GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ-3

Protein sentezi GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ-3 1 2 Genler ve genetik kod Gen: DNA nın genetik bilgiyi taşıyan bölümleri. Bütün genler DNA dan oluşur. Bir gendeki bilgileri A,G,T,C bazlarının sıralanışı belirler. DNA da bulunan bilgiler RNA ya taşınır ve RNA aracılığı ile proteinlere dönüştürülür DNA, RNA ve proteinlerin 3 ü de genetik bilgi içerdiğinden bilgi makromolekülleri olarak isimlendirilirler. Moleküler biyolojinin santral dogması 3 Genetik bilgi akışının moleküler işlemleri 3 basamağa ayrılır 1 replikasyon 2) Transkripsiyon (kopyalama): DNA bir ara molekül olan RNA aracılığıyla protein sentezinde rol oynar. Bilgilerin RNA ya dönüşümüne transkripsiyon denir. Bir veya birden fazla polipeptiti şifreleyen RNA molekülüne de Elçi (mesajcı) RNA (mrna) denir. Bazı genler Transfer RNA (trna) ve ribozomal RNA (rrna) sentezi için gerekli bilgileri içerirler. Bunlar protein sentezinde rol oynarlar ancak, protein yapacak genetik bilgileri kodlamazlar. 3) Translasyon (tercüme): mrna daki bilgiyi kalıp olarak kullanarak protein sentezleme 4 Bir polipeptit zincirindeki amino asitlerin sırası, mrna daki bazların özel dizilişi tarafından tanımlanır. Bir polipeptitin amino asit sırası ile bir genin baz sırası arasında doğrusal bir ilişki vardır. bir mrna molekülü üzerindeki her 3 baz bir amino asidi kodlar. Amino asitleri kodlayan bu 3 lü bazlara Kodon denir. Translasyon işlemi mrna ile olduğundan, genetik kod DNA olarak değilde mrna olarak yazılır mrna nın muhtemel 64 kodonu bulunmaktadır. Ancak bunlardan 61 i a.a leri kodlamaktadır. 3 kodon a.a kodlamaz. Bunlar stop kodonudur. Her bir kodon özel bir aminoasidi kodlar Genetik kod protein kodlayan sistemle proteine dönüştürülür. Bu sistem ribozomlar (protein ve rrna dan oluşur), trna ve çeşitli enzimlerden oluşur. 5 Genetik kodun en ilginç özelliği bir amino asidin farklı kodonlar tarafından kodlanmasıdır. Herhangi bir yerdeki aminoasit bilindiğinde bu yerdeki kodonun otomatik olarak bilinmesi sözkonusu değildir. Diğer yandan DNA dizisini ve doğru okuma zincirini bilerek proteindeki aminoasit belirlenebilir 6 1

PROTEİN SENTEZİ Bu durum DNA dizisinden aminoasit dizisini belirlemeye müsaade eder ve genetik devrin kalbini oluşturur. Canlı bir hücrede pek çok metabolik olay ve reaksiyon proteinler tarafından yürütülür Proteinler yapısal eleman olarak da önem taşırlar Kan plazma proteinleri Hormonlar Antikorlar Enzimler Kloroplast Mitokondri Hücre duvarı ve proteinde yer alan proteinler vb yapısal ve işlevsel protein gruplarıdır 7 8 Protein sentezi Protein sentezi çok karmaşık bir olay olmakla birlikte çok hızlı gerçekleşir. Örn E.coli ribozomlarında 100 amino asitlik bir polipeptit zinciri 5 sn de sentezlenir. Genç bir hücre içinde 5.000-50.000 arasında bulunan ribozomlarda aynı anda yüzlerce, binlerce proteinin sentezlenmesi söz konusudur. Hücrede bulunan proteinlerin ne zaman ve hangi miktarda sentezleneceği diğer moleküller tarafından kontrol altında tutulduğundan bu karmaşık olaya temel komponentler yanında yüzlerce molekül ve faktör katılmaktadır Protein sentezinde temel olarak iki proses vardır 1)Transkripsiyon: DNA sarmalındaki iki komplementer polinükleotit zincirinden asıl kodlayıcı kolun dizisinin yeniden oluşmasına transkripsiyon (kopyalama) denir. Transkripsiyon ile 3 tip RNA oluşur. mrna kodlayıcı DNA zincirinin bir reoksi kopyasıdır. Protein sentezi için gerekli bilgiyi ribozomlara taşır. trna ve rrna ise protein sentezinin ikinci prosesi olan translasyon (tercüme) olayında mrna nın da katılımıyla görev yapar. 2) Translasyon: Transkripsiyonla oluşan RNA lar kullanılarak protein sentezi gerçekleştirilir. 9 10 1) Transkripsiyon : RNA sentezi DNA ve RNA yapısında 3 anahtar fark vardır RNA deoksiriboz yerine riboz içerir RNA timin yerine Urasil bazı içerir RNA tek zincirlidir DNA yı etkileyen enzimler RNA yı etkilemez RNA yı etkileyen enzimler de DNA yı etkilemez Hem timin hem de urasil adeninle eşleşebildiklerinden, bu değişiklik baz eşleşmesini etkilemez Genetik bilgilerin DNA dan RNA ya transkripsiyonu, RNA polimeraz enzimi tarafından gerçekleştirilir. DNA da olduğu gibi RNA polimeraz da fosfodiester bağlarının oluşumunu katalizler RNA polimeraz bir kalıp olarak DNA ihtiyaç duyar. RNA nın öncüleri ise ATP, GTP, UTP ve CTP ribonükleotit trifosfatlardır. Zincirin uzaması sırasında daha önce yerleşmiş olan nükleotitin 3 -OH ına ribonükleotit trifosfat ilave edilir ve enerjice zengin iki fosfat bağının ayrılmasıyla nükleotitler polimerize olur. Açığa çıkan enerji reaksiyonun yürütülmesinde kullanılır 11 12 2

RNA polimerazlar DNA sentezinde olduğu gibi RNA sentezinde de zincir uzaması 5-3 yönünde gerçekleşir ve kalıp yeni sentezlenen zincire antiparaleldir. DNA polimerazın aksine RNA polimeraz, primer gereksinim duymaz. RNA polimerazın DNA kalıbı çift zincirli bir DNA molekülüdür. Herhangi bir gen için iki zincirden sadece bir tanesi transkriptlenir. Bununla beraber genler, DNA nın her iki zincirinde de olabildiklerinden transkripsiyon işlemi farklı zamanlarda her iki zincirde de gerçekleşebilir. Bütün organizmalarda RNA polimerazlar için bu prensipler geçerlidir. Prokaryotlar ve ökaryotlar arasında önemli farklılıklar vardır. Prokaryotlarda tek tip RNA polimeraz vardır Ökaryotlarda ise her biri farklı tip genlerin transkripsiyonunda yer alan 3 RNA polimeraz (l,ll,lll) vardır. 13 14 Bakteriyel RNA polimeraz yapısal olarak en basit olanı ve en detaylı bilinenidir. E.coli nin enzimi β, β,α, σ (sigma) olmak üzere 4 farklı alt üniteye (polipeptit zinciri) sahiptir. Alt üniteler birbirleriyle etkileşerek RNA polimeraz haloenzimi olarak isimlendirilen aktif enzimi oluşturur. Promotorlar RNA sentezinin doğru bir şekilde başlayabilmesi için önce RNA polimerazın DNA üzerinde bulunan uygun bölgeleri tanıması gerekmektedir. Bu bölgelere promotor denir. Ancak σ faktör diğerleri gibi güçlü bağlanmaz kolayca yapıdan ayrılarak RNA polimeraz kor enzim (α,β,β ) olarak isimlendirilen enzimin oluşmasına neden olur. Sigmanın rolü RNA sentezinin başlaması için DNA üzerindeki uygun bölgenin tanınmasını sağlamaktır. 15 16 Poromotor RNA sentezinin başladığı bölgeden 35 baz çifti yukarıda bulunur ve bu nokta -35 pozisyonu olarak isimlendirilir. promotor dizisi transkribe edilmez. Promotorun enzim tarafından tanınması, enzimin promotora bağlanması, DNA nın transkripsiyon için çözülmesi ve RNA sentezinin başlaması promotorun içerdiği iki spesifik dizi (konsensus dizileri) ile sağlanır. Bunlar: 5 -TTGACA-3 transkripsiyonun başlangıcına göre -35 pozisyonunda bulunur 5 -TATAAT-3-10 pozisyonunda bulunur (TATA kutusu veya Pribnow box denir) E. Coli de tespit edilen diğer -35 promotor dizileri Bu dizilerin hepsi sigma tarafından tanınır 17 18 3

Transkripsiyonun sonlanması Protein sentezinin güvenilirliği bakımından transkripsiyonun başlangıcı gibi sonlanması (terminasyon) da oldukça önemlidir. Çeşitli şekillerde transkripsiyon sonlanabilmektedir: RNA sentezinin sonlaması DNA üzerindeki özel baz dizilerinde meydana gelir. Prokaryotlarda çoğunlukla merkez kısmı tekrar etmeyen ters yönlü bir tekrar dizisinden oluşan yaklaşık 40 bazlık bir terminasyon dizisi vardır. Böyle bir dizi transkriptlendiği zaman RNA zincir içi baz eşleşmesiyle saç tokası şeklinde çift zincirli yapı oluşturur. Böyle bir dizi üridinlerle devam ettiği zaman transkripsiyon sonlanır. mrna, RNA polimerazdanayrılır Rho bağımlı terminasyon Bu tip sonladırıcılar, özel protein faktörlere ihtiyaç duyarlar. E.coli deki transkripsiyon sonlandırıcılardan biri Rho adında bir proteine ihtiyaç duyar. 19 20 Elçi, Ribozamal ve transfer RNA ların ömrü Çoğu genler (mrna) proteinleri kodlar. Fakat bazıları da rrna ve trna gibi protein sentezinde görev alan RNA ları kodlar. Prokaryotlarda çoğu mrna lar kısa ömürlüdür (birkaç dak gibi). Bu süre sonunda hücresel ribonükleazlar tarafından parçalanır. trna ve rrna lar kararlıdır. Kararlılık bu RNA ların ribonüklezlar tarafından aşırı derecede katlanmış yapılar oluşturmalarından kaynaklanır mrna lar katlanmış yapılar oluşturmaz 2) Translasyon Transkripsiyonla mrna ya aktarılan genetik bilginin proteinlere dönüştürülmesi Translasyonun her biri değişik moleküllere ve faktörlere gereksinim duyan 5 evresi bulunur a) aminoasitlerin aktivasyonu b) polipeptit sentezinin başlaması c) Polipeptit zincirinin uzaması d) polipeptit sentezinin sonlanması e) polipeptit zincirinde modifikasyon 21 22 Ribozomlar hücre yapıları içinde en karmaşık ve anlaşılması en zor organellerden biridir. Ribozomlar mrna üzerindeki 3 lü baz dizilerinin belli bir düzene göre okunduğu ve aminoasit diline çevrildiği yer ribozomlardır. O nedenle ribozomlar tercüme bürolarına benzetilir. Ribozomların translasyon için seçicilikleri yoktur, hangi genetik bilgi gelirse onun çevirisini yaparlar. Ribozomlara bilgiyi getiren mrna üzerinde bulunan ve herbiri bir aminoasidi belirleyen kodonlar ile doğru aminoasitler arasındaki ilişkiyi kuran adaptör moleküller ise trna lardır. Kısaca kodonlar ile aminoasitlerin doğru buluşmalarını ribozomlar sağlar. Temel olarak RNA ve proteinlerden oluşan ribozomlar oldukça ayrıntılı düzenlenmişlerdir. Ribozomal proteinlerin oranları hem çok yüksektir (%60) hem de çeşitleri çok fazladır. Prokaryotlarda 52, ökaryotlarda ise en az 82 farklı protein bulunmaktadır. Prokaryotik ve ökaryatik ribozomlarının büyüklük ve sayıları farklı olmakla birlikte temel yapıları benzemektedir. Her iki tip bir büyük bir de küçük alt birim içermektedir. 23 24 4

Ökaryotlarda 80S, prokaryotlarda ise 70S ribozomlar tanımlanmıştır PROKARYOTLAR (70 S ribozom) Büyük alt birim (50S) 23S rrna (2904 nükleotit) + 31 protein 5S rrna (120 nükleotit) Küçük alt birim (30S) 16S rrna (1541 nükleotit) + 21 protein ÖKARYOTLAR (80S ribozom) Büyük alt birim (60S) 28S rrna (4718 nükleotit) + 49 protein 5.8S rrna (120 nükleotit) Küçük alt birim (40S) 18S rrna (184 nükloetit) + 33 protein Transfer RNA Sedimantasyon katsayıları 4 S tir Hücrede bulunan en küçük nükleik asitlerdir (73-93 nükleotit). Molekülün %50-70 lik bölümü bazlar arası hidrojen köprüleri kurarak çift zincirler oluşturmaktadır. S: Svedberg unitesi (10-13 sn 25 Prokaryotlarda yaklaşık 60, ökaryotik hücrelerde 100-110 farklı trna bulunmaktadır. 26 Translasyonda doğru aminoasitleri ribozomlara getirmekle görevli trna lar farklı aminoasitleri taşır. Her aminoasit (a.a) için en az bir trna molekülü görev yapar. Bazı a.a ler için iki,üç veya dört trna bulunur. trna lar, RNA da normal olarak bulunan bazların kimyasal olarak değişimi sonucu oluşmuş nispeten farklı pürin ve pirimidinler de içerirler (psödoüridin, inozin, dehidroürüdin, ribotimidin, metil guanozin, metil inozin) trna nın görünümü yonca yaprağı şeklindedir. 4 kısma ayrılır: Antikodon halka Alıcı uç TψC halkası D halkası 27 28 Bütün trna ların 3 ucunda (alıcı uç) üç eşleşmeyen nükleotit bulunur. Bu nükleotitler daima CCA dir. Amino asit trna üzerindeki bu adeninin riboz şekerine bir ester bağı ile kovalent bağlanır. (aa in COOH grubu ile ribozun OH grubu bağlanır) trna nın antikodon bölgesinde mrna daki kodon ile eşleşen bazlar vardır. Bunlara antikodon denir. Antikodon halkasında 3 nükleotit mevcuttur, baz eşleşmesiyle özel olarak kodonu tanır. trna nın en değişken bölgelerinden biri bu bölgedir. trna nın diğer kısımları, ribozomla (hem rrna hem proteinlerle) ribozomal olmayan translasyon proteinleriyle ilişkiye girer ve sentetaz enzimini harekete geçirir. 29 30 5

a) Aminoasitlerin aktivasyonu trna ların doğru a.a lerle eşleşmesi enzimler (aminoaçil transferazlar=aminoaçil trna sentetazlar) sayesinde olur aminoaçil trna sentetazlar ilgili aminoasit ve o aminoasit için özel trna yı tanırlar. aminoaçil trna sentetazlar a.a i ATP reaksiyona sokarak aa i aktifleştirir Oluşan amino açil-amp uygun trna molekülü ile etkileşime girene kadar enzime bağlı kalır Amnino asit + ATP aminoaçil-amp + P-P Aktifleşen aminoasit trna ya transfer edilir aaminoaçil-amp + trna Aminoaçil TRNA + AMP 31 32 Bazı amino asitler için trna üzerindeki tanıma bölgeleri b) Translasyonun başlaması (initiasyon) Translasyon daima metiyonin (AUG) ile başlar. Bu prokaryotlarda formil metiyonindir. Başlangıç kodonu AUG dir. Prokaryotlarda proteinin sentezinin başlaması daima serbest bir 30S ribozom alt ünitesiyle olur. 30S ribozom alt ünitesi, formil metiyonin trna ve IF1, IF2, IF3 adında çok sayıda başlama proteinleri, bir başlama kompleksi oluşturur. 33 34 Formil grubunun metiyonine eklenmesi metiyonil trna formil transferaz tarafından katalizlenir. Bu modifikasyon metiyonin transfer RNA ya eklendikten sonra gerçekleşir. Fmet metiyoninle aynı kodon tarafından kodlanır (AUG). Fakat başlangıçta metiyonin yerine fmet kullanılır. AUG metiyoni tanımlayan tek kodondur Proteinin ilk molekülü olan metiyonin bu formil grubu sayesinde ribozum 50S büyük alt birimi üzerinde bulunan peptidil bölge olarak bilinen spesifik bölgeye tutunmayı garantiler. Ayrıca formil grubu molekülün peptitil zincirine metiyonin gibi eklenmesini önler. trna başlangıç kodonuna bağlandıktan sonra formil grubu uzaklaştırılır. Böylece ilk aa metiyonin olur. Protein sentezi tamamlandıktan sonra genellikle metiyonin, protein üzerinden uzaklaştırılır (metiyonin aminopeptidaz tarafından). 35 36 6

Shine Dalgarno dizisi mrna da başlangıç kodonu olan AUG den 5-8 baz dizisi öncesinde pürince zengin bazlardan oluşan Shine-Dalgarno dizisi vardır. 5 -AGGAGGU-3 Bu dizinin komplementeri olan 3 -UCCUCCA-5 dizisi 16S srna üzerindedir ve translasyonun başlayabilmesi için mrna ve 16S rrna bu bölgeden birbirlerine bağlanırlar. Böylece translasyonu başlatacak olan AUG başlangıç kodonu doğru noktadan yerini almış olur. Ribozom Shine Dalgarno bölgesine bağlandıktan sonra bir mesaj içerisindeki her başlangıç noktasını bulabilir. Bu dizinin translasyonu yapılmaz. Bu dizi ile translasyonun doğru yerde, doğru noktadan başlaması sağlanır. 37 38 c) Zincirin uzaması (elongasyon) mrna ribozom üzerinde özellikle 30 S alt üniteye bağlanır. trna lar 50S alt ünitesinde iki bölge ile etkileşirler A-bölgesi: Alıcı bölge P-bölgesi: peptit bölgesi: fmettrna nın bağlandığı yer A-bölgesi: yeni yüklü trna nın ilk tutunduğu yerdir. İkinci kodona denk gelen trna Zincirin uzamasında EF-Tu, EF-Ts ve EF-G olarak adlandırılan uzama faktörlerine gereksinim duyulur. Bir aminoaçil trna nın A bölgesine taşınması ve tutunması EF-Tu adındaki zincir uzama faktörü tarafından yapılır. Bunun için bir GTP molekülüne ihtiyaç vardır 39 40 Ribozomda yanyana TRNA lara bağlı durumda bulunan bu iki aminoasidin peptit bağını peptidil transferaz (23 S bölgesinin bir komponentidir) enzimi katalize eder. Enzim trna ya bağlı birinci aa in ester bağını kırarak, ikinci aa in amino grubu arasında pepti bağını oluşturur. Yüksüz trna önce ribozomun üzerinde bulunan çıkış bölgesine hareket eder. Daha sonra ribozomu terk ederek başka translasyonları başlatmak üzere hazırlanır 41 42 7

Translokasyon Zincir uzaması ve yeni bir trna eklenebilmesi için peptiti tutan trna A bölgesinden P bölgesine taşınmak (Translokasyon) zorundadır. Böylece yeni yüklü trna için A- bölgesi açılmış olur. Translokasyon için EF-G faktörü ve GTP molekülüne ihtiyaç vardır. Translokasyon işleminde ribozomlar hareket eder (mrna hareket etmez) Her taşınma basamağında ribozom 3 nükleotit ilerleyerek A bölgesi üzerindeki yeni bir kodonla eşleşir. 43 44 Tek bir mrna molekülü, birbirini takip eden çok sayıda ribozom tarafından polizom denilen bir kompleks oluşturarak translasyona uğrayabilir. Polizomlar translasyonun hızını ve verimliliğini arttırır. Her bir ribozomun aktivitesi, komşusu olan diğer ribozomdan bağımsızdır. Böylece bir polizom kompleksindeki her bir ribozom birbirinden bağımsız tam polipeptitleri yapar. c) Sentezin sonlanması (terminasyon) Protein sentezinin terminasyonu, ribozom bir anlamsız (stop) kodona geldiği zaman gerçekleşir. Stop kodonlar : UAA, UAG, UGA Hiçbir trna stop kodonlarına bağlanmaz. Salınma faktörü adında özel bir protein (RF faktörü) zincir sonlama işaretini tanır ve polipeptiti uçtaki trna dan keserek oluşan ürünü salar. Daha sonra ribozom alt ünitelere ayrılır. 45 46 8