HASTANE VE TOPLUM KAYNAKLI STAPHYLOCOCCUS AUREUS İZOLATLARINDA ÇEŞİTLİ VİRÜLANS FAKTÖRLERİNİN REAL-TİME PZR YÖNTEMİ İLE ARAŞTIRILMASI Soner YILMAZ1, Abdullah KILIÇ1, Aylin Üsküdar Güçlü1, Orhan BEDİR1, Alper KARAGÖZ2, A. Celal BAŞUSTAOĞLU1 Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Başkanlığı, Ankara1 ; Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi, Moleküler Mikrobiyoloji Araştırma ve Uygulama Laboratuvarı, Ankara 2
GİRİŞ Staphylococcus aureus; Hastane kaynaklı pnömoni ve cerrahi yara enfeksiyonlarının en sık, Toplum kaynaklı deri ve yumuşak doku enfeksiyonlarının en sık Amerika Birleşik Devletler inde her yıl S. aureus un neden olduğu, 300.000 yeni vaka 12.000 ölüm İlave maliyet 9.5 milyar $ civarında
GİRİŞ Enfeksiyon patogenezinde hücre yüzeyinde bulunan ve hücre dışına salgılanan virülans faktörleri görev almakta
AMAÇ Çeşitli klinik örneklerden elde edilen toplum ve hastane kaynaklı S. aureus izolatlarında real-time PZR yöntemi ile TŞST-1 PVL Stafilokokkal enterotoksin A () Stafilokokkal enterotoksin B (SEB) Stafilokokkal enterotoksin C (SEC) Stafilokokkal enterotoksin D (SED) toksinlerinin varlığı, SCCmec fenotipleri [Metisilin dirençli S. aureus (MRSA) izolatlarında] Hastane ve toplum kaynaklı izolatların birbirleri arasındaki klonal ilişki multiple-locus variable-number tandem -repeat analyze (MLVA) yöntemi ile incelendi.
GEREÇ VE YÖNTEM Gülhane Askeri Tıp Akademisi Tıbbi Mikrobiyoloji AD Başkanlığı Bakteriyoloji Laboratuvarına ; Kasım 2007 - Aralık 2010 tarihleri arasında Polikliniğe başvuran ve yatan hastalardan alınan örneklerden izole edilen 147 adet S. aureus çalışmaya dahil edildi. Her hastadan bir izolat olacak şekilde
BULGULAR Klinik Örnekler İdrar Hastane Kaynaklı S. aureus n=72 (%) Toplum Kaynaklı Toplam S. aureus n=75 (%) n=147 (%) 4 (5.5) 34 (45.3) 38 (25.8) Yara sürüntüsü (deri ve yumuşak doku) Kan 16 (22.2) 21 (28.0) 37 (25.1) 35 (48.7) 0 (0) 35 (23.8) Derin apse, aspirat materyali 10 (13.9) 17 (22.7) 27 (13.8) Kateter 3 (4.2) 0 (0) 3 (2.1) *Diğer 4 (5.5) 3 (4) 7 (4.9) *Diğer; Konjunktiva sürüntüsü, plevral sıvı, balgam, transtrakeal aspirat, bronkoavelor lavaj, biyopsi materyali
Toplum kaynaklı S.aureus ların izole edildiği klinik örnekler: Toplum kaynaklı metisiline dirençli ve duyarlı S.aureus izolatlarının yaptığı enfeksiyonlar genel olarak birbirine benzemekte Herold ve ark. (1998) Deri ve yumuşak doku enfeksiyonları ilk sırada (%49.1) Naimi ve ark. (2003) TK-MRSA izolatlarının neden olduğu enfeksiyonlar arasında deri ve yumuşak doku enfeksiyonları ilk sırada (%75.9) Çalışmamızda Toplum kaynaklı izolatlar en sık olarak idrar örneklerinden (%45.3) izole edildi
Hastaların Temel Demografik Verileri Özellikler Hastalar Cinsiyet Erkek Kadın Yaş Ortalama yaş ±SD Yaş grupları 0-18 >18 Hastane Kaynaklı S. aureus n=72 (%) Toplum Kaynaklı S. aureus n=75(%) 49 (68.1) 23 (31.9) 38 (50.7) 37 (49.3) 43.54±24.09 35.29±21.38 7 (9.7) 65 (90.3) 14 (18.7) 61 (81.3) p-değeri 0.032 0.121
Hastaların Genel Klinik Özellikleri Özellikler Klinik kaynak Yoğun bakım klinikleri Dahili klinikler Cerrahi klinikler Eşlik eden klinik tablolar Diabetes mellitus Hipertansiyon Kronik böbrek yetmezliği Malignite Travma Antibiyotik kullanımı Ateşli silah yaralanması 28 gün içerisinde mortalite Hastane Kaynaklı S. aureus n=72 (%) Toplum Kaynaklı S. aureus n=75(%) 18 23 31 1 22 52 <0.001 6 (8.3) 6 (8.3) 7 (9.7) 17 (23.6) 10 (13.9) 18 (25) 8 (11.1) 18 (25.0) 0 (0) 0 (0) 1 (1.3) 3 (4.0) 1 (1.3) 3 (4.0) 0 (0) 0 (0) 0.012 0.012 0.031 0.001 0.004 <0.001 0.003 <0.001 p-değeri
Tespit Edilen Toksinlerin Dağılımı Toksinler Toplam n=147(%) SEB SEC SED TSŞT-1 50 (34.0) 3 (2.0) 10 (6.8) 6 (4.0) 8 (5.5) PVL + SEB +TSŞT-1 SEB + PVL SEC + PVL SED + TŞST-1 SED + PVL SEC + PVL + TŞST-1 Toksin tespit edilmeyen izolat 2 (1.4) 3 (2.0) 6 (4.0) 2 (1.4) 1 (0.7) 1 (0.7) 1 (0.7) 1 (0.7) 54 (36.8)
TARTIŞMA S. aureus izolatlarında toksin bulunma sıklığı Kim ve ark. (2006) %73.4 Hu ve ark. (2008) %62.4 Demir ve ark. (2010) %61.4 Çalışmamızda %63.2
TARTIŞMA Farklı toksinler değişik oranlarda tespit edilebilmekte Demir ve ark. (Türkiye) (%26.4) Hu ve ark. (Japonya) SEC (%43.4) Scazzocchio ve ark. (İtalya) SEC (%58.9) Kim ve ark. (Çin) TŞST-1 (%40.8) Çalışmamızda (%40.1) Toksinlerin bulunma sıklığı coğrafi özelliklere göre değişkenlik gösterebilmekte!
Toksinlerin Toplum ve Hastane Kaynaklı İzolatlarda Görülme Sıklığı PCR pozitifliği, n=147 (%) TK-S. aureus n=75 (%) 12 (16) SEB 3 (4) Toksinler SEC 10 (13.3) SED 8 (10.6) TŞST-1 10 (13.3) PVL 6 (8) En az bir toksin varlığı 38 (50.7) HK-S. aureus n=72 (%) 47 (65.2) p-değeri <0.001 5 (6.9) 0.488 2 (2.7) 0.019 0 (0) 0.006 7 (9.7) 0.494 0 (0) 0.028 55 (76.4) 0.001
TARTIŞMA Hastane ve toplum kaynaklı izolatlara özgün toksin profili var mı? İtalya da yapılan çalışmada; SEC Toplum kaynaklı grup (p=0.01) TŞST-1 Hastane kaynaklı grup (p=0.09) Çalışmamızda; Hastane kaynaklı grup (p<0.001) SEC Toplum kaynaklı grup (p=0.019) SED Toplum kaynaklı grup (p=0.006)
TARTIŞMA Toksin varlığı ile izolatların antimikrobiyal direnç profilleri arasında ilişki var mı? taşıyan 44 izolatta (%74.5) ÇİD, YİD ya da pan-resistant ilaç direnci var 42 si Hastane kaynaklı 2 si Toplum kaynaklı - Tümü metisiline dirençli - Biri hariç hepsi SCCmec IV SEB, SEC, SED ve TŞST-1 varlığında antibiyotik direnci yok
TARTIŞMA PVL toksini varlığında ciddi deri enfeksiyonları ve nekrotizan pnömoni PVL sıklığı: Holmes ve ark. (2005) %1.6 Issartel ve ark. (2005) %2 Türkiye de yapılan çalışmalarda %2 ila %3.9 arasında değişmekte Kılıç ve ark. 2003-2006 yıllarını kapsayan dönemde hastanemizde yapılan çalışmada MRSA izolatlarında %1.3 (5/370) Çalışmamızda S. aureus suşlarında PVL sıklığı %4
TARTIŞMA PVL toksini yakın zamana kadar TK-MRSA suşları için virülans belirteciydi! Yu ve ark. (2008) Hastane kaynaklı izolatlarda %11.9 Karahan ve ark. (2008) Hastane kaynaklı izolatlarda %0.3 Akoğlu ve ark Hastane kaynaklı MRSA izolatlaınrda %12.7 Çalışmamızda PVL (+) izolatların tümü toplum kaynaklı ve metisilin duyarlı
TARTIŞMA Metisilin Direnci S. aureus a bağlı enfeksiyon toplam prevalansı değişmemekte MRSA nın etken olduğu enfeksiyon oranı artmakta
TARTIŞMA Metisilin direnci (Hastane kaynaklı izolatlar) Kurutepe ve ark. (2007) %51.5 Altoparlak ve ark. (2002) %67 Scazzocchio ve ark. (2011) %44.2 Diekema ve ark. %45 (bakteriyemi enfeksiyonları) (2001) Çalışmamızda %61.1 olarak bulunmuştur
TARTIŞMA Metisilin direnci (Toplum kaynaklı izolatlar) Kurutepe ve ark. (2007) %21.6 Altoparlak ve ark. (2002) %27 Scazzocchio ve ark. (2011) %19.1 Groom ve ark. (2001) %58.9 Çalışmamızda %6.7 olarak bulunmuştur
Hastane kaynaklı enfeksiyonlar toplum kaynaklılara göre Daha invaziv (yumuşak doku enfeksiyonu & bakteriyemi) Daha mortal seyretmekte (p<0.001) Hastane kaynaklı izolatlarda; 1. Metisilline direnç oranı yüksek (p<0.001) 2. En az bir toksin taşıyan izolat sayısı daha fazla (p<0.001)
PBP2A yı kodlayan meca geni, SCCmec olarak adlandırılan mobil bir genomik adada yerleşimli HK-MRSA (ı-ıı-ııı) TK-MRSA (IV-V-VI-VII-VIII)
MRSA suşlarının SCCmec Tipleri. HK- MRSA: TK-MRSA: - SCCmec tip III (40 izolat, %90.9) - SCCmec tip IV - SCCmec tip IV (1 izolat, %2.2) - Tiplendirilemeyen (3 izolat,%60) (2 izolat,%40) - Tiplendirilemeyen (3 izolat, %6.9) Kılıç ve ark. Çalışmamız SCCmec I-II-III %85.8 %81.7 SCCmec IV-V %10.3 %12.2 Tiplendirilemeyen %3.9 %6.1
MLVA Yöntemi Bakteri DNA Jel ya da Kapiller Elektroforez VNTR bölgelerinin PZR si
MLVA Yöntemi 1. İzolat Lokus 1 Lokus 2 Lokus 3 2. İzolat 3. İzolat
100 50 0 Key TARİH KLİNİK 49 12.01.2009 Radyasyon Onkolojisi 64 20.11.2009 Genel Cer 29 28.01.2008 Göğüs Cerrahisi 36 27.09.2008 66 08.02.2010 6 21.06.2008 Anestezi Y. B. 8 30.06.2008 2 02.12.2007 30 24.02.2008 43 29.11.2008 54 07.07.2009 Kadın Doğum 55 29.06.2009 Göğüs Hastalıları 61 23.09.2009 48 17.10.2008 14 25.04.2009 Hematoloji 35 13.09.2008 Hematoloji 20 15.02.2010 Kadın Doğum 57 07.07.2009 50 01.03.2009 51 24.03.2009 53 30.06.2009 33 22.05.2008 Hastane kaynaklı İzolatlar: 41 16.11.2008 42 25.11.2008 46 13.05.2008 60 27.08.2009 Kalp ve Damar Cerrahisi 63 09.10.2009 9 07.07.2008 13 19.04.2009 Geriartri 26 28.09.2010 Tıbbi Onkoloji 28 01.09.2010 Tıbbi Onkoloji 4 14.05.2008 11 10.06.2008 Anestezi Y. B. 23 01.07.2010 Nefroloji 39 17.11.2008 7 26.02.2008 Hematoloji 21 15.03.2010 22 25.03.2010 Nefroloji 3 14.03.2008 Radyasyon Onkolojisi 31 29.04.2008 34 18.06.2008 Hematoloji 45 26.03.2008 Enfeksiyon Hast. 58 19.08.2009 59 24.08.2009 Üroloji 62 25.09.2009 Anestezi Y. B. 67 02.03.2010 68 22.03.2010 69 11.05.2010 70 02.06.2010 71 12.06.2010 24 04.07.2010 18 28.12.2009 16 18.07.2009 17 24.09.2009 12 21.01.2009 15 23.06.2009 47 09.03.2008 44 03.11.2008 Anestezi Y. B. 56 17.01.2009 37 10.01.2008 Nöroloji 40 15.11.2008 Anestezi Y. B. 52 23.05.2009 KBB 65 04.01.2010 72 25.08.2010 Anestezi Y. B. 1 02.12.2007 Hematoloji 10 10.09.2008 Hematoloji 19 25.01.2010 25 07.07.2010 27 22.09.2010 Tıbbi Onkoloji 32 29.04.2008 38 11.02.2008 5 17.06.2008 Kardiyoloji 34 farklı klon TOKSİN GEN PROFİLİ,tşst-1, TSŞT-1 CİP,GEN,OXA,RİF,TE CİP,GEN,OXA,RİF,TE sec SEC tşst-1 TŞST-1,seb,SEB,seb,SEB CİP,DA,GEN,OXA,RİF,T,SXT CİP,ERY,GEN,OXA,RİF,TE CİP,GEN,OXA,RİF,TE CİP,DA,ERY,GEN,OXA,RİF CİP,ERY,GEN,OXA,RİF,TE CİP,GEN,OXA,RİF,TE CİP,GEN,OXA,RİF,TE CİP,GEN,OXARİF,TE CİP,GEN,OXA,RİF,TE tşst-1 TŞST-1 19 özgün profil (altısı MRSA, 13 ü MSSA) 15 küme ANTİBİYOTİK DİRENÇ PROFİLİ seb SEB,TŞST-1, tşst-1 CİP,DA,ERY,GEN,OXA,,RİF,TE OXA,SXT Küme içerisindeki izolat sayısı 53 (53/72; %73.6) Küme genişliği 2-11 izolat CİP,ERY,GEN,OXA,RİF,TE CİP,ERY,GEN,OXA,RİF,TE TŞST-1 tşst-1 CİP,GEN,OXA,RİF,TE CİP,GEN,OXA,RİF,TE DA, ERY SEB seb,tşst-1, tşst-1,tşst-1,tst SEB seb SEC sec,seb,seb ERY,SYN CİP,ERY,GEN,OXA,RİF,TE CİP,ERY,OXA,RİF,TE
100 50 0 veri soner Key TARİH KLİNİK TOKSİN GEN PROFİLİ 100 30.01.2009 sec SEC 105 10.03.2009 114 19.06.2009 Kadın 91 27.02.2008 Kadın Doğum 83 11.02.2008 Üroloji 107 12.03.2009 Sualtı ve 126 11.12.2009 94 11.09.2008 pvl 129 26.01.2010 KBB,pvl 109 22.04.2009 132 02.03.2010 73 20.11.2008 79 30.11.2007 140 18.08.2010 103 07.03.2009 108 24.03.2009 92 30.06.2008 121 14.09.2009 Göz tşst-1 TŞST-1 141 16.09.2010 tşst-1 TŞST-1 106 14.03.2009 Hematoloji sec Doğum sec SEC H. PVL, PVL ERY OXA Toplum kaynaklı İzolatlar: CİP,RİF,TE CİP,ERY,GEN,RİF SEC SEC 113 05.06.2009 Cildiye 133 05.03.2010 Nefroloji 97 13.01.2009 118 26.08.2009 144 27.10.2010 78 28.10.2007 111 12.05.2009 Kadın Doğum SED sed 123 22.10.2009 SED sed 90 13.05.2008 sec SEC 96 08.01.2009 47 farklı klon ANTİBİYOTİK DİRENÇ PROFİLİ sec, TŞST-1, tşst-1 sec SEC ERY,GEN 89 15.05.2008 sed SED CİP,RİF 110 28.04.2009 145 31.10.2010 pvl PVL 117 19.08.2009 KBB 127 28.12.2009 Kalp ve Damar Cerrahisi sec SEC 93 18.07.2008 81 25.02.2008 Göz 104 10.03.2009 Sualtı ve 146 28.12.2010 Üroloji 122 02.10.2009 sed,tşst-1 SED,TSŞT-1 142 09.09.2010 Cildiye SED, PVL sed,pvl 119 11.09.2009 Üroloji 131 17.02.2010 87 19.06.2008 Enfeksiyon Hastalıkları 116 10.08.2009 Göz 128 21.01.2010 Tıbbi Onkoloji 136 13.04.2010 Geriartri 134 04.03.2010 135 25.03.2010 Kadın 137 16.04.2010 Üroloji 84 30.01.2008 Enfeksiyon Hastalıkları 99 29.01.2009 75 05.02.2009 Anestezi Y. B. 88 10.06.2008 Üroloji 143 05.10.2010 85 30.01.2008 KBB 95 26.12.2008 Kadın Doğum 101 03.02.2009 tsşt-1 98 08.01.2009 Üroloji sec, tşst-1,pvl SEC,TŞST-1, PVL 102 10.02.2009 125 01.12.2009 Cerrahisi 130 26.01.2010 KBB 80 22.10.2007 147 29.12.2010 Sualtı ve H. 86 21.01.2008 Sualtı ve H. 138 13.05.2010 Kadın Doğum 139 16.06.2010, tşst-1, TŞST-1 115 25.06.2009 sec SEC 120 11.09.2009 Üroloji SED sed 112 29.05.2009 Kadın Doğum 74 09.01.2009 Kadın Doğum 124 09.11.2009 Üroloji 76 14.12.2010 Üroloji 77 23.12.2010 Kadın Doğum 82 10.02.2008 32 özgün profil 15 küme RİF sed SED H. Küme içerisindeki izolat sayısı 43 (43/72; %57.3) Küme genişliği 2-4 izolat SEB seb TE sed SED CİP sec, SEC, tşst-1 TŞST-1 DA, ERY,GEN,OXA Doğum ERY TŞST-1 seb,pvl SEB, PVL SEB, PVL seb,pvl TŞST-1 tşst-1 TŞST-1 tşst-1 OXA SXT DA, ERY,GEN,OXA,RİF,TE OXA
Genotip Analizi Sonuçları Kaynak Hastane kaynaklı izolatlar Toplum kaynaklı izolatlar Tüm izolatlar İzolat sayısı 72 75 147 Klon Sayısı 34 47 67 Özgün profil sayısı 19 32 37 Küme sayısı 15 15 30 Kümeleşme oranı %73.6 %57.3 %74.8 2-12 2-4 2-12 Küme genişliği
TARTIŞMA Genotip analizi sonuçları Hastane kaynaklı izolatların birbirleriyle olan genotipik ilişkisi daha kuvvetli HK-MRSA içerisinde özgün profili sayısı 6 (toplam 44 izolat) HK-MSSA içerisinde özgün profili sayısı 13 (toplam 28 izolat) HK-MRSA ların genotipik ilişkisi metisiline duyarlı izolatlara göre daha kuvvetli Her iki gruptaki izolatların yarısından fazlasının küme içerisinde bulunması aktif ya da devam eden bulaşı göstermekte Kümeleşme oranının düşmesi, aynı genotipe sahip hastane ve toplum kaynaklı izolat varlığını göstermekte
119 11.09.2009 Üroloji 87 19.06.2008 Enfeksiyon Hastalıkları seb 84 30.01.2008 Enfeksiyon Hastalıkları 144 27.10..2010 18 28.12.2009 135 25.03.2010 Kadın Doğum 137 16.04.2010 Üroloji 23 01.07.2010 Nefroloji 101 03.02.2009 143 05.10.2010 85 30.01.2008 KBB 95 26.12.2008 Kadın Doğum 11 10.06.2008 Anestezi Y. B. 57 07.07.2009 20 15.02.2010 Kadın Doğum tşst-1 98 08.01.2009 Üroloji sec, tşst-1,pvl 88 10.06.2008 Üroloji 75 05.02.2009 Anestezi Y. B. 5 17.06.2008 Kardiyoloji 34 18.06.2008 Hematoloji 62 25.09.2009 Anestezi Y. B. 31 29.04.2008 45 26.03.2008 Enfeksiyon Hast.,SXT 58 19.08.2009 59 24.08.2009 Üroloji CİP,ERY,GEN,OXA,RİF,TE 67 02.03.2010 68 22.03.2010 69 11.05.2010 70 02.06.2010 CİP,GEN,OXA,RİF,TE 71 12.06.2010 CİP,GEN,OXA,RİF,TE 76 14.12.2010 Üroloji DA, ERY,GEN,OXA,RİF,TE 24 04.07.2010 tşst-1 102 10.02.2009 125 01.12.2009 Cerrahisi 130 26.01.2010 KBB 80 22.10.2007 86 21.01.2008 Sualtı ve H. 147 29.12.2010 Sualtı ve H. seb,pvl 44 03.11.2008 Anestezi Y. B.,SYN 56 17.01.2009 CİP,ERY,GEN,OXA,RİF,TE 138 13.05.2010 Kadın Doğum TE tsşt-1 ERY sec, tşst-1 CİP,ERY,GEN,OXA,RİF,TE DA, ERY,GEN,OXA OXA CİP,ERY,GEN,OXA,RİF,TE seb,pvl
113 05.06.2009 Cildiye sec 99 29.01.2009 10 10.09.2008 Hematoloji 1 02.12.2007 Hematoloji 107 12.03.2009 Sualtı ve H. 126 11.12.2009 94 11.09.2008 2 02.12.2007 83 11.02.2008 Üroloji 30 24.02.2008 CİP,GEN,OXA,RİF,TE 43 29.11.2008 CİP,ERY,GEN,OXA,RİF,TE 54 07.07.2009 Kadın Doğum 55 29.06.2009 Göğüs Hastalıları CİP,GEN,OXA,RİF,TE 61 23.09.2009 105 10.03.2009 91 27.02.2008 Kadın Doğum 48 17.10.2008 CİP,DA,ERY,GEN,OXA,RİF 100 30.01.2009 sec 114 19.06.2009 Kadın Doğum sec 14 25.04.2009 Hematoloji 129 26.01.2010 KBB,pvl ERY 35 13.09.2008 Hematoloji sec CİP,DA,GEN,OXA,RİF,T,SXT 12 21.01.2009, tşst-1 ERY 15 23.06.2009,tst 16 18.07.2009 seb pvl DA, ERY
TARTIŞMA Genotip analizi sonuçları Toksin varlığı ile genetik ilişkinin olup olmadığını göstermek için yeni moleküler yöntemler geliştirilmeli Aynı küme içerisinde farklı iki kaynaktan suş bulunması Yanlış bir sınıflandırma sonucu? Toplum kaynaklı suşların hastane ortamında tespit edildiğini göstermek amaçlandığında PFGE gibi ilave bir moleküler yöntem gerekli
SONUÇLAR ve ÖNERİLER Yüz kırk yedi izolatın 93 ünde (%63.2) en az bir adet (77 izolatta bir, 16 izolatta birden fazla) toksin tespit edildi SEC %40.1 %8.1 SEB ve SED %5.4 TŞST-1 %11.5 PVL %4.0 tespit edildi HK-MRSA izolatlar içerisinde %95.4 (42/44) pozitif ile antibiyotik direnç gelişimi arasında ilişki gösterilmeli
SONUÇLAR ve ÖNERİLER Hastane kaynaklı izolatlar daha invaziv enfeksiyonlara neden olmakta Metisiline dirençli ve toksin taşıyan izolat sayısının fazla olması PVL sıklığı özellikle HK-MRSA olgularında takip edilmeli
SONUÇLAR ve ÖNERİLER Hastane ve toplum kaynaklı gruplarda küme içindeki izolat sayısı fazla Aktif bulaş olgularında izolasyon önlemleri vakit geçirilmeden alınmalı Uzun süreli devam etmekte olan bulaşta ise etken eredike edilmeli MLVA sonucu hastane ve toplum kaynaklı izolatlar aynı genotipte olabilmekte PFGE gibi ilave genotipik yöntemler kullanılmalı Toksin taşıyan ve taşımayan izolatlar aynı genotipte olabilmekte Genotipik heterojeniteyi daha iyi gösterecek moleküler yöntemler geliştirilmeli