KAPİLER ELEKTROFOREZ Uzm. Ecz. Emirhan NEMUTLU
Elektroforez, iletken bir çözelti içindeki yüklü/yüksüz parçacıkların veya moleküllerin bir elektriksel alan varlığında göç etmesidir.
Kapiler Elektroforezin Avantajları Kısa analiz süresi Küçük numune hacmi (1-10 l) Az miktarda çözelti harcaması Ucuz Yüksek etkinlik (10 5-10 6 teorik tabaka sayısı) Tekrarlanabilirlik Kullanım alanının geniş olması
Kapiler elektroforezde ayrımı gerçekleştirilebilen moleküller Proteinler Peptidler Amino asitler Nükleik asitler Ġnorganik iyonlar Organik bazlar Organik asitler
Kapiler Elektroforez Yöntemleri Kapiler zon elektoroforez (CZE) Miseller elektrokinetik kapiler kromatografi (MEKC) Kapiler jel elektroforez (CGE) Kapiler izotakoforez (CITP) Kapiler izoelektrik odaklama (CIEF)
Kapiler Zon Elektroforez (CZE)
Elektroosmotik Akış (EOF)
EOF Laminar Akış
EOF nin belirlenmesi Doğal işaretleyiciler (Naturel markers) Çalışan ph da iyonize olmayan Kullanılan dedektörle tanımlanabilen Saf Kapiler ile reaksiyona girmeyen Çalışma elektroliti içinde çözünen Metanol, Formaldehit, Aseton, Dimetilsülfoksit
Elektroosmotik hareketlilik ( EOF ) EOF = / 4 = Tampon dielektrik sabiti = Zeta potansiyeli = Tampon çözeltisinin viskozitesi
Zeta potansiyeli ( ) = 4 e / = Difüzyon tabakası kalınlığı e = Yüzey alana düşen yük = Tampon dielektrik sabiti
Elektroforetik Kuvvet Elektroforetik kuvvet : yük / çap
Elektroforetik hareketlilik ( EP ) EP = q / 6 d q = Ġyonize numunenin yükü d = Numune yarıçapı = Tampon çözeltisinin viskozitesi
CZE ayırım sırası Katyon Nötral Anyon Zaman
CZE ayırım sırası
Ayırıma Etki Eden Parametreler Tampon çözeltisi Tampon çözeltisi derişimi Tampon çözeltisi ph sı Organik faz içeriği Sıcaklık Uygulama voltaj Enjeksiyon süresi
Tampon çözeltisi seçimi
Tampon çözeltisinin derişimi
mau 5 0 mau 5 0 mau 5 0 mau 5 2.5 0 mau 5 2.5 0 50 mm 1 2 3 4 5 6 75 mm 1 2 3 4 5 6 100 mm 1 2 3 4 5 6 125 mm 1 2 3 4 5 6 150 mm 1 2 3 4 5 6 min min min min min
Migration time (min) Peak area 6 5,5 5 t of MEL t of IS MEL IS 25 20 4,5 4 3,5 3 50 75 100 125 150 Borrate concentration (mm) 15 10 5
ph etkisi 2,5 DHBA 2,6 DHBA 3,5 DHBA 3,4 DHBA
mau 5 a ph 7.5 M D 2.5 0 mau 6 4 2 0 b 1 2 3 4 5 6 ph 8 M D dak mau 5 2.5 c 1 2 3 4 5 6 M D ph 8.5 dak 0 mau 6 4 d 1 2 3 4 5 6 ph 9 M D dak 2 0 1 2 3 4 5 6 dak
Migration time (min) N 14 12 10 t of MEL t of IS Rs of MEL-IS N of MEL N of IS 140000 120000 100000 8 80000 6 4 2 0 7,5 8,0 8,5 9,0 ph 60000 40000 20000 0
Organik faz etkisi
mau 7.5 5 2.5 a % 0 MeOH M D 0 mau 5 2.5 b 1 2 3 4 5 6 % 5 MeOH M D dak 0 mau 4 2 c 1 2 3 4 5 6 % 10 MeOH M D dak 0 mau 4 2 d 1 2 3 4 5 6 M % 15 MeOH D dak 0 1 2 3 4 5 6 dak
Migration time (min) Resolution (Rs) 7 6 t of MEL t of IS Rs of MEL-IS 12 11 5 4 10 9 8 3 0 5 10 15 MeOH % 7
Sıcaklık etkisi mau 6 4 2 20 0 C 0 mau 8 6 4 2 0 mau 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 25 0 C 1 2 3 4 5 6 30 0 C 1 2 3 4 5 6 min min min
Uygulama voltajı
Peak height (mau) Peak width (min) Enjeksiyon süresi 14 12 10 8 6 4 2 0 h of MEL h of IS w of MEL w of IS 1 2 3 4 5 Injection time (s) 0,06 0,04 0,02 0
Kapiler elektroforez cihazı
Kapiler Teflon kapiler Pyreks kapiler Fused silika kapiler PVA kaplı kapiler CEP kaplı kapiler Kapiler elektrokromatografi kapileri
Kapilerin yıkanması Fused silika kapiler için 1 N NaOH 0.1 N NaOH Distile su Çalışma elektroliti Organik çözücü ve kuvvetli asit
Enjeksiyon yöntemleri Basınç Vakum Sifon Elektrokinetik
Dedektör UV/ VIS DAD Fluorescence Laser induced fluorescence Conductivity Indirect detection *
UV/VIS
Ġndirekt UV dedeksiyon
CE-MS
Vial Cam vial Renkli cam vial Mikro vial Polietilen vial
Dış basınç uygulanması
Kapiler termostat Hava Su Güç kaynağı 30 kv ile 30 kv
Validasyon Doğrusallık (Linearity) Tekrarlanabilirlik (Repeability) Tayin sınırı (LOQ) Gözlenebilme sınırı (LOD) Sağlamlık (Robustness) Tutarlılık (Ruggedness) Kesinlik (Precision) Doğruluk (Accuracy)
KESĠNLĠK DOĞRULUK SEÇĠCĠLĠK ARALIK GÖÇ ZAMANI PĠK CEVABI DOĞRUSALLIK LOD LOQ SAĞLAMLIK VE TUTARLILIK
Ġç Standart Seçimi Avantajı Göç zamanındaki farklılıkları Enjeksiyondan gelebilecek farklılıkları
Doğrusallık Pik alanı Pik yüksekliği Pik alan oranları Pik normalizasyonu (Pik alanı / Göç zamanı) Pik normalizasyon oranları
Pik Genişlemesi / Kuyruklanmasının Nedenleri Çalışma elektrolitinin derişimi Sıcaklık kontrolü ve Joule ısınması Enjeksiyon süresi Enjeksiyon ile numune taşınması Kapiler yüzeyine adsorpsiyon Kapiler yüzeyinin şartlandırılması Kapilerin düzgün kesilmemesi veya zamanla zarar görmesi Numune derişimi
Duyarlılığın artırılması Dedektör hücresi Numune yüklemesi (Sample stacking)
High sensitivity cell
Kesinlik Ġç standart kullanımı Sıcaklık kontrolü Enjeksiyon zon genişliği Kapilerin şartlandırılması Buharlaşma Çalışma elektrolitinin hazırlanması
Kapiler elektroforezde yöntem geliştirme Literatür tarama Çözünürlüğü pka Tanımlanabilmesi (Direkt & indirekt)
Çeşitli ph ph 2.5 ph 7 ph 9 Pik Var mı? Evet EOF den ayrı mı? Evet Hayır Hayır Kontrol MECK Numune derişimi yeterli mi?
Optimizasyon Ayırım ph Kapiler uzunluğu Enjeksiyon hacmi Voltaj Kapiler iç çapı Pik şekli Tampon derişimi Tampon içeriği Organik faz Göç zamanı ph Kapiler uzunluğu Voltaj Sıcaklık
Optik izomerlerin ayırımı D ve L isomerleri siklodekstran ilavesi ile ayrılabilirler.
Sülfat siklodekstrin
Hekzabarbital CZE HPLC
Kanda katyon tayini E. Nemutlu, N. Özaltın, Determination of magnesium, calcium, sodium and potassium in blood plasma sample by capillary zone electrophoresis Anal. Bioanal. Chem. 383 833 838, 2005.
Kaynaklar: Emirhan Nemutlu, Meloksikamın Farmasötik Preparatlardan UV Spektrofotometrisi ve Kapiler Elektroforez Yöntemi ile Analizi, Bilim Uzmanlığı Tezi, ANKARA, 2002 E. Nemutlu, N. Özaltın, Determination of magnesium, calcium, sodium and potassium in blood plasma sample by capillary zone electrophoresis Anal. Bioanal. Chem. 383 833 838, 2005. N. Özaltın, E. Nemutlu, C. Yardımcı, Ġ. Süslü, Application of micellar electrokinetic capillary chromatography for the determination of nifedipine and its degradation product in pharmaceutical preparations, Anal.Lett., 36 (2), 369-385, 2003. E. Nemutlu, N. Özaltın, S. Altınöz, Determination of rofecoxib, in the presence of its photodegradation product, in pharmaceutical preparations by micellar electrokinetic capillary chromatography, J. Anal. Bioanal. Chem., 378 (2) 504-509, 2004. E. Nemutlu, C. Yardımcı, N. Özaltın, Determination of sertaconazole in pharmaceutical preparations by capillary zone electrophoresis, Anal. Chim. Acta, 547 83-88, 2005. Capillary Electrophoresis, Agillent