ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Nurten KURT YAŞA BAĞLI OLARAK ANTİOKSİDAN ENZİMLERİNİN SÜPEROKSİT DİSMUTAZ (SOD), KATALAZ (CAT) AKTİVİTELERİNİN VE MALONDİALDEHİT (MDA) SEVİYESİNİN İNCELENMESİ KİMYA ANABİLİM DALI ADANA, 2008
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YAŞA BAĞLI OLARAK ANTİOKSİDAN ENZİMLERİNİN SÜPEROKSİT DİSMUTAZ (SOD), KATALAZ (CAT) AKTİVİTELERİNİN VE MALONDİALDEHİT (MDA) SEVİYESİNİN İNCELENMESİ Nurten KURT YÜKSEK LİSANS KİMYA ANABİLİM DALI Bu tez / /2008 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği /Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza... İmza.. İmza.. Yrd.Doç.Dr.Ramazan BİLGİN Prf.Dr.Seyhan TÜKEL Doç.Dr.Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Kimya Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof.Dr.Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Birimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FEF2007YL21 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanundaki hükümlere tabidir.
ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ YAŞA BAĞLI OLARAK ANTİOKSİDAN ENZİMLERİNİN SÜPEROKSİT DİSMUTAZ (SOD), KATALAZ (CAT) AKTİVİTELERİNİN VE MALONDİALDEHİT (MDA) SEVİYESİNİN İNCELENMESİ Nurten KURT ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ KİMYA ANABİLİM DALI Danışman : Yrd.Doç.Dr. Ramazan BİLGİN Yılı : 2008 Sayfa:42 Jüri : Yrd.Doç.Dr. Ramazan BİLGİN Prof. Dr. Seyhan TÜKEL Doç.Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Bu çalışmada, süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) enzim aktiviteleri ve malondialdehit (MDA) seviyelerinin yaşa bağlı değişimleri incelenmiştir. 84 sağlıklı birey 2-11; 12-24; 25-40; 41-69 yaş olmak üzere 4 grupta incelenmiştir. SOD aktivitesinde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı bulunmuştur. CAT aktivitesinde ise 2-11 yaş grubu ile 12-24 yaş grubu arasında anlamlı bir fark olduğu (P< 0,05), fakat diğer gruplar arasında anlamlı bir fark olmadığı gözlenmiştir. MDA seviyelerinde ise 2, 3 ve 4. gruplar 1. grup ile kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olduğu (P<0,0001), ancak 2,3 ve 4. gruplar birbirleriyle kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olmadığı bulunmuştur. Anahtar kelimeler: Yaşlanma, SOD, CAT, MDA I
ABSTRACT MSc THESIS INVESTIGATION OF ANTIOXIDANT ENZYME ACTIVITES SUPEROXIDE DISMUTASE (SOD) AND CATALASE (CAT) AND LEVEL OF MALONDIALDEHYDE (MDA) DEPENDING ON AGEING. Nurten KURT DEPARTMENT OF CHEMISTRY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor : Asst. Prof. Ramazan BİLGİN Year : 2008 Pages:42 Jury : Asst. Prof. Dr. Ramazan BİLGİN Prof. Dr. Seyhan TÜKEL Assoc. Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ In this study, we determined erythrocyte superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities and malondialdehyde (MDA) levels to evaluate the agerelated changes in healthy subjects. 84 healthy subjects divided in four groups as 2-11; 12-24; 25-40; 41-69 of age were investigated. No statistically significant difference in SOD activity was found among the all groups. A statistically significant difference in CAT activity was found between group 2-11 and 12-24 (P<0,05) but no statistically significant difference was observed other groups. When MDA levels of groups 2, 3 and group 4 compared to group 1, a statistically significant difference was found (P< 0,0001) but when groups 2, 3 and group 4 compared to each other, no statistically significant difference was found. Key Words: Aging, SOD, CAT, MDA II
TEŞEKKÜR Yüksek Lisans eğitimim ve tez çalışmam boyunca engin bilgi ve deneyimleri ile bana yol gösteren, sabrını ve hoşgörüsünü esirgemeyen danışman hocam Sayın Yrd. Doç.Dr. Ramazan BİLGİN e, sayın hocalarım Prof. Dr. Seyhan TÜKEL ve Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ e, Tezin oluşum süreci içinde benden yardımlarını esirgemeyen çalışma laboratuarındaki hocalarım Arş. Gör. Özlem ALPTEKİN, Hasan KARADAĞ ve Deniz YILDIRIM a ve ayrıca kan örneklerinin sağlanmasında yardımcı olan Ç.Ü Tıp Fakültesi Kan Merkezinde çalışan bütün personele, Hayatımın her döneminde yanımda olan benden maddi manevi desteklerini esirgemeyen sevgili aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III
İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT.. II TEŞEKKÜR.. III İÇİNDEKİLER. IV ÇİZELGELER DİZİNİ.. VII ŞEKİLLER DİZİNİ VIII SİMGE VE KISALTMALAR XVI 1.GİRİŞ. 1 1.1. Yaşlanma Nedir?... 1 1.2. Yaşlılık Nedir?... 1 1.3.Yaşlanmaya Neden Olan Mekanizmalarla İlişkili Teoriler... 2 1.3.1. Mitokondriyal Hasar Teorisi.. 2 1.3.2. Epifiz-Melatonin Teorisi...... 2 1.3.3. Telomer Kısalması Teorisi..... 3 1.4. Serbest Radikaller...... 4 1.5. Radikallerin Oluşumu.. 4 1.5.1. Kovalent Bağların Homolitik Kırılması..... 5 1.5.2. Normal Bir Molekülün Elektron Kaybetmesi... 5 1.5.3. Normal Bir Moleküle Elektron Transferi... 5 1.6. Oksidatif Stres. 6 1.7. Yaşlılıkta Oksidatif Stres.... 6 1.8. Oksijen ve Oksijen Radikalleri... 6 1.9. Canlılarda Oksijen Radikallerinin Yapımı...... 8 1.9.1. Endojen Kaynaklı Serbest Radikal Üretim Kaynakları. 8 1.9.2. Eksojen Kaynaklı Serbest Radikal Üretim Kaynakları. 9 1.10. Başlıca Reaktif Oksijen Radikalleri.. 9 1.10.1. Süperoksit... 9 1.10.2. Hidrojen Peroksit... 11 IV
1.10.3. Hidroksil Radikali.... 11 1.10.4. Nitrik Oksit..... 14 1.11. Serbest Radikallerin Etkileri..... 16 1.11.1. Lipidlere Etkileri... 16 1.11.2. Proteinlere Etkileri... 16 1.11.3. Nükleik Asitler ve DNA ya Etkileri. 17 1.11.4. Karbohidratlara Etkileri..... 17 1.12. Radikal Kaynakları.... 17 1.13. Antioksidan Savunma Sistemleri.. 18 1.13.1. Eksojen Antioksidanlar...... 19 1.13.2. Endojen Antioksidanlar.. 19 1.13.2.1. Enzimatik Antioksidanlar.... 19 1.13.2.1.(a). Süperoksit Dismutaz.. 19 1.13.2.1.(b) Katalaz.... 21 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR. 22 3.MATERYAL ve METOD.. 26 3.1. Materyal Metod... 26 3.2. Kullanılan Cihazlar... 26 3.3. Metod.. 26 3.3.1. Süperoksit Dismutaz Tayini...... 26 3.3.2. Katalaz Enzim Tayini... 28 3.3.3. Hemoglobin Tayini........ 29 3.3.4. Malondialdehit Tayini....... 30 4.BULGULAR ve TARTIŞMALAR... 32 4.1. Bulgular... 32 4.1.1. Malondialdehit Standart Eğrisi... 32 4.1.2. Süperoksid Dismutaz ve Katalaz Aktiviteleri ve Malondialdehit Seviyelerinene Ait Bulgular.. 33 4.2. Tartışma... 35 5.SONUÇLAR ve ÖNERİLER. 37 KAYNAKLAR.. 38 V
ÖZGEÇMİŞ... 42 VI
ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. Oksijen ve Nitrik oksitten oluşan başlıca reaktif türleri..... 8 Çizelge 4.1. MDA standartlarının 532 nm de alınan absorbans değerleri... 32 Çizelge 4.2. Sağlıklı bireylerde SOD ve CAT aktiviteleri ve MDA seviyesinin yaşa bağlı olarak değişimi... 33 Çizelge 4.3. Cinsiyete göre SOD ve CAT aktiviteleri ile MDA seviyesinin yaşa bağlı olarak değişimi.. 34 VII
ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 4.2. Standart MDA Eğrisi.... 32 VIII
SİMGELER VE KISALTMALAR SOD : Süperoksit Dismutaz CAT : Katalaz MDA : Malondialdehit Hb : Hemoglobin Prot : Protein NO : Nitrik Oksit NOS : Nitrik Oksit Sentataz GSH : Glutatyon GSSG : Okside Glutatyon NADPH : Nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat cgmp : Siklik Guanozin Monofosfat TBARS : Tiyobarbütirik Asit IX
1. GİRİŞ Nurten KURT 1. GİRİŞ 1.1 Yaşlanma Nedir? Yaşlanma her canlıda görülen, tüm işlevlerde azalmaya neden olan evrensel bir süreç olarak tanımlanabilir. İnsan vücudunun, organ ve sistemlerinde zamanın ilerlemesi ile ortaya çıkan, geriye dönüşü olmayan yapısal ve işlevsel değişikliklerin tümüdür. Yaşlanma doğal ve kademeli bir değişimdir. Genel olarak yaşlanma, organizmanın zaman içinde aşama aşama dış uyarılara yeterince uyum göstermemesidir. Yaşlanma bedenin bütün yüzeylerinde görülür. Saçların ağarması, hareketlerin yavaşlaması, görmenin zayıflaması gibi (Hipkiss, 2004). 1.2. Yaşlılık Nedir? Yaşlılık kaçınılmaz bir süreçtir. Yaşlılık, algılama, bellek ve yaratıcılık yeteneklerinin azalmasıdır. Yaşlılık birçok sorunları da beraberinde getirir (Ferrari, 2007). Bunlardan bazıları: Damarlarda sertlik, eklemlerde dejenerasyon meydana gelir. İskelet yapısı bozulur. Kemikler incelir, kırılganlaşır. Refleksler yavaşlar. Kan damarları, sinirler, vücut derisi elastikiyetini kaybeder. Yürüme, koşma, boşaltım yavaşlar. Hormon ve üreme etkinlikleri durur. Bellek kaybı ve unutkanlık başlar. 1
1. GİRİŞ Nurten KURT 1.3 Yaşlanmaya Neden Olan Mekanizmalarla İlişkili Teoriler Yaşlanma olayının ana mekanizmaları moleküler düzeyden organ sistemlerinin fonksiyonel düzeylerine kadar uzanan süreçle meydana gelen spesifik değişiklikleri kapsar. Yaşlanmanın temel prensip ve özelliklerini açıklamaya çalışan biyolojik mekanizmalar genellikle teori seviyesindedir ve hiçbiri tek başına yaşlanmayı açıklamak için yeterli değildir. Yaşlanmaya neden olan mekanizmalarla ilişkili başlıca teoriler şunlardır: 1) Oksidatif Stres ve Serbest Radikaller İle İlişkili Olan a)mitokondriyal Hasar Teorisi b)epifiz-melatonin Teorisi 2) Telomer kısalması (Hipkiss, 2004). 1.3.1 Mitokondriyal Hasar Teorisi Serbest oksijen radikallerine ait metabolizma mitokondriyal olarak yürütülür. Yaşın ilerlemesi ile birlikte çizgili kasta, kalp kasında, diyaframda ve beyinde de mitokondriyal DNA serbest oksijen radikal hasarı gelişir. Meydana gelen bu hasarın kalp kasında 129 yaştan daha fazla yaşla bağdaşamayacağı hesaplanmıştır. Mitokondriyal solunum hasarları sadece dokularda değil Parkinson, Alzheimer ve diğer yaşla artan hareket bozukluklarında da artmaktadır. Ancak kalori kısıtlamasıyla bu hasarın azaldığı gösterilmiştir 1.3.2. Epifiz-Melatonin Teorisi Beyinde bulunan nöroendokrin bir organ olan pineal bez dış çevrenin aydınlık ve karanlık olmasına göre organizmanın başta endokrin sistem olmak üzere birçok sistemin fonksiyonundaki değişiklikleri düzenler. 2
1. GİRİŞ Nurten KURT Melatonin sirkadiyen ritimler, uyku, ruhsal durum, üreme, tümör gelişimi ve yaşlanma gibi birçok olayın biyolojik regülasyonunda rolü olabileceğine dair kanıtlar bulunmaktadır. Hem in vitro hem de in vivo çalışmalarda melatonin güçlü bir serbest radikal süpürücü ajan olduğu gösterilmiştir. Oldukça toksik olan hidroksil radikalleri başta olmak üzere diğer serbest oksijen radikallerinin neden olduğu oksidatif hasardan makro molekülleri özelliklede DNA yı koruyabilir. DNA hasarı oluşturan radikaller hücrede nükleer bir enzim olan poli-adp (PARS) riboz sentazı aktive ederler. Bu enzim, DNA tek zincirinin kırılması ile aktive olur ve hücrelerde şiddetli enerji tüketimine yol açarak hücre ölüme neden olur. Melatonin bunu engelleyen maddedir. 1.3.3. Telomer Kısalması Teorisi Telomer, kromozom uçlarında altı tane bazın tekrarından oluşan DNA dizinlerdir. Bu altı baz insanlarda TTAGGG şeklindedir ve 5-7 bin kez tekrarlanır. Kromozomun fiziksel yapısını korurlar. Telomer tekrarları her hücre bölünmesinde kısalır. Kritik uzunluğa erişen telomerler hücre bölünmesini durdurur. Telomerler memeli hücrelerinde bilinen tek RNA-reverstranskriptaz olan telomeraz tarafından sentezlenir. Telomeraz 1990 ların başında Blackburn tarafından bulunmuş bir enzimdir. Normal DNA sentezi DNA yı kalıp olarak kullanarak yeni DNA sentezlerken, telomeraz protein yapısına katılan RNA yı kalıp olarak kullanarak (RNA virüsleri gibi) DNA sentezler. Telomeraz hipotezi ilk olarak SSCB de çalışan bir bilim adamı tarafından 1971 yılında ortaya atılmıştır. Olevnikov normal DNA sentez mekanizmalarıyla kromozomların uçlarının sentezlenemeyeceğini teorik olarak ileri sürmüştür. Bir sonraki yıl DNA hipotezini ve sentezi hipotezlerini bulan J. D Watson Olevnikov un teorisini desteklemiştir. Ancak 1980 lerin sonunda telomerlerin her hücre bölünmesinde kısaldığı deneysel olarak gösterilmiştir. Hücrenin ve hücrelerden oluşan organizmaların yaşlanmasını tetikleyen işte bu DNA dizinleridir. Çünkü telomeraz enzimi, bozuma uğramış telomerleri onarsa dahi tam bir geri dönüşüm yaratmaz ve telomerler belirli bir kısalığa geldiklerinde 3
1. GİRİŞ Nurten KURT hücre, bölünme eylemini tamamen durdurarak yıkım sürecine girer. Genetikçilerin bir yandan yaşlanmayı öte yandan kanseri önleme amaçlı araştırmalarında birincil dayanak noktası bu küçük DNA dizinleri olmuştur. Ortalıkta telomeraz varsa bölünme sürekli devam eder. Bir kanser vakasında bu telomerazın payı büyüktür. 1.4. Serbest Radikaller Serbest radikaller yaşam için gereklidir. Elektron transferi, enerji üretimi ve pek çok diğer metabolik işlevde temel oluşturur. Oksidasyona neden olan serbest radikaller temel olarak oksijen kaynaklı metabolitler (süperoksit anyonlar (O - 2 ), hidrojen peroksit(h 2 O 2 ), hidroksil radikali (OH - ), hipoklorik asit, kloroaminler, azotdioksit, ozon ve lipit peroksitlerdir. Bunlar organizmalar tarafından hücre içinde mitokondriyal solunum zincirinde ya da hücre dışında özellikle fagositler tarafından oluşturulur. Serbest radikaller kontrolsüz bir davranış gösterirse hücrede hasarlara neden olur. Bilim adamları 1954 lerden beri serbest radikallerin yaşlanma ve dejeneratif hastalıklara neden olduğunu bilmektedirler. 1.5. Radikallerin Oluşumu İçinde bulunduğumuz çevrede çeşitli fiziksel ve kimyasal olaylar nedeniyle sürekli bir radikal oluşumu vardır. Hücrelerdeki metabolik olaylar sırasında farklı tür ve miktarlarda radikaller oluşmaktadır. Radikaller pozitif yüklü veya yüksüz olarak bulunabilirler. Radikaller başlıca 3 temel mekanizmayla oluşurlar (Cheeseman ve Slater, 1993). 4
1. GİRİŞ Nurten KURT 1.5.1. Kovalent Bağların Homolitik Kırılması Yüksek enerjili elektromanyetik dalgalar veya yüksek sıcaklık (500-600 C) kimyasal bağların kırılmasına neden olur. Kırılma arasında bağ yapısındaki iki elektronun her biri ayrı ayrı atomlar üzerinde kalıyorsa, bu tür kırılmaya homolitik kırılma denir. Organik moleküllerdeki bağların heterolitik kırılması durumunda zıt yüklü iyon çiftleri oluşur ve bu türler de reaktiflerdir. 1.5.2. Normal Bir Molekülün Elektron Kaybetmesi Radikal özelliği bulunmayan bir molekülden elektron kaybı sırasında dış orbitalinde paylaşılmamış elektron kalıyorsa, radikal formu oluşur. Örneğin askorbik asit, glutatyon ve tokoferoller (E vitamini) gibi hücresel antioksidanlar, radikal türlere tek elektron verip radikalleri indirgerken, kendilerinin radikal formları oluşur. Glutatyon (GSH) radikalleri indirgerken, kendisinin tiyil radikali oluşur (GS ). İki tiyil radikalinin birbiriyle tepkimesi sonucu oluşan tür ise glutatyonun oksitlenmiş (GSSG) formudur. 1.5.3. Normal Bir Moleküle Elektron Transferi Radikal özelliği taşımayan bir moleküle tek elektron transferi ile dış orbitalinde paylaşılmamış elektron oluşuyorsa, bu tür indirgenme radikal oluşumuna neden olabilir. Örneğin moleküler oksijenin tek elektron ile indirgenmesi, radikal formu olan süperoksitin (O 2ˉ ) oluşumuna neden olur. Bu mekanizma ile radikal yapımı biyolojik sistemlerde yaygın olarak gerçekleştiğinden canlılar için önemlidir. Canlılarda çok sayıda enzimatik olmayan tepkimelerle süperoksit üretilir. Süperoksit radikalinin yapımındaki artış, oksijenin diğer radikal türlerinin ve diğer atom merkezli radikallerinin oluşumu için etkin rol oynar (Akkuş, 1995). 5
1. GİRİŞ Nurten KURT 1.6. Oksidatif Stres Sağlıklı bireylerde normal metabolizma sonucunda oluşan reaktif oksijen radikalleri vücudun savunma mekanizması olan antioksidan sistem ile uzaklaştırılır. Sağlıklı organizmada oksijen radikalleri ile antioksidan savunma mekanizması tam bir denge halinde çalışır. Bu dengenin radikallerin lehine bozulması ile ortaya çıkan duruma oksidatif stres denir. 1.7. Yaşlılıkta Oksidatif Stres Günümüzde yaşlılık ve oksidatif stres arasındaki ilişki bilimsel açıdan tartışılmaktadır. Oksidatif stres biyolojik molekülleri etkilediği için yaşlılık ile ilgili en önemli olgulardan biri olarak düşünülmektedir. Uyarılmış değişimler biyolojik yapıları daima toplar. Harman a göre yaşlılık süreci, hastalık ve ölümlerdeki artan değişimlerle ilgili olarak, hücre ve dokular için oksidatif zararın birikimidir. Bokov ve ark. (2004) yaşlılığın oksidatif teorisi/serbest radikaller ve yaşlılık için bir belirleyici olarak alınan oksidatif stresin temel kabullerdeki kritik değerlerini ortaya koymuşlardır. Oksidatif stres reaktif oksijen türlerinin (serbest radikaller) üretimi ve antioksidan savunmalar arasındaki dengeyi bozucu olarak tanımlanabilir veya hücresel oksidatif reaksiyonların kontrol dışı olduğu metabolik durum olarak tanımlanabilir. Oksijen metabolizması yaşlılığın pleiotropik yapısının iyi bir örneğidir. Bu metabolizma bir taraftan yaşam için temel bir oluş iken, diğer taraftan uzun vadede toksik etkilere sahiptir (Kaur ve ark., 2007). 1.8. Oksijen ve Oksijen Radikalleri Moleküler oksijen (atmosferik oksijen) dış orbitallerinde paylaşılmamış iki elektron içerir. Bu elektronlar, spinleri aynı yönde ve farklı orbitallerde iken minimum enerji seviyesindedirler. Radikal tanımına göre oksijen diradikal yapıya sahip bir moleküldür. Oysa oksijenin reaktivitesi beklenenin aksine çok düşüktür. Diradikal yapıya sahip olan oksijenin herhangi bir molekülle tepkimeye girebilmesi 6
1. GİRİŞ Nurten KURT için, tepkimeye gireceği molekülün de benzer yapıya (farklı orbitallerde spinleri aynı yönde elektron içermesi) sahip olması gerekir. Oysa başta organik moleküller olmak üzere, atom ve moleküller orbitallerinde elektronları anti paralel ve eşleşmiş olarak içerirler veya paylaşılmamış elektronlar bağlara katılmışlardır. Bunun sonucu olarak oksijenin diğer moleküllere olan reaktivitesi son derece kısıtlanmıştır. Bu kısıtlama spin kısıtlaması olarak adlandırılır. Canlıların oksijeni kullanabilmesi için, oksijene elektron transferi yaparak spin kısıtlamasını aşmaları gerekir. Bu işlem için canlılar geçiş elementleri sınıfından bazı metal iyonlarından yararlanırlar. Geçiş elementlerinden Fe, Cu, Mn, Zn, Co ve Mo vücudun gereksinim duyduğu başlıca eser elementler olup, bu elementler dış orbitallerinde bir veya daha fazla sayıda paylaşılmamış elektron içerirler. Canlılarda oksijeni kullanan enzimler ya da oksijenle etkileşime giren proteinler, bu elementlerden en az bir tanesini içermek zorundadırlar (Aust ve ark., 1985). Biyolojik sistemlerde radikaller kavramından bahsedildiğinde genel olarak oksijen merkezli radikaller akla gelir. Oksijen dışında da radikaller oluşmaktadır. Bu anlayışın başlıca haklı gerekçeleri şunlardır: 1. Diğer atom merkezli radikaller büyük bir hızla oksijenle tepkimeye girerler ve tepkimede paylaşılmamış elektron oksijen atomu üzerine kayar; radikal özelliği oksijen atomu üzerinde devam eder. 2. Moleküler oksijen hücrelerde devamlı olarak kullanılan bir moleküldür. Oksijeni kullanabilmek için elektron transferi ile spin kısıtlamasının aşılması gerekir. Bu nedenle de oksijen metabolizması sırasında reaktif radikal türlerinin oluşması kaçınılmazdır. 3. Elektrofilik bir atom olan oksijen, dış orbitaline elektron alarak biyomolekülleri oksitler, bu sırada kendisinin radikal türleri oluşur. Metal iyonları oksijenin bu tür oksitleyici etkilerini hızlandırırlar. 7
1. GİRİŞ Nurten KURT 1.9. Canlılarda Oksijen Radikallerinin Yapımı Oksijen bulunan bir ortamda çeşitli fiziksel ve kimyasal etkenlerle oksijen radikalleri yapılabilir. Özellikle oksijenin metabolize edildiği canlılarda önemli derişimlerde radikal üretimi gerçekleşir. Hücrelerde oluşabilen oksijen radikalleri ile oksijen içeren reaktif türlerin önemli olanları Çizelge 1,1. de görülmektedir. Oksijen radikalleri dış kaynaklı (ekzojen) ve iç kaynaklı (endojen) olarak oluşmaktadır. Normal metabolik olaylar sırasında ara ürün olarak oluşabilmektedir. Bu radikaller belirli seviyenin üzerine çıktığı zaman canlı için ciddi tehlikeler oluşturmaktadır. Ancak tamamen istenmeyen yapılar değildirler ve bazı proseslerde bunların varlığı gerekmektedir. Çizelge 1,1. Oksijen ve nitrik oksitten oluşan başlıca reaktif türler. Tür Adı Tür Adı 1 O 2 Singlet oksijen HO 2 Hidroperoksil radikali O 2ˉ Süperoksit NO Nitrik oksit H 2 O 2 Hidrojen peroksit NO 2 Azot dioksit OH Hidroksil radikali + NO 2 Nitril katyonu ROO Peroksil radikali ONOOˉ Peroksinitrit anyonu ROOOH Hidroperoksit ONOO Peroksinitrit radikali RO Alkoksil radikali N 2 O 3 Diazot trioksit 1.9.1. Endojen Kaynaklı Serbest Radikal Üretim Kaynakları Mitokondriyal elektron transport sistemi reaksiyonları Oksijenaz enzimlerinin reaksiyonları Antimikrobiyal aktivite sırasında oluşan solunum patlaması Otooksidasyon reaksiyonları 8
1. GİRİŞ Nurten KURT 1.9.2. Eksojen Kaynaklı Serbest Radikal Üretim Kaynakları Radyoaktivite Ultrason Ksenobiyotikler (Yabancı kimyasallar) (Sies, 1991) Vücudumuzda oluşabilen radikallerin sayısı yüzlerce farklı tür şeklinde ifade edilebilirse de, bu radikaller arasında süperoksit, hidrojen peroksit, nitrik oksit ve hidroksil radikalinin özel yerleri vardır (Kenneth, 1998). Bu radikaller içinde süperoksit ve nitrik oksit temel radikaller sayılabilir. Çünkü süperoksit ve nitrik oksit enzimatik mekanizmalarla, devamlı olarak ve önemli derişimde üretilen radikallerdir. Ayrıca bu iki radikal, biyolojik sistemlerde tanıdığımız diğer bütün önemli radikaller ile radikal yapıda olmayan reaktif türlerin oluşumunu başlatabilecek özelliktedirler. Normal biyokimyasal tepkimeler sırasında oluşan oksijen radikalleri ile çeşitli biyolojik fonksiyonları yerine getirmek üzere üretilen nitrik oksitin derişimleri genellikle çok düşüktür. Düşük derişimlerdeki reaktif türler, hücrelerin antioksidan sistemleri tarafından aktif olmayan şekle dönüştürüldüklerinden önemli zararlı etkilere neden olmazlar. Ancak bu radikallerin yapımları çeşitli hastalık durumlarında artabilir, çoğunlukla da her iki radikal bileşik grubunun oluşumu birbiri ile paraleldir. Örneğin iltihap durumlarında aktifleşen lökositler aynı anda hem oksijen radikallerini hem de nitrik oksiti yüksek konsantrasyonlarda sentezlerler. Nitrik oksit, oksijen radikalleri ile tepkimeye girerek veya oksijenli ortamda oksitlenerek, kendisinden çok daha reaktif türlerin oluşumuna neden olur. 1.10. Başlıca Reaktif Oksijen Radikalleri 1.10.1. Süperoksit Canlılarda oluştuğu ilk gösterilen radikal olan süperoksit, başlıca şu mekanizmalarla üretilmektedir: 9
1. GİRİŞ Nurten KURT İndirgeyici özellikteki biyomoleküller oksijene tek elektron verip kendileri oksitlenirlerken süperoksit radikali oluşur. Hidrokinonlar, flavinler, tiyoller, ferrodoksinler, indirgenmiş nükleotidler gibi yüzlerce biyolojik molekül aerobik ortamda oksitlenirken süperoksit yapımına neden olurlar. Başta çeşitli dehidrojenazlar ve oksidazlar olmak üzere, yüzlerce enzimin katalitik etkisi sırasında süperoksit radikali oluşabilir. Mitokondrideki enerji metabolizması sırasında oksijen kullanılırken, tüketilen oksijenin %1-5 kadarı süperoksit yapımı ile sonlanır. Buradaki radikal yapımının nedeni NADH dehidrojenaz ve koenzim Q gibi elektron taşıyıcılardan oksijene elektron kaçağının olmasıdır. Sitokrom oksidaz, Fe: Cu: Zn: Mg atomlarını 2:2:1:1 oranında içeren bir protein olup, süperoksit dismutaz, katalaz ve peroksidaz aktivitelerine sahiptir. Bu sayede, sitokrom oksidaz üzerinde süperoksit veya hidrojen peroksit oluşsa bile, içerdiği enzimatik aktivite sayesinde hızla ortamdan temizlenir. Aktifleşen fagositik lökositler bol miktarda süperoksit üreterek; ürettikleri süperoksitleri fagozom içine ve bulundukları ortama verirler. Antibakteriyel etki için gerekli olan bu radikal yapımı, daha reaktif türlerin oluşumunu da başlatır. Bu örnekte görüldüğü gibi radikal yapımı bazı hücresel fonksiyonlar için gerekli de olabilir (Steinman, 1982). Hücresel koşullarda üretilen süperoksit, oksitleyici veya indirgeyici olarak davranabilir. Aldığı elektronu metal iyonuna, sitokrom C ye veya bir radikale verirse tekrar oksijene oksitlenir. Oksijenden daha oksitleyici olan süperoksit bir elektron daha alırsa peroksi anyonuna indirgenir: 2H + O 2ˉ + eˉ O 2ˉ2 H 2 O 2 Yukarıdaki tepkime biyolojik moleküllerin oksidasyonuna neden olduğundan tercih edilmez. Aerobik canlılarda süperoksitlerin H 2 O 2 ye çevrilmesi katalitik aktivitesi çok yüksek bir enzim olan süperoksit dismutaz (SOD) tarafından katalizlenir: 10
1. GİRİŞ Nurten KURT SOD O 2ˉ O 2ˉ + 2H + H 2 O 2 + O 2 1.10.2. Hidrojen Peroksit Hidrojen peroksit, oksijenin enzimatik olarak iki elektronla indirgenmesi ya da süperoksitin enzimatik olmayan tepkimeleri sonucu oluşur. Nötral ve asidik koşullarda net yük taşımaz, biyolojik zarları kolayca geçebilir. Yapısında paylaşılmamış elektron içermediğinden radikal özelliği taşımaz, reaktif bir tür değildir. Hidrojen peroksitin oksitleyici bir tür olarak bilinmesinin nedeni; Cu, Fe gibi metal iyonları varlığında hidroksil radikalinin öncülü olarak davranmasıdır (Elstner, 1991). Hidrojen peroksit özellikle proteinlerdeki hem grubunda bulunan demir ile tepkimeye girerek yüksek oksidasyon düzeyindeki ferril [Fe (IV)] ve perferril [Fe(V)] oluşumuna neden olur. Bu formdaki reaktif demir çok güçlü oksitleyici özelliklere sahip olup, hücre zarlarında lipid peroksidasyonu gibi radikal tepkimeleri başlatılabilir. Belirtilen potansiyel oksitleyici özelliği nedeniyle biyolojik sistemlerde oluşan H 2 O 2 in derhal ortamdan uzaklaştırılması gerekir. Bu görevi, hücrelerdeki önemli antioksidan enzimler olan katalaz ve peroksidaz enzimleri yerine getirirler. 1.10.3. Hidroksil Radikali Hidrojen peroksitin eksik indirgenmesi ile OH yapımı, vücutta bu radikalin en önemli kaynağıdır. H 2 O 2 in iki elektron ile indirgenmesi sonucu su oluşurken, tek elektronla indirgenmesi OH yapımına neden olur. Bu tür indirgenme Fe, Cu gibi metal iyonları tarafından katalizlenir. Askorbik asit, süperoksit gibi indirgeyici bileşiklerin de bulunduğu ortamda, oksitlenen metal iyonu tekrar indirgendiğinden, H 2 O 2 ten OH yapımı sürekli bir duruma gelir. 11
1. GİRİŞ Nurten KURT H 2 O 2 + Askorbat (veya O 2ˉ ) Fe, Cu OH + semihidroaskorbat Haber-Weiss tepkimesi ya da Fenton tepkimesi olarak adlandırılan bu tepkime ile ne kadar OH oluşacağı, vücutta üretilen H 2 O 2 derişimi ve serbest metal iyonunun varlığına bağlıdır. Süperoksit hem H 2 O 2 in öncülü hem de metalleri indirgeyici bir tür olduğundan; ayrıca proteinlere bağlı metallerin indirgenip serbest kalmasına neden olabildiğinden, biyolojik koşullarda süperoksit yapımının arttığı ortamda OH üretimi kaçınılmazdır. Fenton Tepkimesini katalizleyen en aktif metal iyonları demir ve bakırdır. Mangan ve kobalt da bu bakımdan aktif olsalar da, vücuttaki derişimlerinin düşüklüğü nedeniyle demir ile kıyaslandıklarında daha az etkindirler. Serbest metal iyonlarının vücut sıvılarındaki derişimi pratik olarak sıfır kabul edilir, ölçülemeyecek kadar azdır. Demir; metabolizmasının her aşamasında mutlaka ya bir proteine bağlı durumda ya da küçük organik moleküllerle (sitrat, ADP, ATP gibi) kompleks oluşturmuş formda bulunur. Metal iyonlarının proteinlere bağlı formda tutulmaları, OH yapımını önlemenin en kuvvetli yoludur (Kenneth, 1998). Hidroksil radikali biyolojik sistemlerin tanıdığı en aktif türdür ve su dahil ortamda rastladığı her biyomolekülle tepkimeye girer. Bu nedenle 10 9 saniyeden daha kısa bir ömre sahiptir. Hidroksil radikalinin tepkimeleri başlıca: Elektron trasnfer tepkimeleri Hidrojen çıkarma tepkimeleri Katılma tepkimeleri şeklinde gerçekleşir. Bütün bu tepkimeler, OH in paylaşılmamış elektron içeren dış orbitaline elektron alma ilgisinden kaynaklanır. Katılma tepkimeleri özellikle elektronca zengin moleküllerle (pürin ve primidin bazları, aromatik aminoasitler gibi) gerçekleşir. Hidroksil radikalinin organik moleküllerden hidrojen (bir proton ve bir elektron) atomu alarak suya indirgendiği tepkime hidrojen çıkarma tepkimesi 12
1. GİRİŞ Nurten KURT olarak bilinir. Hidrojen çıkarma tepkimesi ile başlayan OH in etkisi, zincirleme tepkimeler şeklinde devam eder. Şöyle ki: Organik bir molekülden (R) hidrojen çıkarılması ile karbon merkezli radikaller derhal ortamdaki oksijen molekülü ile tepkimeye girerek peroksil radikalini (ROO ); peroksil radikali ise OH gibi davranarak bir diğer organik molekülden (R) hidrojen çıkararak yeni bir karbon merkezli radikal (R ) oluşumuna neden olurken, kendisi hidroperoksit (ROOH) formuna indirgenir. Organik hidroperoksit radikal özelliği taşımadığından oldukça stabildir. Oluşan yeni karbon merkezli radikal (R ) ise yukarıdaki gibi yeni bir tepkime dizisini başlatır. Organik hidroperoksitler her ne kadar stabil bileşikler ise de Fe ve Cu gibi metal iyonları varlığında radikalik tepkimelerle parçalanırlar ve bu tepkimeler sırasında yeni karbon merkezli radikaller, oksijen radikalleri, karboniller ile aldehit oluşur: nrooh Fe, Cu RO, OH, ROO, ROOR, R, 1 O 2, karboniller, aldehitler Görüldüğü gibi radikalik tepkimeler stokiyometrik değil, fakat zincirleme tepkimelerdir. Bir tek OH ile başlatılan tepkime, her seferinde katlanarak yayılma yeteneğine sahiptir. Hücre zarında gerçekleşebilen bu tür tepkimelere lipid peroksidasyonu denir. Bir noktada başlatılan tepkime, ortamda uygun bileşikler varsa yayılmaya devam eder. Radikalik tepkimeler; oluşan radikallerin antioksidanlar ile indirgenmesi, radikallerin birbirleri ile tepkimeleri, ya da ortamda tepkimeye girebilecek bileşik kalmaması durumunda sona ererler. Buna göre hücresel koşullarda, oluşan radikalin çok erken safhada indirgenmesi, biyomoleküllerin korunması bakımından hayati öneme sahiptir. Her tür biyolojik molekül OH in bir hedefi ise de, özellikle elektronca zengin bileşikler seçilen tercihli hedeflerdir. Nükleik asitler, proteinler ve lipidlerde başlatılan radikalik tepkimelerde binlerce farklı ara ürünler oluşabilir. 13
1. GİRİŞ Nurten KURT DNA tepkimesi sonucu baz modifikasyonları, baz delesyonları, zincir kırılmaları gerçekleşebilir; ileri derecedeki DNA hasarları tamir edilemediğinden hücre ölümüne sebep olur. Proteinler üzerinde oluşan oksidasyonlar yapı değişimine neden olacağından, proteinler proteolitik yıkıma götürülür. Hücre zarı su içermediğinden OH in başlıca hedefi yağ asitleridir. Zar lipidlerinin peroksidasyonu zarın yapısını bozar ve geçirgenliğini arttırıp yine hücre ölümüne neden olabilir. Bütün bu etkiler ne kadar OH üretildiğine bağlıdır ve gerek H 2 O 2 ten gerekse de organik peroksitlerden (ROOH) OH yapımı ortamdaki serbest metal iyonları tarafından katalizlenir. Metal iyonları varlığında GSH ve askorbik asit gibi önemli antioksidanlar da prooksidan gibi davranmaya başlarlar: ngsh Fe, Cu O 2ˉ, H 2 O 2, OH, RS, RSOO, RSOOH, karboniller Özellikle OH yapımını katalizlemelerindeki etkileri nedeniyle canlılarda metal iyonları radikal hasarlarından birinci derecede sorumludurlar ve bu etkiye neden olamayacakları şekillerde (esas olarak proteine bağlı) tutulmalıdırlar. 1.10.4. Nitrik Oksit Nitrik oksit, yüksek yapılı canlılarda çok önemli biyolojik fonksiyonları yerine getirmek üzere üretilen azot merkezli bir radikaldir. Paylaşılmamış elektron aslında azot atomuna ait ise de, bu elektronun hem azot hem de oksijen atomu üzerinde delokalize olması nedeniyle tam radikal özelliği taşımaz. Bunun sonucu, bilinen diğer radikallere göre reaktivitesi baskılandığından daha uzun ömürlüdür. Yukarıda özetlendiği gibi, oksijen radikalleri çok sayıdaki enzimatik ve enzimatik olmayan yollar ile fiziksel/kimyasal mekanizmalarla oluşturulurlar. Oysa vücudumuzda NO sentezini sağlayan mekanizmalar oldukça kısıtlıdır. Vücuda giren nitro bileşiklerinin metabolize edilmesi sırasında oluşan NO dışında, endojen NO oluşturan tek kaynak nitrik oksit sentetaz (NOS) enzimleridir. 14
1. GİRİŞ Nurten KURT Nitrik oksit NOS enzimi yardımı ile yarı esansiyel amino asit olan L-argininden oksidatif deaminasyon sonucunda sentezlenir (Richard, 1994). Nitrik oksit sentetaz enziminin nöronal (nnos), endotel (enos) ve indüklenebilir (inos) olmak üzere üç formu vardır. enos ve nnos enzimleri tarafından üretilen çok düşük derişimdeki NO sinir sistemi ve düz kaslarda hücre içi ve hücreler arası haberci (messenger) molekül olarak kullanılır. Haberci molekül olarak sitoplazmik guanilat siklazı aktive ederek hücrelerde cgmp derişimini arttırır. cgmp ise çeşitli enzimler yardımıyla hücre içi kalsiyum derişiminin düzenlenmesini sağlar. Nitrik oksit sentetazın indüklenebilir (inos) formu ise başta fagositik lökositler olmak üzere çeşitli hücrelerde bulunur ve sentezi sitokinler ile bakteriyel toksinler tarafından indüklenir (Liew ve ark., 1990). inos enzimin aktivitesi kalsiyumdan bağımsız olup kontrol edilemediğinden ortamda arjinin bulunduğu sürece aktif olup uzun süreli ve yüksek derişimde NO sentezini katalizler. Radikal olarak aktivitesi düşük olan NO, metal içeren merkezler ve radikaller ile büyük bir hızla tepkimeye girer. Özellikle lipid radikallerle (örneğin hücre zarında) tepkimeye girmesi NO e antioksidan bir etki kazandırır. Süperoksit ile NO arasındaki tepkime ile oluşan peroksinitrit (ONOOˉ), hidroksil radikali benzeri aktiviteye sahip olup radikalik tepkimeleri başlatmaya ilave olarak biyomoleküllerin nitrasyonuna neden olur. Fizyolojik (düşük) derişimde üretilen NO esas olarak oksihemoglobin tarafından nitrata (NO 3ˉ) oksitlenerek aktivitesi sonlandırılır (Butler ve ark., 1995). Oksijen radikalindeki durumun aksine, nitrik oksiti ortamdan temizleyen herhangi bir özel enzim yoktur. Aerobik ortamda NO stabil değildir; derişimin artması ile oksidasyon hızlanır. Bu nedenle ortamdaki derişimi ile kendi ömrü arasında ters bir orantı vardır. Özellikle inos enziminin indüksiyonu sırasında NO derişiminin artması ile oksidasyonu da hızlanır ve çeşitli reaktif azot oksit türleri oluşur (Çizelge 1.1). Bu reaktif türler NO in dolaylı etkilerinden sorumlu olup; hücresel proteinlerin, enzimlerin inaktivasyonuna neden olabilirler (Murph,1999). 15
1. GİRİŞ Nurten KURT 1.11. Serbest Radikallerin Etkileri 1.11.1. Lipidlere Etkileri Serbest radikallerin biyolojik dokulardaki doymamış yağ asitlerine etkisi olan lipid peroksidasyonunun toksik olduğu bilinmektedir. Reaksiyonlar zincirleme gerçekleşir ve dönüşümsüzdür. Toksik etki lipid peroksitlerinin düzeyi ölçülerek belirlenir. Doymamış yağ asitlerindeki bir hidrojen atomunun çıkması peroksidasyonun başlamasına neden olur; böylece yağ asiti zinciri lipid radikali niteliği kazanır. Radikal dayanıksız olup, çift bağların yerini değiştirir ve oksijenle reaksiyonu sonucu lipid peroksil radikaline dönüşür. Lipid peroksil radikalleri diğer doymamış yağ asitlerine etki ederek yeni radikalleri oluşturur, bir yandan da hidrojen atomları alarak hidroperoksitlere dönüşürler (Halliwell, 1996). Hidroperoksitlerin parçalanmasıyla lipid alkoksi radikalleri açığa çıkar. Lipid peroksidasyonu antioksidan reaksiyonlarla sonlandırılır ya da devam ederek daha ileriye gider. Lipid peroksidasyonu Fe ve Cu gibi redoks yapan metaller varlığında artar. Lipid peroksidasyon ürünleri olarak açığa çıkan lipid peroksitleri, hidroperoksitleri membran yapısına doğrudan, diğer hücre bileşenlerine ise aldehit üreterek dolaylı olarak zarar verir. Bu da pek çok hastalığın ve doku hasarının oluşmasına neden olur. Membran yapısının bozulması sonucu malondialdehit oluşur (Ansari ve ark., 1989). 1.11.2. Proteinlere Etkileri Proteinler, radikallerin etkilerine lipidlere oranla daha az hassastır ve amino asit dizilişlerine bağlı olarak etkilenirler. Özellikle doymamış bağ ve sülfür ihtiva eden moleküllerin serbest radikallerle etkileşimi yüksektir. Bu nedenle triptofan, tirozin, fenil alanin, histidin, metionin ve sistein gibi amino asitleri içeren proteinler 16
1. GİRİŞ Nurten KURT serbest radikallerden daha kolay etkilenirler. Albumin gibi disülfit bağı fazla olan proteinlerin üç boyutlu yapıları bozulur (Gutteridge, 1995). 1.11.3. Nükleik Asitler ve DNA ya Etkileri Radyasyonla oluşan serbest radikaller, DNA yı etkileyerek mutasyona neden olur ve hücre ölümüne yol açarlar. Bu zararlı etki kromozom değişiklilerine sebep olur. Hidroksil radikali bazlarla kolayca reaksiyona girer. Hidrojen peroksit ise membranlardan kolayca geçip hücre çekirdeğindeki DNA ya ulaşır ve hücre fonksiyonlarının bozulmasına hatta ölümüne yol açar. Bu nedenle DNA daha kolay zarar görebilen bir moleküldür (Agrawal ve Kale, 2001). 1.11.4. Karbohidratlara Etkileri Monosakkaritlerin otooksidasyonu sonucu peroksitler ve okzoaldehitler meydana gelir. Açığa çıkan okzoaldehitler proteinlere bağlanabilme özelliklerinden dolayı antimitotik etki göstererek etki ederler. Bu olaylar kanser ve yaşlanmaya neden olabilir ( Ceballos ve ark., 1992 ). 1.12. Radikal Kaynakları Yaşamamız için mutlaka gerekli bir element olan oksijen, canlıların yaşamının sona erdirilmesinde de etkili olan faktörlerin başında gelir. Canlıların yaşlanması, radikallerin neden olduğu kalıcı hasarların bir birikimi olarak değerlendirilmektedir. Bu açıdan bakıldığında oksijen iki yüzü keskin bir bıçak olarak tanımlanabilecek bir moleküldür. Vücudumuzda üretilen radikaller her zaman tehlikeli ve kötü kimyasal türler olarak değerlendirilmemelidir. Oksijenin biyokimyasal tepkimelerde kullanılması için, reaktif formlarına çevrilmesi zorunludur. Örneğin steroid yapıdaki çok sayıda bileşikler, eikosanoidler gibi biyolojik aktif moleküllerin sentezi; ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu, çok sayıda oksidaz ve hidrolaz enzimlerinin etkileri için ve sitotoksik etkilere sahip 17
1. GİRİŞ Nurten KURT hücrelerin fonksiyonları için radikal yapımı olmazsa olmaz bir koşuldur. Oksijen radikalleri gibi, nitrik oksit radikalinin yapımı da vazgeçilmez bir biyolojik olaydır. Bu radikallerin ne kadar iyi ya da ne kadar kötü olduklarını belirleyen faktör, nerede ve ne kadar üretildiklerine bağlıdır. Biyolojik ihtiyacın üzerinde üretilen radikaller gözlenen toksik etkilerden sorumludurlar. Çevresel faktörler (örneğin iyonlaştırıcı radyasyon), vücuda alınan çeşitli kimyasal bileşikler, çeşitli enfeksiyonlar, doku travmaları ve sayılabilecek diğer çok sayıdaki patolojik durumlar vücutta radikal yapımında artışa neden olurlar. Düşük derişimdeki radikal yapımının etkileri çok uzun bir süreç sonunda, örneğin yaşlanma şeklinde görülürken; yüksek derişimde ciddi bir patolojik durum olarak karşımıza çıkar ( Cheeseman ve Slater, 1993). 1.13. Antioksidan Savunma Sistemleri Serbest radikallerdeki aşırı yüklenme vücut için tehlike oluşturur. Ancak vücudun işlevlerini görebilmesi ve hastalıklardan korunabilmesi içinde gereklidirler. Serbest radikaller vücutta çok hassas bir dengeyle kontrol edilmektedirler. Hücrelerde oksidatif hasarı önleyen, yok eden veya kısmen azaltan bazı mekanizmalar bulunmaktadır. Direkt etki ile oksidanları inaktif hale getiren maddelere antioksidan adı verilmektedir. Tüm antioksidanlar etkilerini başlıca dört farklı şekilde gerçekleştirmektedir: 1) Toplayıcı etki 2) Bastırıcı etki 3) Zincir kırıcı etki 4) Onarıcı etki Antioksidanlar, doğal (endojen kaynaklı) ve doğal olmayan (eksojen kaynaklı) antioksidanlar olmak üzere iki ana grupta toplanabilir (Halliwell ve ark., 1992 ). 18
1. GİRİŞ Nurten KURT 1.13.1. Eksojen Antioksidanlar Trolox-c, Folik asit, Anestezikler, Mannitol, Barbitüratlar, Demir şelatörleri, Bütillenmiş Hidroksi Toluen. 1.13.2. Endojen Antioksidanlar Enzimler; Süperoksitdismutaz (SOD), Katalaz (CAT), Gulutatyon peroksidaz (GSH-Px), Glutatyon-S-Transferazlar (GST), Katalaz (CAT), Mitokondriyal sitokrom oksidaz sistemi, Hidroperoksidaz. Enzim olmayanlar; Melatonin, Seruloplazmin, Transferrin, Miyoglobin, Hemoglobin, Ferritin, Bilirubin, Glutatyon, Sistein, Metiyonin, Ürat, Laktoferrin Albumin. 1.13.2.1. Enzimatik Antioksidanlar 1.13.2.1.(a) Süperoksit Dismutaz Süperoksit dismutaz 1968 yılında oksijenli solunum yapan canlılarda belirlenmiştir. Bu enzim; süperoksitin, hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüşümünü katalizler. Hidrojen peroksit daha sonra glutatyon peroksidaz ve katalaz enzimi aracılığı ile etkisiz hale getirilmektedir. Hücre bölünmelerindeki süperoksit düzeylerini kontrol etmede önemli bir rol oynar ( Fridovich, 1983 ). SOD 2 O 2. - + 2H + H 2 O 2 + O 2 İnsanda SOD nin iki tipi bulunmaktadır. Bunlar, sitozolde bulunan dimerik, Cu ve Zn ihtiva eden izomer (Cu-Zn SOD) ile mitokondride bulunan tetramerik Mn ihtiva eden izomerlerdir (Mn SOD). Genel olarak hücrede bol bulunan izomer sitozolik Cu-Zn SOD dir (Helle ve ark., 1997). 19
1. GİRİŞ Nurten KURT Enzimin fizyolojik fonksiyonu; oksijeni metabolize eden hücreleri süperoksit radikallerinin zararlı etkilerine karşı korumaktır. Böylece lipid peroksidasyonunu inhibe eder. SOD aktivitesi, yüksek oksijen kullanımı olan dokularda fazladır ve doku po 2 artışı ile artar. Normal metabolizma sırasında hücreler tarafından yüksek oranda süperoksit üretimi olmasına rağmen bu enzim sayesinde hücre içi süperoksit düzeyi düşük tutulur. SOD nin hücre dışı aktivitesi çok düşüktür. Süperoksit dismutazın, süperoksit anyonuna olan etkisi şu şekildedir. Süperoksit anyonu, Cu +2 ve bir arginin rezidüsünün guanido grubuna bağlanır. Bu bağlanma sonucunda süperoksitten bir elektron Cu +2 ye transfer olurken Cu + ve moleküler oksijen meydana gelir. İkinci bir süperoksit anyonu Cu + dan bir elektron, bağlanma ortağından ise iki proton alarak hidrojen peroksiti oluştururken, enzim tekrar Cu +2 formuna dönmüş olur. SOD-Cu +2 + O 2. - SOD-Cu + + O 2 SOD-Cu + + O 2. - + 2H + SOD-Cu +2 + H 2 O 2 SOD fagosite edilmiş bakterilerin hücre içinde etkisiz hale getirilmesinde de rol oynar. Bu yüzden SOD, granülosit fonksiyonu için çok önemlidir. Lenfositlerde de granülositlerden daha fazla miktarda SOD bulunmaktadır. SOD enziminin yüksek katalitik aktivitesi nedeniyle hücrelerde süperoksit birikimine izin verilmez. Ancak çeşitli patolojik durumlarda süperoksit yapımının artması durumunda, süperoksite özgü tepkimeler görülmeye başlar. Süperoksit metal iyonlarını indirgeyerek bağlı oldukları proteinlerden salınımına neden olur, kofaktörlerin oksidasyon düzeylerini bozar, metal iyonlarının katıldığı hidroksil radikali yapım tepkimelerini hızlandırır. Diğer radikallere göre daha az reaktif olsa da, süperoksit, indirgenmiş nükleotidleri, bazı amino asitleri ve antioksidan bileşikleri (glutatyon, askorbik asit, tokoferol) oksitler. Süperoksit, hücre zarlarının hidrofobik ortamlarında daha uzun ömürlü ve çözünürlüğü daha fazladır. Zar fosfolipidleri nedeniyle hücre zarı yüzeyleri daha 20
1. GİRİŞ Nurten KURT asidiktir ve süperoksit burada daha kolayca bir proton alarak hidroperoksit radikalini (HO 2. ) oluşturur. Bu radikal de çok reaktif olup, hücre zarlarında lipid peroksidasyonunu başlatabilir ve tokoferol gibi antioksidanları oksitleyebilir. 1.13.2.1.(b). Katalaz Katalaz 4 tane hem grubu bulunduran hemoproteindir. Her alt birim ayrıca bir molekül NADPH içerir. Bu molekül enzimin kararlılığında rol oynamaktadır. Enzim sitokrom sistemi içeren tüm oksijenli solunum yapan hücrelerde mevcuttur. Katalaz esas olarak peroksizomlarda olmak üzere endoplazmik retikulum ve sitozolde yoğundur. Aktivitesi; karaciğer, böbrek, miyokard, çizgili kaslar ve eritrositlerde yüksektir. Görevi, hidrojen peroksiti oksijen ve suya parçalamaktır. Peroksidaz aktivitesine sahip oluşuna ek olarak; bu enzim bir molekül hidrojen peroksiti elektron verici bir substrat olarak, diğerini de oksidan veya elektron alıcısı olarak kullanabilir (Akkuş, 1995). CAT 2H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Katalazın indirgeyici aktivitesi hidrojen peroksit ve metil, etil hidroperoksitleri gibi küçük moleküllere karşıdır. Büyük moleküllü lipid hidroperoksitlerine etki etmez (Jenkins ve Tengi, 1981). 21
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Nurten KURT 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gallagher ve ark., 2000 CuZn-SOD nin nigrostriatal bölgede sinirsel koruyucuya karşı yaşlanmada etkisinin olup olmadığını araştırmışlardır. İnsana ait CuZn-SOD geni aktarılmış 24 erkek fareyi 11 kontrol grubuyla karşılaştırmışlardır. İki grupta nigrostriatal bölgede lokomotor aktivitesinde, 3 H-mazindol ya da 3 H- spiprone bağlayıcıda fark olmadığını belirtmişlerdir. CuZn-SOD artışının sinirsel koruyucu olduğuna dair bir kanıt bulamamışlardır. İnal ve ark., 2001 Lipid peroksiasyonu ve antioksidan enzim aktivitelerinin yaşlılıkla değişimini araştırmışlardır. Sağlıklı insanların eritrositlerindeki SOD, CAT, GPx ve plazmadaki MDA seviyesini incelemişlerdir. Bu çalışmada 176 sağlıklı bireyi grup 1 (0,2-1 yaş), grup 2 (2-11 yaş), grup 3 (12-24 yaş), grup 4 (25-40 yaş) ve grup 5 (41-69 yaş) olacak şekilde beş gruba ayırmışlardır. SOD aktivitesi ve yaşlılık arasında negatif bağlantı bulurken, CAT, GPx aktiviteleri ve MDA seviyesi ile yaşlılık arasında pozitif bağlantılar bulmuşlardır. Sonuç olarak eritrositdeki antioksidan enzim aktivitelerinde yaşla ilgili farklılık bulmuşlardır. Ayrıca, peroksidatif zararın yaşlılık basamaklarında yükseldiğini belirtmişlerdir. Bayne ve ark., 2002 SOD/CAT mimetikleri daha önce Caenorhabditis elegans nematodlarda gösterdiği gibi Muska domestica karasineğin ömrünün uzatıp uzatmadığını belirlemişlerdir. Sineklerin uzun yaşam üzerine etkilerini ve karbonil protein miktarını normoksik ve hiperoksik durumlar altında belirlemişlerdir. SOD/CAT mimetiklerinin sineklerin ömrünü uzatmadığını, normoksik durum altında karbonil protein içerik değerini düşürmediğini belirtmişlerdir. Hiperoksik durum altında sineklerin ömürlerinin kısaldığını gözlemlemişlerdir. Hayvanların uzun yaşamı üzerinde SOD/CAT mimetiklerinin etkisinin türe özgü olduğunu belirtmişlerdir. Devi ve ark., 2004 4 aylık genç yetişkin, 8 aylık yetişkin,12 aylık orta yaş ve 22 aylık yaşlı farelerde beynin farklı bölgelerinde E vitamini ve antioksidan enzimler (SOD, GSH-Px, CAT) ile lipid peroksidasyon ürünleri (MDA) üzerine etkisini araştırmışlardır. CAT aktivitesi, denemeye tabi tutulan farelerde hipokampus içinde önemli bir şekilde artış gösterirken, yaşa bağlı enzim E vitamini kombinasyonuna 22
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Nurten KURT maruz kalan gruplarda artış göstermediğini belirlemişlerdir. SOD ın her iki grupta da artış göstermediğini gözlemlemişlerdir. E vitamininin yetişkinlerde MDA içeren bölgelerde azaldığını belirlemişlerdir. Araştırmalarda, serebral korteks ve hipokampusdaki antioksidan enzimlerin yaşa bağlı olarak eksik olabileceğini gözlemlemişlerdir. Li ve ark., 2005 Hipokampal mitokondride membran akıcılığın değişimi, süperoksit dismutaz aktivitesi ve malondialdehit içeriğini incelemişlerdir. İbotenik asit (Ibo) ve β-amyloid protein(aβ 1-40 ) kombinasyonu ile teste tabi tutulan farelerin keşif amaçlı davranışlarında ve öğrenme-hafıza yeteklerinde dikkate değer bir azalma gözlemlemişlerdir. Enjeksiyon nörokimyasal değişimlere sebep olmuş ve ayrıca hipokampal mitokondrinin membran akışkanlığı ve SOD aktivitesinde önemli derecede azalmaya yol açarken diğer yandan MDA içeriğinin artışı dikkate değer nitelikte olduğunu belirtmişlerdir. Aβ 1-40 ve Ibo enjeksiyonu, peroksidasyon ile hipokampal zararlara neden olduğu ve farelerde ciddi şekilde öğrenme-hafıza sorunlarına yol açtığını gözlemlemişlerdir. Koyu ve ark., 2005 Bu çalışmada demir ile muamele sonucu eritrositlerde oksidatif değişimler üzerine E vitamininin koruyucu etkisini incelemişlerdir. Bu çalışmada 1400±50 g ağırlığında Yeni Zelandalı 30 beyaz erkek tavşanı 3 gruba ayırmışlardır. Birinci gruba (n:10) 500 mg/kg demir-dekstran karın zarı (ip) içine enjekte etmişlerdir. İkinci gruba 500 mg/kg demir-dekstran +100 mg/kg vitamin E (ip) vermişlerdir. Üçüncü grup kontrol grubu oluşturulmuştur. Eritrositlerdeki antioksidant enzimlerin SOD, GSH-Px, CAT ve MDA seviyesini belirlemişlerdir. Demir-dekstranla çalışılan hayvanlarda kontrol grubuna göre eritrositdeki SOD, CAT ve GSH-Px aktivitelerinde azalma, MDA seviyesinde artma olduğunu belirlemişlerdir. Demir-dekstran +vitamin E ile çalışılan grubun kontrol grubuyla karşılaştırılmasında üç antioksidant enzimlerin aktivitelerinde artma ve MDA seviyesinde azalma olduğunu gözlemlemişlerdir. Lipid peroksidasyon oluşumundan sonra kanda aşırı demir yüklemesi olduğunu gözlemlemişlerdir. Bu bulguların ışığında eritrositin içindeki serbest radikal hasarı bağımsız demir ile oluşan toksik oksidatif etkilerini önleyebileceğini belirtmişlerdir. 23
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Nurten KURT Jayakumar ve ark., 2006 İstiridye mantarlarının (Pleurotus ostreatus ) antioksidan aktivitelerinin yaşlı (24 aylık) farelerin başlıca organlarındaki lipid peroksidasyonu ve antioksidan durumunu genç farelerdeki (4 aylık) ile karşılaştırmışlardır. Yaşlı farelerin beyin, kalp, böbrekler ve karaciğerinde yükseltilmiş MDA seviyesi, indirgenmiş glutatyon, vitamin C ve E nin değerlerini genç farelerdeki değerlerle karşılaştırmışlardır. Yaşlı farelerin beyin, kalp, böbrek ve karaciğerinde CAT, SOD ve GPx aktivitelerin kantitatif analiz değerinde önemli azalma gözlemlemişlerdir. Yaşlı farelerde bu enzimlerin değişimlerinin bağıl konsantrasyonunun tahminen oksidatif strese bağlı P. ostreatus ekstraktının yönetimi yaşlı farelerde indirgenmiş glutatyonun yükseltilmiş seviyesi, vitamin C ve E, CAT, SOD ve GPx ın aktivitelerindeki artışı bu parametredeki değerlerde genç farelerinkinden farklı olmadığını belirtmişlerdir. Ek olarak yaşlı farelerde MDA seviyesinin indirgenmiş olduğunu belirtmişlerdir. Bu sonuçlar P. ostreatus ekstraktı ile işlemin yaşlılık esnasında antioksidan durumunun düzeltilebileceği, bu yüzden yaşlılığın meydana gelmesinin mümkün olduğu kadar azaltmanın serbest radikallerin karışması ile ilgili olduğunu belirtmişlerdir. Jolıtha ve ark., 2006 Bu çalışmada fare beyninde yer alan hippokampus (HC), beyincik (CB) ve beyin zarı korteksindeki (CC) protein oksidasyonu (PO), lipid oksidasyonu (LPO) ve süperoksit dismutazın yaşlılıkla ilgili değişimlerine E vitaminin ve egzersizin etkisini araştırmışlardır. Bunun için 4 aylık (yetişkin fare), 12 aylık (orta yaşlı) ve 18 aylık (yaşlı fare) erkek Wistar albino fareleri yüzde 3 yoğunlukta E vitamini ile oral yolla beslenmiş ve günde 30 dakika, haftada 5 gün ve 30 gün periyotlarla yüzme alıştırmasına tabi tutulmuşlardır. Yaşlı farelerdeki HC oranı en yüksek iken CC de toplam SOD azalmasının yaşa bağlı olduğunu görmüşlerdir. Yaşlı deneklerde vitamin E nin SOD ı arttırdığını gözlemlemişlerdir. Yaşlı ve orta yaşlı deneklerde Mn-SOD, yetişkin deneklerde ve yapılan denemelerde ise Cu-Zn-SOD arttığını gözlemlemişlerdir Hatao ve ark., 2006 Yüksek konsantrasyondaki oksijenin direkt olarak açığa çıkmasıyla hedef organ olan akciğerde hücresel hasara neden olabileceğini belirtmişlerdir. Bu amaçla genç (4 aylık) ve yaşlı (26 aylık) erkek Wistar farelerinde akciğerin önemli antioksidant enzimlerinin (Mn-SOD, Cu-Zn-SOD, GPx ve CAT) 24
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Nurten KURT aktivitelerindeki değişiklikleri ve mrna nın ifade edilmesini araştırmışlardır. Thioredoxin redüktaz (TrxR) aktivitesini de araştırmışlardır. Mn-SOD, Cu-Zn-SOD yaşlılıkla artarken, yaşlılığın GPx, CAT ya da TrxR aktivitesine tesir etmediğini belirtmişlerdir. Yargıçoğlu ve ark., 2007 3 aylık genç, 12 aylık orta yaş ve 24 aylık yaşlı İsviçre kökenli albino erkek farelerde TBARS, SOD, GSH-Px ve CAT kullanılarak SO 2 in öğrenmeden kaçınma üzerindeki etkisini araştırmışlardır. SO 2 takviyesi ile genç gruplarda öğrenmeden kaçınmanın önemli bir derecede azaldığı fakat orta yaş ve diğer yaşlı benzer kontrol grupları ile kıyaslandığında bu parametrenin hiçbir etkisinin olmadığını belirlemişlerdir. SO 2 takviyesi sonucu Cu/Zn-SOD aktivitesi tüm deney grupları kontrol gruplarıyla kıyaslandığında GSH-Px aktivitesinin azaldığını belirtmişlerdir. SO 2 verilen grupların TBARS oranları kontrol grupları ile karşılaştırıldığında artmış olduğunu gözlemlemişlerdir. Lambertucci ve ark., 2007 Genç ve yaşlı farelerden alınan kas örneklerinde egzersiz yapmanın aktivite üzerindeki etkisi ve mrna da CAT, GPx, Cu-Zn ve Mn- SOD seviyeleri, TBARS içeriği ve Ksantin oksidaz (XO) aktivitesini araştırmışlardır. Kaslarda yaşlanma ile birlikte mrna oranı ile antioksidan enzim aktivitesinde belirgin bir artış gözlemlemişlerdir. Yaşlı farelerde, genç farelere göre kıyaslanma yapıldığında 8,3 katlık bir fazlalığın ortaya çıktığını gözlemlemişlerdir. Genç farelerde egzersiz denemeleri Cu-Zn-SOD hariç tüm antioksidan enzim aktivitesinin hem de XO değişmeden artmasına sebep olduğunu belirlemişlerdir. Genç farelerden alınan kas örneklerinde egzersiz denemeleri yüzünden TBARS içeriğinin 2,9 kat artmış olduğu, yaşlı farelerde CAT, GPx ve Cu-Zn-SOD aktivitelerinin egzersiz denemeleriyle değişmezken Mn-SOD ve XO aktivitesinin azalmış olduğunu belirlemişlerdir. Yaşlılardan alınan kas örneklerinde, egzersiz denemeleri % 81 oranında TBARS içeriğinin artmasına neden olduğunu belirlemişlerdir. 25