1 T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu Sonuç Raporu Proje No: 2008/38 Projenin Başlığı BAL ARISI (Apis mellifera L.) VİRÜSLERİNİN MOLEKÜLER TANISI, GENETİK KARAKTERİZASYONU VE KİTLESEL ARI ÖLÜMLERİYLE İLİŞKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Proje Yöneticisi Prof. Dr. Şaban TEKİN Birimi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Araştırmacılar ve Birimleri Yrd. Doç. Dr. Yaşar GÜLMEZ / Biyoloji Yrd. Doç. Dr. Ahmet BURSALI / Biyoloji Şubat 2012
1 T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu Sonuç Raporu Proje No: 2008/38 Projenin Başlığı BAL ARISI (Apis mellifera L.) VİRÜSLERİNİN MOLEKÜLER TANISI, GENETİK KARAKTERİZASYONU VE KİTLESEL ARI ÖLÜMLERİYLE İLİŞKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Proje Yöneticisi Prof. Dr. Şaban TEKİN Birimi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Araştırmacılar ve Birimleri Yrd. Doç. Dr. Yaşar GÜLMEZ / Biyoloji Yrd. Doç. Dr. Ahmet BURSALI / Biyoloji Şubat 2012
ii ( * ) ÖZET BAL ARISI (Apis mellifera L.) VİRÜSLERİNİN MOLEKÜLER TANISI, GENETİK KARAKTERİZASYONU VE KİTLESEL ARI ÖLÜMLERİYLE İLİŞKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Bal arısı, Apis mellifera L. çeşitli ürünleri ve çiçekli bitkilerin tozlaşmasına olan katkısı nedeniyle ekonomik önemi olan faydalı böceklerin başında gelmektedir. Ancak virüsler gibi birçok patojen bal arılarına çok ciddi zararlar vermekte ve bunun bir sonucu olarak arıcılıkta büyük ekonomik kayıplar olmaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda dünyada yayılış gösteren 18 farklı arı virüsü tespit edilmiş ve bunların nedeni bilinmeyen toplu arı ölümlerinden sorumlu olabileceğine dair bulgular elde edilmiştir. Bu çalışmada, ülkemizde arıcılığın gelişmiş olduğu ve kitlesel arı ölümlerinin görüldüğü Tokat, Ordu ve Ardahan illerindeki arı kolonilerinde Akut Arı Felci Virüsü (ABPV), İsrail Akut Felç Virüsü (IAPV), Keşmir Arı Virüsü (KBV), Siyah Kraliçe Hücre Virüsü (BQCV), Tulumsu Yavru Çürüklüğü Virüsü (SBV), ve Deforme Kanat Virüsü (DWV) gibi arı virüslerinin varlığının moleküler yöntemleriyle tanısı, genetik karakterizasyonu ve bunların kitlesel arı ölümleriyle ilişkisi araştırılmıştır. Çalışma sonuçlarına göre hedef bölgelerden toplanan bal arısı ve Varroa akarlarının çoğunda DWV virüsü varlığı tespit edilmiştir. DWV virüsünün özellikle akarla enfeste olmuş kolonilerde yaygın olduğu dolayısıyla akarların DWV bulaşında önemli rolü olduğu sanılmaktadır. Yapılan çalışmalarda bal arılarında ve Varroa akarında diğer virüslere rastlanmamıştır. Bu çalışmada toplu arı ölümlerinin rapor edildiği Ardahan da bal arısı kolonilerinde DWV virüsüne rastlanması bu virüsün toplu koloni kayıplarında rolü olabileceği ihtimalini güçlendirmiştir. Anahtar Kelimeler: Tokat, Bal arısı, Virüsler, DWV, Varroa ( * ) Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir (Proje No: 2008/38).
iii ABSTRACT MOLECULAR DETECTION AND GENETIC CHARACTERIZATION OF HONEYBEE (Apis mellifera L.) VIRUSES AND RELATIONSHIP BETWEEN VIRUSES AND MASSIVE HONEYBEE COLONY LOSSES Honeybee, Apis mellifera L., is one of the most important economical insects by contribution to the pollination of agricultural plants. However, many pathogens including honey bee viruses threaten honeybee colonies and cause severe losses to apiculture. To date, approximately 18 honeybee viruses have been identified throughout the world. In the present study, presence and genetic characterization of honeybee viruses such as Acute Bee Paralysis Virus (ABPV), Israilian Acute Paralysis Virus (IAPV), Kashmir Bee Virus (KBV), Black Quin Cell Virus (BQCV), Sacbrood Virus (SBV), and Deformed Wing Virus (DWV) in honeybees and Varroa destructor mites collected from Tokat, Ordu and Ardahan provinces. In addition, relationships between honeybee viruses and Honeybee colony losses was investigated. As a result, Deformed Wing Virus was detected in many honeybees and Varroa mites collected from colonies in Tokat, Ordu and Ardahan provinces. Deformed Wing Virus was prevalent especially in Varroa infested colonies, indicating the role of Varroa mites for transmission of DWV. Detection of DWV in provinces such as Ardahan where the massive colony losses reported suggests that this virus may indirectly involve in honeybee colony losses. Key words: Tokat, Honeybee, Viruses, DWV, Varroa
iv İÇİNDEKİLER İÇ KAPAK.. i ÖZET... ii ABSTRACT. iii ŞEKİLLER DİZİNİ. v ÇİZELGELER DİZİNİ vi 1. GİRİŞ 1 2. MATERYAL VE METOT.. 7 Sayfa 2.1.Örneklerin Toplanması.. 7 2.2.Total RNA Ekstraksiyonu.. 9 2.3.Reverse Transkriptaz PCR. 10 2.4.Jelden DNA Saflaştırması, Dizileme ve RT-PCR Ürünlerinin Genetik Analizi.... 12 3. BULGULAR 13 3.1.Tokat Bölgesinden Toplanan Bal Arısı ve Varroa Örneklerinde Bal Arısı Virüslerinin Tespit Edilmesi 13 3.2.Ordu Bölgesinden Toplanan Bal Arısı ve Varroa Örneklerinde Bal Arısı Virüslerinin Tespit Edilmesi 13 3.3. Ardahan Bölgesinden Toplanan Bal Arısı ve Varroa Örneklerinde Bal Arısı Virüslerinin Tespit Edilmesi 16 3.4. Aydin Söke Bölgesinden Toplanan Bal Arısı ve Varroa Örneklerinde Bal Arısı Virüslerinin Tespit Edilmesi. 17 4. TARTIŞMA VE SONUÇ. 18 5. KAYNAKLAR.. 22
v ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1.1. Projede örnek toplanan arılıkların bulunduğu iller 7 Şekil 3.2.1. Ordu ilinden toplanan işçi arılarda (Worker) Deforme Kanat Virüsünün Belirlenmesi 14 Şekil 3.2.2. Ordu ilinden toplanan erkek arılarda (Drones) Deforme Kanat Virüsünün belirlenmesi..... 15 Şekil 3.2.3. Ordu ilinden alınarak test edilen Varroa örneklerinde Deforme Kanat Virüsünün belirlenmesi... 15 Şekil 3.3.1. Ardahan ilinden toplanan arı örneklerinde Deforme Kanat Virüsü (DWV) varlığının tespit edilmesi. 16 Şekil 3.4.1. Aydın ın Söke ilçesinden getirilen arı örneklerinde Deforme Kanat Virüsünün (DWV) tespit edilmesi.. 17 Şekil 4.1. Ordu bölgesindeki bal arılarında tespit edilen DWV virüsünün, daha önce tespit edilmiş DWV virüsleriyle olan dizi benzerliği... 20
vi ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Tablo 1.1. Dünyada bilinen bal arısı virüsleri.. 3 Tablo 2.3.1. Transcriptor One-Step kitine göre RT-PCR reaksiyon koşulları..10 Tablo 2.3.2. Çalışmada arı virüslerinin tanısında kullanılan primerler. 11
1 1. GİRİŞ Bal arısı (Apis mellifera) dünyanın hemen her yerinde yayılış gösteren ve bal, polen, arı sütü, propolis gibi çeşitli doğal ürünler sağlayarak küresel ekonomiye katkıda bulunan en önemli böceklerden biridir. Bal arılarından elde edilen bu ürünler dışında tüm çiçekli bitkilerin ve aynı zamanda tarımsal ürünlerin de tozlaşmasına yardımcı olmaları ekosistemler açısından son derece önemlidir. Bal arıları tozlaşmaya olan katkıları yönünden ele alındığında, dünya üzerinde yetiştiriciliği yapılan en değerli hayvanlar olup tarımsal üretime sağladıkları katkı, bal ve yan ürünleriyle sağladıkları katkıdan daha fazladır. Öyle ki, çiçekli bitkilerin yaklaşık 3/4 ü böcekler tarafından, çoğunlukla da bal arıları tarafından döllenmektedir (Fries, 1993; Kaftanoğlu ve Kumova, 1989; Özbilgin ve ark., 1999; Saki, 1999; Yücel, 2000). Dünyada günümüze kadar bildirilen 11 adet bal arısı türü bulunmaktadır. Muz (2008) e göre Apis cinsinde yer alan bu türler: Apis cerena, A. koschevnikovi, A. nigrocineta, A. dorsata, A. laboriosa, A. florea, A. andreiformis, A. binghami, A. breviligul, A. nuluensis ve A. mellifera dır (Burğut ve ark., 2009). Dünya da yaygın olarak yetiştiriciliği yapılan bal arısı türü olan Apis mellifera, bu türlerden ekonomik yönden en fazla öneme sahip olanıdır. Türkiye de Apis mellifera nın 4 alttürü bulunmaktadır. Bunlar; çoğunlukla Orta Anadolu da yaygın olan Apis mellifera anatoliaca, Ardahan, Kars, Erzurum ve Doğu Karadeniz yöresinde Apis mellifera caucasica, Batı Anadolu da Apis mellifera ligustica, Trakya ve Batı Karadeniz yöresinde Apis mellifera carnica dır (Akkaya ve Vuruşaner, 1995; Cengiz ve ark., 2005; Fıratlı ve ark., 2004; Kaftanoğlu ve Kumova, 1989; Özbilgin ve ark., 1999; Ruttner, 1988; Saki, 1999). Türkiye sahip olduğu yaklaşık 5,6 milyon dolayındaki kovan varlığı ve yıllık 81 bin ton bal üretimi ile dünya ülkeleri arasında ikinci sırada bulunmaktadır (Anonim, 2010). Kovan varlığı ve bal üretimi bakımından dünyanın önemli ülkeleri arasında bulunması, ülkemizin arıcılık potansiyelinin yüksek olduğunu göstermektedir. Ancak, Türkiye de kovan başına üretilen bal miktarı yaklaşık 18 kg olup ülkemiz bu konuda diğer birçok ülkenin gerisindedir (Akkaya ve Vuruşaner, 1995; Saki, 1999; Yücel, 2000).
2 Türkiye nin ekolojik yapısı ve bitki örtüsü birçok bölgede arıcılık için uygun olmasına karşın ağırlıklı olarak Ege, Karadeniz ve Akdeniz bölgelerinde arıcılık yapılmaktadır. Arıcıların bilgi ve eğitim bakımından yeterli düzeyde olmaması, bazı yıllarda ortaya çıkan olumsuz mevsim şartları ve arı zararlılarına karşı mücadelede yetersiz kalınması gibi çeşitli nedenlerle ülkemizde arıcılıktan arzu edilen yüksek verim alınamamaktadır. Arıcıların bilinçlendirilmesi, özellikle arı hastalık ve zararlıları konusunda farkındalıklarının arttırılması ve gerekli önlemlerin zamanında alınması, bu tarım sektöründe yüksek verim alınmasına önemli katkılar sağlayacaktır (Fries, 1993; Kaftanoğlu ve Kumova, 1989; Özbilgin ve ark., 1999; Saki, 1999; Yücel, 2000). Son yıllarda dünyanın çeşitli bölgelerinde nedeni bilinmeyen toplu arı ölümleri, arıların kovanlarını terk etmesi veya verim düşüklüğü gibi olayların nedenleri araştırılırken, özellikle arı virüslerinin kovanlar üzerinde olumsuz etkileri üzerinde durulmuştur (Bakonyi ve ark. 2002a, 2002b; Bowen-Walker ve ark., 1999; Chen ve ark., 2004). Günümüzde dünyanın farklı yerlerinde yayılış gösteren 18 bal arısı (Apis mellifera L.) virüsü tespit edilmiştir (Bailey and Ball, 1991; Chen ve ark., 2004; Fievet ve ark., 2006; Chen ve Reinhold, 2007) (Tablo 1). Bu arı virüslerinden en önemlileri arasinda Deformed Wing Virus (DWV), Sacbrood Virus (SBV), Black Queen Cell Virus (BQCV), Kashmir Bee Virus (KBV), Acute Bee Paralysis Virus (ABPV), ve Israeli Acute Paralysis Virus (IAPV) bulunmaktadir ve arılarda en çok bu virüslere rastlanmaktadır (Maramorosch ve Shatkin 2007). Dünyanin değişik ülkelerindeki bal arısı kolonilerinde sık olarak rastlanan bu arı virüslerinin bazılarının özellikleri aşağıda verilmiştir.
3 Tablo 1.1. Dünyada bilinen bal arısı virüsleri. Bal Arısı Virüsleri Kısaltmalar Virüsün Adı Deformed Wing Virus DWV Deforme Kanat Virüsü Kakugo Virus KV Kakugo Virüs Sacbrood Virus SBV Tulumsu Yavru Çürüklüğü Virüsü Thai Sacbrood Virus TSV Thai Tulumsu Yavru Çürüklüğü Virüsü Black Queen Cell Virus BQCV Siyah Kraliçe Hücre Virüsü Kashmir BeeVirus (KBV) KBV Kaşmir Arı Virüsü Acute Bee Paralysis Virus ABPV Akut Arı Felç Virüsü Chronic Bee Paralysis Virus CBPV Kronik Arı Felç Virüsü Slow Paralysis Virus SPV Yavaş Felç Virüsü Israeli Acute Paralysis Virus IAPV İsrail Akut Felç Virüsü BeeVirus X BVX Arı X Virüsü BeeVirus Y BVY Arı Y Virüsü Arkansas Bee Virus ABV Arkansas Arı Virüsü Berkeley Bee Picorna Virus BBPV Berkeley Arı Picorna Virüsü Cloudy Wing Virus CWV Bulanık Kanat Virüsü Filamentous virus FV Filamentöz Virüsü EgyptBeeVirus EBV Mısır Arı Virüsü Apis Irisdescent Virus AIV Arı İridesent Virüsü Deforme kanat virüsü (DWV) ilk olarak Japonya da erişkin arılardan izole edilmiştir. Doğal konakçısı A.mellifera ve A. cerana dır. Etken dünyanın birçok bölgesinde bulunmaktadır. Bugüne kadar Avrupa da, Kuzey ve Güney Amerika da, Afrika da, Asya da ve Orta Doğu da etkenin varlığı gösterilmiştir. Iflavirus genusunda yer alan Deforme kanat virüsü 30 nm çapında ve kübik simetrili bir viriona sahiptir (Lanzi ve ark., 2006). Etken, pozitif anlamlı tek iplikçikli RNA genomu taşır (Lanzi ve ark., 2006, Maramorosch ve Shatkin, 2007). Etkenin, Mısır arıvirüsü ile serolojik olarak yakın ilişkisi vardır (Allen ve Ball, 1996). Tulumsu yavru çürüklüğü virüsü ile DWV nün aminoasit dizisi % 40 oranında benzerlik göstermektedir (Tentcheva ve ark., 2004a).
4 Ayrıca Kakugo virüs (KV) ile DWV nün nükleotit dizilimleri arasında % 98 oranında benzerlik olduğu ve aynı viral doku tropizmine sahip oldukları bilinmektedir (Rortais ve ark., 2006). Virüse bağlı olarak erişkin arılarda kanatlarda buruşukluk, gövdede küçülme ve renksizleşme meydana gelir. Virüs, erişkin arılarla birlikte yumurta, larva ve pupa dönemlerinde de enfeksiyon oluşturabilir. Pupanın gelişimi esnasında virüs yavaş çoğalır ve nadiren ölüme yol açar. DWV ile enfekte erişkin arılar genellikle normal görünür ancak enfekte arıların yaşam sürelerinde kısalma olduğu düşünülmektedir. Virüsün morfolojik değişimlere hangi mekanizma ile yol açtığı henüz tam olarak açıklanamamıştır (Maramorosch ve Shatkin 2007). DWV ile enfekte olan bazı arılarda Varroa destructor enfestasyonuna da rastlanmaktadır (Yue ve Genersch, 2005). Laboratuar ve saha çalışmaları Varroa nın DWV için etkili bir vektör olduğunu göstermiştir (Tentcheva ve ark., 2004b, Maramorosch ve Shatkin, 2007). Tüm araştırmalar bal arılarında Varroa enfestasyonu ile DWV nün prevalansı arasında bir ilişki olduğuna işaret etmektedir. Bu ilişkiye dayanarak kolonilerin sönmesinde viral enfeksiyonlar kadar Varroa nın da rolü olduğu öne sürülmektedir. Bunun yanı sıra DWV virüsünün Varroa akarı haricinde besinlerle bulaşabileceği de sanılmaktadır. Çünkü son yapılan bir çalışmada bu virüsle birlikte BQCV ve SBV nin çiçek tozlarında ve bu çiçeklerden beslenen bal arıları ve diğer yaban arı ve böceklerinde varlığı belirlenmiştir (Singh ve ark. 2010). Buna karşın diğer arı virüslerinin çiçek tozları ve nektardaki varlığı ve arılara bulaşması hakkında bilgi bulunmamaktadır. BQCV (Siyah Kraliçe Hücre Virüsü) hastalığı petek gözlerinde koyu kahverengiye dönmüş ölü kraliçe arı, pupa ve prepupaların bulunmasıyla karakterizedir. Enfeksiyon Kuzey Amerika, Avrupa, Okyanusya, Asya, Afrika ve Orta Doğu da tespit edilmiştir. İzometrik yapıda, 30 nm büyüklüğünde ve tek iplikçikli RNA genomuna sahip olan virüs Dicistroviridae ailesinde Cripavirus genusunda yer alır (Benjeddou ve ark., 2001, Mayo, 2002). Viral genom 8550 nükleotidden oluşmaktadır (Leat ve ark., 2000). Hasta larvalar soluk sarı renkte olup derileri Tulumsu yavru çürüklüğünde olduğu gibi yumuşamıştır. Etken pupalarda hızla çoğalır ve pupa koyu renge dönerek ölür. Pupanın koyu renk alması bu hastalık için karakteristiktir. İsçi arılar da bu virüsle enfekte olabilirler ancak genellikle semptom göstermezler (Maramorosch ve Shatkin 2007).
5 BQCV nün epidemiyolojisi Nosema apis paraziti ile ilişkilidir (Berényi ve ark., 2006, Tentcheva ve ark., 2004b). N. apis enfestasyonunun yoğun olduğu ilkbahar ve yaz aylarında BQCV enfeksiyonu yoğunluğu artar. Ayrıca N. apis ile enfekte erişkinlerde virüs daha hızlı çoğalır (Maramorosch ve Shatkin, 2007). Varroa nın bu hastalıkta da vektör olarak rol oynadığına ilişkin bulgular olmasına rağmen tam tersi görüşler de bulunmaktadır (Tentcheva ve ark. 2004b). IAPV (İsrail Akut Arı Felç Virüsü) ilk olarak 2004 yılında İsrail de tanımlanmıştır (Mayo, 2002). Takiben 2006 yılında ABD de oldukça fazla sayıda arı kolonisinin sönmesine neden olmuştur (Chen ve Evans, 2007). Ani koloni sönmesi (colony collapse disorders) gözlenen kolonilerin %96.1 inde İsrail akut arı felci virüsü tespit edilmiştir (Kaplan, 2007). Ani koloni sönmesi kovan ve çevresinde ölü arıların hiç bulunmadığı veya çok az bulunduğu, genellikle tarlacı arıların uçuş için kovan dışına çıkıp geri dönmemeleri ile karakterize bir durumdur (Handerson ve ark., 2007). Bu virüsle ilişkili ani koloni sönmesi olayları ABD dışında Belçika, Fransa, Almanya, Hollanda, Polonya, Yunanistan, İtalya, Portekiz, İspanya, İsviçre ve Tayvan'da tespit edilmiştir. Araştırmalar ani koloni sönmesi gözlenen bal arısı kolonilerinin viral ve paraziter patojenlerle aynı anda enfekte olma oranlarının diğer patojenlerle aynı anda birlikte bulunma oranlarına göre daha yüksek olduğunu göstermektedir (Bakonyi ve ark., 2002a, 2002b, Yue ve Genersch, 2005, Berényi ve ark., 2006). Akut Arı Felç Virüsü (ABPV) genomik yapısına göre (RNA) Dicistroviridae ailesi içinde sınıflandırılmaktadır. (Blanchard ve ark., 2008). Kaşmir arı virüsü ve akut arı felç virüsü ile genetik yakınlığa sahiptir. Fakat serolojik olarak yakınlık söz konusu değildir (Maori ve ark., 2007). Hastalığa bağlı olarak arılarda felç ve kanatlarında titreme gözlenir. Enfekte arılar tipik bir şekilde kovanın dışında ölü olarak bulunurlar. Saflaştırılmış kronik arı felç virüsünün arılara inokule edilmesi sırasında hayvanların ölmeden 5-7 gün önce titremeye başladığı ve uçamadıkları gözlenmiş, böylece ekstrakttaki virüs akut arı felç virüsü olarak tanımlanmıştır (Maramorosch ve Shatkin, 2007). Bugüne kadar etkenin varlığı Amerika, Avrupa, Okyanusya, Asya, Afrika, Orta Doğu ve Uruguay da bildirilmiştir (Antúnez ve ark., 2005, Maramorosch ve Shatkin, 2007). Avrupa ve Amerika daki birçok koloni sönmesi olayında bu etkenin Varroa ile beraber görüldüğü tespit edilmiştir (Antúnez ve ark., 2006, Berényi ve ark., 2006).
6 Enfeksiyonun yayılmasında Varroa nın vektör olarak rol oynayabileceğini gösteren birçok araştırma mevcuttur (Tentcheva ve ark., 2004b). Varroa nın vektör rolü ile birlikte ABPV nün aktivatörü olduğu da sanılmaktadır. Etkenin bulunduğu fakat her hangi bir ABPV pozitif Varroa nın tespit edilemediği kolonilerin belirlenmiş olması virüsün çoğalmasını tetikleyen başka faktörlerin de bulunabileceğini göstermektedir (Tentcheva ve ark., 2004b). Real-time PCR ile arıların beyinlerinde agresif davranışlara neden olan RNA genomuna sahip picorna virüs benzeri bir etken olan Kakugo virüs tespit edilmiştir (Fujiyuki ve ark., 2004, 2006). Etken genetik olarak Deforme kanat virüsü ile %98 oranında benzerlik göstermesine rağmen patojeniteleri farklıdır (Fujiyuki ve ark., 2006). DWV genç arılarda kanat deformitelerine neden olurken KV un arılar üzerinde patojenik veya öldürücü etkisi olup olmadığı henüz netleşmiş değildir (Fujiyuki ve ark., 2004). Bir çok ülkede arı virüsleri konusunda çok yoğun çalışmalar yapılmasına rağmen, ülkemizde arı virüsleri hakkında çok sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Çok yüksek kovan bulunan ve ekonomik anlamda ülke ekonomisine önemli katkı sağlamasına rağmen arıcılıkta önemli bir problem olan balarısı virüslerinin genellikle ihmal edilmiş hatta bir çok arıcının bu virüslerden haberi bulunmamaktadır. Bu nedenle bu proje kapsamında Türkiye de arıcılığın çok gelişmiş olduğu ve/veya arı ölümlerinin yoğun olarak görüldüğü bölgelerdeki bal arılarında DWV, ABPV, SBV, KBV, BQCV ve IAPV gibi arı virüslerinin varlığı, yayılışları ve arı ölümleriyle ilişkileri moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak test edilmiştir.
7 2. MATERYAL VE METOT 2.1. Örneklerin Toplanması Bu çalışma kapsamında Tokat, Ardahan ve Ordu illerinde (Sekil 1) arazi çalışmaları yapılarak çeşitli arılıklardan bal arısı ve Varroa akarı örnekleri alınmıştır. Örnek toplama esnasında Ordu Arıcılık Araştırma Enstitüsü ve Ardahan Arıcılık Üretme İstasyonu müdürlüklerinin desteği ile arıcılarla iletişim kurulmuştur. Ayrıca toplu arı ölümlerinin görüldüğü Aydın, Antalya, Gaziantep ve Hatay illerinden Arı Yetiştiricileri Birlikleri aracılığıyla ölü arı örnekleri temin edilmiştir. Şekil 2.1.1. Projede örnek toplanan arılıkların bulunduğu iller.
8 2009 bahar döneminde yapılan arazi çalismalarıyla Ordu ilinin Fatsa, Persembe, Ünye, Gölköy ve Merkez ilçelerinde 5 farklı arılıktan çok sayıda bal arısı ve Varroa destructor örnekleri toplanmıştır. Bu çalışmada 220 sağlıklı kovanın 15 tanesinden rastgele 50 işçi ve 50 erkek arı alınmıştır. Yoğun olarak Varroa akarı tarafından istila edilmiş 180 kovanın 25 inden kanat ve vücut anormalliği bulunan 50 bal arısı (30 işçi ve 20 erkek) alınmıştır. Ayrıca Varroa lı 180 kovanın 10 tanesinden 50 şer adet Varroa örneği alınmıştır. Tokat ilinde yapılan arazi çalışmaları 2009 ve 2010 yıllarının bahar döneminde yapılmıştır. Tokat ilinde Niksar, Turhal, Pazar ve Merkez ilçelerindeki arılıklardan rastgele 700 den fazla işçi ve 200 erkek bal arısı 20 adet kraliçe arı örnekleri toplanmıştır. Ayrıca Varroa lı 10 kovanın her birinden 20 şer adet Varroa örneği alınmıştır. Ardahan ilinde arazi çalışmaları 2010 yılı yazında yapılmıştır. Ardahan ilinde, Ardahan Arıcılık Üretme İstasyonu müdürlüğünün de lojistik desteği ile Posof, Çıldır ve Merkez ilçelerinde bazı köylerdeki arılıklardan örnek alınmıştır. Bölgeden rastgele seçilen sağlıklı görünümlü ve Varroa istilası bulunmayan 17 farklı arılıktaki 921 kovanın 77 sinden 1089 bal arısı örneği alınmıştır. Arı örneği alınan arılıklardaki varsa önceki yıllarda gözlenmiş olan koloni kaybı vakaları kayıt altına alınmıştır. Ayrıca, proje kapsamını dışında olmasına rağmen Aydın ın Söke ilçesinde yoğun arı ölümlerinin görüldüğü iki arılıktaki farklı kovanlardan isteğimiz üzerine 500 ölü işçi arı örneği Aydın Arıcılar Birliği tarafından laboratuarımıza test edilmek üzere gönderilmiştir. Çalışmada araziden toplanan bal arısı ve Varroa numuneleri 50 ml lik plastik tüplere koyulduktan sonra toplandığı bölgelere göre ayrılarak total RNA ekstraksiyonu yapılana kadar -86 o C de saklanmıştır.
9 2.2. Total RNA Ekstraksiyonu Çalışmada total RNA izolasyonunda, hem viral RNA izolasyon kiti hem de manuel Trizol tabanli RNA izolasyon solusyonu üretici firmaların tavsiye ettiği prosedürlere göre gerçekleştirilmiştir. Manual total RNA izlasyonu aşağıda kısaca özetlenmiştir. a. Bal arısı örnekleri tek tek 2 ml lik steril ependorf türpler içerisine alınır. b. Üzerine 0.5 ml Total RNA Extraction Reagent (Biozol) koyularak steril plastic pestillerle ezilir. c. Elde edilen homojenatlar 5000 g de 5 dk santrifüj yapıldıktan sonra üstteki supernatant kısmı alınarak 2 ml lik steril ependorf tüplere koyulmuştur. d. Örneklerin üzerine 0.5 ml EZ-RNA (Biozol) eklenerek çalkalanmış ve 12000 g de 8 dk santrifüj edilmiştir. e. Santrifüj sonucunda tüpte 3 faz oluşmuştur. En üst kısımdaki renksiz saydam kısım pipet yardımıyla steril yeni ependorf tüplere koyulmuştur. f. Her tüp içerisine RNA yı çöktürmek için 0.5 ml 2- propanol (Isopropanol) eklenmiştir. g. Örnekler oda sıcaklığında 5 dk inkübe edilmiş ve 12000 g de 10 dk santrifüj yapılmıştır. h. Santrifüj sonrasında supernatant kısım atılmış ve dipte kalan RNA yı yıkamak için üzerine 1 ml %75 lik Etanol koyulup, karışım vortekslenmiştir. i. Örnekler 12000 g de 5 dk santrifüj yapılıp supernatant kısım atıldıkan sonra örnekler hava ile kurutulur. j. Kurutulan örnekler üzerine 50 µl DEPC (Diethyl pyrocarbonate / RNase inhibitörü) eklenir. Bütün örneklerde, toplam RNA nın ekstraksiyon hacmi 50 µl dir. Bütün bal arısı örneklerinin RNA konsantrasyonu bir spectrophotometre (Eppendorph Biophotometer) yardımıyla belirlenmiştir ve test edilene kadar -86 o C de saklanmıştır.
10 2.3. Reverse Transkriptaz PCR (RT-PCR) Örneklerde arı virüslerinin varlığı Ctherm One Step RT-PCR kit (Roche, USA) veya Transcriptor One Step RT-PCR kiti (Roche, USA) kullanılarak one step RT-PCR yöntemiyle test edilmiştir. 0.5µg veya 2 µl toplam RNA kullanılarak üretici firmanın önerdiği protokole uygun olarak veya bazı küçük değişiklikler sonrasında yapılmıştır. Transcriptor One-Step kitine göre RT-PCR reaksiyonlarının total hacmi 25 µl olup reaksiyon içeriği aşağıda verildiği gibidir. RT-PCR reaksiyon koşulları da Tablo 2.3.1 de verilmiştir. Water, PCR Grade (vial 3) 14.5 µl 5xReaction Buffer (vial2) 5 µl Upstream primer 1 µl Downstream primer 1 µl Transcriptor Enzym mix. (vial 1) 0.5 µl Template RNA 3 µl Tablo 2.3.1. Transcriptor One-Step kitine göre RT-PCR reaksiyon koşulları. Sıcaklık ( o C) Süre Döngü Sayısı RT Reaksiyon 50 20 dk Ön Denatürasyon 94 7 dk 1 Denatürasyon 94 10 sn Bağlanma 55 30 sn 35 Uzatma 68 10 sn Son Uzatma 68 7 dk 1
11 Genel olarak RT-PCR reaksiyon koşulları kit protokolüne uygun olarak 50 o C de 20 dakika, 94 o C de 7 dakika, takip eden aşamada 94 o C de 30 saniyelik 35 cycle, 55 o C de 30 saniye, 68 o C de 10 saniye ve final uzama basamağında 68 o C de 7 dakika olacak şekilde ayarlanmistir. Gerektiğinde primerlerin Tm derecesine bağlı olarak reaksiyon şartlarında bazı değişiklikler yapılmıştır. Örneklerdeki virüs varlığı Tablo 2.3.2 de verilmiş olan primerlerden her reaksiyon için 0.2 µm/primer kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bütün testlerde negatif kontrol olarak ddh 2 O, pozitif kontrol olarak da sekans doğrulaması yapılmış örneklerden elde edilen pozitif RNA örneği kullanılmıştır. RT-PCR sonrasında, 3 5 µl PCR ürünü etidium bromür içeren 1% lik agaroz jel elektroferezinde koşturulmuştur. Agaroz jeldeki PCR ürünleri bir jel görüntüleme sistemi (IVP, England) kullanılarak fotoğraflanmıştır. Çalışmamızda RT- PCR testleri tüm örnekler için en az iki kez tekrarlanmıştır. Tablo 2.3.2. Çalışmada arı virüslerinin tanısında kullanılan primerler. PRİMERLER SBV Forward SBV Reverse IAPV Forward IAPV Reverse BQCV Forward BQCV Reverse KBV Forward KBV Reverse ABPV Forward ABPV Reverse DWV Forward DWV Reverse NÜKLEOTİT DİZİLERİ (5 - GGATGAAAGGAAATTACCAG-3 ) (5 - CCACTAGGTGATCCACACT-3 ) (5 - AGACACCAATCACGGACCTCAC-3 ) (5 - TCCATTACCACTGCTCCGACAC-3 ) (5 - TGGTCAGCTCCCACTACCTTAAAC-3 ) (5 - GCAACAAGAAGAAACGTAAACCAC-3 ) (5 - TCTTTCTTTGACTCAGGCGACCCA-3 ) (5 - AATATGGGATGGTCCGTCGGTGTT-3 ) (5 - GCTCCTATTGCTCGGTTTTTCCGT-3 ) (5 - TTATGTGTCCAGAGACTGTATCGA-3 ) (5 - TTTGCAAGATGCTGTATGTGG-3 ) (5 - GTCGTGCAGCTCGATAGGAT-3 )
12 2.4. Jelden DNA Saflaştırması, Dizileme ve RT-PCR Ürünlerinin Genetik Analizi RT-PCR sonrasinda pozitif sonuç veren PCR ürünleri DNA dizisinin doğrulanması amacıyla dizi analizine gönderilmiştir. Seçilen pozitif PCR ürünleri Qiagen DNA Gel Isolation Kit i veya Milipore One Step DNA jel ekstrasyon kiti kullanılarak üretici firmaların tavsiye ettiği protokollere göre veya bazı değişiklikler yapılarak agaroz jelden izole edilmiştir. Gerektiğinde çok temiz PCR ürünleri doğrudan DNA dizi analizinde kullanılmıştır. RT-PCR ürünlerinin DNA dizilemesi Gülmez ve ark. (2009) da belirtildiği gibi ABI PRISM 310 Genetic Analyzer üzerinde RT PCR da kullanılan primer çifti kullanılarak DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham) kullanılması yoluyla uygulanmıştır. Gülmez ve ark. (2009) da belirtildiği gibi bu çalışmada tespit edilen DWV nün DNA sekans benzerliği Basic local alignment search tool (BLAST) of NCBI kullanılarak analiz edilmiştir (Altschul ve ark., 1990). DWV dizisinin protein sekansı ExPASy very tabanı kullanılarak yapılmıştır (Gasteiger ve ark., 2003) ve gözlemlenen kısmı DWV çoklu protein sekansı NCBI ın BLAST protein veri tabanı kullanılarak diğer virüslerle karşılaştırılmıştır. Bu çalışmada, moleküler yöntemlerin virüs tanısı için yeterli olması nedeniyle, ELISA gibi arı virüsleri için uygun çalışma kitleri bulunmayan ve çok masraflı olan protein temelli diğer tanı yöntemleri kullanılmamıştır.
13 3. BULGULAR 3.1.Tokat Bölgesinden Toplanan Bal Arısı ve Varroa Örneklerinde Bal Arısı Virüslerinin RT-PCR Yöntemiyle Tespit Edilmesi Yapılan RT-PCR çalışmaları sonucunda Tokat bölgesinde bazı köylerdeki arılıklardan toplanan hastalık şüphesi olan bal arılarında DWV spesifik primerler kullanılarak yapılan RT-PCR testlerinin sonucuna göre DWV varlığı tespit edilmiştir. DWV virüsüne örnek toplanan bölgeler içerisinde en çok Tokat Merkez ilçesinden toplanan işci, erkek arı, kraliçe arı ve Varroa örneklerinde rastlanmıştır. Kraliçe arı örnekleri en çok Tokat bölgesiden temin edilebilmiştir ve bu örneklerin en az %25 i DWV pozitif bulunmuştur. DWV virüsü varlığına en çok erkek arılarda rastlanmış fakat erkek arılarla sınırlı olmadığı ortaya çıkmıştır. Genel olarak, varroa ve kanat deformasyonu gözlenen tüm kovanlarda yoğun olarak DWV virüsüne rastlanmıştır. Çalışmada bazı arılıklardan erkek arı larvalarıda toplanarak test edilmiştir. Bunlardan Varroa akarı bulunan kovanlardan toplananlarda DWV virüsüne rastlanmıştır. Bu çalışmada Tokat bölgesinde DWV pozitif bulunan RT-PCR ürünlerinin DNA dizileri belirlenmiş ve bu dizilerin BLAST araştırması sonucunda daha önce dünyanın başka bölgelerinde ve Avrupada bulunan DWV sekansları ile %98 oranında benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Bu çalışmada Tokat bölgesinden toplanan örneklerde DWV virüsüne ek olarak SBV, KBV, ABPV, BQCV, IAPV varlığı da test edilmiştir. Yapılan test sonuçlarına gore test edilen örneklerde bu virüslere rastlanmamıştır. 3.2. Ordu Bölgesinden Toplanan Bal Arısı ve Varroa Örneklerinde Bal Arısı Virüslerinin RT-PCR Yöntemiyle Tespit Edilmesi Ordu ilinde toplam 400 kovandan oluşan 5 arılıktan alınan bal arısı ve Varroa akar örneklerinde en yaygın arı virüslerinin varlığı araştırıldı. Varroa destructor akarı ile bulaşık olan 3 arılık ve akar bulaşık olmayan 2 arılıktaki kovanlardan rastgele alınan örneklerde; işçi arı, erkek arı ve Varroa akar örnekleri RT-PCR yoluyla test edilmiştir. Varroa istilası bulunan kovanlardan alınan işçi arı, erkek arı ve Varroa örneklerinde
14 DWV tespit edildi (Şekil 3.2.1, 3.2.2 ve 3.2.3). Varroa istilası olmayan sağlıklı kovanlardan alınan işçi ve erkek arılarda ise DWV tespit edilmedi Ayrıca çalışılan örneklerin tümünde SBV, ABPV, BQCV, IAPV ve KBV varlığı da test edildi, fakat bu virüslere rastlanılmamıştır. Varr. + Varr. - Şekil 3.2.1. Ordu ilinden toplanan işçi arılarda (Worker) Deforme Kanat Virüsünün Belirlenmesi (Gülmez ve ark., 2009). M; standart, Varr.+; Varroa istilası olan, Varr.- ; Sağlıklı kovan, W1-4; İşçi arılar.
15 Varr.+ Varr. - Şekil 3.2.2. Ordu ilinden toplanan erkek arılarda (Drones) Deforme Kanat Virüsünün belirlenmesi (Gülmez ve ark., 2009).. M; standart, Varr.+; Varroa istilası olan, Varr.- ; Sağlıklı kovan, D1-4; Erkek arılar. Şekil 3.2.3. Ordu ilinden alınarak test edilen Varroa örneklerinde Deforme Kanat Virüsünün belirlenmesi (Gülmez ve ark., 2009).. M; Standart, V1-3; Pozitif Varroa örnekleri. Yapılan Blast analizleri, Tokat bölgesinde saptanan DWV de olduğu gibi Ordu bölgesindeki arılarda ve Varroa akarlarında tespit edilen DWV visününde daha önce dünyanın başka bölgelerinde ve Avrupada bulunan DWV sekansları ile %98 oranında benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Sonuç olarak, Tokat ve Ordu DWV örneklerinin sekans homolojisi %100 olarak bulunmuştur.
16 3.3. Ardahan Bölgesinden Toplanan Bal Arısı ve Varroa Örneklerinde Bal Arısı Virüslerinin RT-PCR Yöntemiyle Tespit Edilmesi Çalışmamızda, Ardahan ilinde Varroa akarı ile bulaşık olmayan, sağlıklı görünümlü 17 farklı arılıktaki 921 kovanın rastgele 77 sinden 1089 bal arısı örneği toplanmıştır. Ardahan ilinde yaptığımız arazi çalışmaları zamanında Varroa akarı mücadelesi yapılmış olduğundan kovanlarda Varroa akarına rastlanılmamıştır. Dolayısıyla Ardahan daki kovanlardan Varroa akarı toplanamamıştır. Alınan 1089 örnekten 43 ü işçi arı, 32 si erkek arı olmak üzere, rastgele seçilen 75 arı havuzunda virüslerinin varlığı araştırıldı. Bu örneklerde de Tokat ve Ordu örneklerinde olduğu gibi DWV, SBV, BQCV, KBV, AVPV, ve IAPV varlığı RT-PCR yöntemiyle test edilmiştir. Ardahan ilinden toplanan arılardan toplam 75 arı örnek havuzudan 20 sinde bu virüsün bulunduğu tespit edilmiş olup, Şekil 3.3.1 de DWV pozitif örneklerden birinin jel görüntüsü bulunmaktadır. Ayrıca diğer illerde oldugu gibi Ardahan bölgesinden çalışılan örneklerde SBV, ABPV, BQCV, IAPV ve KBV virüslerinin varlığına rastlanmamıştır. M + 1 2 3 4 5 _ 500 bp 395 bp Şekil 3.3.1. Ardahan ilinden toplanan arı örneklerinde Deforme Kanat Virüsü (DWV) varlığının tespit edilmesi. M; Marker, +; Pozitif kontrol, -; negatif kontrol, 4; DWV pozitif bant (DWV pozitif örnek).