Mycobacterium Tuberculosis ve Direnç Selin Yılmaz, Ayşe Şenol, Gülay Çandır, Bekem Güvenir Danışman: J. Sedef Göçmen ÖZET Tüberküloz(TB) dünya çapında hala çözülemeyen en eski sağlık sorunlarından biridir. Tüberküloz her yıl yaklaşık 9 milyon insanı enfekte eden ve yaklaşık 2 milyon insanın ölümüne sebep olan bir enfeksiyon hastalığıdır. Türkiye de de Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) önerilerine göre yürütülen Tüberküloz kontrol programı uygulanmaktadır. Bu programın düzenlenmesi ve yönetilmesinden Verem Savaş Dairesi Başkanlığı sorumludur. DSÖ, Tüberkülozu 1993 yılında Küresel Acil Durum adıyla bildirimi zorunlu hastalık ilan etmiştir. Hastalığa Mycobacterium tuberculosis basili sebep olmaktadır. Tüberküloz % 85-90 oranında pulmoner tutulum gösterirken %10-15 ekstrapulmoner yerleşim gösterir. Tüberküloz, tedavi edilebilir bir hastalıktır. Tüberküloz tedavisinde Streptomisin, İzoniazid(INAH), Etambutol, Rifampisin, Prazinamid primer ilaçlarken; Etionamid, Paraaminosalisilik asit, Tioasetozon, Sikloserin, Kinolonlar sekonder ilaçlardır. Primer direnç, daha önce hiçbir tüberküloz ilacı kullanmamış bir hastada, bir veya daha fazla ilaca karşı dirençi gösterir. Sekonder Direnç, hatalı tedavi veya tedaviye uyumsuzluk nedeniyle tedavi sırasında gelişen dirençtir. Birden çok ilaca dirençli tüberküloz; INAH ve Rifampisin in her ikisini de aynı anda içermeyecek şekilde, içinde en az 2 tane birinci basamak antitüberküloz ilacının bulunduğu kombinasyondur. Çoklu ilaç dirençli Tüberküloz(MDR), basilin, INAH ve Rifampisine aynı anda direnç göstermesine denir. Genişlemiş ilaç dirençli Tüberküloz (XDR), INAH ve Rifampisin direncinin yanı sıra basilin ikinci basamak antitüberküloz ilaçlarda en az 3 üne direnç göstermesidir. INAH ve Rifampisin e ek olarak ikinci basamak herhangi bir Florokinolona ve parental kullanılan antitüberküloz ilaçlardan en az birine direnç olarak tanımlanmıştır. Tüm İlaçlara Dirençli TB, duyarlılık testi yapılabilen tüm birinci ve ikinci basamak antitüberküloz ilaçlara direnç olarak tanımlanmaktadır. Çalışmamızda Tüberküloz, epidimiyolojisi, patogenezi, bakteriyolojisi ve tedavisinde kullanılan ilaçlar irdelenmiş. Antitüberküloz ilaçların direnç mekanizmaları ve direnç oranlarından ayrıntılı olarak söz edilmiştir. Anahtar kelimeler: Mycobacterium tuberculosis, Antitüberküloz ilaçlar, Direnç mekanizmaları.
GİRİŞ Tüberküloz, değişik klinik görünümlere sahip kronik, nekrozitan bir enfeksiyon hastalığıdır. Bu hastalığın oluşumundan %97-99 oranında Mycobacterium tuberculosis sorumludur. Tüberküloz, Dünya Sağlık Örgütü tarafından acil durum ilan edilen tek hastalıktır. Hastalığın etkeni M. tuberculosis, 1882 yılında tanımlanmış, korunmak için 1921 yılında aşısı geliştirilmiş ve 1950'li yılların ortalarından beri etkili bir şekilde tedavi edilmeye başlanmıştır. Bütün bunlara karşın tüberküloz, tüm dünyada, özellikle de yoksul ülkelerde, önemli bir sağlık sorunu olarak varlığını hala sürdürmektedir. Tüm dünya nüfusunun yaklaşık üçte biri tüberküloz basili ile enfektedir ve her yıl yaklaşık 9 milyon insanı infekte eden ve yaklaşık 2 milyon insanın ölümüne sebep olan bir enfeksiyon hastalığıdır(1,18,19). İnsanların mikobakterilerle, yerleşik topluluklar oluşturması ve sığırların evcilleştirmesiyle birlikte karşılaştıkları düşünülmektedir. M.Ö. 8000 ve M.Ö. 5000 yıllarına ait insan iskeletlerinde asit ve alkole dirençli basiller saptanmış. Mısırda ele geçirilen M.Ö.3500-3000 yıllarına ait mumyalarda da tüberkülozu düşündüren lezyonlar saptanmıştır. Kısacası insanlığın var olduğundan bu yana tüberküloz enfeksiyonu da vardır(1). EPİDEMİYOLOJİSİ Günümüzde dünya genelinde Tüberküloz önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Dünya nüfusunun 1/3 ünü oluşturan 1.7 milyar insan tüberküloz basili ile enfekte olup tablo 1 ve tablo 2 de görüldüğü gibi bunların büyük çoğunluğunu gelişmekte olan ülkelerdeki insanlar oluşturmaktadır. Tüm dünyada 20 milyondan fazla tüberküloz hastası bulunmakta olup, buna her yıl 8 milyon yeni hasta eklenmektedir. Tüberküloz tüm dünyada önlenebilir ölüm nedenleri içinde ilk sırada yer almaktadır(6,19). Tablo 1 : Dünya'da tüberküloz vakalalarının genel dağılımı(19),dsö 2012 raporu
Tablo 2: Tüberküloz vakalarının insidansı(19), DSÖ 2012 raporu Osmanlı İmparatorluğu döneminde 19. yüzyılın ortalarından itibaren tüberküloz Anadolu coğrafyasında yayılmaya başlamış, birçok padişahın ölümüne yol açacak yaygınlığa ulaşmıştır. Birinci dünya savaşının getirdiği yoksulluk neticesinde 1940 ların sonunda en yüksek düzeyine ulaşmıştır. TBMM ce 1949 yılında onaylanan 5368 sayılı yasayla Türkiye de tüberküloz kontrol çalışmaları başlatılmıştır. İlki 1953 te olmak üzere 1980 e dek 9 kez kitlesel aşılama kampanyası yapılmıştır(11). M.tuberculosis insandan insana solunum yolu ile geçer. 1-5 µm büyüklüğündeki damlacıkların solunum yolu ile alınması ve bunların alveollere yerleşmesiyle hastalık gerçekleşir. Kapalı ortamlarda, standart nem ve ısı koşullarında aerosol halindeki tüberküloz basillerinin %60-71'i üç saat, %48-56'sı altı saat, %28-30'u dokuz saat canlı kalmaktadır. Pulmoner tüberküloz tüm tüberküloz olgularının %80'ini oluşturmaktadır. Ekstrapulmoner tüberküloz ise, plevra, lenfatik sistem, genitoüriner sistem ve miliyer tüberküloz şekillerinde görülebilir. İmmun sistemin baskılanmış olması örneğin HIV ile enfekte bireylerde tüberküloz belirgin şekilde artmaktadır(7). Tablo 3: TB olgularında yaş gruplarına göre hastalığın tutulum yeri,2009. Türkiye verem savaş raporu 2011
TÜBERKÜLOZ BAKTERİYOLOJİSİ Tüberküloz basili Actınomycetales takımı, Mycobacterıaceae ailesi ve Mycobacterium cinsi içinde yer almaktadır. M. tuberculosis ve M. leprae dışında 70'in üzerinde türü tanımlanmıştır. Mycobacterium cinsi bakterilerin temel özellikleri yavaş üremeleri, aside dirençli olmaları, hücre duvarlarında bol miktarda mikolik asit (lipid) içermeleridir. Genomlarında ki GC oranı %59-65 dir. Bakteriyolojik özellikleri ve DNA benzerlikleri nedeniyle birbirleriyle yakın ilişkili türler "complex olarak adlandırılır. "M. tuberculosis complex" M. tuberculosis, M. bovis, M.microti, M.africanum ve M. Bovis BCG içermektedir. Klinik açıdan bakıldığında hastalık yapma potansiyeli ve halk sağlığı ile yakın ilişkisi nedeniyle M. tuberculosis cinsin en önemli üyesidir ve günümüzde insanlarda görülen tüberkülozun esas nedenidir. M.tuberculosis compleks dışındaki mikobakterilere "tüberküloz dışı mikobakteriler" veya "atipik mikobakteriler" denmektedir (7). PATOGENEZ Tüberküloz, T lenfositler, makrofajlar ve bunlardan salınan sitokinler ile kontrol edilebilen hücre içi bir enfeksiyondur. Hastalık sırasında antikor yanıtının oluşmasına rağmen humoral immünitenin konak savunmasına önemi yoktur. Tüberküloz, enfeksiyon oluşumu ve hastalık gelişimi olmak üzere iki aşamalı bir hastalıktır. M. tuberculosis mukusu geçemediğinden enfeksiyon oluşumu için mutlaka bakterinin alveoler alana ulaşması gerekir. İnsanda minimal enfekte edici basil sayısı tam olarak bilinmemekle birlikte 1-3 basilin hastalık oluşumunda yeterli olabildiği düşünülmektedir. Akciğer tüberkülozunda, hastalık, basilin alveollere girişinden kavite oluşumuna dek beş evrede özetlenebilir. Tüberküloz; primer, sekonder, milier, ekstrapulmoner, olmak üzere farklı şekillerde de karşımıza çıkabilir (7,20). TÜBERKÜLOZ DA TANI I- Bakteriyolojik Tanı a. Mikroskobik 10x100 EZN boyası i. Ehrlich-Ziehl-Neelsen boyama yöntemi ii. Roadamin-Auramin boyama yöntemi b. Kültür
Löwenstein Jensen besiyeri TB kolonileri i. Yumurta temelli besi yerleri-löweinstein Jensen, Petragnani, Trudeau, Dorset besiyerleri ii. Yarı yada tam otomatize besi yerleri -M. Growth Incubator Tube (MGIT) c. Moleküler tanı yöntemleri d. Tiplendirim testleri e. Direnç testleri II- Tüberkülin Deri Testi (9). TEDAVİ Tüberkülozda etkili tedavi 1950 yılından bu yana yapılmaktadır. Tüberküloz tedavisinde kullanılan ilaçlara antitüberküloz ilaçlar denir. Antitüberküloz İlaçlar; Birinci seçenek ilaçlar: İzoniazid (INH), Rifampisin(RIF), Prazinamid(PZA), Streptomisin(SM), Etambutol(EMB) olarak sayılabilir. EMB dışındakilerin hepsi bakterisidaldir. Toksisiteleri azdır ve kombine olarak kullanılabilirler. İkinci seçenek ilaçlar: Sikloserin, etionamid, tiasetozon, kanamisin, kapreomisin ve p-aminosalysilicacid (PAS) olarak sıralanır. Bu ilaçlar birinci seçenek ilaçlara göre daha toksik, daha az tolere edilebilen ve daha az etkili ilaçlardır. Bu grup ilaçlara ß laktamaz İnhibitörleri, kinolonlar, amikasin ve rifabutini eklemekte mümkündür. Bu yeni ilaçlar özellikle dirençli tüberküloz olgularında kullanılmaktadırlar(4). Tüberküloz, basillerin duyarlı olduğu en az iki ilaçla tedavi edilmelidir. Hiç ilaçla karşılaşmamış M. tuberculosis suşlarında bile kendiliğinden ilaca dirençli mutantlar gelişebilmektedir. Kazanılmış direnç ise hatalı tedavi rejimlerinin kullanılması veya tedaviye uyumsuzluk nedeniyle tedavi süresince gelişen direnç olarak tanımlanır. Tedavi almakta olan bir hastada tedavi sırasında direnç gelişimi ciddi bir sorundur. Genellikle tedavi başarısızlığına yol açar(4, 5,13). ANTİTÜBERKÜLOZ İLAÇLARA DİRENÇ GELİŞİMİ 1980 ler den bu yana kısa süreli kemoterapi ve etkili kombinasyonlarla hastalığın tamamen ortadan kaldırılabileceği düşünülmekteydi. Fakat tüberküloz olgularındaki düşme eğilimi 1984 lerde duraklamış ve 1985 den sonra bildirilen tüberküloz olguları hızla artmaya başlamıştır. Tüberküloz insidansındaki bu artma evsizlik, intravenöz ilaç kullanımı gibi sosyal problemlerin yanı sıra HIV epidemisi ile paralellik göstermektedir(8,10).
Tablo 4 : Dünyadaki HIV ıle enfekte tüberküloz vakaların dağılımı(19), DSÖ 2012 raporu M.tuberculosis te klinik açıdan ilaç direnci primer ya da sekonder olarak gelişebilir. Hiç bir tüberküloz ilacı ile karşılaşmadığı halde tüberküloz basili toplulukları içinde doğal olarak 10 5-8 basilde bir oranında ilaca dirençli mutantlar bulunur. Örneğin bu oran INH ve SM için 10 6 basilde bir basildir. RIF için aynı oran 10 8 basilde bir basildir. Bir basilin hem INH hem de RIF e mutasyonel olarak dirençli olma olasılığı ise 10 14 (10 6 X10 8 )'dür. Mutasyonel direncin ilaç kullanmakla ilgisi bulunmamaktadır. Çünkü ilaçlarla karşılaşmak mutasyona yol açmamaktadır. Eksik ya da uygunsuz ilaç kullanımı ile duyarlı basillerin ortadan kalkarken, dirençli mutantların sayıca artmasına bağlı olarak gelişen bu direnç sekonder ya da kazanılmış dirençtir. Bu şekilde dirençli hastanın basilleri ile enfekte olmuş ve hiç ilaç kullanmamış kişilerde görülen direnç ise primer direnç olarak bilinir. MDR- TB olguları primer ya da sekonder direnç sonucu gelişebilir(5, 7,14). ÇOK İLACA DİRENÇLİ TÜBERKÜLOZ Tüberküloz etkin ve uygun tedavi ile başarıyla tedavi edilebilmektedir. Bu gerçek son 15 yıl içinde, etkenin antitüberküloz ilaçlara giderek artan oranda direnç kazanması ve tedavide alternatif ilaçların azlığı sonucunda değişmekte ve tüberküloz kontrolünde ciddi sorunlar yaşanmaktadır. En az INH ve RIF'e dirençli M. tuberculosis suşları ile oluşan tüberküloza çok ilaca dirençli tüberküloz MDR-TB (Multidrug resistant tuberculosis) denmektedir. Klinik olarak en önemlisi INH ve RİF direncidir. Bu direnç kalıbının tedavi başarı şansı %56'dır.
Yetersiz tedavi programlarının uygulandığı gelişmekte olan ülkelerde MDR- TB sorunu yıllardır yaşanmaktadır. Son yıllarda HİV ile beraber gelişmiş ülkelerde de gözlenmektedir. Nitekim ABD'de primer direnç %13 sekonder direnç %26,2 olarak bulunmuştur. Türkiye de aynı yıllarda primer direnç %14-27, sekonder direnç %37-66 olarak bulunmuştur(14,15, 16). MDR Tüberküloz, INAH ve rifampisine aynı anda direnç göstermesidir. XDR-Tüberkülozun ilk çıkışı 2005 yılıdır. Bu yıldaki tanım INAH ve rifampisin direncinin yanı sıra ikinci basamak anti-tüberküloz ilaçlarda en az 3 üne direnç göstermesidir şeklindedir. Daha sonra 2006 yılında, bu tanım değişmiş ve INAH ve rifampisine ek olarak ikinci basamak herhangi bir florokinolona ve parental kullanılan anti-tüberküloz ilaçlardan en az birine direnç olarak tariflenmiştir. Tüm İlaçlara Dirençli TB, duyarlılık testi yapılabilen tüm birinci ve ikinci basamak anti-tüberküloz ilaçlara direnç olarak tanımlanmaktadır(2,5,9). Rifampisin direncine %96 oranında, RNA polimerazın beta alt ünitesini kodlayan rpob geninin 81 bp lik bölgesindeki (27 kodon, 507-533) mutasyonlar sebep olur.en sık görülen ve yüksek MİK değerli dirençten sorumlu mutasyonlar 526 ve 531. Kodonlardadır (%65-86). Düşük MİK değerli rifampisin direnci 511, 516, 518 ve 522. kodonlardaki mutasyonlarla ilişkili bulunmuştur. En sık Ser 531 Leu(% 42) ve His 526 Tyr (% 23) mutasyonları saptanmıştır.etambutol, Arabinozil transferazenzimini kodlayan embcab geninde meydana gelen mutasyonlar % 70 oranında etambutol direncinden sorumludur. Streptomisin, Ribozomal protein S12 yi11 kodlayan rpsl genindeki mutasyonlar (% 60) ve 16S rrna yı kodlayan rrs genindeki mutasyonlar (< %10) streptomisin direncinden sorumludur. Kanamisin,Amikasin,Kapreomisin, Streptomisin ile kanamisin veya amikasin arasında çapraz direnç bulunmazken, kanamisin ve kapreomisin arasındaki çapraz direnç değişkendir. Kanamisin ve amikasine karşı yüksek MİK değerli dirençten rrs geninde A 1400 G nükleotid değişikliğinin sorumlu olduğu düşünülmektedir. Florokinolonlar, DNA giraz enzimi gyra geni tarafından kodlanan iki A alt ve gyrb geni tarafından kodlanan iki B alt birimden oluşur. MTK in gyra genindeki küçük bir bölgesinde oluşan mutasyonlar yüksek MİK değerli kinolon direncinden sorumlu bulunmuştur (> % 90)(16,17). GyrA genindeki Ser 95 Thr mutasyonu polimorfizm olarak değerlendirilmiştir, duyarlı izolatlarda da vardır. Bununla birlikte gyrb genindeki mutasyonlar nadirdir, düşük MİK değerli dirençten sorumludur ve fenotipe her zaman direnç olarak yansımamaktadır. Rifabutin, Rifampisin ve rifabutin arasında çapraz direnç oranı yüksektir. Ethionamid, Ethionamid direncinden inha genindeki mutasyonların sorumlu olduğu düşünülmektedir.pirazinamid,pza direncinin, %72-97 kadar olguda, pirazinamidazı kodlayan pnca geninde ortaya çıkan mutasyonlara bağlı olduğu belirlenmiştir.izoniazid, Katalazperoksidaz enzimini kodlayan katg genindeki mutasyonlar % 60-70 oranında izoniazide karşı yüksek MİK değerli dirençten sorumludur(3,20)
Tablo 5: Antitüberküloz ilaçlarda dirençten sorumlu mutasyon bölgeleri TÜRKİYE DE DİRENÇLİ TÜBERKÜLOZ Türkiye Verem Savaş Dairesi Başkanlığı 2010 raporunda duyarlılık testi çalışılan hastaların %80,9 ü 4 ilaca duyarlı, %19.1 i en az 1 ilaca duyarlı, %13.8 i İNAH a dirençli, %6.6 sı Rifampisin e dirençli,%4.3 ü Etambutol e dirençli ve %7.5 i Streptomisin e dirençli olarak bildirilmektedir. Yine Türkiye Verem Savaş Dairesi Başkanlığı 2011 raporundan aldığımız tablo 5 te direnç oranları gösterilmiştir.(15,16, 17). Tablo 5: Türkiyede 2005-2009 yılları arasında tespit edilen antitüberküloz ilaçlara karşı direnç oranları, Verem Savaş Raporu 2011
SONUÇ Bütün dünyada Tüberkülozun ortadan kaldırılabileceği varsayılırken; Tüberküloz olguları artmaya başlamıştır. Tüberküloz insidansındaki bu artma toplumlardaki yoksulluk yanı sıra HIV epidemisi ile paralellik göstermektedir. Ayrıca beklide en önemsenmesi gereken neden dirençli TB olgularıdır. Sağlık bakanlığı verilerine göre Türkiye de tedavi başarısı yüksektir. Ülkemizde dirençli tüberküloz için çeşitli rakamlar bildirilmektedir. Özellikle çok ilaca dirençli tüberküloz için yeni ve eski vakalarda saptanan kombine ilaç direnci oranları %4,8 ile %17,2 arasında değişmektedir. Türkiye de anti tüberküloz ilaç direnci çok yüksek değilmiş gibi görünse de, mutlaka dikkate alınması gerekir. Hedef bu direnç oranlarının daha düşük seviyelere indirilmesi olmalıdır. KAYNAKLAR 1) Barış Y. İ. Dünyada Tüberkülozun Tarihçesi. TürkToraksDerg. Aralık 2002;3/3 :338-340 2) Baylan O.Çok İlaca Dirençli Tüberkülozdan Sonra Yaygın İlaca Dirençli ve Tüm İlaçlara Dirençli Tüberküloz Formları: Eski Hastalığın Yeni Yüzleri.Mikrobiyol Bul 2011;45(1):181-1957 3) Boechat AL, Ogusku MM, Sadahiro A, et al. Association between the PTPN22 1858C/T gene polymorphism and tuberculosis resistance. InfectGenetEvol. 2013 Mar 14;16C:310-313. doi: 10.1016/j.meegid.2013.02.019.Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Brazil. 4) Çilli A.Antitüberküloz İlaçlar ve Etki Mekanizmaları. 21.Yüzyılda Tüberküloz Sempozyumu kitabı, 163-172, 2003. 5) Durmaz R.Mycobacteriıum tuberculosis'de Direnç Sorunu.ANKEM Derg. 2005;19(2):107-110 6) Dündar D,Sönmez G.Mycobacterium tuberculosis Kompleksi İzolatlarının Primer Antitüberküloz İlaçlara Direnç Oranları.Klimik Derg. Cilt:22 Sayı:2 Ağustos 2009 7) Göçmen JS, Aksoy A.Solunum hastalıkları tanısında klinik mikrobiyoloji laboratuvarının yeri.solunum sistemi ve hastalıkları. Özlü T, Metintaş M, Karadağ M, Kaya A.İstanbul Tıp Kitabevi.2010:325-347 8) Korkmaz G,Balcı İ,Bayram A, ve diğerleri,mycobacterium tuberculosis Kompleks Kökenlerinin Birinci Seçenek Antitüberküloz İlaçlara Duyarlılığının Saptanmasında BACTEC ve Agar Proporsiyon Yöntemlerinin Karşılaştırılması. İnfeksiyon Dergisi 2006;20(1):7-14 9) Köksalan OK.Günümüzde Tüberküloz Tanısı/Güçlükleri.ANKEM Derg. 2010;24(Ek 2):61-63 10) Mboma SM, Houben RM, Glynn JR, et al.control of (multi)drug resistance and tuberculosis incidence over 23 years in the context of a wellsupported tuberculosis programme in rural Malawi.Karonga Prevention Study, Chilumba, Malawi
11) Öğer O. Tüberküloz Epidemiyolojisi ve Türkiye de Tüberküloz Durumu. KlimikDerg 1989; 2/1 : 42-44 12) Perinçek G, Tabakoğlu E, Otkun M, ve diğerleri.mycobacterium tuberculosis Üremesi Saptanan Akciğer Tüberkülozlu Hastaların Antitüberküloz İlaçlara Direnç Oranları.Türk Toraks Derg. 2011;11:111-3 13) Saygan MB,Ocak F, Ceyhan İ, ve diğerleri.bölge Tüberküloz Laboratuarlarında Gönderilen Mycobacterium tubeculosis Suşların Majör Antitüberküloz İlaçlara Duyarlılıkları.Refik Saydam Hıfzısıhha Merkez Başkanlığı Tüberküloz Referans Ve Araştırma Laboratuarı 14) Tansel Ö,Antitüberküloz İlaçlara Karşı Direnç Mekanizmaları ve Türkiye de Durum (Cilt:16 Özel Sayı:1 Mart 2003) 15) Tuncer İ.,Türkdağı H.,Yüksekkaya Ş. Konya Bölge Tüberküloz Laboratuvarında 2001-2008 Yılları Arasında Soyutlanan MikobakteriSuşlarının 1. Seçenek Antitüberküloz İlaçlara Direnci.TürkMik. Cem. 2012; 42/1 :27-31 16) Uçar E.,Kılıç A.,Ceyaln İ. ve diğerleri,ülkemizin Yedi Farklı Bölgesinden 2003-2006 Yılları Arasında Elde Edilen Mycobacterium tuberculosis Suşlarının Majör Antitüberküloz İlaçlara Direnç Oranları, Mikrobiyol Bul 2010;44:11-19 17) Verem Savaş 2011 Raporu 18) www.cdc.gov/tb 19) www.who.int 20) Yüksel P,Pirazinamide Dirençli MycobacteriumTuberculosis Kompleks Kökenlerinde PncA Genindeki Mutasyonların Araştırılması.Tez No: 2002K120500 Edirne,2005