BULUNAN SERT KENELERDE (ACARİ: IXODİDAE) KIRIM KONGO KANAMALI ATEŞİ VİRÜSÜ NÜN (KKKAV) MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE TESPİTİ

TOKAT ve AMASYA ÇEVRESİNDE İNSAN ve KİRPİLERDE BULUNAN SERT KENELERDE (ACARİ: IXODİDAE) KIRIM KONGO KANAMALI ATEŞİ VİRÜSÜ NÜN (KKKAV) MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE TESPİTİ Mustafa EKİCİ Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Yrd. Doç. Dr. Ahmet BURSALI 2011 Her hakkı saklıdır

T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ TOKAT ve AMASYA ÇEVRESİNDE İNSAN ve KİRPİLERDE BULUNAN SERT KENELERDE (ACARİ: IXODİDAE) KIRIM KONGO KANAMALI ATEŞİ VİRÜSÜ NÜN (KKKAV) MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE TESPİTİ Mustafa EKİCİ TOKAT 2011 Her hakkı saklıdır

TEZ BEYANI Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim. Mustafa EKİCİ

ÖZET Yüksek Lisans Tezi TOKAT ve AMASYA ÇEVRESİNDE İNSAN ve KİRPİLERDE BULUNAN SERT KENELERDE (ACARİ: IXODİDAE) KIRIM KONGO KANAMALI ATEŞİ VİRÜSÜ NÜN (KKKAV) MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE TESPİTİ Mustafa EKİCİ Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Yrd. Doç. Dr. Ahmet BURSALI Keneler zorunlu kan emici ve birçok ölümcül patojenin vektörü olan ve bu hastalıkların hayvan ve insanlara bulaşmasında önemli rol oynayan tehlikeli ektoparazitlerdir. Bu çalışmada Tokat il ve ilçelerinde kirpilerden ve Amasya il ve ilçelerinde insanlardan toplanan sert kene türlerinde (Acari: Ixodidae) Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü (KKKAV) varlığının Revers Transkription-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) ve Real Time RT-PCR gibi moleküler yöntemlerle saptanması hedeflenmiştir. Çalışma sonuçlarına göre kirpilerden toplanan bir adet Hyalomma aegyptium türü kenede ve Amasya ilinde insanlardan toplanan sert kenelerden oluşturulan her biri 10 keneden oluşan 25 Hyalomma havuzundan 7 sinde (%28 ) KKKAV varlığı saptanmıştır. Sonuç olarak Tokat ve Amasya bölgelerinde kirpi ve insanlarda parazitlenen kenelerden özellikle Hyalomma cinsine ait olan türlerinin KKKAV bulaştırma potansiyeline sahip oldukları ve bu bölgelerde insanlara KKKAV bulaşmasında rolleri olduğu düşünülmektedir. 2011, 42 sayfa Anahtar Kelimeler: Kene, KKKAV, Real Time RT-PCR, Kirpi, İnsan, Amasya, Tokat. i

ABSTRACT Ms Thesis DETERMINATION OF CRIMEAN CONGO HEMORRHAGIC FEVER VIRUS (CCHFV) in IXODID TICKS FROM HUMAN AND HEDGEHOGS in TOKAT and AMASYA USING MOLECULER METHODS Mustafa EKİCİ Gaziosmanpasa University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Asst. Prof. Dr. Ahmet BURSALI Ticks are mandatory blood sucking ectoparasites carrying and transmitting numerous deadly pathogens to animals and human. In the present study, presence of Crimean Congo Hemorrgagic Fever Virus (CCHFV) in hard ticks (Acari: Ixodidae) infesting hedgehogs and humans from Tokat and Amasya respectively using Revers Transcription-Polymeraz Chain Reaction (RT-PCR) ve RealTime RT-PCR. As a results, presence of CCHFV was detected in a Hyalomma aegyptium tick from a hedgehog in Tokat and in 7 out of 25 Hyalomma tick pools (%28) collected from humans in Amasya. Results indicate that hard ticks infesting hedgehog and humans in Tokat and Amasya posses CCHFV and might have an important role for the transmission of CCHFV to humans. 2011, 42 pages Key Words: Tick, CCHFV, Real Time RT-PCR, Hedgehog, Human, Amasya, Tokat. ii

ÖNSÖZ Tokat ve Amasya İllerinde İnsan ve Kirpilerden Toplanan Sert Kenelerde Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü (KKKAV) Varlığının Belirlenmesi adlı tez çalışmamda benden her türlü bilgi ve yardımlarını esirgemeyen Danışmanım Yrd. Doç. Dr. Ahmet BURSALI ya ve çalışmama öneri ve yardımları ile büyük katkıda bulunan Doç. Dr. Şaban TEKİN e teşekkür ederim. Ayrıca kene numunelerinin toplanmasındaki yardımlarından dolayı Sağlık Bakanlığı Temel Sağlık Hizmetleri Genel Müdürlüğüne, Amasya ve Tokat İl Sağlık Müdürlüklerine ve örneklerinin tür teşhisi için Uzm. Biyolog Adem KESKİN e, Biyoloji Bölümümüzün değerli öğretim üyelerine ve çalışmam süresince bana maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen aileme teşekkür ederim. Mustafa EKİCİ Ocak/2011 iii

İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET i ABSTRACT ii ÖNSÖZ iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ vi ŞEKİLLER DİZİNİ vii ÇİZELGELER DİZİNİ viii 1. GİRİŞ 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ 3 2.1. Tarihçe 3 2.2. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı nın Dünyadaki ve Türkiye deki Dağılışı 3 2.2.1. KKKA nın Dünyadaki Dağılımı 3 2.2.2. KKKA nın Türkiye deki Dağılımı 4 2.3. KKKA Virüsü 5 2.3.1 KKKA Virüsü nün Moleküler Yapısı ve Özellikleri 6 2.3.2. KKKA Virüsü nün Bulaşma Yolları 8 2.3.3. KKKA nın Klinik Seyri 9 2.3.4. KKKA Hastalığının Tanısı 11 2.3.5. KKKA Hastalığının Tedavisi 12 2.4. Keneler 13 2.4.1. Kenelerin Sistematik Özellikleri 13 2.4.2. Kenelerin Yaşam Döngüleri 14 2.4.3. Keneler ve KKKAV 17 3. MATERYAL ve YÖNTEM 18 3.1. Materyal 18 3.1.1. Kullanılan Kimyasal Madde ve Malzemeler 20 3.1.2. Kullanılan Cihazlar 21 3.1.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ve Revers Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) 21 3.2. Metod 22 3.2.1. Total RNA Ekstrasyonu 22 3.2.2. c DNA Sentezi 23 3.2.3. Real Time RT-PCR 23 3.2.3.1. Real Time RT-PCR Reaksiyon Koşulları 24 3.2.3.2. TaqMan Hidroliz Prob Testi (Taqman assays - 5' Nuclease Assays) 25 3.2.4. Real Time Primer ve Probe Hazırlanışı 26 3.2.5. Tek Basamaklı Revers Transkripsiyon PCR ( One Step RT- 26 PCR) 3.2.5.1. Thermal Cycler in Programı 27 3.2.6. Agaroz Jel Elektroforezi 28 3.2.7. DNA Dizi Analizi 28 4. BULGULAR ve TARTIŞMA 29 4.1. Tokat İli ve İlçelerindeki Kirpilerden Toplanan Kenelerin Türleri 29 iv

4.2. Tokat İli ve İlçelerinde Kirpilerde Bulunan Kene Türleri ve Bu Türlerin Morfolojik Özellikleri 29 4.2.1. Hyalomma aegyptium (Linnaeus, 1758) 29 4.2.2. Hyalomma detritum Schulze, 1919 30 4.2.3. Hyalomma marginatum Koch, 1844 31 4.2.4. Rhipicephalus turanicus Pomerantsev, 1946 32 4.3. Tokat İli ve İlçelerindeki Kirpilerden Toplanan Kenelerin Türlerinde KKKAV Varlığının Belirlenmesi 32 4.4. Amasya İli ve İlçelerinden Toplanan Kenelerden KKKA Pozitif Örneklerin Tespiti ve PCR Ürünlerinin Dizi Analizi 33 4.5. Amasya Kenelerinde Bulunan KKKAV nin Filogenetik Analizi 34 5. TARTIŞMA ve SONUÇ 36 KAYNAKLAR 38 ÖZGEÇMİŞ 42 v

KISALTMALAR DİZİNİ Kısaltmalar Açıklama E. concolor Erinaceus concolor H. aegyptium Hyalomma aegyptium H. detritum Hyalomma detritum H. marginatum Hyalomma marginatum R. turanicus Rhipicephalus turanicus H. turanicum Hyalomma turanicum H. anatolium Hyalomma anatolium R.sanguineus Rhipicephalus sanguineus KKKA Kırım Kongo Kanamalı Ateşi KKKAV Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü vi

ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2. 1. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığının Dünya Üzerinde Dağılımı... 4 Şekil 2. 2. KKKA olgularının yoğun olarak görüldüğü Kelkit Vadisi... 5 Şekil 2. 3. Bunyaviridae virüsünün şematik kesiti... 7 Şekil 2. 4. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü nün replikasyonu... 8 Şekil 2. 5. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi nin klinik ve laboratuar seyri... 11 Şekil 2. 6. Bir konaklı kenenin yaşam döngüsü... 15 Şekil 2. 7. İki konaklı kenenin yaşam döngüsü... 16 Şekil 2. 8. Üç konaklı kenenin yaşam döngüsü... 16 Şekil 3. 1. Amasya merkez ve ilçeleri... 18 Şekil 3. 2. Tokat ili ve ilçelerine kirpi kenesi toplamak için yapılan arazi çalışması... 19 Şekil 3. 3. Baskılayıcı reporter floresans sinyalini baskılar... 25 Şekil 3. 4. Probun hedef sekansa hibridize oluşu... 25 Şekil 3. 5. Probun hidrolize oluşu ve floresans sinyalin artışı... 26 Şekil 4. 1. Real Time RT-PCR da pozitif bulunan Hyalomma aegyptium... 33 Şekil 4. 2. RT-PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi yöntemi ile görüntülenmesi... 34 Şekil 4. 2. Amasya kenelerinde bulunan KKKAV nin filogenetik analizi... 35 vii

ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2. 1. Bunyaviridae ailesine ait virüsler... 6 Çizelge 3. 1. Tokat merkez ve ilçelerinden toplanan kirpilerde bulunan keneler... 20 Çizelge 3. 2. Çalışmada kullanılan Real Time PCR dizaynı... 24 Çizelge 3. 3. Çalışmamızda kullanılan Real time PCR reaksiyon koşulları... 24 Çizelge 3. 4. Roche Transcriptör One Step RT-PCR Kiti prosedürü... 27 Çizelge 4. 1. Tokat ili ve ilçelerinde kirpilerde toplanan kene türleri.29 viii

1 1. GİRİŞ Keneler, Arthropoda şubesi, Arachnida sınıfı, Acarina, alt sınıfı, Ixodidae, Argasidae ve Nuttalliellidae olmak üzere 3 familya olarak temsil edilmektedir. Ixodidae familyası 14 cins içerinde yaklaşık 702, Argasidae familyası 5 cins içerinse 193 tür içermektedir. Nuttalliellidae familyası Nuttalliella namaqua adında sadece bir tür içermektedir (Guglielmone ve ark., 2010). Keneler zorunlu kan emici ektoparazitlerden olup, kutup bölgesi hariç dünyanın her bölgesinde bulunan eklembacaklılardandır. Ülkemizde de yoğun olarak bulunan keneler halk arasında sakırga, yavsı, kerni gibi isimlerle tanınmaktadır (Merdivenci, 1969). Kan emici parazitlerden olan keneler bakteri, fungus, protozoa ve virüsler olmak üzere çok çeşitli patojeni diğer canlılara bulaştırarak çok tehlikeli veya ölümcül salgın hastalıklara neden olurlar. Kenelerin taşıdıkları viral patojenler arasında en önemlilerinden biri Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü (KKKAV) olup, insanlarda Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı na neden olurlar. KKKA Hastalığı insanlarda yüksek ateş ve şiddetli kanamalar gibi semptomlarla seyreden, zoonoz karakterli bir hastalıktır. Bu kanamalı hastalığa neden olan etken, Bunyaviridae ailesinin Nairovirüs genusunda yer almaktadır. Bu virüs, tek iplikçikli, negatif anlamlı ve üç molekülden oluşan bir RNA virüsüdür (Nichol, 2001). Ülkemizde 2002 yılından beri, başta Tokat ili olmak üzere Yozgat, Çorum, Sivas, Kastamonu, Karabük, Gümüşhane, Erzurum, Amasya, Çankırı, Giresun ve Samsun da 300 den fazla ilçeye bağlı 2000 kadar kırsal yerleşim biriminden 4448 olgu kaydedilmiş olup, bunların 218 (%4.9) i ölümle sonuçlanmıştır ve hastalık diğer illere de yayılmaktadır (Anonim, 2010). KKKAV nin biyolojik vektörü olan keneler, insanlara özellikle Hyalomma ve Rhipicephalus cinslerine ait kene türlerinin ısırmasıyla bulaşmaktadır. KKKA virüsünün taşınmasında ve yayılmasında rol alan başlıca rezervuarlar vektörler arasında fare ve

2 tavşan gibi küçük yabani kemirgen gelmektedir. Virüs kenelerde uzun süre kalabilmekte, yaşam döngüsü sırasında kenenin bir formundan diğer formuna (transstadial) ve dişi keneden yumurtalara (transovaryal) geçebilmektedir (Hewson, 2007). Keneler KKKAV gibi tehlikeli pek çok hastalığın yayılmasına neden olduklarından, değişik patojenleri bulaştırma potansiyellerinin belirlenmesi, kenelere karşı daha etkin ve uzun süreli önlemleri alınması ve kene kökenli hastalıklara karşı korunmanın sağlanması açısından oldukça önemlidir. Bu nedenle ülkemizde değişik konak canlılarda bulunan kenelerin KKKAV taşıma potansiyelinin belirlenmesi hastalığın diğer bölgelere yayılımının ve meydana gelecek KKKA vakalarının kontrol altına alınmasına katkı sağlayacaktır. Bu çalışmada Tokat il ve ilçelerinde kirpilerden (E. concolor) toplanan ve Amasya il ve ilçelerinde insanlardan toplanan kenelerde KKKAV varlığı moleküler yöntemlerle araştırılarak, bu kene türlerinin KKKAV bulaştırma potansiyelleri belirlenmeye çalışılmıştır.

3 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Tarihçe Tarihi belgelere göre 12. yüzyılda, Tacikistan'da aynı KKKA vakalarında olduğu gibi dışkıda, idrarda, balgam ve kusmukta, dişetlerinde ve karın boşluğunda kanama ile seyreden bir hastalık tanımlanmış olması nedeniyle KKKA hastalığının tarihçesinin çok eskilere dayandığı düşünülmektedir (Ergonul, 2006). Kırım Kongo Kanamalı Ateşi, klinik olarak ilk kez II. Dünya Savası esnasında (1944 1945) Kırım da, köylülere yardım eden yaklaşık iki yüz Rus askerinin hastalanması ile fark edilmiş ve klinik bulgular doğrultusunda Kırım Kanamalı Ateşi olarak adlandırılmıştır. Daha sonra 1956 yılında Kongo da görülen ateşli bir hastalığın etkeninin, 1945 yılındaki Kırım Kanamalı Ateşi ile aynı olduğu belirlenmiş ve bu tarihten itibaren hastalık Kırım Kongo Kanamalı Ateşi olarak adlandırılmıştır (Simpson, 1978). 2.2. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı nın Dünyadaki ve Türkiye deki Dağılışı Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı ülkemizin de içinde bulunduğu geniş bir coğrafyada görülmektedir. Afrika, Asya, Avrupa ve Ortadoğu da bulunan 30 ülkenin üzerinde hastalığın ortaya çıktığı bildirilmiştir (Hoogstraal, 1979; Swanepoel, 1995). 2.2.1. KKKA nın Dünyadaki Dağılımı 1970 lerden önce olguların çoğunluğu Sovyetler Birliği, Bulgaristan ve Zaire (Kongo) ve Uganda dan bildirilmiştir. Çin de 1965 yılında %80 mortalite ile seyreden bir salgın bildirilmiş, ancak ayrıntılı bilgi sunulmamıştır. 1970 ve 2000 yılları arasında Güney

4 Afrika Cumhuriyeti, Kongo, Moritanya, Burkina Faso, Tanzanya, Senegal den ayrıntılı çalışmalar sunulmuş, Irak, Pakistan, Birleşik Arap Emirlikleri, Suudi Arabistan, Umman Krallığı ve Çin den önemli sayıda olgu bildirilmiştir. 2000 yılı itibariyle Yugoslavya, Pakistan, Senegal, İran, Arnavutluk, Türkiye, Bulgaristan, Yunanistan, Kenya ve Moritanya dan yeni salgınlar veya sporadik olgular bildirilmiştir. Portekiz, Hindistan, Mısır, Macaristan, Fransa dan serolojik bulgular bildirilmişse de olgu rapor edilmemiştir. KKKAV, Balkanlarda Romanya ve Yunanistan dışında endemiktir (Anonim, 2010). KKKA vakaları ülkelere ve yıllara göre değişiklik göstermekte olup, bazı ülkelerdeki KKKA vakaları Şekil 2.1. de verilmiştir. Şekil 2.1. Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığının Dünya Üzerinde Dağılımı (Ergonul, 2006) 2.2.2. KKKA nın Türkiye deki Dağılımı Türkiye de ilk kez 2002 yılı Nisan ayında, Tokat SSK Hastanesi nde bir hemşirenin ölümünün ardından spekülasyonlar üzerine başlatılan araştırmalar, Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Hastalığı nın ülkemizde tanınmasını sağlamıştır. Yapılan bir çalışmada, KKKA hastalığının, Türkiye de daha çok Kelkit Vadisi ve çevresindeki kırsal alanlarda

5 çiftçilik ve hayvancılıkla uğraşan kesimlerde görüldüğü belirtilmiştir (Karti, 2004). Ülkemizde KKKA hastalığı 2002 yılından beri birçok ilde endemik olarak görülmektedir (Anonim, 2005). Tokat ve çevresinde yapılan bir araştırmada, insanlardaki KKKA seroprevalansının Tokat ve çevresinde, özellikle hayvancılığın yoğun olduğu bölgelerde, %18 civarında olduğu tespit edilmiştir (Tekin ve ark., 2009). KKKA vakalarının yoğun olarak görüldüğü bölgeler Şekil 2.2. de verilmiştir. Şekil 2.2.KKKA olgularının yoğun olarak görüldüğü Kelkit Vadisi (Yılmaz ve ark., 2008) 2.3. KKKA Virüsü KKKA, Bunyaviridae ailesine bağlı Nairovirus cinsine ait olan virüslerin meydana getirdiği, şiddetli seyir gösteren ve oldukça yüksek mortalite oranı olan viral hemorajik bir hastalıktır. Bu grup virüsler, 100 nm büyüklüğünde, üç parçalı RNA içeren, heliksel kapsidli ve zarflıdır (Whitehouse, 2004). Bünyaviridae ailesine bağlı virüsler Çizelge 2.1. de verilmiştir.

6 Çizelge 2.1 Bunyaviridae ailesine ait virüsler (Whitehouse, 2004). 2.3.1. KKKA Virüsünün Moleküler Yapısı ve Özellikleri Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü ( KKKAV) Bunyaviridae ailesine ait virüsler zarflı, tek sarmallı, negatif polariteli RNA virüsüdür. Çoğunlukla küresel yapıda 80-120nm çapındadırlar. Üç segmentten oluşan viral genom dört yapısal proteini kodlamaktadır (Şekil 2.3). Her bir RNA segmenti ile birlikte virüse ait RNA'ya bağımlı RNA polimeraz da paketlenmiştir. L proteini (RNA bağımlı RNA polimeraz) L (large) segmenti, GN ve GC glikoproteinleri M (medium) segmenti ve N nükleokapsid proteini ise S (small) segmenti tarafından sentezlenmektedir (Whitehouse, 2004). Viral glikoproteinler olan GN ve GC'lerin işlevi, duyarlı hücrelerdeki reseptör bölgelerinin tanınmasıdır. Virüs, duyarlı olduğu hücreye yapıştıktan sonra endositozla vezikül içerisinde hücre içine alınır. Virüsün replikasyonu sitoplâzmada gerçekleşir. Vezikül içindeki ortamın asitleşmesi ile glikoproteinlerin üç boyutlu yapısında değişiklikler ortaya çıkar ve virüsle vezikül membranının füzyonu gerçekleşir. GN golgi aygıtında, GC ise endoplazmik retikulumda bulunur (Schmaljohn ve ark., 2001). Daha sonra nükleokapsid sitoplâzmada serbest hale geçer. Nairovirüsler negatif polariteli kodlama sistemine sahiptirler. Viral RNA polimeraz çıplak haldeki RNA'yı kalıp olarak kullanamaz. RNA polimeraz konak hücre mrna'larını kullanarak bu negatif polariteli viral genlerin mrna'sını oluşturur. Bu mrna'lardan ilgili proteinler sentezlenir.

7 Transkripsiyonun ardından replikasyon için tam uzunlukta crna'lar sentezlenir. crna'lar kalıp olarak kullanılıp komplementer genomik RNA'lar oluşturulur. İkincil mrna'lar proteinlere dönüştürülür. M segmenti tarafından kodlanan glikoproteinlerin translasyonu sonucunda GC ve GN 'nin öncülleri oluşturulur (Schmaljohn ve ark., 2001). Pre GN'nin SKI/SIP tarafından kesilmesi ile GN, PreGC'nin RKPL1040 motifinden kesilmesi ile GC ortaya çıkmaktadır. Virüsler golgi aygıtı içinde toplanır ve tomurcuklanma yoluyla ile hücre içine geçer. Oluşan virionlar veziküller içinde hücre yüzeyine taşınıp serbest hale gelirler (Midilli, 2007; Morikawa ve ark., 2007; Whitehouse, 2004). KKKAV nin replikasyonu şekil 2.4 de şematize edilmiştir. Şekil 2.3 Bunyaviridae virüsünün şematik kesiti (Schmaljohn ve Hooper, 2001). KKKAV S ve M segmentlerinin sekanslarının filogenetik analizi, KKKAV suşlarının genetik farklılık gösterdiklerini ortaya koymuştur. Düşük genetik farklılıkları nedeniyle Avrupa suşları, Yunan suşu AP92 hariç aynı grupta yer almaktadır. Avrupa suşları Güneydoğu Rusya suşları ile benzerdir. Türkiye'deki son salgında izole edilen suşlar ise Güneybatı Rusya ve Kosova suşları ile yakın ilişkilidir (Bursalı ve ark., 2008; Ergonul, 2006). Türkiye'de kenelerden ve hastalardan elde edilen suşlar Avrupa I Grubu olarak adlandırılan Doğu Avrupa Rusya suşları ile gruplanmaktadır (Tonbak ve ark., 2006; Midilli, 2007). Balkanlarda ölümcül bir hastadan KKKAV izole edilmiş ve bütün

8 genom dizisi tanımlanmıştır. Virüsün toplam genomu 19.2 kb uzunluğunda olup, S segmentinde 1672, M segmentinde 5364 ve L segmentinde 12150 nükleotid içermektedir. KKKAV nin filogenetik analizleri Avrupa/Türkiye grubundaki Kosova suşlarının bütün genomları Rus izolatları ile yüksek benzerlik gösterirken, Kosova suşları arasında ise %1.9 oranında farklılık bulunmuştur. Bu da uzak virüs suşlarının yüksek endemik alanlarda bir arada bulunabileceğini işaret etmektedir (Duh ve ark., 2008). Şekil 2.4 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü nün replikasyonu (Schmaljohn ve Hooper, 2001). 2.3.2. KKKA Virüsü nün Bulaşma Yolları KKKA Virüsü kenelerin kan emmesi, viremik hayvanların ve insanların vücut sıvıları ve dokuları ile teması ve kenelerin el ile ezilmesi sonucu derideki yaralardan vücuda girmesi sonucu insanlara bulaşmaktadır. Epidemiyolojik olarak en önemli bulaşma yolu infekte kenelerin kan emmesidir. Keneler hastalığın doğadaki esas taşıyıcısı ve rezervuarı olarak kabul edilirler. Virüs, kenelerin enfekte hayvanı emmesi sonucunda keneye geçer, kenelerin tüm hayat döngüsü sırasında taşınır ve bulunduğu konakları

9 enfekte eder. Kene türünün ve konak sayısının fazlalığı virüsün diğer canlı ve insanlara bulaşma ihtimalini arttıran faktörlerden biridir (Ergonul, 2006). KKKAV keneler haricinde enfekte insan ve hayvanların kan ve salgılarından ve az da olsa aerosolerle bulaşabilmektedir. Özellikle çiftçiler, hayvancılık yapanlar, mezbaha çalışanları, kasaplar ve sağlık personeli başlıca risk gruplarını oluşturmaktadır. (Ergonul, 2006). Virüs kenelerde ömür boyu (1 1,5 yıl), hatta nesiller boyu (transovaryal + transstadial geçiş) kalmakta ve çoğalabilmektedir (Hoogstraal, 1979). 2.3.3. KKKA nın Klinik Seyri Virüsün oluşturduğu hastalığın klinik tablosu hafif, orta ve ciddi-ağır olmak üzere üç formda görülür. Klinik gidiş ise inkübasyon dönemi, prehemorajik dönem, hemorajik dönem ve konvalesan dönem olmak üzere dört fazdır (Çevik, 2004). Hastalığın klinik ve serolojik seyri şekil 2.5 de gösterilmektedir. İnkübasyon Dönemi: Kenenin tutulması ile hastalık gelişmesi arasındaki süredir ve kesin bir rakam vermek güç olsa da 3 7 gün olarak bildirilmişti. Hastaların %50 60'ında kene yapışma öyküsü vardır (Ergonul, 2006). İnkübasyon süresi, viral yük ve enfeksiyon yoluna bağlı olarak değişebilir, örneğin kan yoluyla geçişlerde bu süre daha kısadır. Hastaneye başvurmadan önce geçen ortalama gün sayısı Türkiye'de 5.5 gündür (Watts ve ark., 1988). Prehemorajik Dönem: Prehemorajik dönem ateş yükselmesi şiddetli bas ağrısı, bas dönmesi gibi bulgularla ani olarak başlayabilir ve hastalarda boğaz ağrısı, aşırı halsizlik, yorgunluk, yaygın kas ve eklem ağrıları ortaya çıkar. Prehemorajik dönem 1-7 gün sürebilir. Hastalarda nadir de olsa sarılık, boyun ağrısı, fotofobi, duygu değişiklikleri görülebilir (Ergonul, 2006).

10 Hemorajik Dönem: Çabuk gelişen, kısa süren, mukoza ve deride yaygın kanamaların görüldüğü dönemdir. Hastaların değişik organlarında kanamalar görülebilir. En sık kanama alanları burun, gastrointestinal sistem, diş eti kanamaları, üriner sistem ve solunum sistemidir. Ağır seyreden olgularda hepatorenal sendrom, kardiyovasküler ve dissemine intravasküler koagülopati gelişebilir ve sinir sistemi tutulumu kötü prognoz göstergesidir (Ergonul ve ark., 2006). Konvalesan dönem: Hastalığın başlangıcının 10. gününden itibaren ortaya çıktığı dönemdir. Bu dönem içerisinde sıklıkla, solunum güçlüğü, hafıza kaybı, işitme, görme ve taşikardi gibi bulgular görülür. Hafif ve orta derecede klinik seyir gösteren hastalar yaklaşık 9 10 günde iyileşir ve tam iyileşme süreci 2-6 hafta sürer (Çevik, 2004). Laboratuar test sonuçlarına bakıldığında, trombositopeni ve lökopeni dikkati çekmektedir.bilirubin, aspartataminotransferaz, kreatin kinaz ve alaninaminotransferaz değerlerinde yükselmeyi; gamaglutamil transferaz, alkalen fosfotaz ve laktat dehidrogenaz değerlerindeki yükselme takip eder. Protrombin zamanı, parsiyel tromboplastin zamanı ve diğer pıhtılaşma testlerinde belirgin bozukluk görülmektedir. Bariz kanama olmasa da hemoglobin düzeylerinde düşme gözlenebilir. İyileşme 9 10. günlerde olmakla birlikte bazen dört hafta veya daha uzun sürede olabilir. Ölüm daha çok hastalığın ikinci haftasında görülmektedir (Yılmaz ve ark., 2005).

11 Şekil 2.5 Kırım Kongo Kanamalı Ateşi nin klinik ve laboratuar seyri (Kara, 2006) 2.3.4. KKKA Hastalığının Tanısı KKKAV oldukça hassas ve bulaşıcı bir virüs olduğu için, çalışma esnasında çok dikkatli olunmalı ve laboratuarda gerekli koruyucu önlemler alınmalıdır. Viremi safhası hastalığın başladığı günden 12. güne kadar sürebilir. Bu dönem içerisinde doku veya kan örneklerinden virüs izole edilebilir ve istenirse hücre kültüründe ( CER, Vero E6 hücre kültürleri veya canlı farelerin serebral hücrelerine inokule edilerek) üretilebilir (Shepherd ve ark., 1986). Viral antijenlerin doku ve kan örneklerinde tespiti için ELİSA, IFA ve immünhistokimyasal yöntemler kullanılabilir. Ayrıca PCR ve RT-PCR yöntemleri de tercih edilen yöntemlerdir. PCR ile çoğaltılan komplemanter DNA filogenetik analiz için S ya da M segment sekanslaması yapılabilmektedir. Diğer bir yöntem de Real Time PCR yöntemidir. Real Time PCR yönteminin geliştirilmesi kontaminasyon riskini azaltmıştır. Real Time PCR yöntemi KKKAV tanısının daha hızlı sonuç verilmesine neden olmuştur (Burt, 1997; Ergonul, 2006; Morikawa ve ark., 2007; Shepherd ve ark., 1988; Schwarz ve ark., 1996). KKKA hastalığının tanısında, kene ile hastanın öyküsünün olması çok önemlidir. Hastalığın tanısında üç yöntem kullanılır (Whitehouse, 2004).

12 Virüs Kültürü: Akut dönemdeki hastalardan alınan kan örneklerinden 2 5 gün içerisinde virüs izolasyonu yapılabilir. Bunun içinde Vero E6, BHK 21, SW 13, LLC- MK2 hücre kültürleri kullanılmaktadır. Virüsler spesifik monoklonal antikorlar kullanılarak immünfloesan antikor (IFA) yöntemi kullanılarak belirlenir. Virüs kültüründe sitopatik etki ve plak oluşumlarının iyi görülebilmesi için pasajların seri yapılması gerekmektedir. Bu şekildeki tanı hızlı olmasına karşın daha az duyarlıdır (Whitehouse, 2004). Serolojik Tanı: Virüse ve virüs antijenlerine karşı oluşmuş antikorların serolojik olarak gösterilmesi esasına dayanan bir yöntemdir. Hastalığın 6. gününden itibaren alınan kan örneklerinde virüse karşı oluşmuş IgM ve IgG antikorları hızlı bir biçimde ELISA yöntemi ile saptanabilmektedir. IgG antikorları 5 yıla kadar saptanabilecek seviyede kalabilirken, IgM antikorları 4. ayın sonunda serumda saptanamayacak kadar azalır (Saijo ve ark., 2005). Moleküler Tanı: KKKA Virüsü; Real Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu( Real Time PCR) ve Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) ile hastadan 16. güne kadar alınan serum örneklerinden saptanabilmektedir (Drosten ve ark., 2003). 2.3.5. KKKA Hastalığının Tedavisi Virüslere karşı aşı bulunmadığından hastaların tedavisinde genellikle destek tedavisi yöntemi esas alınır. Destek tedavisinde hastaya trombosit, donmuş plazma ve eritrosit solüsyonlarının verilmektedir. Etkinliği ve etki mekanizması tam olarak bilinmemesine karşın, KKKA tedavisinde kullanılan tek antiviral ilaç Ribavirindir (Watts ve ark., 1989). Ribavirin yapı yönünden guanozine benzemesi nedeniyle, guanozin ön maddelerinin sentezini bozarak virüslerde kalıp çıkmasını engellemektedir. Vücutta önce fosfatlanan ribavirin, adenozin kinaz aracılığında ribavirin 5 monofosfata dönüşür. Oluşan ribavirin 5 monofosfatinozin monofosfat dehidrogenazın etkinliğini inhibe ettiğinden dolayı

13 inozin monofosfat ksantin monofosfata dönüşemez. Bu durumun bir sonucu olarak guanin nükleotidlerinin sentezi yapılamaz ve guanozin trifosfatın hücre içi yoğunluğu azalır. Ribavirin 5 -monofosfat, tekrar fosfatlanır ve ribavirin 5 -trifosfat oluşur. Oluşan bileşik, hem guanozin trifosfat hem de adenozin trifosfat ile yarışmalı bir şekilde viral RNA polimerazın etkinliğini ve bunun sonucunda da yeni kalıbın çıkmasını engeller (Uzun ve Uğurlu, 2004). Ribavirinin viral protein sentezini durdurması olayının, ribavirin 5 -trifosfat n, viral mrna nın konak hücre ribozomuna bağlanmasını engelleyerek gerçekleştirdiği de ifade edilmektedir (Ustaçelebi, 1992). 2.4. Keneler Kenelerle ülkemizde halk arasında sakırga, yavsı, kerni gibi isimlerle bilinmekte olan Arachnida sınıfına ait canlılardır. Türkiye, bulunduğu iklim kuşağı dolayısıyla kenelerin yaygın olduğu bir ülkedir (Merdivenci, 1969). 2.4.1. Kenelerin Sistematik Özellikleri Keneler Ixodidae, Argasidae ve Nuttalliellidae olmak üzere 3 familya içerisinde incelenmektedir. Ixodidae familyası 14 cins içerisinde yaklaşık 713 tür, Argasidae familyası 4 cins içinde yaklaşık 185 tür içermektedir (Barker ve Murrell, 2004). Barker ve Murrell (2004) e göre sert kenelerin sistematiği aşağıdaki gibidir: Phylum: Arthropoda Subphylum: Chelicerata Classis: Arachnida Subclassis: Acari (Acarina) Ordo: Parasitiformes Subordo: Metastigmata Superfamily: Ixodoidea Family: Ixodidae Genus: Amblyomma, Anomalohimilaya, Bothriocroton, Cornupalpatum, Compluriscutula, Cosmiomma, Dermacentor, Haemaphysalis, Hyalomma, Ixodes Margaropus, Nosomma, Rhipicentor, Rhipicephalus.

14 2.4.2. Kenelerin Yaşam Döngüleri Yumurtadan çıkan larvalar hızlıca ot, çim veya benzeri bitkiler üzerine tırmanırlar. Keneler konaklarını kokularından (laktik asit, karbondioksit, amonyak ve bazı spesifik vücut kokuları), vücut ısısından, titreşimlerden yararlanarak tanırlar. Potansiyel bir konak yaklaştığında dalgalanma benzeri bir hareket yaparak ön bacakları ile yanından geçen konaklarına tutunurlar. Keneler zıplayamazlar ve uçamazlar, sadece temas ile konaklarına yapışırlar. Kene uygun bir yer bulana kadar konak üzerinde bir süre dolaşabilir veya konağına hemen yapışabilir. Sert keneler yavaş kan emerler ve konak üzerinde tamamen doyana kadar kalırlar. Erkek keneler aralıklı olarak kan emerler ve konak üzerinde bir hafta kadar kalabilir. Pek çok erkek kene konak üzerinde kan emerken çiftleşir. Ancak Ixodes cinsi erkek keneler çiftleşme önce kan emmeye ihtiyaç duymaz ve çiftleşme konak üzerinde veya konak dışında gerçekleşebilir. Dişi keneler, erkeklerden daha fazla kan emerler (Merdivenci, 1969; Stafford, 2007; Oliver, 1989). Keneler, genellikle ilkbahar ve sonbahar mevsimleri arasında aktiftirler. Hayatları boyunca geçirdikleri her dönemde (larva-nimf-olgun) mutlaka kan emmek zorundadırlar. Erkek ve dişiler kan emme sırasında çiftleşebilir. Dişi keneler yumurtalarını taş, toprak ve merada yaprakların altına, toplu ve birbirine yapışık şekilde bırakırlar. Yumurtlama süresi ve miktarı, dişi kenenin az veya çok kan emmesine ve diğer dış faktörlere bağlı olarak değişir. Ayrıca türlere göre de yumurta sayısı değişiklik gösterir. Ortalama 3,000 15,000 arasında yumurta yumurtlarlar. Dişiler yumurtladıktan sonra ölürler. Argasidae ailesindeki türlerin dişileri daha az sayıda ve tekrarlı olarak yumurtlar. Yumurtadan çıkan larvalar, 3 çift bacaklıdır. Türlere göre farklı sürelerde konaklardan kan emerler ve kan emdikten sonra yine değişen sürelerde gömlek değiştirerek 4 çift ayaklı nimf olurlar. Nimflerinde de larvalar gibi henüz genital organları gelişmemiştir. Aç olan nimfler konaktan kan emerek doyar ve gömlek değiştirdikten sonra aç erişkin hale gelir. Erkek ve dişi erişkin keneler kan emerken çiftleşir, dişi doyduktan sonra toprağa düşer ve yumurtlar. Dişi ergin keneler, kendilerine tekrardan konak bulurlar, kan emip çiftleşirler ve doyduktan sonrada konağı terk ederek toprağa geçerler. Toprağın uygun bir yerinde yumurtalarını bırakır ve

15 ölürler. Keneler, yaşam döngülerini bu şekilde devam ettirirler (Anonim, 1997;Dohm ve ark., 1996; Sonenshine ve ark., 2002). Bir konaklı keneler gömlek değiştirme dahil bütün gelişme safhalarını aynı konak üzerinde geçirirler (Şekil 2.6.). İki konaklı keneler larva ve nimf dönemlerini bir konakta, erişkin dönemlerini başka bir konakta tamamlar (Şekil 2.7). Üç konaklı keneler ise larva, nimf ve erişkin dönemlerinin her birinde, üç ayrı konaktan kan emerler.(şekil 2.8). Bu dönem içerisinde, larvadan nimfe, nimften erişkine olmak üzere iki defa gömlek değiştirirler. Gömlek değiştirme, kenenin konak sayısı tercihine göre konak üzerinde (bir konaklı kenelerde) veya toprakta (üç konaklı kenelerde) gerçekleşir. İki konak tercihli kenelerdeki gömlek değiştirme ise, larvadan nimfe konak üzerinde, nimften erişkine yerde gerçekleşir (Walker ve ark., 2003). Şekil 2.6. Bir konaklı kenenin yaşam döngüsü (Walker ve ark., 2003)

16 Şekil 2.7. İki konaklı kenenin yaşam döngüsü (Walker ve ark., 2003) Şekil 2.8. Üç konaklı kenenin yaşam döngüsü (Walker ve ark., 2003)

17 2.4.3. Keneler ve KKKAV İnfeksiyonların insanlara bulaşmasında önemli olan türler Ixodidae ailesinde bulunmaktadır. Ambyolomma türleri dışında birçok kene türü KKKA Virüsü ne vektörlük etmektedir. Özellikle Hyalomma cinsi keneler Türkiye nin de içinde bulunduğu coğrafyada çok yaygın olarak bulunmaktadır (Merdivenci, 1969; Özkan, 1978; Karaer ve ark., 1997). Hyalomma türleri KKKAV nin başlıca vektörü olarak kabul edilmektedir. H. marginatum, H. aegyptium, H. detritum, H. anatolicum, H. turanicum, Rhipicephalus bursa ve R. sanguineus türlerinde KKKAV varlığı çeşitli araştırmacılar tarafından gösterilmiştir (Bursalı ve ark., 2010; Tekin ve ark., 2009).

18 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal Çalışmamız 2 aşamalı olarak gerçekleşmiştir. Birinci aşamada, Tokat merkez ve çevre ilçelerindeki karayollarında araç çarpması sonucu ölmüş 49 kirpi (Şekil 3.2.) ve Tokat Taşlıçiflik Köyü nde toplanan 3 kirpi olmak üzere, toplam 52 kirpiden toplanan 54 kenenin sistematik incelemesi yapılmış ve bularda 47 sinde KKKAV varlığı Real Time PCR yöntemi kullanılarak test edilmiştir (Çizelge 3.1.). Toplanan keneler test edilene kadar -86 o C'de muhafaza edilmiştir. İkinci aşamada ise; Amasya Merkez ve ilçelerinde (Şekil 3.1.). 2008 yılı Nisan-Kasım ayları arasında insanlar üzerinden toplanan 250 Hyalomma cinsi kene türünde KKKAV varlığı RT-PCR yöntemi ile test edilmiştir. Şekil 3.1. Amasya Merkez ve ilçeleri (Anonim, 2007)

19 Kirpilerde bulunan kenelerin türlerin teşhislerinde son yapılan çalışmalar ve temel kaynak makale ve kitaplardan (Nuttall ve Warburton, 1911; Pomerantzev, 1950; Arthur, 1960, 1963; Parrish, 1961; Trapido ve ark., 1964; Nemenz, 1967, Merdivenci, 1969; Yamaguti ve ark., 1971; Özkan, 1978; Hoogstraal, 1979; Tanskul ve Inlao, 1989; Walker ve ark., 2000; Horak ve ark., 2002; Apanaskevich ve ark., 2006; Filipova, 1997) yararlanılmıştır. Şekil 3.2. Tokat ili ve ilçelerinde kirpilerden kene toplamak için yapılan arazi çalışması (13.07.2010 - Tokat- Erbaa karayolu)

20 Çizelge 3.1 Tokat merkez ve ilçelerinden toplanan kirpilerde bulunan keneler TARİH GÜZERGÂH KİRPİ SAYISI KENE SAYISI 11.03.2009 Taşlıçiflik Kampüsü 1( canlı) 1 18.05.2009 Tokat-Artova 1 1 02.06.2009 Taşlıçiflik Kampüsü 1( canlı) 35 25.06.2009 Tokat-Erbaa 4 2 25.06.2009 Taşlıçiflik Kampüsü 1(canlı) 0 26.06.2009 Tokat-Niksar 3 1 29.06.2009 Tokat-Pazar 4 0 03.07.2009 Tokat-Reşadiye 5 1 06.07.2009 Tokat-Artova,Yeşilyurt,Çamlıbel 3 1 10.07.2009 Tokat- Pazar, Turhal 2 1 13.07.2009 Tokat-Erbaa 3 2 24.07.2009 Tokat-Erbaa 3 1 27.07.2009 Tokat-Turhal, Zile 3 2 31.07.2009 Tokat-Reşadiye 4 2 03.08.2009 Tokat-Sulusaray 3 1 05.08.2009 Tokat-Erbaa 5 1 07.08.2009 Tokat-Turhal 3 1 10.08.2009 Tokat- Erbaa 3 1 Toplam 52 54 3.1.1. Kullanılan Kimyasal Madde ve Malzemeler High Pure Viral RNA izolasyon kiti (Roche), Transcriptör One Step RT-PCR kiti, DEPC Water, RNA later, etanol, cdna kiti (High Fidelity cdna Kiti), LightCycler Taqman Master (Roche), Problar (5 FAMACASRATCTAYATgCAYCCTgC-- TMR), Primerler (CCRealP1=5 -TCTTYgCHgATgAYTCHTTYC 3,CCRealP2=5 gggatkgtyccraagca 3 ), dh20, erlen, beher, cam şiseler (100, 500, 1000 ml),

21 mezür, bistüri, forcep, enjektör, petri kapları (Isolab), pipet uçları (Corning, Neptune, Eppendorf), mikrosantrifüj ve PCR tüpleri (Axygen) ile diğer laboratuar malzemeleri kullanıldı. 3.1.2. Kullanılan Cihazlar Light Cycler 1,5 (Roche) Real Time PCR cihazı, thermal cycler (Peqlab), santrifüjler (Eppendorf, Hettich), güç kaynağı (Consort), otomatik pipetler (Eppendorf, Brand), manyetik karıştırıcılar, vorteks (Ika), buz makinesi (Scotsman), otoklav (Hiclave), etüv (Memmert), mikrodalga fırın (Arçelik), -20 ve -80 C deki buzdolapları (Uğur, Arçelik, U410 premium), fotoğraf makinesi (Sony) ve saf su cihazları (Mes mp. minipure, Millipore) kullanıldı. 3.1.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ve Revers Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) PCR laboratuar ortamında spesifik DNA dizilerinin, primer adı verilen sentetik oligonükleotid diziler yardımıyla çoğaltılması işlemidir. PCR çeşitlerinden biri olan RT- PCR da kalıp kullanılan RNA dan Revers Transkriptaz enzimleri varlığında komplementer DNA (c DNA) oluşması ve c DNA dan da standart PCR yöntemi kullanılarak polimeraz enzimleri varlığında iki evrede DNA nın çoğaltılması esasına dayanır. Thermus thermophilus gibi bakterilerden üretilen DNA polimerazlar; RNA hem de DNA yı kalıp olarak kullanabileceğinden dolayı RT-PCR işleminde tek başına kullanılabilmektedir.( Mullis, 1990; Bardakçı ve Yenidünya,2007). PCR işlemi sonrasında PCR ürünleri, etidium bromür kullanılarak agaroz jel elektroforezinde koşturulduktan sonra bir UV transillüminatör yardımıyla görüntülenir (Osterman, 1984; Özerol, 2001). hem

22 3.2. Metod 3.2.1. Total RNA Ekstrasyonu Çalışmamızda Amasya bölgesi kenelerinden 250 adet kene 10 arlı gruplandırılarak 25 kene havuzu hazırlanmış ve viral RNA izolasyonu yapılmıştır. Tokat ta kirpilerden toplanan kene örneklerinin her birinden viral RNA izolasyonu yapılmıştır. Kenelerden viral RNA ektrasyonu için Roche un High Pure Viral RNA kiti kullanılarak Viral RNA ekstrasyonu üreticinin prosedürüne uygun olarak yapılmıştır. Kısaca, steril bir petri kabı içine konulan keneler, ortalarından kesilerek bisturi yardımı ile iç organları çıkarılmıştır. Forcep yardımı ile mikrosantrifüj tüplerine alınan dokular, 370 μl RNase free ddh2o ile sulandırıldıktan sonra tüplerin içerisinde ezilerek homojenize edilmiştir. Oluşan homojenat 14.000 rpm de 5 dakika santrifüj edilerek, süpernatant kısmı alındı ve Roche High Pure Viral RNA kiti kullanılarak aşağıda özetlendiği şekilde izole edildi. RNA ekstrasyonu ( Roche High Pure Viral RNA Kitine Göre) 1) Her 10 numune için, bir falcon tüpüne 40 μl Carrier RNA, 4000 μl Binging Buffer eklenerek carrier RNA karışımı hazırlandı, yavaşça karıştırıldı. 2) Filtreli tüpler yerleştirildi. Üzerine 300 μl homojenat( 14.000 rpm de santrifüj edilen numunenin homojenatı), 400 μl Carrier RNA karışımı eklendi. 8000 rpm de 1 dakika santrifüj edildi. 3) Tüpler değiştirilir, tüpler içindeki filtreler yeni tüplere konuldu. Üzerine 500 μl inhibitör removal buffer eklendi ve 8000 rpm de 1 dakika santrifüj edildi. 4) Tüpler değiştirildi, tüpler içindeki filtreler yeni tüplere konuldu, üzerine 400 μl wash buffer eklendi. 8000 rpm de 1 dakika santrifüj edildi. 5) Tüpler değiştirildi, tüpler içindeki filtreler yeni tüplere konuldu, üzerine 450 μl wash buffer eklendi. 8000 rpm de 1 dakika santrifüj edildi. Santrifüj işlemi bitince tüpler santrifüjden çıkarılmadı ve 14000 rpm de 10 sn. daha santrifüj edildi. 6) Tüpler içindeki filtreler RNase free eppendorf tüplerine yerleştirildi, üzerine 50 μl eletion buffer eklendi, 8000 rpm de santrifüj edildi, -86 C de saklandı.

23 3.2.2. cdna Sentezi cdna sentezi (Roche kitine göre) 1. Aşama 9,4 μl Template RNA 2 μl Random hexamer primer 65 C de 10 dakika termal cyclerde inkübe edilir. 2. Aşama 4 μl 5 X Reaction Buffer 0.5 μl RNase İnhibitör 2 μl Deoxynücleotid Mix 1 μl DTT 1.1 μl Transcriptör High Fidelity Revers Transkriptaz. 45 C 30 dakika ; 85 C 5 dakika ; 4C inkübasyon. Çalışmada 47 adet kirpi kenesi RNA ekstratının cdna sentezi bu prosedür kullanılarak hazırlanmıştır ve -86 C de muhafaza edilmiştir. 3.2.3. Real Time RT-PCR Çalışmada 45 adet kirpi kenesi RNA ekstratından sentezlenen cdna örnekleri, bir pozitif bir de negatif kontrol kullanılarak Real Time PCR ile çalışılmıştır. Çalışmamızda KKKAV için spesifik primer seti, FAM (5 )-TAMRA (3 ) işaretli spesifik probe ve Taqman Master (Roche, Germany) kiti kullanılmıştır. Her bir Real Time RT-PCR reaksiyonunda kullanılacak maddelerin son konsantrasyonu ve stok miktarı üretici firma tavsiyesine göre seçilmiş, test edilmiş ve en uygun şartlar belirlenmiştir (Çizelge 3.2.).

24 Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan Real time PCR dizaynı Her test sırasında daha önceden pozitif olduğu bilinen bir pozitif kontrol cdna, negatif kontrol olarak da ddh 2 0 kullanılmıştır. Reaksiyonlar 20 μl hacimde olup testler Light Cycler 1.5 Real Time PCR (Roche) cihazı kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Çizelge 3.3.). 3.2.3.1. Real Time RT-PCR Reaksiyon Koşulları Çizelge 3.3. Çalışmamızda kullanılan Real Time PCR reaksiyon koşulları

25 3.2.3.2. TaqMan Hidroliz Prob Testi (Taqman assays - 5' Nuclease Assays) TaqMan testleri (TaqMan assays) olarak da bilinen hidroliz prob testlerinde, iki floresan etiket ihtiva eden tek bir prob kullanılmaktadır. Probun 5' ucunda bir floresan reporter boya (örneğin; 6-FAM), 3' ucunda ise floresan baskılayıcı (quencher) (örneğin; TAMRA) boya bulunur. Prob normal haldeyken, baskılayıcı reporter boyaya yakındır ve onun floresans sinyalini baskılar (Şekil 3.3.). Prob hedef sekansa hibridize olduğunda,(şekil 3.4.) Taq polimerazın 5' nükleaz aktivitesi hidroliz probunu kırar ve reporter ve baskılayıcının birbirinden ayrılmasına neden olur. Bu durumda baskılayıcı reporter boyanın floresanını baskılayamaz ve reporter floresan ışık yayar. PCR sırasında artan miktarda hedef sekans kadar prob hidrolize olur ve floresans sinyal de artar (Şekil 3.5). Şekil 3.3. Baskılayıcı reporter floresans sinyalini baskılar (Anonim, 2003) Şekil 3.4. Probun hedef sekansa hibridize olduğunda (Anonim, 2003)

26 Şekil 3.5. Probun hidrolize oluşu ve floresans sinyalin artışı (Anonim, 2003) 3.2.4. Real Time Primerleri ve Probun Hazırlanışı Primerler prosedürde belirtilen miktarda PCR grade su eklenerek (P1,P2 = 650 μl ) 20 μm olacak şekilde; probeler ise prosedüre göre 20 μm olacak şekilde hazırlanır. Daha sonra 1 μl probe üzerine 79 μl ddh2o, 20 μl primer üzerine 140 μl ddh2o eklenerek final konsantrasyonu hazırlanmış olur. Primerler 2.5 μm; probe 0.25 μm olacak şekilde elde seyreltilmiştir. 3.2.5. Tek Basamaklı Revers Traskripsiyon PCR ( One Step RT-PCR) Çalışmamızda İnsanlardan toplanan kene örneklerine KKKAV varlığı Roche, One Step RT-PCR kiti ve CC356 F (5-TGGACACCTTCACAAACTC 3_) ve CC536 R (5-_ GACAAATTCCCTGCACCA 3_) primer çifti kullanarak, One Step RT-PCR yöntemi ile test edilmiştir. RT-PCR reaksiyonları içeriği Çizelge: 3.4. te verilmiştir.

27 Çizelge 3.4. Roche Transcriptör One Step RT-PCR kiti prosedürü Reaction buffer 5 μl CC536 F primer CC 536 R primer RNase Free H2O RNA Enzim Toplam Miktar 1 μl 1 μl 13.5 μl 4 μl 0.5 μl 25 μl 3.2.5.1. Thermal Cycler ın Program Ayarı 1. Lid Heat on 110 C 2. 50 C 00.20.00 (1 döngü) 3. 94 C 00.07.00 (1 döngü) 35 döngü 4. 94 C 00.00.10 5. 60 C 00.00.30 6. 68 C 00.00.10 Final uzama (1 döngü) 7. 68 C 00.05.00 8. 4 C Forever

28 3.2.6. Agaroz Jel Elektroforezi RT-PCR işlemi sonucunda oluşan PCR ürünleri, aşağıda açıklandığı şekilde %1 lik agaroz jel elektroforezinde koşturulmuş ve görüntülenmiştir. Kısaca, 0.30 mg agaroz tartılır ve üzerine 30 ml 1xTAE ( ph: 7.5-8.5; 50 nm) eklenerek mikrodalga fırın kullanılarak tamamen çözdürülür. Elektroforez tankının tarakları yerleştirilir. Mikrodalga fırından çıkarılan çözünmüş agaroz jel üzerine 0.5 μl etidyum bromür ilave edilir. Jel elektroforez havuzuna dökülür ve katılaşması beklenir. 2 μl Brom Fenol Blue (BFB) ve 8 μl numuneden alır ve jeldeki kuyucuklara yükleme yapılır. Jelin ilk kuyusuna ise 2 μl standart eklenir. Örnekler 100 ma de yaklaşık 30 dakika koşturulur. Koşturma işleminden sonra agaroz jel bir UV transillüminatör kullanılararak görüntülenir ve fotoğraflanır. 3.2.7. DNA Dizi Analizi Elektroforez yapılan jelde pozitif görülen örneklere ait PCR ürünleri DNA dizisinin belirlenmesi ve KKKV S segment sekansı varlığının doğrulanması için RT-PCR primerleri Refgen (Ankara) firmasına gönderilerek DNA dizi analizi yaptırıldı.

29 4. BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1. Tokat İli ve İlçelerinde Kirpilerden Toplanan Sert Kene Türleri Bu çalışmada kirpiler üzerinde bulunan kene türleri Çizelge 4.1. de verilmiştir. Bu çalışmamızda kirpilerde parazitlenen kenelerin tek bir türle sınırlı olmadığı ve kirpilerde Çizelge 4.1. de verilen kene türlerinin de parazitlendiği belirtilmiştir. Çizelge 4.1. Tokat ili ve ilçelerinde kirpilerden toplanan kene türleri Rhipicephalus turanicus Hyalomma marginatum Hyalomma aegyptium Hyalomma detritium 35 tane 5 tane 5 tane 2 tane 4.2. Tokat İli ve İlçelerinde Kirpilerde Bulunan Sert Kene Türleri ve Bu Türlerin Morfolojik Özellikleri 4.2.1. Hyalomma aegyptium (Linnaeus, 1758) Erkekler: Vücut ovaldir. Renk koyu kahverengimsidir. Hipostom uzundur. Dişler 3/3 sıralıdır. Dişlerin uçları küttür. Capitulum uzun basis capituli altı köşelidir. Cornualar kısa ve uçları yuvarlaklaşmıştır. Scutum donuk, koyu kahverengimsidir. Servikal oluklar çok kısa ve derindir. Üyeler scutum ile aynı renktedir. Eklemlerin birbirine bağlanma noktalarında açık renkli halkalı bölgeler bulunur. Solunum açıklığının kuyruk uzantısı büyük, ince ve ucu küttür. Dışa dönük olan kenarlarındaki kitin halka kalınlaşmıştır. Macula dar ve uzundur. Maculanın ön kısmında bulunan hava deliği yuvarlaktır. Dişiler: Vücut ovaldir. Renk siyahımsı-kahverengidir. Hipostom: Uzun, dişler 3/3 sıralıdır. Her dizideki ilk iki ve son üç diş değerine oranla küçüktür. Boyuna bir sıradaki diş sayısı 10 kadardır. Capitulum uzundur. Basis capituli altı köşelidir. Auriculalar sivri

30 değildir. Cornualar kısa ve kalındır. Scutum yuvarlaktır. Servikal oluklar derin ve arka kenar ile birleşmiştir. Solunum açıklığının dorsal uzantısı ince ve kısadır. Macula uzun, kırmızımsı-kahverengi renkte, boyu eninin yaklaşık üç katıdır. Macula ile çevre halkalar arasındaki gözenekli alan dardır. Boşaltım açıklığı kapakçıkları üzerinde kıllar bulunur. Anal oluk derin, uçları serbest ve arka median olukla birleşmiştir. Konaklar: Özellikle kara kaplumbağalarında bulunmalarının yanı sıra sürüngenlerde, keklik, yabani kemiriciler, sığır, koyun ve insanlardan da kan emebilmektedir. Gelişimini üç konakta tamamlar (Hoogstraal,1956; Kurtpınar, 1954; Merdivenci, 1969, Özkan 1978). 4.2.2. Hyalomma detritum Schulze, 1919 Erkekler: Vücut oval şekillidir. Renk parlak kırmızımsı kahverengidir. Capitulum uzundur. Basis capitulinin eni boyunun iki katı kadar olup üst yüzeyinde dağınık halde büyük ve küçük nokta çukurluklar bulunur. Hipostomda dişler 3/3 sıralıdır. Dişler sivri uçlu, corona küçük ve düzdür. Scutum oval şekillidir. Servikal oluklar derin ve kısadır. Lateral oluklar derin ve uzun olup scutumun orta noktasını geçmektedir. Bacaklardaki açık renkli halkalar belirgindir. I. coxanın iç ve dış spuru eşit boyda ve uçları sivridir. Diğer coxaların spurleri kısa ve küttür. Solunum açıklığının dorsal uzantısı kalın ve ucu dışa doğru büküktür. Solunum açıklığının ön ucu yuvarlaktır. Macula uzun mekik şekillidir. Hava deliği maculanın geniş olan ön kısmında ve ovaldir. Boşaltım açıklığı kapakçıkları birbirine paralel, her kapağın ön ucunda 1, arka ucunda ise 3 er adet kıl bulunmaktadır. Anal oluk dar ve derindir. Dişiler: Vücut oval şekillidir. Gri-kahverengi ile kırmızımsı kahverengi arasında bir renge sahiptir. Capitulum uzun şekillidir. Basis capituli altı köşeli ve eni boyunun iki katıdır. Hipostomda dişler 3/3 sıralıdır. Her sırada 9-10 adet diş bulunmaktadır. Servikal oluklar geniş ve derindir. Scapulalar büyük ve uçları sivri değildir. Büyük ve küçük nokta çukurluklar tüm scutum yüzeyine dağılmış durumdadır. Üyeler açık renkli ve halkasızdır. I.coxa bir yarıkla iç ve dış olmak üzere eşit uzunlukta 2 spure ayrılmıştır.

31 Diğer coxaların iç ve dış spurleri kısa ve küt, iç yüzeyleri yuvarlaklaşmıştır. Solunum açıklığının dorsal uzantısı ince, kısa ve ucu arkaya doğru kıvrık olup ön tarafta dar, kuyruk uzantısının başlangıcına doğru genişlemiştir. Maculanın uç kısımları ince, hava deliği ortada ve ovalimsidir. Boşaltım açıklığı kapakçıkları önde birbirine yakın arkada ise uzaktır. Anal oluk kısa, derin ve uçları serbesttir. Konakları: Sığır, keçi, at, koyun, deve, eşek, köpek, kuş ve deve. İki konaklı kenelerdir (Kurtpınar, 1954; Hoogstraal,1956; Merdivenci, 1969). 4.2.3. Hyalomma marginatum Koch, 1844 Erkekler: Vücut yumurtamsı şekildedir. Renk koyu kırmızımsı kahverengidir. Capitulum uzundur. Basis capitulinin eni boyunun iki katıdır. Basis capitulinin arka tarafı düz, üzerinde büyük ve küçük nokta çukurluklar bulunur. Hipostomda dişleri 3/3 sıralıdır. Her sırada 10 diş bulunur. Servikal oluklar derin olup orta çizgiyi geçmektedir. Median oluklar dar ve derindir ve asimetrik olan fovea dorsalislere kadar uzanmamıştır. I.coxa derin bir yarıkla iç ve dış spure ayrılmıştır. I. coxanın dış spuru iç spuru ile aynı boyda ve sivri uçludur. Diğer coxaların spurleri körelerek kenar tümsekliği şekline dönüşmüştür. Solunum açıklığının dorsal uzantısı kalındır. Macula uzun ve boyu eninin üç katıdır. Boşaltım açıklığının kapakçıkları ön uçta birbirine yakın, arkada daha uzak ve önde çevre halkası kalınlaşmış fakat daha derin ve dardır. Dişiler: Vücut oval şekillidir. Renk koyu, kahverengidir. Capitulum uzundur. Basis capituli altı kenarlı ve boyu eninin yarısı kadardır. Cornualar kısa ve küttür. Poros arealar küçük, ön uçları sivri, arkada daha yuvarlaktır. Hipostomda dişler 3/3 sıralıdır. Her bir sıradaki diş sayısı 12-14 kadardır. Scapulalar büyük fakat uçları sivri değildir. Solunum açıklığının dorsal uzantısı kısa, uç kısmı dışa doğru kıvrıktır. Solunum açıklığının kenar kısmında bir kalınlaşma bulunur. Macula koyu renkli ve uzun mekik şekillidir. Boşaltım açıklığı kapakçıkları iç bükey olup uçlarda birbirine yakındır. Konakları: Koyun, sığır, keçi, deve, eşek, at, katır, kedi, köpek, evcil domuz. İki veya üç konaklıdır ( Hoogstraal,1956; Kurtpınar, 1954; Özkan 1978).

32 4.2.4. Rhipicephalus turanicus Pomerantzev, 1940 Erkekler: Vücut oval şekilli olup önde dar arkada yuvarlatır. Kırmızımsı kahverengi renge sahiptir. Capitulum kısadır. Basis capituli altıgen şekillidir. Eni boyunun yaklaşık 3 katı kadardır. Hipostom kısa ve kalındır. Scutum üzerinde çok sayıda yuvarlak ve büyük nokta çukurluk bulunur. I. coxa derin bir yarıkla iç ve dış olmak üzere iki spure ayrılmıştır. I. koksanın iç ve dış diken boyları birbirine eşittir. İç spurun ucu küt dış spurun ucu sivridir. II. III. ve IV. coxaların dış spurleri daha küçüktür. Solunum açıklığının kuyruk uzantısı uzun ve uzantının uç kısmına kadar aynı genişliktedir. Macula ön bölgede ve boyu eninin üç katıdır. Solunum açıklığının dorsal uzantısının uç kısmında goblet hücreleri daha küçüktür. Boşaltım açıklığı kapakçıkları iç bükey ve arka bölgeleri kıllıdır. Anal oluk belirgindir. Dişiler: Vücut ovalimsi şekilli ve dorsoventral olarak yassılaşmıştır. Capitulum kısadır. Hipostom dişleri 3/3 sıralıdır. Boyuna bir sırada 8 adet diş bulunur. Scutumun eni boyuna eşittir. Servikal oluklar uzun ve derindir. Scutumun üzerinde çok sayıda büyük nokta çukurluklar bulunur. I. koksa derin bir yarıkla iç ve dış olmak üzere iki spure ayrılmıştır. Dış spur ince ve sivri, iç spur kalın ve küt uçludur. Genital açıklık geniş ve arka kenarı yuvarlaktır. Solunum açıklığı büyük ve dörtgenimsi şekillidir. Solunum açıklığının dorsal uzantısı kısa, kısmen kalın ve hafifçe yukarıya yönelmiştir. Genital ve anal oluklar belirgindir. Konaklar: Koyun, keçi, köpek, eşek, deve, manda, at, kirpi, çakal. Üç konaklı kenelerdir (Kaiser ve Hoogstraal, 1963; Merdivenci, 1969). 4.3. Tokat İli ve İlçelerindeki Kirpilerden Toplanan Kenelerin Türlerinde KKKAV Varlığının Belirlenmesi Bu çalışmamızda kirpilerden toplanan 35 adet Rhipicephalus turanicus, 5 adet Hyalomma marginatum, 5 adet H. aegyptium ve 2 adet de H. detritum türlerinde KKKAV varlığı Real Time RT-PCR yöntemiyle test edilmiştir. RT-PCR sonuçları çalışılan 47 kene numunesi arasından taşlı çiftlik köyündeki bir kirpiden toplanan 1 adet H. aegyptium türü sert kenenin KKKAV pozitif olduğunu göstermiştir (Şekil 4.1). Buna

33 göre KKKA pozitif oranı % 2,12 dir. Sonuç olarak kirpilerde bulunan H. aegyptium türünde KKKAV varlığı ilk defa bu çalışma ile gösterilmiştir. Pozitif Kontrol KKKAV Pozitif Kene Negatif Kontrol KKKAV Negatif Kene Şekil 4.1.Kenelerde KKKAV varlığının Real Time RT-PCR ile belirlenmesi. Tokat Merkez ilçesinde bir kirpiden toplanan H.aegyptium türü sert kenede KKKAV varlığı gösterilmiştir 4.4. Amasya İli ve İlçelerinden Toplanan Kenelerden KKKA Pozitif Örneklerin Tespiti ve PCR Ürünlerinin Dizi Analizi Çalışmamızda Amasya ilinde insanlardan toplanan 250 Hyalomma kene örneği cins seviyesinde gruplanarak test edilmiştir. Bu grupları oluşturan keneler özellikle H. marginatum, H. detritum, H.turanicum, H. anatolicum türlerinden oluşturulmuştur. Hazırlanan 25 Hyalomma kene havuzu RT-PCR yöntemi kullanılarak test edilmiştir. RT-PCR sonuçları ve sekans analizlerine göre 7 kene havuzunun KKKAV pozitif

34 olduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.2). Diğer bir değişle test edilen kene havuzlarının % 28 i KKKAV pozitif bulunmuştur. Bu sonuç Amasya Hyalomma türü kenelerinin KKKAV bulaştırma potansiyeli taşıdıklarını açıkça göstermektedir. Şekil 4.2.İnsanlardan toplanan sert kenelerde KKKAV varlığının tek basamaklı RT- PCR ile belirlenmesi. RT-PCR ile test edilen kene örneklerinden elde edilen PCR ürünlerinde KKKAV spesifik ürün varlığının agaroz jel elektroforeziyle (%1 lik) görüntülenmesi (MW: Moleküler Ağırlık, 1, 2, 3, 8, 11 ve 12 numaralılar KKKA pozitif, 4,5 ve 10 KKHA negatif, 6 ve 14 pozitif kontrol, 7 ve 13 negatif kontrol) 4.5. Amasya Kenelerinde Bulunan KKKAV nin Filogenetik Analizi Filogenetik analiz sonuçları çalışmamızda Amasya kenelerinde bulunan KKKAV nin Avrupa I Clade inde olduğu gösterilmiş ve Kosova, Bulgaristan ve Rusya KKKAV suşlarına yüksek oranda benzerlik göstermektedir (Şekil 4.3.).