir türü hariç tamamı mezofiliktir. Bir grup olarak, tabi ki metabolik yönden çok çeitlidir. Bir kısmı bakteriyorodopsin tarafından yönlendirilen proton pompası üzerinden ATP sentezlemek için, güne ııını kullanabilir. Bazıları fakültatif fermentatif anaerobtur ve bir tür de denitrifiye edicidir (Kristjansson, 1995). Metanojenik bakteriler metanojen denilen, sadece bu grup üyelerinin sahip olduu hiçbir öbakteride bulunmayan bir metabolik yol izini kullanan zorunlu anaeroblardır. Deniz sedimenti gibi sulfatça zengin anaerobik ekosistemlerde metanojenik bakteriler çounluu hidrojen ve asetat olan substrat için sulfat redükleyen bakterilerle yarımak zorundadır. Temiz su sedimentleri gibi düük sülfat içeren anaerobik ekosistemlerde ise dier yandan, aynı substrat için çok az bir rekabet söz konusudur (Kristjansson, 1995). Kükürdü metabolize eden arkeabakteriler, metabolik olarak arkea içindeki en çeitli gruptur. Bunların bazıları gerçekte kükürt bileiklerini enerji kaynaı olarak kullanmasalar da rrna sekans analizlerine göre filogenetik olarak bu gruba konulmutur. Thermoplasma nın arkealar arasında çok özel bir yeri vardır. Bunlar çepersiz (hücre çeperi olmayan) heterotroflardır, ılıman termofilik, fakültatif anaerobik ve ekstrem asidofiliktirler. Aerobik olarak herhangi bir kükürt bileiini büyüme için kullanmazlar, ancak kükürtü anaerobik olarak redükleyerek enerji elde ederler. Thermoplasma nın bu nedenle Acidianus a benzer bir yaam ekli

9 vardır. Filogenetik olarak, kükürt-metabolize eden ekstrem termofiliklere uzaktırlar ve metanojenlere daha yakındırlar (Kristjansson, 1995). Ekstrem termofiliklerin kükürdü metabolize eden grubu, aerobik heterotrof, aerobik kükürt-okside eden ototrof, anaerobik heterotrofik kükürt respirasyonu (H 2 S oluumu ile), anaerobik kükürt respirasyonu ve organik bileiklerin anaerobik fermentasyonunu yapabilen mikroorganizmaları içerir. Son grup bazen kükürdü enerji kazanmadan bir elektron alıcısı olarak kullanır. Bazı kükürt oksitleyen ototroflar ve 1987 de kefedilen bir sülfat redükleyen heterotrof olan Archaeoglobus, metal sülfitleri gibi metal iyonlarını okside ederek de büyüyebilir (Kristjansson, 1995). Birçok metanojen kükürdü indirgeyip, H 2 S üretme yeteneindedir. Bu nedenle, kükürt bileiklerinin bir formdan dierine metabolize edilmesinin arkealar arasında çok yaygın olduu görülmektedir. Arkealar ayrı bir grup olarak ayrılmadan önce, özel lipid ve hücre çeperi gibi farklı yapılara sahip oldukları belirlenmitir. Bu durum, bulundukları, alıık olunmayan ekstrem çevrelere adaptasyon olarak yorumlanmıtır (Kristjansson, 1995).