EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ)

i EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) KEFİR VE KEFİR TANESİNDE AFLATOKSİN M 1 TAYİN YÖNTEMİNİN GELİŞTİRİLMESİ VE KONTAMİNE SÜTLERDEN KEFİRE VE KEFİR TANELERİNE AFLATOKSİN M 1 GEÇİŞİNİN ARAŞTIRILMASI Perihan Kendirci Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: 614.01.00 Sunuş Tarihi: 12/09/2002 Tez Danışmanı: Prof.Dr. Tomris ALTUĞ Bornova-İzmir

ii

Sayın Perihan KENDİRCİ tarafından YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak sunulan Kefir ve Kefir Tanesinde Aflatoksin M 1 Tayin Yönteminin Geliştirilmesi ve Kontamine Sütlerden Kefire ve Kefir Tanelerine Aflatoksin M 1 Geçişinin Araştırılması adlı bu çalışma, Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği nin 12 inci madde (c) ve (d) bentleri ve Enstitü yönergesinin ilgili hükümleri dikkate alınarak tarafımızdan değerlendirilmiş olup yapılan sözlü savunma sınavında aday oy birliği ile başarılı bulunmuştur. Bu nedenle Perihan KENDİRCİ nin sunduğu metnin yüksek lisans tezi olarak kabulüne birliği ile karar verilmiştir. iii 12/09/2002 Adı Soyadı İmza Juri Başkanı ; Prof.Dr. Tomris ALTUĞ... Raportör ; Doç.Dr. Şahika GÖNÜL... Üye ; Yrd.Doç.Dr. Cem KARAGÖZLÜ... Dr. Süleyman BORUZANLI Enstitü Sekreteri Prof. Dr. Emür Henden Enstitü Müdürü

iv

v ÖZET KEFİR VE KEFİR TANESİNDE AFLATOKSİN M 1 TAYİN YÖNTEMİNİN GELİŞTİRİLMESİ VE KONTAMİNE SÜTLERDEN KEFİRE VE KEFİR TANELERİNE AFLATOKSİN M 1 GEÇİŞİNİN ARAŞTIRILMASI KENDİRCİ, Perihan Yüksek Lisans Tezi, Gıda Mühendisliğ Bölümü Tez yöneticisi: Prof.Dr. Tomris ALTUĞ Eylül 2002, 67 Sayfa Bu tezde kefir ve kefir tanesinde Aflatoksin M 1 tayini için uygun yöntem geliştirilmiş ve kontamine sütlerden kefire ve kefir tanelerine Aflatoksin M 1 geçişi ve depolamanın etkisi araştırılmıştır. Ayrıca kefirden izole edilen iki bakterinin kültür ortamında Aflatoksin M 1 e etkisi incelenmiştir. Kontamine edilmiş kefir ve kefir tanesinde Aflatoksin M 1 analizi için yapılan denemeler sonucunda imünoafiniti kolon ile saflaştırmadan sonra YBSK analizi tekniğinin en doğru sonuç veren yöntem olduğu belirlenmiştir. Söz konusu yöntem kullanılarak kefir için %75, kefir tanesi için ise %65 geri kazanım değeri saptanmıştır. Aflatoksin M 1 tayini için belirlenen yöntem kullanılarak laboratuvar koşullarında 0.1, 0.2 ve 0.5 µg/l düzeylerinde Aflatoksin M 1 ile kontamine edilen sütlerden kefir eldesinde bu toksinin kefire ve kefir tanesine geçişi incelenmiştir. Kefire geçiş oranı sırasıyla %60, 60 ve 80; kefir tanesine geçiş oranı ise sırasıyla %1.6, 2.6 ve 2.6 olarak belirlenmiştir. Depolamanın kefirdeki Aflatoksin M 1 üzerine etkisinin olmadığı belirlenmiştir. Kefirden izole edilen bakterilerin kültür ortamında Aflatoksin M 1 üzerine etkisi ile ilgili kesin bulgular elde edilememiştir. Anahtar Sözcükler: sütten kefire ve kefir tanesine aflatoksin M 1 geçişi, kefirde ve kefir tanesinde aflatoksin M 1, Aflatoxin M 1 için immunoassay teknik

vi

vii ABSTRACT DEVELOPMENT OF AFLATOXIN M 1 ANALYSIS METHOD IN KEFIR AND KEFIR GRAIN AND INVESTIGATION OF THE CARRY-OVER OF THE AFLATOXIN M 1 FROM CONTAMINATED MILK TO KEFIR AND KEFIR GRAIN KENDİRCİ, Perihan MSc in Food Engineering Supervisor: Prof.Dr. Tomris ALTUĞ September 2002, 67 Pages In this thesis, the appropriate method is developed for determination of Aflatoxin M 1 in kefir and kefir grain and the carry-over of the Aflatoxin M 1 from contaminated milk to kefir and kefir grain and changes that occur during storage are investigated. The effect of two bacteria isolated from kefir on Aflatoxin M 1 is also observed in culture medium. As the result of the experiments conducted for analysis of Aflatoxin M 1 in contaminated kefir and kefir grain, the application of immunoaffinity column with HPLC analysis technique were found as the most accurate method. The recovery values obtained by this method for kefir and kefir grain were found to be 75% and 65%, respectively. By using this method, the carry-over of Aflatoxin M 1 from milk contaminated at 0.1, 0.2 and 0.5 µg/l levels in laboratory conditions to kefir and kefir grain was investigated. The carry-over ratio of Aflatoxin M 1 to kefir in respect to the contamination levels (0.1, 0.2 and 0.5 µg/l) were found to be 60, 60 and 80%, whereas they were dedected as 1.6, 2.6 and 2.6% in kefir grain. It was also determined that there wasn t any effect of storage of Aflatoxin M 1 level in kefir. There weren t precise results which indicate the effect of bacteria on Aflatoxin M 1 in cultured medium. Key Words: carry-over of Aflatoxin M 1 from milk to kefir and kefir grain, Aflatoxin M 1 in kefir and kefir grain, immunoassay technique for Aflatoxin M 1

viii

ix TEŞEKKÜR Değerli önerileri ve yönlendirici katkılarıyla bu çalışmanın her aşamasında bana destek veren değerli hocam Sayın Prof. Dr. Tomris ALTUĞ a, Vermiş oldukları maddi destek ile bu çalışmanın yürümesini sağlayan Araştırma Fon Saymanlığına, Bu çalışmada kullandığım immunoaffinity kolonları ve Aflatoksin M 1 standardını ve konu ile ilgili her türlü yardımı sağlayan Sincer Dış Ticaret A.Ş. ye, Kefir üretiminde hammadde olarak kullandığım kefir tanelerini sağlayan ve çalışmamın özellikle kefir ile ilgili bölümlerinde yardımlarını esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Cem KARAGÖZLÜ ye, Gereksinim duyduğum her anda yanımda ve arkamda olduğu duygusunu uyandırarak manevi desteğini her zaman hissettiğim Yrd. Doç. Dr. Yeşim ELMACI ya, Umutsuzluğa düştüğüm her an arkamda olan ve desteklerini esirgemeyen değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Kemal DEMİRAĞ a ve arkadaşım Murat ZORBA ya, Tüm tez çalışmam boyunca bana vermiş oldukları sonsuz destek, özveri ve anlayış için sevgili aileme, içtenlikle teşekkürlerimi sunarım. Perihan KENDİRCİ

x

İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET...v ABSTRACT... vii TEŞEKKÜR...ix ŞEKİLLER DİZİNİ... xiii ÇİZELGELER DİZİNİ...xiv KISALTMALAR DİZİNİ...xv 1 GİRİŞ...1 2 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR...7 2.1. Aflatoksin M 1 İle İlgili Genel Bilgiler...7 2.2. Kefir İle İlgili Genel Bilgiler...10 2.3. Aflatoksin M 1 Tayin Yöntemleri...16 2.4. Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksinler İle İlgili Çalışmalar...21 3 MATERYAL VE METOD...26 3.1. Materyal...26 3.2. Metod...26 3.2.1. Kefir üretimi...26 3.2.2. Sütte Aflatoksin M 1 Tayini İçin Gerçekleştirilen Deneme...27 3.2.2.1. İmmunolojik yöntem...27 3.2.3. Kefirde Aflatoksin M 1 Tayininin Geliştirilmesi Amacıyla Yapılan Denemeler...28 3.2.3.1. I. Yöntem...29 3.2.3.2. II. Yöntem...31 3.2.3.3. III. Yöntem...33 3.2.3.4. IV. Yöntem...35 3.2.4. Kefir Tanesinde Aflatoksin M 1 Tayininin Geliştirilmesi Amacıyla Yapılan Denemeler...37 xi

xii İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 3.2.4.1. I.Yöntem...37 3.2.4.2. II. Yöntem...37 3.2.5. Sütten Kefire ve Kefir Tanesine Aflatoksin M 1 Geçişinin Belirlenmesi Amacıyla Sütün Kontaminasyonu...38 3.2.6. Kefirin Depolanması...38 3.2.7. Kefirden Elde Edilen Bakteri İzolatlarının Aflatoksin M 1 İle Etkileşimlerinin Besiyerinde İncelenmesi...38 3.2.7.1. Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonu, Saflaştırılması, Etkili Laktik Asit Bakterilerinin Tanımlanması...38 3.2.7.2. Laktik Asit Bakterilerinin Aflatoksin M 1 İle Kontamine Olan Besiyerinde Geliştirilmesi...39 3.2.7.3. Aflatoksin M 1 Analizi...40 4 BULGULAR VE TARTIŞMA...41 4.1. Süt, Kefir ve Kefir Tanesinde Aflatoksin M 1 Tayini İçin Uygun Yöntemin Belirlenmesi İle İlgili Bulgular...41 4.2. Sütten Kefire ve Kefir Tanesine Aflatoksin M 1 Geçişi...44 4.3. Depolama Denemeleri İle İlgili Bulgular...46 4.4. Bakteri İzolatları İle Besiyerinde Gerçekleştirilen Analizler İle İlgili Bulgular...47 5 SONUÇ...49 KAYNAKLAR DİZİNİ...52 EKLER...59 ÖZGEÇMİŞ...67

xiii ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa 1.1 Aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2, M 1 ve M 2 nin kimyasal yapıları...2 2.1 İmmunoaffinity kolonların çalışma ilkesi...18

xiv ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge Sayfa 1.1 Aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2, M 1 ve M 2 nin bazı fiziko-kimyasal Özellikleri...2 1.2 Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine göre gıdalarda bulunmasına izin verilen aflatoksin miktarları...3 1.3 Kefirin mikrobiyolojik yapısı...5 2.1 Kefirin bileşimi...12 2.2 Kefirin çeşitli hastalıklarda alternatif tedavi yöntemi olarak kullanımı ile ilgili öneriler...15 4.1 Süt, kefir ve kefir tanesinde farklı analiz yöntemleri ile elde edilen geri kazanama değerleri...41 4.2 0.1, 0.2 ve 0.5 ppb düzeyinde kontamine edilen sütten kefir üretiminde kefire ve kefir tanesine Aflatoksin M 1 geçiş düzeyleri...44 4.3 Kontamine süt kullanılarak elde edilen kefirlerin buzdolabı koşullarında (+4 C) 10 günlük depolanması süresince Aflatoksin M 1 içeriklerinde gözlenen değişimler...46 4.4 Besiyerinde gerçekleştirilen analizler ile ilgili bulgular...48

xv SİMGELER VE KISALTMALAR Simgeler Açıklama C Santigrad derece dk Dakika g Gram kg Kilogram l Litre ml Mililitre ppb Milyarda bir kısım ppm Milyonda bir kısım RSD R Yenilenebilirlik açısından relatif standard sapma RSD r Tekrarlanabilirlik açısından relatif standard sapma v/v hacim/hacim µg Mikrogram µl Mikrolitre Kısaltmalar AT CMO E.Ü. ELISA IDF ISO İTK RIA TGKY TS TSE YBSK YPİTK Avrupa Topluluğu Karboksi Metil Oksim Ege Üniversitesi Enzim Bağlı Radyo İmmunosorbent Analiz Uluslararası Süt Federasyonu Uluslararası Standardizasyon Örgütü İnce Tabaka Kromatografisi Radyo İmmunoanaliz Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği Türk Standardı Türk Standardları Enstitüsü Yüksek Basınç Sıvı Kromatografisi Yüksek Performans İnce Tabaka Kromatografisi

1 GİRİŞ Aflatoksinler Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus adı verilen küflerin bazı suşları tarafından üretilen toksik maddeler olup uygun sıcaklık ve nem koşullarında pek çok gıda için kontaminasyon kaynağı oluşturmaktadırlar. Aflatoksinler ilk kez 1960 yılında İngiltere deki bir çiftlikte yer fıstığı küspesi ile beslenen hindilerin ölümü ile keşfedilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda yemlerde A. flavus küfü saptanmış ve bu küfün neden olduğu zehirlenmelerin önceleri X Hastalığı olarak bilinen hastalıkla aynı belirtileri gösterdiği belirlenmiştir. Söz konusu küfün oluşturduğu mikotoksinlere Aflatoksin adı verilmiştir (Goldblatt 1969;Yaygın ve Demiryol, 1980; Ueno, 1987). Gıdalardaki aflatoksinler mavi ve yeşil floresans verme özelliklerine göre B 1, B 2, G 1 ve G 2 olmak üzere dört temel bileşik halinde bulunurken aflatoksin B 1 ve B 2 nin vücuttaki metabolitleri olan aflatoksin M 1 ve M 2 süt toksini olarak bilinmektedirler. Şekil 1.1 de aflatoksinlerin kimyasal yapıları, Çizelge 1.1 de ise bazı fizikokimyasal özellikleri verilmektedir Aflatoksinlerin sıçanlarda karaciğer kanseri oluşturma potansiyeli en yüksek olan maddeler olduğu bilinmektedir. Bir kıyaslama yapmak gerekirse sıçanlar için kanserojen bir madde olan sakkarinin kanser oluşturma potansiyeli aflatoksin B 1 den 50 milyon kat daha azdır (Jones, 1992). Aflatoksin B 1 ile kontamine besinleri tüketen memeliler bu toksini 4-hidroksi metaboliti şekline dönüştürüp süt yolu ile vücutlarından uzaklaştırırlar. Söz konusu metabolit süt toksini veya Aflatoksin M 1 olarak bilinmektedir. Aflatoksin B 1 li yem tüketen hayvanların sütlerinde aflatoksin M 1 e rastlanmış ve bu maddenin aflatoksin B 1 ile benzer toksisite gösterdiği bulunmuştur. Hayvanın yemle aldığı aflatoksin B 1 in yaklaşık % 0.35 ile %3 arasındaki düzeylerde sütte aflatoksin M 1 e dönüştüğü bilinmektedir. Aflatoksin M 1 süt ve süt ürünlerinde stabil olup pastörizasyondan etkilenmediği için bir kontaminasyon durumunda süt tüketen kişilerin ve özellikle bebeklerin sağlığı açısından riskli durumlar ortaya çıkabilmektedir (Galvano et al., 1996).

2 Şekil 1.1: Aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2, M 1 ve M 2 nin kimyasal yapıları (Hussein ve Brasel, 2001) Çizelge 1.1: Aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2, M 1 ve M 2 nin bazı fizikokimyasal özellikleri (Bahar,1996) Aflatoksin Molekül formülü Molekül ağırlığı Kristalleri Erime noktası ( C) B 1 C 17 H 12 O 6 312 Soluk sarı 267 Mavi UV altında floresans özelliği B 2 C 17 H 14 O 6 314 Beyaz, iğnesiz G 1 C 17 H 12 O 7 328 Renksiz, iğnesiz G 2 C 17 H 14 O 7 330 Renksiz, iğnesiz M 1 C 17 H 12 O 7 328 Renksiz, düzlem M 2 C 17 H 14 O 7 330 Renksiz, düzlem 303-306 Mavi 257-259 Yeşil 237-240 Yeşil 299 Mavi 293 Mavi

Aflatoksinler insanlar da dahil olmak üzere pek çok hayvan türünde kanserojenik, mutajenik ve teratojenik etki göstermektedirler. Aflatoksin B 1 ile kontamine olan gıdaları tüketen süt sığırlarının sütleriyle bir miktar Aflatoksin M 1 salgılanmaktadır. Avrupa Topluluğu (AT) sütteki yüksek Aflatoksin M 1 kontaminasyonunun önlenmesi amacı ile gıdalardaki Aflatoksin B 1 miktarı düzenlemişlerdir. AT tarafından yapılan düzenleme ile 1984 yılında hayvan yemlerinde bulunabilecek maksimum Aflatoksin B 1 miktarı 10µg/kg olarak belirlenmiş olup, Aralık 1991 de bu miktar 5µg/kg a düşürülmüştür. Aflatoksin B 1 miktarı ile ilgili olarak yapılan bu düzenleme Aflatoksin B 1 in Aflatoksin M 1 e oransal dönüşümü göz önüne alınarak belirlenmiştir (Veldman et al., 1992). Ülkemizde 1990 yılına kadar aflatoksinlerin gıdalarda bulunma miktarları ile ilgili bir sınır belirtilmemiştir. 1990 yılında o dönem bakanlıklarından Tarım Orman Bakanlığının çıkardığı aflatoksin kontrolüne dair tebliğ ile gıda maddeleri, çocuk mamaları, tarım ürünleri ve hayvan yemleri için izin verilen maksimum aflatoksin miktarları belirlenmiştir (Altuğ ve Elmacı, 1995). 1997 yılında ise Türk Gıda Kodeksi ile gıdalarda bulunmasına izin verilen maksimum aflatoksin miktarları yeniden düzenlenmiş olup çizelge 1.2 de gösterilmektedir. 3 Çizelge 1.2. Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine göre gıdalarda bulunmasına izin verilen aflatoksin miktarları (TGKY, 1997) Madde Gıda maddesi Aflatoksin B 1 Baharatlar 0.005 Aflatoksin B 1 Hububatlar 0.002 Aflatoksin B 1 Hububat unları 0.002 Aflatoksin B 1 Tüm gıda maddeleri 0.005 Aflatoksin M 1 Peynir 0.00025 Aflatoksin M 1 Süt ve süt ürünleri 0.00005 Aflatoksin M 1 Bebek mamaları ve 0.00002 devam formülleri Aflatoksinler Bebek gıdaları ve 0.00001 (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) Aflatoksinler (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) hazır karışımlar Tüm gıda maddeleri 0.010 Kabul edilebilir en yüksek değer (mg/kg)

4 Kefir çok eski bir geçmişi olan özellikle Kafkasya da, bazı Orta Doğu ve Avrupa ülkelerinde üretilen hafif alkollü, ekşi ve köpüklü bir süt içkisidir. Söz konusu içeceğin sindiriminin kolaylığı, serinletici ve iştah açıcı niteliği, ve bazı hastalıkları iyileştirici etkisi hem tüketiminin artmasına neden olmuş hem de çok sayıda araştırıcının ilgisini üzerine toplamıştır (Ergüllü ve Üçüncü, 1993). Kefir yapımı basit olduğu gibi hammadde olarak her çeşit çiğ ya da pastörize süt (inek, koyun, keçi vb.) ve hatta peynir suyu kullanılabilmektedir (Kaptan,1982). Kefir üretiminde kullanılan kefir taneleri beyazımsı renkte, karnabahara benzer yapıda, bezelye ya da fındık büyüklüğündedir. Kefir taneleri kazein ve birbirleriyle ortaklaşa yaşayan mikroorganizmaların meydana getirdiği jelatinimsi kolonilerden oluşmuştur. Sütü fermente edici rol oynayan kefir taneleri basit olarak süt proteini, maya, küf, bakteri ve süt yağının bir bileşimidir. Tanenin en önemli özelliği fermantasyon sonunda süzülerek geri alınması ve tekrar tekrar kullanılabilmesidir Kefir tanesinde genel olarak bulunan mikroorganizmalar; laktik asit bakterileri, asetik asit bakterileri, laktozu fermente eden ve edemeyen çeşitli mayalardır. Mikroorganizmaların çeşit ve miktarları taneden taneye değişmekle beraber genel olarak bulunanlar; Lactococcus lactis, Lactobacillus brevis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus caucasicus, Leuconostoc kefir, Saccharomyces torulopsis, Saccharomyces carlbergensis, Saccharomyces kefir, Torula kefir ve Saccharomyces fragilis olarak sayılabilir (Karagözlü, 1990). Toklu (1999) ise kefirde bulunan mikroorganizmaları çizelge 1.3 de görüldüğü şekilde sınıflandırmaktadır. Kefir taneleri ıslak veya kuru saklanabilmektedir. Basit bir saklama yöntemi kefir üretiminde kullanılmış olan tanelerin su ile yıkanması ve oda sıcaklığında kurutulması olarak bildirilmektedir. Ancak bu yöntem tanelerin kontamine olmasına ve kommensal floranın değişmesine neden olabilmektedir. Dondurarak kurutma yöntemi çok daha iyi bir sistemdir. Kültür, toz veya küçük kristaller şeklinde saklanmakta iki üç ara kültür eldesinden sonra kefir taneleri ortamda gelişmeye başlamaktadırlar. Bunun dışında, yıkanan tanelerin steril bir ortamda süspansiyon halinde buzdolabı sıcaklığında birkaç ay aktivitelerini kaybetmeden saklanması mümkün olabilmektedir (Tamime, 1990). Sağlık açısından önemli yararları olan kefirin tüberküloz, hazım bozuklukları ve kanser üzerinde olumlu etkiler gösterdiği belirlenmiştir.

Mide iltihapları, depresyon, karaciğer ve safra hastalıkları, enfeksiyonlar, sarılık, iç ve dış urlar, kronik bağırsak iltihapları, egzama, atardamar problemleri, yüksek tansiyon, ishal ya da kabızlık gibi pek çok hastalığın tedavisinde diyet tamamlayıcı olarak kullanıldığında iyileştirme sürecini hızlandırdığı bilinmektedir (Koçak ve Gürsel, 1981). 5 Çizelge 1.3: Kefirin mikrobiyolojik yapısı (Toklu,1999) Mikroorganizma Çoğunlukla bulunan türler Karakteristiği Lactobacilli Lb. brevis, Lb. kefir Lb. kefir içilecek kefirde 8x10 7 mo/g oranında iken tanede 9x10 7 mo/g oranında bulunur. Lactococci Leuconostoc Streptococci Asetik asit bakterileri Mayalar Lb. paracasei subsp. Paracasei, Lb. plantarum, Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. kefiranofaciens Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis var. diacetylactis, Lc. lactis subsp. Cremoris Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides, Ln. mesenteroides subsp. dextranicum, Ln. mesenteroides subsp cremoris, Ln. lactis S. thermophilus, Acetobacter aceti, Acetobacter rasens Laktozu fermente edemeyenler: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces unisporus Laktozu fermente edenler: Candida kefir, Kluyveromyces marxianus var. marxianus Kefir tanesinde 10 9 mo/g oranında iken içecekte bu oran 2x10 7 dir. Taneden ve içecekten değişik oranlarda (10 8-10 9 mo/g) izole edilmiştir. Inkübasyonun ilk 1. saatinde hızlı asitlik gelişimini sağlar. Yüksek asitlik değerlerinde inhibe olur. Lactococlarla birlikte anılırlar. Taneden ve içecekten izole edilmiştir. Tat ve aroma oluşumuna katkısı vardır. Genellikle bulunur. Tane mikro florasında simbiyosis sağlar. Kefirin viskozitesini arttırır. Tanede maya oranı 10 5-6 x10 7 mo/g, içilecek kefirde maya oranı 2x10 4-7 x10 5 mo/g dır. Mayaların çoğunluğu laktozu fermente edemeyen mayalardır. Simbiyosise katkısı vardır. CO 2 oluşumundan sorumlu olduğu gibi kefirin karakteristik tat ve aromasını da verir.

6 Kefir içinde yer alan mikroorganizmalar ile kültür ortamında yapılan çalışmalar (Karunatre et al.. 1990; Luchese ve Harrigan 1990; Gourama ve Bullerman 1995; Pierides et al. 2000), bu mikroorganizmaların aflatoksin degradasyonuna neden olduğunu göstermiştir. Organizmaların besiyerinde gösterdikleri bu degrade edici özelliğin kefir tanesi içindeki simbiyoz yaşamda da sürebileceği, kefir eldesi sırasında sütte bulunan aflatoksinlerin inhibe edilebileceği düşünülmektedir. Bu nedenle çalışmamızda kontamine sütlerden kefire ve kefir tanelerine Aflatoksin M 1 geçişinin araştırılması planlanmıştır. Bu amaçla Aflatoksin M 1 ile kontamine edilmiş kefirde söz konusu toksinin analizi için çeşitli kimyasal yöntemler denenmiş ve geri kazanımlarına bakılarak en uygun yöntem belirlenmeye çalışılmıştır. Aflatoksin M 1 tayini için uygun yöntemin belirlenmesinden sonra, laboratuvar koşullarında Aflatoksin M 1 ile kontamine edilen sütten kefir eldesinde bu toksinin kefire ve kefir tanesine geçişi ve depolama sırasında değişimi incelenmiştir. Çalışmada ayrıca kefirden izole edilen iki bakterinin kültür ortamında Aflatoksin M 1 üzerine etkisi de araştırılmıştır.

7 2 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1 Aflatoksin M 1 İle İlgili Genel Bilgiler Mikotoksin ifadesi Yunanca da küf anlamına gelen mykes ve latincede zehir anlamına gelen toxicum kelimelerinden türetilmiştir. Günümüzde mikotoksin terimi, bazı küf türleri tarafından üretilen ve tüketildiğinde insan ve hayvanlarda hastalıklara veya ölümlere neden olan maddeler olarak tanımlanmaktadır. Mikotoksinlerin tüketilmesi ile oluşan hastalıklara ise mikotoksikosiz adı verilmektedir. Mikotoksin oluşumu fungal gelişme ile yakından ve sıkı bir bağlantı içindedir. Vejetatif büyümeden oldukça sonra, küflerin ölümünün ardından toksinler ortamda kalmaya devam edebilirler. Mikotoksinler üremenin logaritmik fazın sonlarında veya duraklama fazının başlangıcında üretilen ikincil metabolitlerdir (Lang and Lang, 1973). Aflatoksin oluşumu daha çok yerfıstığı, Brezilya kestanesi, ceviz, badem, fındık, antep fıstığı, pamuk tohumu, sorgum (bir çeşit darı), milet (akdarı) ve incir gibi bitkisel ürünlerde gözlenmektedir. Hayvansal ürünlerde ise aflatoksin gelişimine daha az rastlanmaktadır. Hayvansal gıdalarda aflatoksin açısından ana kaynak hayvanın toksik yem tüketmesi durumunda kalıntının geçtiği süt ve hayvansal dokulardır. Bazı bitki ve baharatlar antifungal (küf gelişimini önleyici) özelliklere sahip olup mikotoksin üremesine izin vermezler, ancak çoğu gıda küf gelişimine ve mikotoksin oluşumuna olanak sağlamaktadır. Peynir, kürlenmiş et ürünleri ve soya fasulyesi gibi bazı gıdalar mikotoksin oluşumuna daha az olanak sağlamaktadır. Kuraklık etkisi, böcek hasarı ve kimyasal hasarlar A.flavus ve diğer küf türlerinin yer fıstığı, pamuk tohumu ve diğer tohumları kontamine etmesini kolaylaştırmakta ve hızlandırmaktadır. Sulama sistemleri ile kuraklığın önlemesi, böcek hasarlarının ve mekanik hasarların minimizasyonunu sağlanmak suretiyle bazı önlemler alınabilmektedir. Hasat öncesi A.flavus üremesine karşı dayanıklı yer fıstığı çeşitleri ve mısır hibritlerinin geliştirilmesi de kontrol yöntemi olarak önerilmektedir. Mikroorganizma rekabeti küf gelişiminin ve mikotoksin oluşumunun kısıtlanmasını sağlamaktadır. Oksijen konsantrasyonunun (<%1) düşürülmesi ve/veya diğer gazların konsantrasyonlarının arttırılması (örneğin >%90 CO 2 ) küf gelişimini ve

8 mikotoksin oluşumunu zayıflatabilmektedir. Küf gelişimi ve mikotoksin oluşumunun kontrolünde antimikrobiyal maddeler de kullanılabilmektedir. Sorbik asit, potasyum sorbat, propiyonik asit ve propiyonatlar geniş bir spektrumda benzoatlardan daha etkili antimikrobiyal özellik göstermektedirler. Ayrıca sodyum diasetat ve BHA (bütillendirilmiş hidroksi anisol) gibi diğer maddeler de antifungal aktiviteye sahiptirler. Tarçın, karanfil ve hardal gibi bitki ve baharatlar, normal kullanım düzeylerinde katıldıklarında da yeterli antifungal aktivite sağlayabilmektedirler. Sodyum hipoklorit, potasyum permanganat, hidrojen peroksit ve sodyum perborat, amonyak, kükürt dioksit ve sülfitler gibi birçok oksidasyon ajanı aflatoksin ile reaksiyona girerek yapısını değiştirmektedirler (Bullerman et al., 1984; Ueno, 1987; Altuğ vd., 1990; İçibal ve Altuğ, 1992; Elmacı ve Altuğ, 1994; Altuğ ve Elmacı, 1995; Özer ve Altuğ, 1985). Gıdada aflatoksin oluşturan küflerden A.flavus un üremesi için %85 bağıl nem (buğday mısır %18-18.5 nem, ayçiçeği tohumu %13.5 nem) ve 0.85 su aktivitesi gerekmektedir. Genelde küfler için optimum gelişme sıcaklığı 30 ºC olmasına karşın, A. flavus 45-50 ºC a kadar üreyebilmektedir (Altuğ ve Elmacı, 1995). Aflatoksinin organizma üzerindeki etkisinin, hücre çekirdeğindeki DNA ile birleşip m-rna oluşumunu etkilemesi olduğu bilinmektedir. Bunun sonucu olarak da 5-10 dakika içinde protein sentezi bloke edilmekte ve mitoz bölünme aşaması gerçekleşmediğinden hücre ölmektedir. Bazı hayvanlar aldıkları aflatoksini karaciğerlerinde metabolize ederek daha toksik maddelere dönüştürürler. Böyle hayvanların aflatoksine duyarlılığının fazla olduğu gözlenmiştir. Aflatoksin zehirlenmelerinde plazmadaki enzimlerin düzeylerinde artış olmasına karşın karaciğer enzimlerinin aktivitelerinde azalmalar olmaktadır. Aflatoksinler temel vitamin metabolizmasına da zarar verirler. A vitamininin depo edilmesini engellerler, kanda ise Mg, P ve Ca düzeylerinde azalmalara neden olurlar (Yaygın ve Demiryol, 1980). Aflatoksine doğrudan veya kontamine yem tüketmiş hayvanlardan elde edilen gıdaları tüketerek maruz kalan kişilerde hepatik ve ekstrahepatik kanserojen olgular gözlenmiştir. Ayrıca aflatoksinlerin çocuklarda protein enerji malnutrisyonu sonucu ortaya çıkan Kwashiorkor hastalığı ile de ilişkili olduğu bulunmuştur (Rustom,1997). Aflatoksinler deney hayvanlarında hepatokanserojen olarak iyi bilinmekte ve gıdaların aflatoksin ile kontaminasyonu insan ve hayvan sağlığında ciddi problemlere neden olmaktadır. A. flavus çoğu gıdanın ve

hayvan yeminin aflatoksin ile kontaminasyonundan sorumlu olsa da aslında yalnızca A. flavus un bazı türleri bu toksik metaboliti üretmektedir (Ueno, 1987). Hayvanın yemle aldığı aflatoksin B 1 in sütte aflatoksin M 1 e dönüşüm oranı %0.35-3 arasında değişmektedir (Yaygın ve Demiryol, 1980). Aflatoksin M 1 süt ve süt ürünlerinde stabil olup pastorizasyondan etkilenmediği için bir kontaminasyon durumunda süt tüketen kişilerin ve özellikle bebeklerin sağlığı açısından riskli durumlar ortaya çıkabilmektedir (Altuğ ve Elmacı, 1995; Galvano et al., 1996). Tüketilebilir hayvansal dokulardan insan diyetine geçen aflatoksin kalıntıları açısından en büyük potansiyele sahip olan süt ve süt ürünleri, bebek ve çocukların da ana besin kaynağı olduğundan bu ürünlerde aflatoksin M 1 oluşumu büyük önem taşımaktadır (Galvano et al., 1998). Süt ürünlerinde mikotoksin; hayvanların tükettiği yemlerin kontaminasyonu (indirekt kontaminasyon), veya süt ürünlerinin küf ile kontaminasyonu sonucunda mikotoksin oluşumu (direkt kontaminasyon) sonucu bulunabilmektedir (Barrıos et al., 1996; Yaygın ve Demiryol, 1980). İndirekt kontaminasyonda Aflatoksin B 1 in vücuda alımının ardından ilk 12-24 saatte sütte Aflatoksin M 1 belirlenebilmektedir. Bir günlük ördek yavrularında LD 50 değerleri Aflatoksin B 1 için 0.24 mg/kg, Aflatoksin M 1 için ise 0.32 mg/kg olduğu halde Aflatoksin M 1 sıçanlarda ve ördek yavrularında Aflatoksin B 1 kadar toksiktir. Söz konusu toksinlerin her ikisinin de alabalık karaciğerinde benzer kanserojen etki gösterdiği belirlenmiştir (Lopez, 2001; Sinhuber 1970 den). Rothschild (1992) Aflatoksin B 1 ve Aflatoksin M 1 i insan kanserojenleri arasında sırasıyla kanserojen ve olası kanserojen olarak sınıflandırmıştır. Ayrıca Aflatoksin M 1 in Aflatoksin B 1 den 10 kat daha az kanserojen olmasına karşın yüksek genotoksik aktiviteye sahip olduğu gözlenmiştir (Lopez, 2001). 9

10 2.2 Kefir İle İlgili Genel Bilgiler Fermente süt ürünleri içerisinde bugün dünyada yoğurttan sonra en fazla tanınan kefir, çok eski çağlardan beri Kafkasya da üretilen ve buradan dünyaya yayılan sindirimi kolay, serinletici, hafif alkollü, ekşi ve köpüklü bir süt ürünüdür (Toklu, 1999, Karagözlü ve Kavas, 2000). Kefirin ne zaman ve nasıl oluştuğu kesin olarak bilinmemekle beraber, ilk kez Kafkasya da Elburus dağları eteklerinde bulunan Gaucase köyünde oluştuğu, burada yaşayan köylülerin sütleri deri tulumlar içerisinde fermentasyona bırakmaları ile airan adı verilen bir süt mamulünün elde edildiği ve yapımının gizli tutulduğu, ve Rusya da yayınlanan Kefir kitabının 1884 yılında Almancaya çevrilmesiyle bu içeceğin Avrupa ya yayıldığı görüşü hakimdir (Toklu, 1999; Ergüllü ve Üçüncü, 1983). Bir başka görüş ise kefirin kaynağının 1300 lerde Himalayalar a (şimdiki Tibet) dayandığı yönündedir (Kroger, 1993). Halen dünyada kefir tüketimi özellikle Rusya ve SSCB den ayrılan ülkeler, ABD, Macaristan, Polonya, Norveç, İsveç, İsviçre, Romanya, Finlandiya, Almanya, Brezilya, Fransa, İsrail, Lüksemburg da oldukça önemli düzeylerdedir (Toklu, 1999; Kılıç vd., 1999, Karagözlü ve Kavas, 2000). Son yıllarda da İngiltere ve Japonya da etnik bir içecek olarak önem kazanmıştır (Toklu, 1999). Ülkemizde endüstriyel boyutta kefir üretimi yapılmamaktadır. Ancak bu içecek geleneksel üretim yolu ile evlerde bireysel olarak üretilmekte ve tüketilmektedir (Kılıç vd., 1999). Kefirin bileşiminde %0.5-1.5 etil alkol, %0.6-0.8 süt asidi ve %50 CO 2 (hacimsel olarak) bulunmaktadır. Sindiriminin kolaylığı, serinletici ve iştah açıcı niteliği ve bazı hastalıklardaki iyileştirici etkisi bu içeceğin hem tüketiminin artmasına neden olmuş, hem de çok sayıda araştırıcının ilgisini üzerinde toplamıştır (Ergüllü ve Üçüncü, 1983; Karagözlü ve Kavas, 2000). Kefirleri asit, alkol ve CO 2 içeriklerine göre; zayıf kefir (asit, alkol ve CO 2 açısından fakir), orta sert kefir, sert kefir ve çok sert kefir (asit ve alkolce zengin, CO 2 miktarı fazla, dolayısıyla çok köpüklü) diye sınıflandırmak da mümkündür. Tatlı kefir 24 saatlik, orta sert kefir 48 saatlik, sert kefir 3 günlük, çok sert kefir de daha uzun süre fermantasyon sonucu yapılabilmektedir. Çok sert kefirde laktoz oranı %75 oranında azalma göstermektedir. Bu kefir türlerinin dışında ekşi süt kefiri, kefir sodası, glikozlu kefir ve peynir suyu kefiri gibi değişik özellikte ürünler de bulunmaktadır (Kaptan, 1982; Koçak ve Gürsel. 1981; Üçüncü, 1980).

Kefir üretiminde kültür olarak kullanılan kefir taneleri, Kafkasya da keçi tulumu içinde, inek sütünün dana ve koyun şirdenleri ile pıhtılaştırılması sonucunda elde edilmektedir. Pıhtılaştırmanın yapıldığı tulumun iç yüzeyinde birkaç hafta sonra oluşan süngerimsi bir kabuk tabakası alınmakta ve bölünerek kurutulmaktadır. Kuruma sonunda oluşan küçük topaklar kefir taneleridir (Koçak ve Gürsel. 1981). Bazı Müslüman bölgelerde Peygamber Darısı olarak adlandırılan kefir taneleri; sarımtırak-beyaz renkte, çapı 1-2 mm den 3-6 mm ye kadar değişen karnabahar veya patlamış mısır görünümündedir. Yüzeyi pürüzlü ve helezonik yapıdaki kefir taneleri suda erimezler ancak süte atıldıkları zaman şişerler ve renkleri beyazlaşır. Kefir tanelerinin bulunduğu ortamın önemli bir bölümü suda çözünen ve kefiran olarak adlandırılan eşit miktarda glikoz ve galaktozdan oluşan polisakkarit bir tabaka ile kaplıdır. İyi bir kefir tanesi elastiki yapıda olmalı, yapışkan ve yumuşak olmamalıdır, ve tanenin polisakkaritten meydana gelmiş ve içerisinde bir miktar kazein ile yağ bulunduran bir özellik taşıması gerekmektedir. Tane içerisinde bulunan mikroorganizmalar simbiyoz bir yaşam sürdürmekte ve süt içerisine bırakılan taneden, immobilize bir sistemle süt içerisine mikroorganizmalar geçebilmektedir. Taneden süte geçen mikroorganizma türleri içinde süt asidi bakterileri, asetik asit bakterileri ile mayaların bulunduğu saptanmıştır. Laktozu fermente edemeyen mayalar tanenin daha iç kısımlarında, laktozu fermente edenler ise, tanenin daha yüzeyinde bulunmakta ve tane yüzeyinde de laktik asit bakterileri ile asetik asit bakterileri yer almaktadır. Ancak konuyla ilgili olarak yapılan farklı araştırmalarda, tane yapısında bulunan mikroorganizma türlerinin, birbirlerine olan oranlarıyla sayılarının, tanelerin orijinine ve kullanım şartlarına göre değiştiği belirlenmiştir (Karagözlü ve Kavas, 2000; Toklu, 1999; Kroger, 1993; Tavlaş, 1986; Liu ve Moon, 1983; Ergüllü ve Üçüncü, 1983; Koçak ve Gürsel, 1981; Üçüncü, 1980). Kefir, genellikle inek, koyun ve keçi sütlerinden üretilmektedir. Laktik asit ve alkol fermantasyonlarının bir arada yürümesi sonucunda oluşan kefir, sindirimi kolay, ferahlatıcı ve iştah açıcı özelliklerinin yanı sıra bazı hastalıklara da iyi gelen ve içerdiği CO 2 nedeniyle de köpüren bir özelliğe sahip olan bir içecektir (Karagözlü ve Kavas, 2000). Tane içindeki mikroorganizmaların proteolitik aktiviteleri kefirin reolojik özellikleri ile çeşitli miktar ve türde tat ve aroma sağlamaktadır (Kılıç vd., 1999). Sütün içindeki tüm besleyici ögeleri içermesi nedeniyle yüksek beslenme değerine sahip olan kefirin bileşimi çizelge 2.1 de verilmektedir. 11

12 Çizelge 2.1: Kefirin bileşimi (Karagözlü, 1990) Bileşim Yüzde değeri Bileşim Yüzde değeri Kuru madde 11.63 Kül 0.69 Yağ 2.80 Asitlik (SH) 39.26 Protein 3.57 Alkol (ppm) 1365 Laktoz 3.35 Asetaldehit (ppm) 29.5 Kefir taneleri tercihen 18-22 C de süt içerisinde gelişimlerine izin verildiğinde, taneden süt içine dağılan mikroorganizmalar sütte asit, lezzet, diğer metabolitler ve ikincil yapısal değişimler oluştururlar. Böylece kefir tanelerinin kütlesi bir dereceye kadar artar ve daha fazla ana kültür eldesi için bölünebilirler. Tanelerden uzaklaştırılmış kefir inokulum olarak kullanılabilmekte, ancak mikroorganizmaların orijinal dengesi karıştığı için sonraki inokulasyonlarda kabul edilebilir bir ürün eldesinde başarılı olamamaktadır (Kroger, 1993). Kefir tanesinde farklı patojen mikroorganizmaların yaşamsal aktivitelerinin belirlenmesi ile ilgili olarak yapılan çalışmalarda, koliform grubu bakterilerinin doğal olarak kefir mikroflorası tarafından inhibe edildiği, ayrıca Shigella ve Salmonella gibi patojen mikroorganizmaların da kefir saf kültürü ile birlikte üreyemedikleri belirlenmiştir. Söz konusu patojenlerin üreyememeleri ile ilgili nedenlerin, kefir fermantasyonu sırasında meydana gelen biyokimyasal olaylar ile ilgili olduğu belirlenmiş ve söz konusu biyokimyasal olaylar araştırmacılar tarafından şu şekilde sıralanmıştır; - Laktozdan laktik asit oluşumu (laktik asit fermantasyonu) - Laktozdan etil alkol ve CO 2 oluşumu (alkol fermantasyonu) - Kefire özgü tipik mayayı andırır kefir aroması oluşumu - Sınırlı ölçüde proteinin pepton ve aminoasitlerle parçalanması (yavaş proteoliz) (Karagözlü ve Kavas, 2000; Toklu, 1999). Geleneksel kefir üretiminde çiğ ya da pastörize süt kullanılmakta ve süt 5 dakika kaynatılarak 20-25 C ye soğutulmaktadır. Üretim paslanmaz çelik veya cam bir kavanozda yapılmakta, bakır ile alüminyum tencere gibi kapların kesinlikle üretimde kullanılmadıkları görülmektedir. Kaynatılmış ve belirli sıcaklığa kadar soğutulmuş süt

içerisine %3-5 oranında kefir tanesi ilave edilerek ağzı hava alacak ancak toz, sinek gibi kontaminasyon kaynakları bulaşmayacak şekilde kapatılmaktadır. 20-25 C de yaklaşık 18-24 saat süren fermantasyon sonucunda kefir oluşmakta ve bu sırada kefirin ph sı 4.7 civarına ulaşmaktadır. Bu süre boyunca kefirin sık sık karıştırılması gerekmektedir. Fermantasyon sonunda kefir temiz bir süzgeç ile süzülmekte ve süzgeçte kalan kefir taneleri tekrar kullanılabilmektedir. Süzüntü bir süre buzdolabında bekletilip olgunlaştırılmakta ve daha sonra da tüketici tercihine göre soğuk olarak tüketilmektedir. Geleneksel yolla üretilen kefirlerin raf ömrü 3 gün kadardır (Karagözlü ve Kavas, 2000; Toklu, 1999). Süt endüstrisi ilerlemiş ülkelerde kefir üretimi bir endüstri niteliği taşımaktadır. Endüstriyel amaçlı kefir üretiminde, farklı yöntemler kullanılmakla birlikte, söz konusu yöntemlerin tümünde temel ilke aynı olup üretimin ilk basamağında yağlı veya yarım yağlı %8 kuru maddeli inek sütü homojenize edilmektedir. Üretimin ikinci aşamasında söz konusu süt 90-95 C de 5-10 dakikalık ısıl işleme tabi tutulmakta ve daha sonra da 18-24 C ye soğutulup %2-8 oranında kefir kültürü ile aşılanmaktadır. Aşılama işleminden sonra gerçekleşen inkübasyonun genellikle tankta yapıldığı ve inkübasyon süresinin 18-24 saat sürdüğü bildirilmektedir. İnkübasyon sonucunda oluşan pıhtı pompalar ile parçalanıp paketlenmektedir. Firmaların üretim proseslerine göre kefir bazen pakette 12-14 C veya 3-10 C de 24 saat olgunlaştırıldıktan sonra buzdolabı koşullarında satışa sunulmaktadır (Karagözlü ve Kavas, 2000). İyi bir kefir akıcı kıvamda homojen ve parlak bir görünümde olmalıdır. Topaklı yapı kefir için kusur sayılmaktadır. Kefir içildiği zaman hafif maya tat ve aroması hissedilmeli, serinletici bir etki göstermelidir. Kefir, 1-2 hafta buzdolabında depolanabilmekte ve depolanma sırasında asitlik, CO 2 ve alkol miktarı artmaktadır. Bu nedenle kefir; tatlı kefir, orta sert kefir, çok sert kefir olarak sınıflandırılmaktadır. Kefirin bileşimi ve kimyasal özellikleri yapımında kullanılan sütün niteliklerine, inkübasyon ve soğuk odada muhafaza süresine bağlı olarak değişmektedir.(karagözlü ve Kavas, 2000; Toklu, 1999; Koçak ve Gürsel, 1981). Kefir, içerdiği protein, mineral maddeler ve yağ miktarı açısından içme sütüne benzer özellikler göstermesinin yanı sıra; serinletici ve ferahlatıcı tadı nedeni ile süt kürlerinde süte oranla daha kolay tüketilebilmektedir. Literatürlerde kefirin organizmayı genç ve kararlı durumda tuttuğu, bazı mide ve bağırsak rahatsızlıklarını iyileştirdiği 13

14 açıklanmıştır (Toklu, 1999). Yapılan çeşitli araştırmalarda kefir tüketimi ile uzun yaşam arasında bir bağ bulunmuştur (Tavlaş, 1986). Kefirin gençlik içkisi olarak tanındığı ve su yerine içildiği Kafkasya da tüberküloz, kanser ve hazım bozukluğu gibi hastalıklara rastlanmaması ve ortalama insan ömrünün 110-130 seneye ulaşması dikkatleri çekmiştir. Yapılan araştırmalarda kefirin bu konuda önemli rol oynadığı saptanmış ve bazı hastalıkların tedavisinde başarılı bir şekilde kullanılabileceği görülmüştür. Mide iltihapları depresyon, karaciğer ve safra hastalıkları, enfeksiyon, sarılık, iç ve dış urlar, uzun süren ve kronik olan bağırsak iltihapları, egzama, kalbin atardamarları ile ilgili olan hastalıklar, yüksek tansiyon, ishal ve kabızlık bu hastalıklar arasındadır (Koçak ve Gürsel, 1981). Kefir tüketiminin beslenme sağlık açısından sağladığı yararlar arasında; bağırsak mikro florasının doğal dengesinin korunması, belirli besin ögelerinin sentezi, antikanserojenik (kanser önleyici) aktivite, laktoz intoleransının azaltılması ve serum-kolesterol seviyesinin düşürülmesi sayılabilmektedir. Bunların dışında kefirin sinirsel rahatsızlıklar, ülser, yüksek tansiyon, safra bozuklukları, bronşit ve astım gibi pek çok hastalıkta tedavi edici özelliği bilinmekte ve bu konuda klinik çalışmalar devam etmektedir (Toklu, 1999). Örneğin, dünyanın birçok yerinde kefir gastro-intestinal hastalıkların tedavisinde terapi katkısı olarak düşünülmektedir (Kroger, 1993). Kefirin ishale iyi gelmesi, Escherichia coli, Salmonella gibi patojen mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal bir etkiye sahip olmasından kaynaklanmaktadır (Tavlaş, 1986). İki günlük kefir, tereyağı ve kaba öğütülmüş buğday veya çavdardan yapılmış ekmek müzmin kabızlıkta geniş ölçüde kullanılmaktadır. Bazı ülkelerde ise kronik dizanteriden şikayet eden hastalara 3 günlük kefir reçeteleri yazılmaktadır (Üçüncü, 1980; Kaptan, 1982). Kefirin son yıllarda öne sürülen bazı yararları arasında daha iyi laktoz sindirimi, patojenik veya diğer istenilmeyen bağırsak mikroorganizmalarının kontrolü, kolon kanserinde azalma ve bağışıklık sisteminin enfeksiyonlara dayanıklılığının artması olarak sıralanabilir (Kroger, 1993). Kefirin çeşitli hastalıklarda kullanımı ile ilgili öneriler çizelge 2.2 de verilmiştir (Kaptan, 1982). Sağlığa yararları oldukça fazla olduğu bildirilen kefirin bir dezavantajı kalp hastalarının yüksek CO 2 miktarı nedeniyle bu içkiyi tüketememeleri olarak ifade edilmektedir (Üçüncü, 1980).

Çizelge 2.2: Kefirin çeşitli hastalıklarda alternatif tedavi yöntemi olarak kullanımı ile ilgili öneriler(kaptan, 1982) Hastalık Önerilen miktar (litre) Not 15 Sinirsel hastalıklar Her gün 1 litre 2-3 kere alınabilir Bronşit ve astım Her gün 1 litre Ağır vakalarda 1 yıl süreyle hastalık süresince Kabızlık ve kan Her gün 1 litre Ağır vakalarda büyükler 2 litre bozuklukları Çıbanlar Her gün 1 litre Hastalık süresince Egzama Her gün ½ litre Ayrıca hastalıklı yerler çizilmeli ve çiziklere kefir akıtılmalı Mesane hastalıkları Her gün 1 litre --- Böbrek hastalıkları Her gün 1 litre --- Yüksek tansiyon Her gün 1 litre --- Enfeksiyonlar Her gün 1 litre --- Safra bozuklukları Her gün 1 litre --- Sarılık Her gün ½ litre 12 saatlik kefir kullanılmalı Yatağa girerken alınmalı 2-4 hafta kullanılmalı

16 2.3 Aflatoksin M 1 Tayin Yöntemleri İnsan ve hayvan sağlığını tehdit eden mikotoksinlerin gıdalardan tamamen uzaklaştırılamayan doğal kontaminant maddeler olmaları nedeni ile halk sağlığı ile ilgili kurumlar söz konusu toksinlerin gıdalarda bulunma düzeyi hakkında düzenleyici kararlar almak zorunda kalmıştır. Ancak bu kararların verilebilmesi için tarama programları ve doğru sonuç veren analiz yöntemleri gerekmektedir. Bu nedenle tarama ve araştırma programlarında anahtar rolü analiz yöntemleri oynamaktadır. Mikotoksinlerin tarımsal ürünlerde ppb düzeylerinde bulunabilmeleri duyarlı ve doğru yöntemlerin geliştirilmesini zorunlu kılmıştır (Boyacıoğlu ve Gönül, 1986). Aflatoksinlerin analizi genel olarak toksinin ayrılması/ekstraksiyonu, temizleme işlemleri ve miktar belirleme aşamalarını içermektedir. Ekstraksiyon işlemi için önerilen yöntemlerin hemen hepsinde metanol-su (55:45 v/v), aseton-su (85:15), asetonitril-su (9:1), kloroform-su (kuru substratın %50 si) ve metilen di klorür-su (kuru substratın %50 si) gibi çözgen sistemleri kullanılmaktadır (Ueno, 1987). Aflatoksin ve gıdalarda bulunan diğer çevresel toksinlerin tayini için temizleme işlemi çok önemlidir. Çoğu kez lipidler tayinin son aşamalarında girişim yapıcı etkiye neden olan bileşenlerdir ve lipidlerin uzaklaştırılması için uygulanan işlemler aflatoksin ekstraksiyonunda kullanılan çözgenlere bağlıdır. Hidrofilik çözgen (metanol, aseton, asetonitril) kullanımı ile elde edilen ekstraktlardan yağ ayırma işlemi hegzan veya izooktan kullanılarak gerçekleştirilebilmektedir. Girişime neden olan maddelerin uzaklaştırılması için genellikle silikajel veya aluminyum içeren adsorbant kolonlardan yararlanılmaktadır. Florisil ve diğer adsorbantlar ise değişik yöntemlerde önerilmektedir. Bitkisel orijinli ekstraktlarda bulunan pigmentlerin analizde girişim yapması durumlarında kurşun asetat, çinko asetat ve kaprik karbonat gibi maddeler kullanılabilmektedir (Ueno, 1987). Temizlenmiş örneklerde aflatoksin tayini için yasal yöntemlerde genellikle İnce Tabaka Kromatografisi (İTK) ve Yüksek Basınç Sıvı Kromatografisi (YBSK) kullanılmaktadır. İTK nin basit ve ekonomik bir ayırma yöntemi olması nedeniyle bu yöntem pek çok ülkede rutin aflatoksin analizlerinde kullanılmaktadır. Gıdalarda ve

biyolojik sıvılarda aflatoksin tayini için ise genellikle YBSK den yararlanılmaktadır (Ueno, 1987). Süt ve süt ürünlerinde aflatoksin M 1 tayini için uygulanabilen bir çok yöntem olmasına karşın günümüzde, pek çok laboratuvarda İTK yerine YBSK tercih edilmektedir. Bunun nedeni ikinci yöntemin daha duyarlı ve doğru sonuçlar vermesinden kaynaklanmaktadır. Özellikle zıt faz YBSK aflatoksin M 1 tayininde en fazla kullanılan teknik olarak belirtilmektedir (Barrios et al., 1996). Daha kolay ve spesifik yöntemlerin araştırılmasında, poliklonal ve monoklonal antikorlar ile çeşitli immunokimyasal yöntemler aflatoksinleri de içine alan mikotoksinlerin tayini için geliştirilmiştir. Chu (1984) mikotoksinler uygulanan immünolojik analiz tekniğini gözden geçirmiş, Garner ve arkadaşları (1985) insan vücut sıvılarında aflatoksinlerin ve metabolitlerinin gözlenmesi amacı ile kullanılan verileri özetlemiştir (Ueno, 1987). Bir immünolojik analiz tekniğinin gelişimi en az dört aşama içermektedir. Bu aşamalar immünizasyon için mikotoksinlerin proteinlere bağlanması, mikotoksinlere karşı antikorların oluşumu, antikorların spesifikliğinin karakterizasyonu, ve genel tayin için spesifik antikorların uygulanması olarak sıralanabilmektedir. Mikotoksinlerin pek çoğu küçük organik moleküller olup taşıyıcı proteinlere bağlanmaları önemlidir. Bağlanma işlemi için genellikle suda çözünen karbodiimid veya karışık anhidrit yöntemi uygulanmaktadır. Aflatoksin B 1 karboksil grubu içermekte ve proteine bağlandıktan sonra karboksimetil oksim (CMO) türevi oluşturmaktadır. Bu yöntemde CMO grubu Aflatoksin B 1 ve Aflatoksin M 1 halkasındaki karbonil grubuna girmektedir. Immunoanaliz teknolojisi kısaca radyoimmunoanaliz (RIA) veya enzim-bağlı immunosorbent analiz (ELISA) olarak ikiye ayrılabilir. RIA tekniğinin uygulanması için yüksek etiketli (highly laballed) aflatoksinlere gereksinim olmakta ve radyoaktif ligantın spesifik aktivitesi RIA nın duyarlılığında çok önemli bir rol oynamaktadır. RIA nın duyarlılığı test edilecek örneklerin ekstraksiyondan sonra basit bir temizleme işlemi ile arttırılabilmektedir. Genelde, mikotoksinler için ELISA nın duyarlılığı saf mikotoksinler kullanıldığında RIA ya göre yaklaşık 10-100 kat daha fazla olup bu yöntemde radyoaktif maddelerin kullanımı pratikte büyük avantaj sağlamaktadır (Ueno, 1987). 17

18 Günümüzde mikotoksin analizlerinde immunolojik yöntemlerden tayin öncesi saflaştırma ve ekstraksiyon aşamalarında yararlanılmaktadır. Bu amaçla geliştirilen imünoafiniti kolonlar genellikle monoklonal antikorlardan oluşmakta ve analiz edilen toksini bağlamaktadırlar. Kolondan geçirilen örnek içindeki toksin kolon içindeki antikorlar tarafından tutulmakta, daha sonra kolondan uygun bir çözgen geçirilerek geri alınabilmektedir. İmünoafiniti kolonların çalışma ilkesi şekil 2.1 de şematize edilmektedir. örnek yıkama elüsyon Yarı kantitatif Diğer YBSK İTK Mikotoksinler Diğer maddeler Şekil 2.1: İmünoafiniti kolonların çalışma ilkesi (Rhone Diagnostatics seminer notlarından) Hansen (1990) çiğ sütte bulunan Aflatoksin M 1 in imünoafiniti kolon saflaştırmasından sonra direkt olarak floresans miktar tayini üzerinde çalışmıştır. Söz konusu çalışmada kontamine edilen sütün yağı uzaklaştırıldıktan sonra, süt Aflatoksin saflaştırması amacıyla doğrudan imünoafiniti kolondan geçirilmiştir. İşlem sonrasında kolon su ile yıkanmış ve metanol kullanılarak kolonda tutulmuş olan Aflatoksin M 1 geri alınmıştır. Elde edilen ekstrakt florimetrede analizlenerek miktar belirlemesi yapılmıştır. Denemeler sonucunda 0.05-0.5 ppb düzeylerinde %97 geri kazanım elde edilmiştir. Düşük konsantrasyonda Aflatoksin M 1 içeren sütlerde Aflatoksin M 1 in tayini amacı ile Uluslararası Süt Federasyonu (IDF) laboratuvarlar arası bir çalışma yaparak YBSK yöntemini değerlendirmiştir. Bu çalışmaya 11 ülkeden 16 laboratuvar katılmıştır. Uygulanacak yöntem olarak hazırlık grubu tarafından çeşitli yöntemler incelendikten sonra temizleme aşamasında imünoafiniti kolon kullanımı seçilmiştir. Söz

konusu yöntemde, örnek kolondan geçerken kolonda bulunan antikorlar selektif olarak antijenleri olan Aflatoksin M 1 i bağlarlar ve antikorantijen kompleksini oluştururlar. Örnek matriksi içinde yer alan tüm diğer maddeler su ile yıkanarak kolondan uzaklaştırıldıktan sonra asetonitril kullanılarak Aflatoksin M 1 kolondan alınmaktadır. Tanımlama ve miktar belirleme aşamasında floresan dedektörlü zıt faz sıvı kromatografisi kullanılmıştır. İkisi kör deneme olmak üzere 24 örnek analizlenmiş ve uyarlık açısından relatif standard sapma (RSD R ) değerleri %11-23 arasında bulunmuştur (80-600 ng Aflatoksin M 1 /kg süt tozu) (Tuinstra vd., 1993). Toyoda ve arkadaşları (1994) tarafından yapılan bir çalışmada, sütte aflatoksin M 1 tayini için üç kromatografik yöntem; İTK, geleneksel YBSK ve imünoafiniti kolon ile birlikte YBSK kullanımı karşılaştırılmıştır. En duyarlı yöntemin imünoafiniti kolon ile desteklenmiş YBSK sistemi, en az duyarlı olanın da İTK yöntemi olduğu belirlenmiştir. İmünoafiniti kolon ile desteklenmiş YBSK sisteminin duyarlılığının geleneksel YBSK ne göre %35.5, İTK ne göre ise %65.3 daha fazla olduğu saptanmıştır. Dragacci ve ark (1995) peynirde aflatoksin M 1 tayini için imünoafiniti kolonda saflaştırma yöntemi tanımlamışlardır. Diklorometan ile basit bir çözgen ekstraksiyonundan sonra n-hegzan ile yıkama yapılarak saflaştırılmış ekstrakt elde edilmiş ve Aflatoksin M 1 in saflaştırılması ve konsantre edilmesinde kullanılan iki yöntem olan katı faz ekstraksiyon temizlemesi ve imünoafiniti kolon temizlemesi karşılaştırılmıştır. Aflatoksin M 1 e karşı monoklonal antikor içeren imünoafiniti kolonda en iyi sonuç elde edilmiştir. Aflatoksin M 1 in kantitatif tayini için floresans dedektörlü YBSK kullanılmıştır. Bu yöntem hem doğal kontamine hem de aflatoksin aşılanmış örneklerde başarılı olmuştur. Geri kazanımlar % 75 civarındadır. Tayin edilen toksin düzeyinin 0.020 µg afl. M 1 / kg peynir olduğu belirtilmektedir. Çalışma sonucunda peynir gibi süt ürünlerinde aflatoksin M 1 kontaminasyonunun belirlenmesinde bu yöntemin uygun olduğu ifade edilmektedir. Kaksuri ve arkadaşları (1995) yaptıkları diğer bir çalışmada sütteki aflatoksin M 1 in immnunoafiniti kolon/ybsk tekniği ile tayinini değerlendirmişlerdir. Analiz sonunda geri kazanımların çok yüksek olduğu gözlenmiş ve kimyasal yöntemlere kıyasla daha hızlı, duyarlı ve seçici olan bu yöntemde herhangi bir girişim yapıcı maddenin pikinin gözlenmediği belirtilerek, söz konusu yöntem Aflatoksin M 1 tayini için önerilmiştir. 19

20 Bu konuda gerçekleştirilen diğer bir çalışmada farklı peynir çeşitlerinde aflatoksin M 1 analizi için imünoafiniti kolon kullanımının oldukça iyi geri kazanımlar verdiği belirlenmiştir. 0.200 µg/kg oranında Aflatoksin M 1 ile kontamine edilen peynirlerde geri kazanma değerleri %63.1-114 arasında değişmekle birlikte çoğunlukla %70-100 civarında olduğu bulunmuştur. Hammadde olarak kullanılan sütün kaynağı veya peynir tipleri ile geri kazanma yüzdeleri arasında bir ilişki saptanmamıştır (Dragacci ve Fremy, 1996). Bir başka çalışma Dragacci ve arkadaşları (2001) tarafından Fransa da gerçekleştirilmiştir. Düzenlenen laboratuvarlar arası çalışmada sütte Aflatoksin M 1 tayini için imünoafiniti kolon kullanımı ile ekstraksiyon sonrasında YBSK ile miktar belirleme yöntemi incelenmiştir. Çalışmada sütün analize alınacak miktarı santrifüj edilmiş, süzülmüş ve imünoafiniti kolondan geçirilmiştir. Kolonda tutulan Aflatoksin M 1, saf asetonitril yardımıyla elue edildikten sonra zıt faz sıvı kromatografisinde floresans dedektör yardımı ile analizlenmiştir. Doğal olarak kontamine olmuş ya da laboratuvar koşullarında 0.05 ng/ml düzeyinde Aflatoksin M 1 katılması ile yapay olarak kontamine edilmiş olan dondurulmuş süt örnekleri 12 Avrupa ülkesinden 12 laboratuvara gönderilmiştir. Elde edilen sonuçlardan uyumsuz olan iki set ayrıldıktan sonra ortalama geri kazanımın %74 olduğu gözlenmiştir. Ayrıca hesaplamalar sonucunda tekrarlanabilirlik açısından bağıl standard sapmanın (RSD r ) %8-18, uyarlık açısından bağıl standard sapmanın (RSD R ) ise %21-31 arasında olduğu belirlenmiştir. Süt ve süt tozunda Aflatoksin M 1 içeriğinin tayininde imünoafiniti kolon ile ekstraksiyon ve YBSK ile miktar tayini ile ilgili 1998 yılında yürürlüğe giren ISO 14501 sayılı uluslararası standard ülkemiz tarafından da kabul edilerek TS ISO 14501 adı altında kullanıma sunulmuştur (TSE, 2002).

2.4 Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksinler İle İlgili Çalışmalar 21 Pek çok çalışmada aflatoksin degradasyonu üzerine çeşitli mikroorganizmaların kültür ortamında etkileri araştırılmıştır. Bu çalışmaların birinde Karunatne ve arkadaşları (1990) Lactobacillus türlerinin Aspergillus flavus subs. parasiticus un gelişimi ve aflatoksin oluşturması üzerindeki etkilerini araştırmışlardır. Bu çalışmaya göre laktik asit üreten bakterilerin varlığında inkübasyon süresi boyunca aflatoksin oluşumu gözlenmemiştir. Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus ve Lb. plantarum un etkileri incelenmiş ve Lb. acidophilus un aflatoksin oluşumu inhibisyonunda en etkili mikroorganizma olduğu gözlenmiştir. Luchese ve Harrigan (1990) yaptıkları bir çalışmada farklı başlangıç ph değerlerinde, Lactococcus lactis veya laktik asit varlığında Aspergillus parasiticus gelişimi ve aflatoksin üretimi üzerinde çalışmışlardır. Söz konusu çalışmada A.parasiticus modifiye Lab-Lemco tripton broth da tek kültür olarak ve Lactococcus lactis bakterisi ile birlikte geliştirilmiştir. Çalışma sonunda toplam aflatoksin (B 1 +G 1 ) üretiminin bakteri varlığında daha yüksek olduğu, ve faklı besiyerleri, inokülasyon işlemleri, farklı ingrediyen kullanımlarında da sonucun aynı olduğu belirlenmiştir. Başlangıç ph sı 4.2 olan besiyerinde nötral besiyerine göre aflatoksin üremesinde artış olduğu; hidroklorik asit ve/veya laktik asidin çok az etkiye sahip olduğu; besiyerinin karbon içeriğinin yarısının laktat ile sağlanması durumunda aflatoksin üretiminde 4.2 başlangıç ph sında artış, 6.8 başlangıç ph sında azalma olduğu elde edilen diğer bulgulardır. Gourama ve Bullerman (1995) Lactobacillus türlerinin aflatoksin üretimini inhibe ettiğini bulmuşlardır. Araştırıcılar, 24 saatlik Lactobacillus spp. kültürüne küf sporlarını enjekte ederek ve 4 günlük küf kültürlerine Lactobacillus hücrelerini ekleyerek yaptıkları iki farklı denemede aflatoksin B 1 in sırayla %48 ve %72 oranında inhibe olduğunu belirlemişlerdir. Aflatoksin G 1 için ise inhibisyon oranlarını sırayla %72 ve %91 olarak bulmuşlardır. Pierides ve arkadaşları (2000) süt ürünlerinde bulunan laktik asit bakterilerinin aflatoksin M 1 içeren fosfat tamponlu salamuradaki aflatoksin M 1 i degrade edebilme yetenekleri üzerinde çalışmışlardır. Bu amaçla 6 laktik asit bakterisi test edilmiştir. Kültür ortamında en iyi sonucu veren iki mikroorganizma (L. rhanmosus strain GG [LBGG], ve L. rhanmosus strain LC-705 [LC-705]) ile yavan ve tam yağlı sütte