14. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, Bildiriler, 29-31 Mayıs 2002, Eskişehir, Eds. K.H.C.Başer ve N.Kırımer Web de yayın tarihi: Haziran 2004 ISBN 975-94077-2-8 KARBON TETRAKLORÜRLE OLUŞTURULAN AKUT KARACİĞER TOKSİSİTESİNDE FOENICULUM VULGARE (REZENE) UÇUCU YAĞININ HEPATOPROTEKTİF ETKİSİ: Deneysel Çalışma Hanefi Özbek 1, Serdar Uğraş 2, Haluk Dülger 3, İrfan Bayram 2, İlyas Tuncer 4, Abdurrahman Öztürk 1 1 Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı, Van 2 Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Patoloji Anabilim Dalı, Van 3 Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı, Van 4 Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Gastroenteroloji Anabilim Dalı, Van Özet Foeniculum vulgare (rezene) uçucu yağının hepatoprotektif etkisi, karbon tetraklorürle oluşturulan akut karaciğer toksisite modeli kullanılarak sıçanlarda araştırıldı. Gruplara ait karaciğerlerin histopatolojik incelemesinde; serum fizyolojik grubunda normal histolojik tablo, karbontetraklorür grubunda belirgin balon dejenerasyonu ve az miktarda nekrozlar, rezene uçucu yağı grubunda ise az miktarda balon dejenerasyonu gözlendi. Gruplara ait serumların biyokimyasal incelemesinde; rezene uçucu yağının, karbon tetraklorür grubunda gözlenen yüksek serum aspartat aminotransferaz, alanin aminotransferaz, alkalin fosfataz değerlerini (p<0,001) ve bilirubin değerlerini (p<0,01) anlamlı derecede düşürdüğü saptandı. Çalışma süresince ölçülen vücut ağırlık değişimleri ile klinik seyir, histopatolojik ve biyokimyasal bulguları destekler nitelikteydi. Histopatolojik bulgular, biyokimyasal testler, günlük vücut ağırlık takibi ve klinik seyir; rezene uçucu yağının karbontetraklorürle oluşturulan akut karaciğer toksisitesi üzerinde anlamlı derecede koruyucu bir etkiye sahip olduğunu çarpıcı bir şekilde ortaya koymaktadır. 1. Giriş Rezene (Foeniculum vulgare Mill., Umbelliferae ailesi) türe bağlı olarak yıllık, iki yıllık ya da çok yıllık aromatik bir bitkidir. Anadolu ve Avrupa da ilk çağlardan beri bilinmektedir. Bitkinin yaprak, sap ve tohumu (meyvesi) yenilebilir özelliktedir. Kurutulmuş aromatik meyveleri, lezzet verici olarak ekmekte ve hamur işlerinde, tatlılarda, alkollü içkilerde, ayrıca kozmetik ve tıbbi preparatlarda kullanılmaktadır (Farrell, 1985; Hänsel ve ark., 1993). Rezene bitkisinin çeşitli coğrafi bölgelerde yetişen birçok türüne ait ekstrelerinin içeriği ve verimi ile uçucu komponentleri üzerinde son zamanlarda birçok çalışma yapılmıştır (Embong ve ark., 1977; Miura ve ark., 1986; Akgül ve Bayrak, 1988; Katsiotis, 1988; Verghese, 1988; Arslan ve ark., 1989; Gupta ve ark., 1995; Venskutonis ve ark., 1996; Özcan ve ark., 2001). Trans-anethole ve fenchone, Rezene uçucu yağının (RUY) en önemli elemanlarıdır. RUY nı oluşturan bazı bileşiklerin oranları değişmekle birlikte; fenchone % 5-20, anethole 61-90 oranlarında bulunmaktadır (Lawrence, 1994; Bernath ve ark., 1996). Rezene tohumu ekstresi uçucu komponentlerinin kromatografik analizi sonucu trans-anethole, fenchone, methylchavicol, d-limonene, α-pinene, camphene, β-pinene, β- myrcene, α-phellandrene, 3-carene, camphor, ve cisanethole bileşiklerinin bulunduğu rapor edilmiştir (Simándi, ve ark., 1999). RUY nın sıçanlarda yapılan toksisite testlerinde LD 50 dozunun 1326 mg/kg olduğu bildirilmiştir (Ostad ve ark., 2001). 301
Rezene ve rezeneden elde edilen preparasyonlar; halk arasında hafif dispeptik şikayetlerde, sindirim sistemine ait spazmlarla karakterize yakınmalarda, şişkinlik hissinde, ayrıca üst solunum yolu akıntılarında kullanılmaktadır (Madaus, 1976; Merkes, 1980; Forster ve ark., 1980, Forster, 1983; Czygane, 1989; Weib, 1991). Rezene bitkisinin tohumları, kadınlarda menstruasyonu destekleyici ve klimakterik semptomları azaltıcı olarak, aynı zamanda libidoyu artırıcı yönleriyle de bilinmektedir (Albert-Puleo, 1980). RUY nın çocuklardaki koliklerde ve bazı solunum sistemi hastalıklarında spazm çözücü etkisinden dolayı kullanıldığı rapor edilmiştir (Reynolds, 1982). Karaciğer, vücuttaki stratejik konumundan dolayı; vücudun maruz kaldığı çeşitli ksenobiyotiklerin, çevre kirliliği etkenlerinin ve kemoterapötik ajanların metabolizmasının, salgılama ve atılım işlemlerinin gerçekleştirilmesi için bir anahtar organdır. Karaciğer hastalıkları bütün dünyayı ilgilendiren bir sorun olarak varlığını sürdürmektedir. Karaciğerle ilgili hastalıklarda kullanılan klasik ilaçlar bazen yetersiz kalabilmekte ve ciddi yan tesirlere neden olabilmektedirler. Bu yüzden karaciğer hastalıklarının tedavisi için alternatif ilaçların araştırılması ve bugün kullanılan etkinliği ve güvenirliği şüpheli ilaçların yerine konulması gereklidir. Rezene bitkisinin muhtemel hepatoprotektif etkinliğini değerlendirme yönünde herhangi bir çalışmaya rastlanmadı. Bu çalışmada rezene tohumu uçucu yağının sıçanlarda karbontetraklorürle (CCl 4 ) oluşturulmuş akut karaciğer toksisitesi üzerine olası etkileri araştırılmıştır. 2. Materyal ve Metod 2.1 Bitki materyali Rezene tohumları Van daki baharatçılardan temin edilmiştir. Referans için örnekler laboratuvarda saklanmaktadır (B-02). 2.2. Kimyasal maddeler Çalışmada Carbon tetrachloride (Merck KgaA, 64271 Darmstadt, Germany) kullanılmıştır. 2.3. Deney hayvanları Bu çalışmada; erkek, Sprague-Dawley sıçanlar (180-200 g) kullanıldı. Deney hayvanları, Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Neuroscience Araştırma Birimi (NAB) Deney Hayvanları Ünitesi nden temin edildi, standart kafeslerde barındırıldı, yem ve su alımı serbest bırakıldı. Hayvanların bulunduğu oda 22 ± 2 o C de, 12 saat karanlık-12 saat ışık ortamında tutuldu. Çalışma öncesi Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu ndan onay alındı (karar sayısı: 2001/04-02). 2.4. RUY nın izolasyonu Rezene tohumları elektrikli değirmende öğütüldü, buhar distilasyonu yöntemiyle (% 1 verim) rezene uçucu yağı toplandı. 2.5. Karaciğeri Koruyucu Etkinin Araştırılması Modeli Handa ve Sharma nın (1990) belirlediği model kullanıldı ve CCl 4 le birebir oranda karıştırılmış zeytin yağı solüsyonundan 0.8 ml/kg, intraperitoneal (i.p.) yolla sıçanlara yedi gün boyunca uygulandı. 2.6. Deney prosedürü Otuz adet sıçan üç gruba ayrıldı (n=10). Birinci gruba (normal kontrol grubu) çalışma süresince izotonik serum fizyolojik solüsyonu (SF); ikinci gruba (CCl 4 kontrol grubu) çalışma süresince 0.8 ml/kg CCl 4 ve üçüncü gruba (RUY grubu) çalışma süresince 0.4 ml/kg RUY verildi. Tüm gruplara i.p. yoldan uygulama yapıldı. Tüm hayvanlar günlük 302
olarak gözlem altında tutuldu. Çalışmanın sonunda sıçanlardan, hafif eter anestezisi altında, kalp içine enjektörle girerek kan örnekleri alınıp serumları ayrıldı, aspartat aminotransferaz (AST), alanin aminotransferaz (ALT), alkalin fosfataz (ALP) ve total bilirubin değerleri araştırıldı. Sıçanların vücut ağırlıkları çalışma boyunca günlük olarak sabah 08.30-09.00 arasında ölçüldü ve ilk gün ölçülen ağırlığa göre yüzde değişim oranı aşağıdaki formüle göre bulunarak kaydedildi: % değişim=100 X (n. ağırlık - ilk ağırlık) / ilk ağırlık 2.7. Karaciğer Fonksiyonlarının Değerlendirilmesi Serum AST, ALT, ALP ve total bilirubin konsantrasyonları, Roche Modular Autoanalyzer cihazında ölçüldü. 2.8. Karaciğerin Histopatolojik Yönden Değerlendirilmesi Çalışmada son uygulamadan (yedinci gün) 24 saat sonra (sekizinci gün) sıçanlar derin eter anestezisi altında öldürülüp karaciğerleri çıkarıldı ve % 10 luk tamponlu formalin içerisine konularak fikse edildi. Rutin fiksasyon işlemlerinden sonra parafin bloklar içine gömülüp, dört µm kalınlığında kesilerek Hematoksilen Eozin ve Masson Trikrom boyası ile boyandı. Histolojik hasar şu şekilde derecelendirildi: 0: Hasar yok; +: Hafif hasar; ++: Orta hasar; +++: Şiddetli hasar. 2.9. İstatistiksel Analiz Tüm veriler ortalama ± standart hata ortalaması (Ort ± SHO) olarak gösterildi. İstatistik analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı; anlamlılık gösteren gruplar için post-hoc Tukey HSD testi kullanıldı ve p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi (Sümbüloğlu, 1998). 3. Sonuçlar 3.1. Çalışma Gruplarının Takibi Çalışma gruplarından hiçbirinde çalışma sonuna kadar ölüm olmadı. RUY grubundaki hayvanların klinik durumlarının SF grubundaki hayvanlardan farklı olmadığı gözlendi. CCl 4 uygulanan sıçanların klinik durumları SF grubuna göre oldukça kötü seyretti; sıçanların hareketlerinde ve canlılığında, yem ve su alımında belirgin bir azalma oldu. 3.2. RUY nın AST, ALT, ALP ve Total Bilirubin Düzeylerine Etkileri Çalışma gruplarının serum AST, ALT, ALP ve total bilirubin düzeyleri; ortalama ± standart hata ortalaması şeklinde tablo 1 de gösterilmiştir. CCl 4 grubunun serum AST, ALT, ALP ve bilirubin seviyeleri hayli yüksekti. Buna karşılık RUY grubunun AST, ALT, ALP ve bilirubin seviyeleri CCl 4 grubunun AST, ALT ALP seviyelerine göre (p<0,001) ve bilirubin seviyesine göre anlamlı derecede düşüktü (p<0,01). 3.3. RUY nın sıçan vücut ağırlığı üzerine etkileri Sıçanların vücut ağırlığı değişimleri tablo 2 ve grafik 1 de verilmiştir. Buna göre; CCl 4 grubunda SF grubuna göre çalışmanın tümünde vücut ağırlığının anlamlı düzeyde azaldığı görülmektedir (p<0,001). Rezene uçucu yağı grubunda çalışmanın 1, 3 ve 5. günleri p<0,001; 2, 4, 6 ve 7. günleri p<0,01 düzeyinde anlamlı derecede azalma olmuştur. CCl 4 grubu, RUY grubu ile karşılaştırıldığında; çalışmanın 1. günü anlamlı fark bulunmazken, 2 ve 3. günler p<0.05; 4, 5 ve 7. günler p<0.01; 6. gün ise p<0.01 düzeyinde RUY grubunun daha az ağırlık kaybettiği görülmüştür. 303
Tablo 1. Grupların AST, ALT, ALP ve bilirubin düzeyleri (Ort ± SHO) AST ALT ALP Bilirubin Gruplar Serum (U/L) Serum (U/L) Serum (U/L) (mg/dl) Kontrol 129.7 ± 012.1 50.0 ± 003.4 751.7 ± 52.8 0.08 ± 0.01 CCl 4 a 2707.6 ± 090.6 a 2185.0 ± 192.1 a 1168.0 ± 78.6 b 0.66 ± 0.17 RUY ac 922.5 ± 125.1 bc 666.5 ± 094.6 c 708.2 ± 55.5 d 0.13 ± 0.01 F Değeri *204.6 *74.2 *15.7 *10.03 Varyans analizi için p değeri: * : p <0.001 Post-hoc Tukey testi için p değerleri: a: p<0.001 ilgili grubun kontrol (SF) grubuyla karşılaştırılması. b: p<0.01 ilgili grubun kontrol (SF) grubuyla karşılaştırılması. c: p<0.001 ilgili grubun CCl 4 kontrol grubuyla karşılaştırılması. d: p<0.01 ilgili grubun CCl 4 kontrol grubuyla karşılaştırılması. Tablo2. Sıçanların vücut ağırlıklarının günlük % değişimleri (Ort ± SHO) Ölçümler Grup 1 2 3 4 5 6 7 Kont 0.2±0.3 0.5±0.3 1.0±0.4 1.5±0.6 1.7±0.8 2.3±0.6 2.5±0.8 CCl 4 b -7.2±0.6 b -12.1±0.8 b -14.3±1.1 b -15.0±1.3 b -15.7±1.2 b -18.4±1.5 b -19.0±2.1 RUY. b -7.7±1.9 ac -6.5±2.2 bc -10.2±2.1 ad -8.1±2.0 bd -7.7±1.1 ae -6.4±0.9 ad -7.6±0.7 F değ *23.430 *35.762 *49.160 *45.756 *75.222 *83.854 *54.118 Varyans analizi için p değeri: *: p < 0.001 Post-hoc Tukey testi için p değerleri: a: p<0,01 ilgili grubun SF grubu ile karşılaştırılması. b: p<0,001 ilgili grubun SF grubu ile karşılaştırılması. c: p<0,05 ilgili grubun CCl 4 grubu ile karşılaştırılması. d: p<0,01 ilgili grubun CCl 4 grubu ile karşılaştırılması. e: p<0,001 ilgili grubun CCl4 grubu ile karşılaştırılması. Grafik 1. Çalışma süresince sıçanların günlük vücut ağırlığı % değişimleri. Günlük vücut ağırlığı yüzde değişimleri (g) 3 0-3 -6-9 -12-15 -18-21 Kontrol CCl4 RUY 0 1 2 3 4 5 6 7 8 çalışma günleri 304
3.4 Histopatolojik değerlendirme Histolojik hasarı değerlendirmek amacı ile hepatositlerde balon dejenerasyon, tek hücre nekrozu, sentrlobüler nekroz, köprüleşme nekrozu ve apopitoz araştırılmıştır (tablo 3). Tablo 3. Çalışma grupları karaciğerlerinin histopatolojik değerlendirmesi.* Mikroskopik değerlendirme Kontrol CCl 4 RUY Hepatositlerde balon dejenerasyon 0 +++ + Sentrlobüler ve köprüleşme nekrozu 0 + 0 Hepatositlerde apopitoz 0 ++ + *: 0, yok; +, hasar; ++, orta; +++, şiddetli. Karbon tetraklorür kontrol grubundaki sıçanların karaciğerinde yaygın balon dejenerasyonu (resim 1), seyrek apopitoz, sentrlobüler nekroz ve köprüleşme nekrozu izlenmiştir (resim 2). RUY uygulanan sıçanların karaciğerlerinin histopatolojik incelemesinde karaciğerde anlamlı derecede düzelme gözlenmiştir. Hepatositlerde seyrek balon dejenerasyonu ve apopitoz izlenmiş, köprüleşme nekrozu ve sentrlobüler nekroza rastlanmamıştır (Resim 3). Resim 1. Karaciğerde, balon dejenerasyon gösteren çok sayıda hepatosit (HE, X50) 305
Resim 2. Karaciğerde sentrlobüler nekrozlar ve balon dejenerasyon gösteren az sayıda hepatosit (HE, X25) Resim 3. Karaciğerde balon dejenerasyon gösteren çok az hepatosit (HE, X25). 4. Tartışma Histopatolojik bulgular; CCl 4 grubu ve RUY grubundaki hepatositlerde CCl 4 ün etkisine bağlı olarak dejenerasyon meydana geldiğini, SF grubunda ise tamamen normal histolojik tablonun olduğunu göstermektedir. Ancak CCl 4 etkisiyle oluşan hepatik lezyonların, CCl 4 grubuna göre RUY grubunda anlamlı derecede daha az olduğu gözlenmektedir. Bu bulgular, biyokimyasal testler, günlük vücut ağırlığı takibi ve çalışma gruplarının klinik seyri ile uyumluluk göstermektedir. Histopatolojik bulgular, biyokimyasal testler, günlük vücut ağırlığı takibi ve klinik seyir; RUY nın CCl 4 le oluşturulmuş akut karaciğer toksisitesi üzerinde anlamlı derecede koruyucu bir etkiye sahip olduğunu çarpıcı bir şekilde ortaya koymaktadır. 306
Rezene tohumu ekstresinin uçucu komponentleri üzerine yapılmış kromatografik analizlerde; trans-anethole, fenchone, methylchavicol, d-limonene, α-pinene, camphene, β- pinene, β-myrcene, α-phellandrene, 3-carene, camphor, ve cisanethole gibi bileşikleri içerdiği bildirilmiştir (Simándi, et al., 1999). Bunlar arasında d-limonene; karaciğerdeki azalmış glutatyon (GSH) konsantrasyonunu artırarak (Reicks ve ark., 1993), β-myrcene ise; sitokrom P450 enzim sisteminin alt tiplerinden olan CYP2B1 ve CYP2B2 düzeylerini artırarak (De Oliveira ve ark., 1997) karaciğer fonksiyonlarını etkilemektedir. Glutatyon ve glutatyon redüktaz enzimleri birçok protein ve polipeptid hormonların disülfid bağları üzerinde ve ksenobiyotik metabolizmasında yer almaktadırlar (Rodwell, 1993). Sitokrom P450 (CYP) enzim sistemi ise; ilaçlar, karsinojenler, toksinler, steroidler, yağ asitleri ve prostaglandinlerin büyük bir kısmının oksidatif metabolizmasını katalize eden hemoproteinlerin süperfamilyasını oluştururlar (Shimada et al., 1994). Dolayısı ile RUY nın hepatoprotektif etkisi d-limonene ve β-myrcene in karaciğer üzerindeki etkilerine bağlanabilir. Rezene uçucu yağını oluşturan diğer komponentlerin karaciğerle ilgili etkileri üzerine yapılmış bir çalışmaya, Mayıs 2002 tarihine kadar İngilizce literatürde rastlamadık. RUY nın karaciğeri koruyucu etkisinin hangi komponente bağlı olduğunun kesin olarak tespit edilememesi sebebiyle bu etkinin sadece d-limonene ve β-myrcene e bağlanmaması ve bu etkiyi oluşturabilecek diğer komponentlerin de belirlenmesi gerekir. Daha ileri aşamalarda ise bu bileşiklerin etki mekanizmalarının araştırılması ve insan sağlığı üzerindeki olumlu etkilerinin belirlenmesi gereklidir. Kaynaklar Akgül A, Bayrak A. 1988. Comparative Volatile Oil Composition of Various Parts from Turkish Bitter Fennel (Foeniculum vulgare var. vulgare). Food Chem. 30, 319-323. Albert-Puleo M. 1980. Fennel and anise as estrogenic agent. Journal of Ethnopharmacology 2, 337-344. Arslan N, Bayrak A, Akgül A. 1989. The Yield and Components of Essential Oil in Fennels of Different Origin (Foeniculum vulgare Mill.) Growing in Ankara Conditions. Herba Hung. 28, 27-31. Bernath J, Nemeth E, Kattaa A, Hethelyi E. 1996. Morphological and Chemical Evaluation of Fennel (Foeniculum vulgare Mill.) Population of Different Origin. J. Essent. Oil Res. 8, 247-253. Czygane FC Fenchel. 1989. Teedrogen, 2 nd ed.: Wichtl, M.: Ed.; Wissenscaftliche Verlagsgesellscaht: Stuttgart, pp 171-173. De-Oliveira AC, Ribeiro-Pinto LF, Otto SS, Goncalves A, Paumgartten FJ. 1997. Induction of liver monooxygenases by beta-myrcene. Toxicology 26;124(2):135-40. Embong MB, Hadziyev D, Molnar S. 1977. Essential Oils from Spices Grown in Alberta, Fennel Oil (Foeniculum vulgare var. dulce). Can. J. Plant Sci. 57, 829-837. Farrell KT. 1985. Spices, Condiments, and Seasonings. AVI Publishing: Westport, CT, pp 106-109. Forster HB, Niklas H, Lutz S. 1980. Antispasmodic effects of some medicinal plants. Planta Med. 40, 309-319. Forster HB. 1983. Spasmolytische wirkung pflanzhlicher carminativa. Z. Al. Med. 59, 1327-1333. Gupta K, Thakral KK, Gupta VK, Arora SK. 1995. Metabolic Changes of Biochemical Constituents in Developing Fennel Seeds (Foeniculum vulgare). J. Sci. Food Agric. 68, 73-76. Handa SS, Sharma A. 1990. Hepatoprotective activity of andrographolide from Andrographis paniculata against carbontetrachloride. Indian J Med Res [B] 92, 276-283. Hänsel R, Keller K, Rimpler H. 1993. Foeniculum 5. In Hagers Hanbuch der Pharmazeutischen, Praxis 5; Springer: New York, pp 156-181. Katsiotis ST. 1988. Study of Different Parameters Influencing the Composition of Hydrodistilled Sweet Fennel Oil. Flavour Fragrance J. 4, 221-224. Lawrence BM. 1994. Progress in Essential Oils. Perfum. Flavor. 19, 31-32. 307
Madaus G. 1976. Foeniculum. Lehrbuch der biologischen Heilmittel. Vol. 2; G. Olms, Ed.: Hilesheim: New York, pp 1354-1361. Merkes K. 1980. Drogen mit ätherischem Öl (XVI) Foeniculum vulgare Miller-Fenchel. PTA- Repetitorium 12. 45-48. Miura Y, Ogawa K, Fukui H, Tabata M. 1986. Changes in the Essential Oil Components During the Development of Fennel Plants from Somatic Embryoids. Planta Med. 52, 95-96. Ostad SN, Soodi M, Shariffzadeh M, Khorsidi N, Marzban H. 2001. The effect of fennel essential oil on uterine contraction as a model for dysmenorrhoa, pharmacology and toxicology study. Journal of Ethnopharmacology 76, 299-304. Özcan M, Akgül A, Başer KHC, Özok T, Tabanca N. 2001. Essential oil composition of sea fennel (Crithmum maritimum) from Turkey. Nahrung/Food 45(5); 353-356. Reicks MM, Crankshaw D. 1993. Effects of D-limonene on hepatic microsomal monooxygenase activity and paracetamol-induced glutathione depletion in mouse. Xenobiotica 23(7):809-19. Reynolds JEF. 1982. Essential Oils and Aromatic Carminatives, Martindale-The Extra Pharmacopeia, 28 th ed. Royal Pharmaceutical Society: London, pp 670-676. Rodwell VW. 1993. Peptides. In Harper s Biochemistry (24 th edn), Murray RK, Granner DK, Mayes PA (eds). Aplleton & Lange: USA; 33-40. Shimada T, Yamazaki H, Mimura M, Inui Y, Guengerich FP. Interindividual variation in human liver cytochrome P450 enzymes involved in oxidation of drugs, carcinogens and toxic chemicals: studies with liver microsomes of 30 Japanese and 30 Causasians. J Pharmacol Exp Ther 1994;270:414-23. Simándi B, Deák A, Rónyani E, Yanxiang G, Veress T, Lemberkovics È, Then M, Sass-Kiss Á, Vámos- Falusi Z. 1999. Supercritical carbon dioxide extraction and fractionation of Fennel oil. J. Agric. Food Chem., 47, 1635-1640. Sümbüloğlu K, Sümbüloğlu V. 1998. Biyoistatistik, 8 th edition, p. 76-86. Hatiboğlu Yayınevi, Ankara. Venskutonis PR, Dapkevicius A, van Beek TA. 1996. Essential Oils of Fennel (Foeniculum vulgare Mill.) from Lithuania. J. Essent. Oil Res. 8, 211-213. Verghese J. 1988. Fennel. Indian Cocoa Arecanut Spices J. 12, 39-43. Weib RF. 1991. Lehrbuch der Phytoterapie. 7 th ed. Hippokrates: Stuttgart, pp 107-108. 308