Genel Transkripsiyon Mekanizmaları Çok hücreli ökaryotların geneomlarının toplam kodlama kapasitesinin yaklaşık %5-10 u transkripisyonu düzenleyen proteinlere ayrılmıştır. Bu proteinler 3 büyük sınıfa ayrılırlar : 1: Genel transkripsiyon makinesi : RNA sentezinin katalizlenmesi ve promotorların tanınması için gerekli olan, büyük çok proteinli RNA polimeraz komplekslerin genel fakat farklı bileşenleridir. 2: Spesifik transkripisiyon faktörleri: proksimal protomorlara ve uzun menzilli düzenleyici elementlere bağlanan, gen spesifik transkripsiyonel aktivasyon ve baskılamaya aracılık eden, diziye spesifik DNA bağlanma proteinleridir. 3: Transkripsiyonel koaktivatörler ve korepressörler: DNA ya doğrudan bağlanmayan protein protein etkileşimleri ile transkripsiyonel aktiviteyi artttıran yada azalatna proteinlerdir.
Genel Transkripsiyon mekanizmasının bileşenleri RNA pol II ; RNA sentezini katalizlemek için oldukça özenli araçlarla doğru zamanda spesifik promotorlara getirilir. Genel transkripisiyon faktörlerinide içeren bir çok faktör ve polimeraz, ön başlatma bölgesi oluşturmak için birlikte çalışırlar ve transkripisyonun başlamasına öncülük ederler. 20 yıldan fazla süregelen çalışmlarda genel transkripsiyonun 3 ana bileşeni karakterize edilmiştir. Bunlar : 1- RNA pol II, RNA sentezleme ve olgunlaşmamış transkripteleri düzeltebilen 12 alt üniteli bir polimerazdır. 2- TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF ve TFIIH simgeleri ile gösterilen transkripisyon faktörleri (RNA pol II için transkripisyon faktörleri ) protomorun tanınması ve protomor bölgesindeki DNA zincirinin açılmasından sorumludur. RNA pol II kesinlikle bu faktörlere ihtiyaç duyar. 3- Mediatörler ( Aracılar ): 20 alt birimlik komplekstir. Düzenleyici bilgiyi aktivatör ve represör proteinlerden RNA pol II aktarırlar.
RNA POLİMERAZ II YAPISI Ökaryotlardaki 3 nükleer RNA plimerazlardan en iyi karakterize edilmiş polimerazdır. Mayadan karakterize edilmiş RNA polimeraz 0. 5MD luk enzim kompleksi ve 12 alt üniteden ( Rpb 1-12 ) ibarettir. Maya RNA pol II kristal yapısı imcelendiğinde ise iki farklı yapıya sahip olduğu görülmüştür.bunlardan biri 10 alt üniteden oluşan klatalitik kor diğeri ise Rpb 4/ 7 altünitelerinden oluşan heterodimerlerdir. RNA pol II nin kor enzizmi aktiftir fakat promotor bölgenden transkripisyonu başlatabilmesi için Rpb 4/7 komplexine ihtiyacı vardır Rbp 4/7 komplexi transkiripisyon ve post transkripisyon arsında foksiyoneldir ve mrna nın nükleustan çıkışında ve transkripisyona bileşik DNA tamirnde görev almaktadır. Rbp1 nin hareketli C terminal domaini (CTD); RNA pol II nin ilave bir bileşenidir ancak kristallenmediğinden bu bölümün kristal yapısı gösterilmemiştir.
RNA pol II C terminal domaini ( CTD) CTD RNA pol II nin en büyük alt ünitesi olup kuyruk benzeri yapıdadır.7 amino asitten oluşan d( Tyr-Ser-Pro-Tyr Ser- Pro Ser) dizisinin 52 ye kadar tekrarını içerebilir. CTD invivoda mrna işlenmesi için gerekilidir ve invitro işleminde ise işleme faktörlerine bağlandığı görülmüştür. Transkripsiyon döngüsü sırasımda CTD tekrarn dizisinin 2 ve 5 inci pozizyondaki serin amino asitidin fosforillediği bilinmektedir.transkripsiyonun başlangıcı için fosforillenmemiş CTD gerekli iken uzama esnasında fosforillenmiş CTD gereklidir. CTD fosforillediğinde sonlanma olayları sırasında mrna işleme faktörüne bağlanabilir RNA pol II yeniden döngüye girmesi için CTD tekrar de fosforile edilmelidir.
Genel Transkripisyon faktörleri ve ön başlangıç kompleksinin oluşması TFIID nin bağlaması diğer transkripisyon faktörlerinin ve RNA pol II nin promotora toplanası için bir platform oluşturur. invitroda bu proteinler şu sıra ile toplanır. TFIIB ; mediatör gibi bir çok proteinle koplex yapmış olan RNA pol II ile birlikte ardından TFIIF, TFIIE ve TFIIH RNA pol II nin aşağısına bağlanır. TFIID de, DNA kalıbı ile etkileşime giren ilk genel transkripsiyon faktörüdür. TFIID ; TATA ya bağlnma proteini (TBP) ve TBP ile oside olmuş 14 proteinden oluşan (TAF ) bir komplekstir.tbp evrimsel değişim sürecide korunmuş olup ökaryotlarda 3 ana RNA polimerazın transkripisyon yapabilmesi için gereklidir. TFIID nin kor protomorlara bağlanması aktivatör ve/ veya kromotini yeniden düzenleyeci faktörlerin transkripsiyonu kontrol edebildiği kritk hız sınırlayıcı basamaktır.
TFIIB promotorlardaki komplexi yönlendirir : TFIID bağlandıktan sonra TFIIB büyüyen topluluğa bağlanır. TFIIB bağlanması spesifik protein protein ve protein DNA etkileşimlerinin yönünü belirler. TFIIB ; TBP nin sadece bir ucununa ve aynı anda TATA kutunusunu takip eden GC zengin bir DNA zincirine bağlanır. TFIIB/ TBP/ DNA RNA polimarzın transkiripisuonu hangi yöne doğru yapacağını ve çift zincirli heliks DNA zincirlerinin hangisini kalıp olarak kullanacağını belirler. TFIIE, TFIIF, TFIIH ın bağlanması ile ön başlangıç kompleksinin oluşumu tamamlanır : Promotora RNA polimaraz II nin yüklenmesi için polimerazla sıkı kompleks yapma özelliği olan TFIIF faktörüne ihtiyaç vardır.büyümekte olan topluluğa TFIIF nin girişi TFIIH ı davet eder. TFIIH genel transkripsiyon faktörleri içinde en kopleks olanıdır. Bir çok işi yapabilmesinden dolayı tyranskripisyonun yanısıra DNA tamirinde de etken olduğu düşünülmektedir. TFIIH 9 alt üniteden oluşur Bu alt ünitenin foksiyonları çeşitlidir.bu alt üniteler : CDK, Siklin H, 5-3 Helikaz, 3 5 Helikaz, iki adet çinko pramak proteini ve bir hlka parmak proteinden oluşur. Yapılan Çalışmlarda TFIIH ; RNA polimerazın CDT sini fosforilleyen bir protein kinaz olduğunu ayrıca birde ATP bağımlı helikaz aktivitesini gösterilmiştir.
Kor promotorlara bağlanan genel transkripsiyon faktörleri ve RNA polimeraz II nin oluşturduğu kompleks, ön başlangıç komplexi ( PIC ) olarak adlandırılır.promotorun açılması ve çift zinicrli DNA nın ayrılması ATP nin hidrolizini gerektirir. Bu reaksiyon TFIIE nin yardımı ile TFIIH NON ATPaz/ Helikaz alt ünitesi tarafından gerçekleştirilir. Açılma sonrası kalıp olarak kullanılmayacak zincir TFIIF tarafından tutulur. Kalıp zincir ise RNA pol II nin aktif bölgesine iner Mediatör ( Aracı ) : Moleküler köprü Mediatör yaklaşok 30 alt birimden oluşan çok alt üniteli bir komplekstir. korunmuş bir bölgesi vardır ve bu bölge RNA pol II nin CDT si ile ve kor promotordan uzaktaki transkripsiyon faktörleri ile çeşitli protein altbirmleri ile birleşir. Kornberg ve diğerlerinin elde ettiği bulgulara göre Mediatör en hansır ve diğer uzun menzilli düzenleyici elementlere bağlı transkripsiyonal aktivatörler ile RNA pol II yi birbirene bağlayan moleküler bir köprüdür. Mediatör, in vitro da RNA pol II kor promotordan temel transkripisyon yapmasım için gerekli değildir.bu yüzden transkripisyon faktörü olarak sınıflandırılmazlar.
Transkripisyonun başlaması : Ön başlangıç kompleksininin oluşmasınından sonra kısa bir başlama periyodunun ardından polimeraz protomor bölgesini terkeder ve uzama safhasına girer.rna sentez işlemi çeşitli alt basamklara ayrılır.bunlar; NTP seçimi (DNA nın komplementeri olan nükleotit trifosfat ) fosfodiester bağlarının oluşumunun katalizlenmesi ve DNA- RNA nın translokasyonunudr. Başlangıç aşamasında polimeraz bir seri trankrip sentezler. RNA pol II biraz ilerlerken bir transkripsiyon kabarcığı meydana getirerek bu kısa transkriptler DNA zincirlerini ayrı tutarlar.promotordan ayrılma RNA pol II nin C terminal domainin 7 li peptid tekrarlarındaki bir çok bölgenin fosforilllenmesine bağlıdır.ctd nin TFIIH tarafından hiperfosforilasyonu polimerazın aktivasyonu ve uzaman fazına geçmesi için gereklidir. Uzama sırasında fosfotların ilavesi polimerazın başlangıç için kullanılan transkripsiyon faktörlerine geride bırakarak yoluna devam etmesini sağlar.
Gen regülasyonunda spesifik transkripisyon faktörterinin rolü : Gen aktivitesinin düzenlenmesi genellikle transkripisyon faktörlerinin ( TF) aktivitesindeki veya miktarındaki değişmeler ile olur.tf leri spesifik genlerin transkripsyonun oranının pozitif veye negatif olarak etkileyebilir.bu etkilemeyi protomorun proksimali enhansırlar ve diğer uzun menzilli düzenleyici elemntler ve diğer proteinler ile etkileşerek yaparlar. TF leri gen spesifik transkripsiyonel aktivasyona veya baskılamaya aracılık ederler. Represör olrak iş görenler ise transkripsiyonun sistemini baskılarken aktivatör olarak iş görenler transkripsiyon hızını çeşitli mekanızmlar ile artırırlar.bu mekanızmalar: 1- Genel Trankripsiyon faktörlerinin ve RNA pol II nin ön başlangıç kompleksini oluşturmak için promotora bağlanmasının uyarılması. 2- genel transkripsyon araçlarının enzimatik etkilerini uyaran fosforilasyon gibi konformasyonel değişimlerin veya post translasyonel modifikasyonlarının indüksiyonu 3- kalıp DNA ya genek transkripsiyon faktöelerinin veya spesifik aktivatörlerin ulaşılabilirğini artırmak için kromatini yeniden şekilldendirici ve modifiye edici komplekslerle etkileşimi
Bu farklı roller genel transkripsyon araçları ile protein protein etkileşimi aracılığıyla veya transkripsiyonel koaktivatör ve korepressöerleri aracılığıyla meydana getirebilmektedir. Bir çok transkripsiyon faktörü multi protein ailesinin bir üyesidir. Transkripsiyon faktörleri modüler proteinlerdir. TF belli sayıda domainden oluşan modüler proteinlerdir. Bu tip proteinlerde 3 ana domain şunlardır. DNA bağlanma domaini, transaktivasyon domaini ve dimerizazyon domainidir.ayrıca Tfleri nükleusa girmek için genel olarak nükleer lokalizazyon dizisine ( NLS ) ve nükleustan stoplazma girmesi için nükleusatn çıkış dizisine ( NES ) sahiptir.bazı transkripsiyon faktörleri ( TF) hormon bağlanma domini, ligand bağlanma domainine sahiptir. DNA bağlanma domain motifleri :Bir TF ünün DNA bağlanma domaini spesifik bir DNA dizisine bağlanabilir. X ışını kristalografisi ile yüzlerce protein DNA kompleksi analiz edilmiştir. Transkripsiyon faktörleri ile DNA arasında en yaygın tanıma biçimi protein α- helix domaini ile DNA çift sarmalınınn büyük oluğundaki yaklaşık 5 baz çifti arasındaki etkileşimdir. α- helix domaini, baz çiftleri ve fosfatların oluşturduğu DNA yüzeyinin komplementeridir. TF ile DNA bir araya gelmeden önce - helix domainilerinin polar grupları su moleküllerinin etrafında hidrojen bağları oluşturular.
DNA bağlanma domainleri karşılaştırıldığında TF lerinin çoğu motiflere göre belirlenen gruplara ayrılır. Motif ; bir amino asit kümesi olarak tanımlanmış ve spesifik bir fokiyonu vardır. DNA motiflerinden bazıları şunlardır. Heliks turn döngü heliks, çinko parmak, bazik lösin fermuar ve bazik heliks halka heliks motifleridir. Heliks Turn heliks motifi ( HTH ) : Bu motif ilk keşfedilen DNA bağlanma domaini olup iyi karakterize edilmiştir. Klasik HTH domaini kısmen açık konformasyonlu bir sağ el demetinden oluşup 3 kor α- helixten ibaret basit bir amino asit kıvrımıdır.üçüncü heliks ara yüzeyi oluşturur. HEMEODOMAİN ; klasik HTH bir tütü olup bir çok transkripsiyon faktöründe mevcuttur. Çinko parmak ( ZİF ): En yaygın DNA motiflerinden biridir. ilk olarak TFIIIA( 5S rrna nın RNA pol III tarafından gerekli oloan TF ) olarak tanımlandı.