Diyare tanısında MALDI - TOF MS Yakut Akyön Yılmaz
MALDI-TOF MS Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization timeof-flight, Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) (Matriks ile desteklenmiş lazer dezorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi)
Mikrobiyoloji Uygulamaları Tarihi Gelişim Klinik uygulamada sık kullanılan yöntemler: 3 3
Mevcut Tanımlama Metodları 4
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,1.0)=>NF0.7[BP = 4423.9, 2117] 0 3000 5000 7000 9000 11000 13000 Mass (m/z) 2117.3 Modern mikrobiyal taksonomi: proteomiks ve genomiks protein bacterial cell DNA proteome species definition & determination genome 4424.2 mass fingerprint DNA fingerprint 3132.3 3311.8 3491.4 4026.9 4535.6 4765.4 4738.6 6137.3 6533.3 6629.0 % Intensity 9476.2 6786.7 6984.6 7209.8 7424.9 8054.3 8383.8 8610.6 8903.3 9075.2 9611.5 10110.8 10493.9 10975.2 12271.4 5897.8 6271.2 8823.5 4861.0 5
Günümüzde Klinik Kullanım 24 saatlik kültür Manuel Ön-seçim Manuel Ön-seçim yok Otomatize sistem Direnç Testleri Serolojik Testler Görsel Metodlar PCR MALDI-TOF MS 4 72 saat Sadece 2 dakika Mikroorganizma tanımlaması
MALDI-TOF MS MALDI-TOF bakterilerin protein yüklerine bağlı ayrıma giderek tanımlamayı gerçekleştirmektedir.
MALDI-TOF MS: Temel Prensipler tespit İyon dedektörü ayırım hızlanma iyonizasyon desorpsiyon + + + + + + Hareket alanı elektrot Hızlanma alanı matriks / analit kristalleri kuyucuk
Tam bakteri hücresindeki kütle spektrometresine göre farklı tepe paternlerinin oluşması Pantoea agglomerans Acinetobacter lwofii Burkholderia cepacia Raoultella ornithinolytica Staph.aureus 4000 m/z 8000 E.coli
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 <<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3 0 3000 5000 7000 9000 11000 13000 Mass (m/z) 1648.1 İş akışı 1- Örnek Hazırlığı 1µL CHCA matrix 1µL-Öze ile Tek koloni alınır Escherichia coli Tek kuyucuk Bakteri 2- Ölçüm Kurumaya bırakılır Digestive tract E.coli Veri Analizi % Intensity 3581 3775 5015 5931 6837 7092 7075 7367 7863 7980 8074 8450 8744 9330 9453 9654 9994 10226 10347 10608 10939 11572 11906 3- Analiz - Tanımlama
Barkod, örnek numarası ile slayt pozisyonu arasındaki bağlantıyı sağlar
İş akışı: Adım 1 Örnek hazırlama VITEK MS-DS slayd 48 pozisyonlu Tek bir koloni den seçim ve transferi 1µL Matrix solusyon ilave edin Kalibrant suşu tek kolonisinden seçimi ve transferi
Örnek hazırlama
Sarf Malzemeler
Hazırlanmış Slayt
Cihaza Yükleme Bir defada yüklenebilecek toplam örnek sayısı 4X48= 192 adettir.
<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3 İş akışı: Adım 2 Ölçüm Otomatik spektrum okuması ~1 dakika numune kalitesine bağlı proteinlerin ionizasyonu ve moleküler ağırlık ölçümü % Intensity 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 3581 3775 5015 5931 6837 7075 7092 7367 7863 8074 7980 8450 8744 9330 9453 9654 9994 10226 10347 10608 10939 11572 11906 1648.1 0 3000 5000 7000 9000 11000 13000 Mass (m/z) 18
İş akışı : Adım 3 Analiz - Tanımlama Mikroorganizma tanımlaması Algoritma hesaplaması Veritabanı ile karşılaştırma
MALDI-TOF MS: Temel Prensipler Miktar Değer
MALDI kaşifleri Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry 1980 de geliştirildi : Karas & Hillenkamp _Almanya ve Tanaka et al _Japonya. İlk ticari cihaz 1991 Kimya Nobel ödülü : K. Tanaka 2002 21
Koichi Tanaka: biyolojik makromoleküller Koichi Tanaka John Fenn, 2002
Kullanım alanları MALDI-MS mikroorganizma analizi için önemli bir tanı aracı MALDI-MS hastalık monitorizasyonu tanısı serum protein profillenmesi Bakteri, maya ve filamentöz mantarların, virus, viral vektörlerin doğru ve hızlı tanımlanması Bakteri, maya ve filamentöz mantarların, virus, viral vektörler ve paraziter yapıların araştırılması Taksonomi ve epidemiyoloji
Abiotrophia Bordetella Corynebacterium Fusarium Lactobacillus Nocardia Propionibacterium Staphylococcus Achromobacter Brettanomyces Cronobacter Fusobacterium Lactococcus Obesumbacterium Proteus Stephanoascus Acinetobacter Brevibacillus Cryptococcus Gardnerella Leclercia Ochrobactrum Prototheca Streptococcus Actinobacillus Brevibacterium Cupriavidus Gemella Lecythophora Oerskovia Providencia Suttonella Actinomyces Brevundimonas Debaryomyces Geobacillus Legionella Oligella Pseudoflavonifractor Tatumella Aerococcus Brochothrix Delftia Geotrichum Leifsonia Paecilomyces Pseudomonas Tetragenococcus Aeromonas Budvicia Dermabacter Globicatella Leptotrichia Paenibacillus Psychrobacter Thermoanaerobacterium Aggregatibacter Burkholderia Dermacoccus Gluconobacter Leuconostoc Pantoea Rahnella Trichosporon Alcaligenes Buttiauxella Dietzia Gordonia Listeria Parabacteroides Ralstonia Trueperella Alicyclobacillus Campylobacter Edwardsiella 753 Granulicatella Lysinibacillus Tür Paracoccus Raoultella Vagococcus Alloiococcus Candida Eggerthella Grimontia Macrococcus Parvimonas Rhizobium Veillonella Alternaria Capnocytophaga Eikenella Haemophilus Malassezia Pasteurella Rhodococcus Vibrio Anaerobiospirillum Cardiobacterium Elizabethkingia Hafnia Mannheimia Pectinatus Rhodotorula Virgibacillus Aneurinibacillus Carnobacterium Empedobacter Helcococcus Methylobacterium Pectobacterium Riemerella Weeksella Arcanobacterium Cedecea Enterobacter Helicobacter Microbacterium Pediococcus Rothia Weissella Arcobacter Cellulosimicrobium Enterococcus Histophilus Micrococcus Penicillium Saccharomyces Williopsis Arthrobacter Chryseobacterium Erwinia Kingella Mobiluncus Peptoniphilus Salmonella Xanthomonas Asaia Citrobacter Erysipelothrix Klebsiella Moellerella Peptostreptococcus Serratia Xenorhabdus Aspergillus Cladosporium Escherichia Kloeckera Moraxella Photobacterium Shewanella Yersinia Bacillus Clavibacter Eubacterium Kluyvera Morganella Pichia Sphingobacterium Yokenella Bacteroides Clostridium Ewingella Kocuria Mycobacterium Plesiomonas Sphingobium Zygosaccharomyces Bergeyella Collinsella Facklamia Kodamaea Myroides Porphyromonas Sphingomonas Bifidobacterium Comamonas Finegoldia Kytococcus Neisseria Prevotella Sporobolomyces
MALDI-TOF 11605 MALDI-TOF bacteria 2484 MALDI-TOF fungi 1669 MALDI-TOF virus 366 MALDI-TOF parasite 121 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez 13.Mayıs.2014
MALDI-MS BAKTERİ Anhalt JP, Fenselau C. Identification of bacteria using mass spectrometry. Anal Chem 1975; 47:219 25.
1660 bakteri izolatının %95.4 doğru tanımlanmış 1 izolat için 6 dakika Maliyet konvansiyonel fenotipik tanımlamanın %22-32
Mayıs 2010 MALDI-TOF %99 Fenotipik yöntem %98
Br J Biomed Sci. 2012;69(2):47-55. Comparison of bacterial identification by MALDI-TOF mass spectrometry and conventional diagnostic microbiology methods: agreement, speed and cost implications. El-Bouri K, Johnston S, Rees E, Thomas I, Bome-Mannathoko N, Jones C, Reid M, Ben-Ismaeil B, Davies AR, Harris LG, Mack D. 928 bakteride cins düzeyinde %99.4 tür düzeyinde %89 5-10 dak ilk sonuçlar 90 dak 96 bakteri 1.79-2.56 pound
PLoS One. 2012; 7(3): e32589. Published online 2012 March 16. doi: 10.1371/journal.pone.0032589 PMCID: PMC3306318 Direct Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Improves Appropriateness of Antibiotic Treatment of Bacteremia Anne L. M. Vlek,* Marc J. M. Bonten, and C. H. Edwin Boel Tür düzeyinde saptama 28.8 saat Uygun antibiyotik başlama oranında %11.3 artış
Hızlı ve Doğru Campylobacter Tanımlanması VITEK MS ile Campylobacter türlerinin hızlı ve doğru tanımlanması Sonuçlar: 49 adet Campylobacter jejuni 49 adet Campylobacter coli ve referans suşların tamamı %100 doğrulukla ve 90 dakikadan az bir zamanda tanımlanmıştır. ECCMID 2012 - Rapid and accurate identification of Campylobacters with VITEK MS - Reading et al Poster 2323
Hızlı ve Doğru Salmonella Tanımlanması
Kafkas Univ Vet Fak Derg 19 (2): 325-330, 2013 Salmonella Türlerinin Hızlı Tanısında Kromojenik Besiyeri İle Birlikte Matrix- Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry Yönteminin Phoenix Otomatize Sistemi ile Kıyaslanması Işın AKYAR Simge CAN Acıbadem Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Üsküdar, İstanbul - TÜRKİYE Acıbadem Labmed Klinik Laboratuvarları, Fahrettin Kerim Gökay Cad. No: 49 Altunizade/Üsküdar, İstanbul - TÜRKİYE 347 Salmonella türü hem Phoenix otomatize sisteminde hem de MALDI-TOF cihazında çalışılmıştır. 2 yöntemin sonuçları birbiri ile %100 uyumludur. Her iki cihazda da tür düzeyinde tanımlama yapılabilmekte, alttür tanımlamaları için konvansiyonel olarak Salmonella antiserumları ile serolojik tiplendirmeye gereksinim duyulmaktadır.
Haziran 2013 13 Mayıs 2014 37 Salmonella türleri 2 Shigella türleri 9 Campylobacter türleri (5 kan kültürü) 6 C. jejuni
MALDI-TOF Maliyet Etkinlik ve Sonuç Zamanı
MALDI-TOF Sonuç Duyarlılığı
Gram-pozitif koklar Stafilokok, streptokoklar Enterobacteriaceae Escherichia coli Yersinia enterocolitica Erwinia türleri Salmonella enterica Nonfermentatif bakteriler Campylobacter Helicobacter pylori Aeromonas Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Streptococcus agalactiae Bartonella henselae Neisseria, Listeria, mikobakteri Antibiyotik direncinin dakikalar içinde belirlenmesi
Avantaj Hızlı Fazla sayıda örnek (96) Maliyet etkin Sarf malzemeleri ucuz Az örnekle çalışılır Maya ve anaerop tanısı koyulabilmekte Parazit ve virus çalışılabilmektedir Güvenilir Rutin ve araştırma için kullanılabilir
Dezavantaj Kurulum pahallı Koloni olmalı Teknik donanım Veriler biyoinformatik programla kısıtlı
Teşekkür ederim.