TÜBİTAK-1003 Projesi Serin İklim Tahıllarında Çeşit Islah Programlarının Oluşturulması Çağrısı 214O072 no lu Klasik ve Moleküler Islah Yöntemleri Kullanılarak Bazı Buğday Çeşitlerine Tuza Toleranslılık Genlerinin Aktarılması Başlıklı Projenin 1. Gelişme Raporu Özeti (Ekim 2016) Proje Yürütücüsü Prof. Dr. Erdoğan Eşref Hakkı Selçuk Üniversitesi Toprak Bilimi ve Bitki Besleme Bölümü
Projenin Konusu: Dünya da ve de ülkemizde insan beslenmesinde en ön sırada olan kültür bitkisi buğdayın ekim alanlarına oldukça yaygın olan elverişsiz (tuz ve bor içeriği yüksek) tarım alanlarının ve gittikçe önem kazanan marjinal alanların dahil edilebilmesi için kendi ekolojik şartlarımıza uygun genotiplerimizin bu ortamlarda verimli ve kaliteli üretimi konusunda ilerleme sağlamaktır. Projenin Amacı: Avustralya da CSIRO dan temin edilerek çoğaltılan tuza toleranslı ekmeklik ve makarnalık buğday hatlarından klasik ve moleküler ıslah yöntemleri ile bu toleranslılığı sağlayan Nax1 ve Nax2 genlerinin Orta Anadolu tarım kuşağına iyi adapte olmuş yerel buğday çeşitleri ve ümitvar hatlara aktarılmasıdır. Ayrıca tuzlu, kurak ve yarı kurak toprakların önemli bir kısmında aynı zamanda bor toksisitesi özellikle buğday tarımında verimi düşüren ve kaliteyi etkileyen önemli bir abiyotik strestir. Bor toksisitesine tolerans allelini taşıyan eski bir Türk buğday çeşidinin melezleme programına dahil edilmesi ile tuz ve bor toleranslılığı özelliğine sahip buğday genotiplerinin geliştirilmesinde ilerletilmiş melez hatlar elde edilmesi hedeflenmektedir.
Ön Çalışmalar-1 Proje 1 Ekim 2015 tarihinde başlamıştır. CSRIO dan 2013 yılında temin edilen tuza tolerans genlerini taşıyan Avustralyalı hatlar (5004, 5020-7, 5924 and 5907) fakültemizin tarlasına ekilmiştir ve tohumluk eldesi için çoğaltılmıştır. 2013 Ekim ve 2014 Mart aylarında ise makarnalık (Mirzabey 2000, Kızıltan 91 ve MBH1) ve ekmeklik (Bayraktar 2000, Kınacı 97, EBH1 ve EBH2) ve Avustralyalı hatlar ekilmiştir. Bu aşamada genotiplerin çiçeklenme zamanları/gelişimleri takip edilmiştir. İlk melezlemeler 2014 Mayıs ayında yapılmıştır. Bu aşamada elde edilemeyen veya yeterli olmayan melez tohumlar için 2014-2015 sezonunda 3 farklı zamanda arazi şartlarında ekim gerçekleştirilmiştir: Ekim 2014, Kasım 2014 ve Mart 2015.
2014-2015 Ekim Dönemi
2015 Mayıs Melezleme Dönemi
Ön Çalışmalar-2 Arazi ekimine paralel olarak ayrıca sera koşullarında da bitkilerin gelişimini/büyümesini takip etmek için ekim gerçekleştirilmiştir ve melezleme çalışmaları yürütülmüştür. 2014-2015 sezonu melezleme çalışmalarında her bir kombinasyon için minimum 150 tohum hedeflenmiştir. 16 kombinasyondan sadece EBH1*5924 kombinasyonunda 119 melez tohum elde edilmiştir. Projenin resmi başlangıç tarihi olan Ekim 2015den evvel F1 tohumları hazır edilmiştir.
2014-2015 Sezonu Sera Ekimi
2014-2015 Sezonu Sera Melezleme
Geri Melezleme(GM1) Eldesi için Çalışmalar Bir önceki senenin tecrübesine dayanarak melezleme için çiçeklenme zamanlarını yakalayabilmek için GM1 eldesi için tarlada 10ar gün arayla 3 farklı zamanda ekim gerçekleştirilmiştir: 5 Ekim 2015, 15.10.2015, 25.10.2015. Ekim öncesi parsellere DAP gübresi uygulanmıştır, Şubat sonunda üre ve Nisan ayında da amonyum sülfat gübrelemesi yapılmıştır. Bitkiler ekim sonrası için çim suyu ve daha sonraki dönem ihtiyaçlarına göre damlama sulama yapılmıştır. Herhangi bir ilaçlama yapılmamıştır. Yabancı otlar ise elle uzaklaştırılmıştır. Anne olarak kullanılacak olan F1 genotiplerin her birinden kardeşlenme döneminde Nax1,Nax2 ve Bot gen taramalarını yapmak için yaprak örnekleri alınmıştır. Moleküler taramalarını gerçekleştirdikten sonra gen taşıyan pozitif genotipler belirlenmiştir. Pozitif genotiplerin kastrasyonuna Nisan 2016 da başlanmıştır. Hava şartlarına göre 3-5 gün sonra da tozları verilmiştir.
Geri Melezleme(GM1) Eldesi için Çalışmalar Moleküler taramalarda skorlamalar sonucu geni taşıyanlar yani pozitif olan örnekler arazide sarı fiyonk ile işaretlenmişlerdir. F1 eldesinde anne olarak kullanılan genotipler geri melezleme çalışmalarında baba olarak kullanılmıştır. F1 genotipleri kastrasyon edildikten sonra, hava durumuna göre F1 genotiplerine 3-5 gün sonra tozları verilmiştir. 2015 Temmuz ayında ise hasat gerçekleştirilmiştir. Hasat sonucunda her bir kombinasyondan ortalama 300 tohum hedeflenmiştir. Ama bazı kombinasyonlarda bu hedefe ulaşılamamıştır. (Bayraktar X 5924) X Bayraktar; (Bayraktar X 5907) X Bayraktar; (EBH1 X 5907) X EBH1; (EBH2 X 5924) X EBH2 den sırası ile 185, 181, 144 and 203 tane pozitif melez tohum elde edilmiştir. Yalnız Mirzabey*5004 kombinasyonunda 902 melez tohum elde edilmiştir. Lakin tiplendirme çalışmalarında teknik bir sorundan dolayı zamanında tamamlanmadığı için pozitif melez tohumlar belirlenememiştir.
2015-2016 Nisan-Mayıs Melezleme Dönemi
2015-2016 Nisan Mayıs Melezleme
DNA İzolasyonu ve Nax1, Nax2 ve Bot(Tp4A)-B5c taramaları DNA izolasyonları için Şubat 2016 döneminde alınan yaprak örnekleri sıvı azotta şoklanıp, -80 C e kaldırılmıştır. DNA izolasyonları ilk olarak modifiye edilmiş 2xCTAB metodu ile gerçekleştirilmiştir. İzolasyonların daha hızlı gerçekleştirilebilmesi için 96 örneği aynı anda izole edebilen QIAGEN marka Qiacube HT modeli devreye girmiştir. Nax1 ve Nax2 PCR taramaları CSIRO dan alınan protokolün optimizasyonu ile gerçekleştirilmiştir. Bot genleri taraması ise (Pallotta ve ark., 2014) den modifiye edilerek gerçekleştirilmiştir. Bor toksisitesi tolerans geni taramaları için AWW516 ve AWW525 genetik markörleri test edilmiştir ama AWW525 ile genotiplerin taraması gerçekleştirilmiştir. Tiplendirme çalışmaları için Bioptic cihazından elde edilen elektrofenogramlar ve jel görüntülerinin sonucuna göre belirlenmiştir.
TissueLyser II İLE HOMOJENİZASYON
QIAcube HT İLE EKSTRAKSİYON
DNA Örneklerine Ait: Agaroz Jel Görüntüsü & NanoDrop 1000 Okuması
Bioptic ile Tiplendirme
Moleküler Optimasyon Çalışmaları Jel Görüntüleri
2016 2. Dönem için Ön Çalışmalar Pozitif olan genotiplerin başakları ayıklanmıştır. Projenin 2. dönem çalışma planında GM1 tohumlarının serada yetiştirilip GM2 aşamasına getirilmesi planlanmıştır. Tohumlar ekilmeden evvel vernalizasyona ihtiyaç duymaktadır. Bu yüzden tohumların vernalizasyonu öncesinde 104 gözlü viyollerde tohumların sterilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Ebeveyn takibini yapabilmek için viyollerin Excel de ekim planları hazırlanmıştır. Tohumların sterilizasyonu için sırasıyla %5 lik Sodyum Hipoklorit çözeltisi, çeşme suyu ve saf sudan geçirilmiştir. Tohum sayısı az olan kombinasyonlar hariç her bir viyolde en az 200 tohum steril edilmiştir. 5 hafta boyunca +4 derece dolapta ebeveynler ve GM1 tohumları vernalize edilmiştir. 6.haftada ise tohumların devernalize olmaması için 8-10 C ye sıcaklığı yükseltilmiştir. Eylül ayının son haftasında ise 15 kg lık saksılar 1:1 oranında toprak torf karışımından doldurulmuştur. Her bir saksıya 10ar tohum ekilmiştir.
Sera Revizyonu Selçuk Üniv. Ziraat Fakültesi Toprak Bilimi ve Bitki Besleme Bölümü ne ait olan sera yaklaşık 15 yıldan beri aktif çalıştığı için bazı revizyonlara ihtiyaç duyulmuştur. Bu kapsamda projenin de desteği ile 1. Isıtma-soğutma, kenar yansıtıcıların ve otomasyon sisteminin yenilenmesi 2. Konya şartlarında sera ekimleri için güz döneminde gerekli olan özel amaçlı aydınlatma sistemi (LED Red-Blue Growth Light Sistemi) devreye sokulmuştur.