PLASMID Mustafa EMREM 162161022 BAKTERİ GENETİĞİ
Giriş Bazı prokaryotik (Bakteri) ve ökaryotik organizmalarda (maya, mantar, bitki), genomik DNA nın yanısıra, çok daha küçük, DNA karakterinde, çift iplikli genetik elementler bulunmaktadır. Bunlar arasında plasmidler de yer almaktadır. Ancak, bu genel tanım içine, bakteriyofajlar, kromozomla birleşik olan profajlar, transpozonlar, İSelementleri ökaryotiklerde mitokondriumlar girmektedir Plasmidlerin Genel Karakterleri Plasmidler çift iplikli otonom DNA molekülleridir. Şimdiye dek prokaryotik ve ökaryotiklerde RNA (ribonukleik asit) özelliği taşıyan plasmidlerin varlığı bildirilmemiştir. MA. 1-600 mega dalton, Md arasında değişmektedir. E. coli de DNA'nın %0.04-%8'i kadardır. Büyük plasmidlere daha çok, Gram negatif mikroorganizmalarda (Pseudomonas, Agrobacterium, vs) rastlanılmaktadır. Streptomyces rochei 'de iki küçük ve lineer morfolojide B. burgdorferi 'de 4-9 adet lineer ve sirküler plasmid bulunur.
Ekstrakromozomal materyaller, hücre sitoplazmasında serbest olarak bulunabilecekleri (plasmid) gibi bakterinin kromozomu ile de birleşebilirler. Böyle plasmidlere episom adı verilmektedir. Kointegrasyon, plasmidle genomik DNA arasında oluşabileceği gibi, plasmidle plasmid arasında da meydana gelebilir. Bazı plasmidler de Col E1 gibi, negatif süpersarmal (süperheliks) bir yapı özelliğine sahiptir ve E. coli 'de 19-20 süpersarmal bulunmaktadır.
Değişik morfolojilere sahip plasmidlerin agarose gel elektroforezisdeki lokalizasyonları ve sentrifugasyondaki sedimentasyon katsayıları (S20 W) arasında farklar vardır. Bunlar, sukroz densite gradient (%5-20) sentrifugasyonda, santrifüj tüpünde sukrozun değişik yoğunluğuna sahip yerlerinde toplanırlar. Elektroforezisde ise, süpersarmal form karşı uçta, lineer form ortada, sirküler formlar ise başlangıç yerine yakın kısımlarda yerleşirler.
Plasmidlerin kendileri ve kodladıkları spesifik informasyonların konak bakteri için hayati önemi yoktur. Bunlar olmadan da bakteriler normal yaşamlarını sürdürürler. Çünkü, plasmidler bakterilere sonradan transfer olmuşlardır ve özel koşullar altında da bakteriden ayrılabilirler. Ancak, bunlar bakterinin genomunda bulunmayan (veya bazen bulunabilen) özel karakterleri kazandırırlar ve avantajlar sağlarlar: Örneğin, Antibiyotikler Metaller İlaçlara dirençlilik Toksin formasyonları Pilus oluşumu Virulens faktörleri Fermentasyon özellikleri Nitrojen fikzasyonu bunlardan sadece birkaç tanesidir.
Farklı özellikler kazandıran plasmidler bakterilerden ayrılırsa veya çıkarılırsa (plasmid eliminasyonu, plasmid eksklusyonu, curing), bakteriler kazandıkları bu avantajları kaybederler ve bu yönlerden negatif hale gelirler. Örn, C. tetani 'de toksin formasyonu bir plasmid tarafından kodlanır. Bu plasmidin çıkması nonpatojenik hale getirir. İn vitro koşullarda ve amaca uygun olarak kendilerine istenilen özel markerler eklenerek hazırlanan suni plasmidler (pbr322, puc8/9 vb.) rekombinant DNA teknolojisinde, genlerin klonlanmasında aracı molekül (vektör) olarak daha fazla kullanılmaktadırlar.
Genellikle küçük veya orta boy suni plasmidlerden daha fazla yarar sağlanmaktadır, kromozomla birleşmediğinden veya sitoplasmada yeterince bulunduklarından, hücrelerden çıkarılmaları oldukça kolaydır. Büyük plasmidler, hem kendilerini ve hem de taşıdıkları informasyonları ve konakçı kromozomundan bir geni, kendine yakın türlere transfer etme yeteneğine sahiptirler. Buna karşın, küçük plasmidler ise, ya aynı bakterideki büyük plasmidlerin yardımı ile veya konakçının genomu ile birleşerek bakteri bölünmesi sırasında kardeş hücrelere transfer edilirler. Bunlardan ayrı olarak, genel transdüksiyonlada küçük plasmidler transfer olabilirler. Kimyasal ve fiziksel yöntemler kullanarak plasmidlerin bakteriden çıkması kolaylaştırılır ve serbest hale getirilebilirler.
Konjugatif plasmidlerde bulunan seks pilusu formasyonunu kodlayan genler, nonkonjugatiflerde bulunmamaktadır. Bakteri DNA'sının replikasyonuna mani olan mutasyonlar aynı zamanda plasmid replikasyonunu da bloke ederler. Küçük plasmidler bakteri kromozomu ile senkronize replike olmadıkları için böyle mutasyonlardan etkilenmezler. Bunlar ancak, DNApol I'de oluşan mutasyonlara duyarlıdırlar.
Plasmidlerin Yapısı Plasmidler, genellikle, konakçı bakteri içinde kendi bağımsız durumlarını koruyabilecek ve devam ettirebilecek gerekli genetik informasyonlara sahip otonom ünitelerdir. Plasmidlerde bulunması gerekli olan en önemli sekansların başında, replikasyonda fonksiyonu olan replikasyon orijini (ORI)'ni kodlayan nukleotidlerdir. ORI'ya sahip olan küçük veya büyük DNA sekansları bağımsız replikasyon özelliği gösterebilirler (replikon). Replikasyon orijini plasmidlerde genellikle tek olmasına karşın, bazılarında R6K plasmidinde 2-3 ORI bulunabilmektedir.
F plasmidleri : ORI + pilus formasyon genler R plasmidleri : ORI + pilus formasyon genleri+antibiyotiklere dirençlilik genleri Virulens plasmidleri : ORI + toksin genleri (B. anthracis 'te p0x1 ve Cl. teteni 'de nörotoksin) Bakteriosin plasmidleri : ORI + Co1E1, Col I, Col V, Pesticin, Cloacin, Megacin vs. genler Metabolik plasmidler : ORI + bazı kimyasal maddeleri ASL, TOL, NAH, vs) ayrıştıran genler (SAL,
Plasmidler, spesifik restriksiyon endonuklease enzimlerinin kesim yerlerine ve restriksiyon haritalarına sahiptirler. Enzimler, türlerine göre, plasmidlerde farklı sayıda kesmeler yaparak değişik boylarda DNA segmentlerine ayırırlar. Bazı enzimlerin (Bst II, Hpa I ve Xba I) plasmidde (pbr322) hiç bir kesim yeri bulunmamaktadır. Buna karşın, Hpa II'nin bu plasmidde 26 yerden kesme yeteneği vardır. Sadece bir kesim yerinin bulunması ve spesifik markerlerden birinin üzerinde olması, genin inaktivasyonu için istenilen bir durumdur (EcoR I, Pst I, gibi).
Aşağıda, bazı suni plasmidlerde amaca yönelik olarak ilave edilen bazı spesifik markerler gösterilmektedir. pmb 9 (5300 bp): ORI + tetr pbr322 (4363 bp): ORI + ampr+ tetr pneo (5510 bp): ORI + ampr+ neor pbr 325 (6000 bp) : ORI + ampr + Camr+ tetr puc 8/9 (2655 bp): ORI + ampr+lac
04. Plasmidlerin Sınıflandırılması Bakteri plasmidleri bazı klasifikasyonlara tabi tutulmuştur. Ancak, yine de tam yerleşmiş ve bütün kriterlere uyabilecek veya cevap verebilecek bir sınıflama yapılmış değildir. 1) Büyüklüklerine göre sınıflama: Bazı araştırmacılar plasmidleri büyüklüklerine veya molekül ağırlıklarına göre 3 gruba ayırmaktadırlar, a) Küçük (mini sirküler) plasmidler: Bunlar 1-10 x106 dalton ağırlığındadırlar b) Orta plasmidler: Bunlar, 10-50x106 molekül ağırlığındadır. c) Büyük plasmidler: Bu ölçülerin üstünde molekül ağırlığına sahip olanlar.
2) İnkompatibilite durumlarına göre sınıflama: Birden fazla plasmid aynı bakteride uyum içinde bulunabiliyorsa bunlar kompatible uyum içinde olamıyor ve birbirlerini itiyorlarsa inkompatible kabul edilmektedirler. Birbirlerinin üremelerine veya diğerinin replikasyonuna da mani olmaktadır. 3) Konjugatif özelliklerine göre sınıflama: Küçük (1-10 kbp uzunlukta) plasmidlerin transferi, aynı bakteri içinde bulunan diğer konjugatif plasmidlerce sağlanır veya bakteri kromozomu ile birleşerek veya genel transdüksiyonla gerçekleştirilir. Bu tür plasmidler, yapılarında seks pilusu formasyonu için de genetik kodlar taşımazlar. 4) Taşıdıkları spesifik sekanslara göre sınıflama: DNA'larında bazı özel markerler kodlarına sahiplerdir. Konjugatif plasmidler bu özelliklerini transfer edebilme yeteneğindedirler. Bu markerlere göre plasmidler 5 gruba ayrılırlar: F faktörü (seks pilusu), Rezistenslik plasmidleri, Virulens plasmidleri, Bakteriyosin plasmidleri, Metabolik plasmidler
05. Plasmidlerin Bakteride Saptanması Bakteriyel populasyonlarda plasmidlerin varlığını belirlemede fiziksel, morfolojik ve fonksiyonel testlerden yararlanılmaktadır. Bakterilerin, bazı özel karakterleri çabuk kazanması ve bunları nesillere transfer etmesi veya bunları çabuk kaybetmesi, bu özelliklerin plasmidlerce kodlandığının bir işareti olarak kabul edilmektedir. Elektroforezisde Plasmid DNA'sı karşı uçta yer alırken, büyük olan kromozomal DNA başlangıç yerine yakın kalır. Elekron mikroskopuyla plasmid DNA'sı kolayca görüntülenebilir. Plasmid DNA'sı kromozomal DNA'dan, büyüklük farkı nedeniyle kolayca ayırt edilebilir. Nukleusla birleşenleri saptamak için spesifik işaretli problardan yararlanılabilir. Ethidium bromide caesium chloride densite gradient sentrifugasyona tabi tutularak sirküler plasmid DNA'sı dibe yakın yerde, kromozomal DNA ise bunun üstünde bant oluşturur.
06. Plasmid DNA'sının İzolasyonu Bakterinin içinde plasmidin varlığı saptandıktan sonra, kontamine olmadan plasmidleri çıkarmak ve bazı özelliklerini belirlemek mümkündür. Bu amaç için, genellikle, sitoplasmada bulunan plasmidler tercih edilirler. 1)Rapid boiling method for small plasmids in E. coli (Holmes & Quigley,1981; modified by Riggs & McLachlan, 1986) 2)Hot alkaline method for all plasmid sizes and bacteria (Kado & Liu,1981), modified 3) Lysozyme method for various Gram-negative bacteria (Davis et al.,1980) 4) Lysis of cells from single colonies on agarose gel (Eckhardt, 1978; Priefer, 1984), modified 5)Plasmid isolation from Gram-positive bacteria, especially lactobacilli, with mutanolysin or lysozyme (Klaenhammer, 1984) 6) Isolation procedure for all plasmid sizes from all bacteria (Crosa et al., 1994)
07. Plasmid Eliminasyonu (Curing, Plasmid Eksklusyonu) Bakteriye ait özelliklerin büyük bir kısmı kromozomal orijinli diğerleri ise plasmidler tarafından kodlanmaktadırlar. Bu iki durumu birbirinden ayırmak için plasmid eliminasyon testi yapılır. Plasmid eliminasyon testinde, genellikle, kimyasal maddeler (acridin orange, acriflavine, ethidium bromide, mitomycin C,optimalin üstündeki ısı derecelerinde üretme, UV-ışınları, iyonizan ışınlar, vs) fazla kullanılır. Plasmidlerin bakteriden ayrıldığını anlamak için ise İndikatör mikroorganizma, plasmidlerin taşıdığı yeni karakterleri alarak pozitif hale gelir. Ortama CaCl2 katılarak permeabilitesi arttırılır ve böylece transfeksiyon kolaylaştırılır. Bu karakterler, dirençlilik veya metabolik plasmidler, vs olabilir. Diğer teknik ise, selektif ortamların kullanılmasıdır. Özellikle, antibiyotiklere duyarlılığın oluştuğunu veya fermentasyon durumunu ortaya koyabilen özel besi yerleri bu amaç için kullanılabilir.
08. Plasmid Replikasyonu Plasmidler, hücre içinde, aynen bir bakteri kromozomu gibi replikasyon modeline sahiptirler. Üzerinde en fazla çalışılan ColE 1 plasmidin replikasyonudur ve unidireksiyonaldır R-plasmidlerinden olan R1, R100 ve R6-5'de unidireksiyonaldır E. coli 'ye ait bazı plasmidlerin replikasyonu iki yönlü olabilmektedir (bidireksiyonal). Bu model replikasyon, bakteri kromozomunun sentezine aynen uymaktadır. Replikasyon çatalı iki yönde ilerleyerek belli bir noktada birbirleriyle birleşirler. Plasmidlerde replikasyon orijini genellikle, tek olmasına karşın bazı F-plasmidinde iki ve R6K'de ise 3 tane RO'nun bulunduğu açıklanmıştır.
09. İnkompatibilite Bir bakteride bulunan replikasyon mekanizması bir plasmid tarafından kullanılıyor ve bloke ediliyorsa, aynı mekanizmadan yararlanan ikinci plasmid bu olanağa sahip olamadığı için replike olamaz (kompetatif inhibisyon). Bu durum aynı zamanda, aynı plasmid ile ikinci infeksiyona da mani olur (immunite). E. coli 'ye ait olan F plasmidi sitoplasmada serbest olarak veya bakteri kromozomu ile birleşik olarak (Hfr hücre) bulunur. İki tarz birlikte E. coli 'de bulunamaz. Böylece biri elimine edilir. Genellikle, aynı tür plasmidler birbirleri için inkompatibil bir karakter taşırlar.
10.Nonkonjugatif Plasmidlerin Transferi Konjugatif plasmidler kendilerini transfer edebilir ancak nonkonjugatif olanların böyle bir yetenekleri bulunmamaktadır. Konjugatifler, kendilerini transfer ettikleri oranda, nonkonjugatifleri de mobilize ederek transferlerini sağlayabilirler. Mobilizasyon bazı durumlarda, konjugatif plasmide bağlanarak bununla birlikte (kotransfer) ve ne de bakterinin reca gen ürünü proteinine bağımlıdır. Kendilerinin mobilizasyonunu sağlayan konjugatif plasmidler bu amaç için en az bir proteinin kodlarına sahiptirler.
11. Plasmid Profil Analizi (Plasmid Fingerprint Testi) Bu test, bakterilerde plasmidlerin varlığını ortaya koyduğu gibi plasmid türlerini belirlemede de yardımcı olmaktadır. Bakterilerde aynı molekül ağırlığında olanlarla farklı olanların fingerprintleri, agarose jel üzerinde farklı yerlerde lokalizasyon gösterdiklerinden, bu durumları teşhiste büyük kolaylıklar sağlamaktadır.
12.1. F plasmid (F Faktörü, Seks Faktörü) F faktörü (fertilite faktörü) en iyi E. coli K 12 da incelenmiştir. Bu plasmid, yapısında replikasyon orijininden ayrı olarak kendisinin transferini sağlayabilecek ve pilus formasyonunu kodlayan bilgilere sahiptir (Tra operonda 21 gen). Bu plasmid hangi hücreye aktarılırsa, o bakteride hücre membranında pilus sentezi meydana gelir. Bu pilus (seks pilusu), bu faktörü taşımayan alıcı hücrenin (F- hücre), verici hücre ile (F+ hücre) bağlantı kurmasına ve bir konjugasyon köprüsü oluşturmasına yardımcı olur. F faktörü konjugatif (transmissible) bir plasmiddir. F faktörü bakterinin sitoplasmasında bulunabileceği gibi, konakçının genomuna da integre olabilir ve Hfr (high frequency recombination) hücre meydana gelir. F plasmidi ile başlıca 3 tür konjugasyon oluşabilmektedir.
1) F+ hücre x F- hücre konjugasyonu: F+ hücre ile buna sahip olmayan F- hücre arasında gerçekleşen F faktörü aktarılmasında seks pilusu önemli fonksiyona sahiptir. F+ hücre x F hücre birleşmelerinde genin aktarımı tek yönlüdür 2) Hfr hücre x F-hücre konjugasyonu: Alıcı hücreye aktarılan F faktörü veya F faktörü + kromozom segmenti, ya alıcı hücrenin genomuna integre olur ve bu hücreyi de Hfr haline getirir veya F plasmidi, hücre sitoplasmasında da kalabilir. 3) F' hücre x F- hücre konjugasyonu: Hfr hücrelerinde kromozomda yerleşik bulunan F plasmidi buradan ayrılabilir. Bu ayrılma tam veya kısmi olabildiği gibi bazı durumlarda da kromozomdan da bir segmentin veya genin birlikte çıkmasına neden olabilir.
12.2. Rezistenslik Plasmidleri (R Plasmidleri) Enterobakteriler arasında çeşitli ilaçlara karşı dirençlilik, hem in vitro ve hem in vivo olarak saptanmıştır. İlk defa bu özellik, 1951 yılında Japonya'da seyreden bir dizanteri olgusundan izole edilen S. flexneri suşunun 4 antimikrobial maddeye (kloramfenikol, tetrasiklin, streptomisin ve sulfonamid) karşı dirençli olduğu R plasmidleri çift iplikçikli sarmal, sirküler ve yapıda DNA karakterinde genetik elementlerdir. Genellikle konjugatif bir özelliktedirler Bakteri kromozomu ile de integre olabilirler. R faktörleri iki bölümden oluşurlar. Biri konjugasyonu ve aktarılmayı yöneten transfer faktörü (TF) ve diğeri de çeşitli ilaçlara karşı dirençliliği tayin eden rezistenslik faktörü (RF) veya R determinanttır. E. coli 'de bu iki faktör tek bir ünite halinde bulunmasına karşılık salmonella ve proteuslarda bunlar ayrı sekanslar halindedirler. Bu faktörler birbirlerinden bağımsız olarak aktarılabilirler ve akridin boyalarından da ayrı ayrı etkilenirler. Eğer, RF transfer edilirse alıcı hücre ilaçlara karşı dirençli hale gelir. Ancak, RF'nin, TF olmadan tek başına aktarılması olanaksızdır.
12.3. Bakteriyosin Plasmidleri Bakteriyosinler, ancak kendini sentezleyen türden veya konakçısına çok yakın olan mikroorganizmalara etkilidirler. Örn., E. coli tarafından sentezlenen colicin bunu sentezleyemeyen E. coli 'ler ile S. sonnei için letaldir. Şimdiye kadar 20'den fazla ve ayrı özellikte kolisin izole edilmiş olup bunlar A'dan V'ye kadar, büyük harflerle bir sıralamaya tabi tutulmuştur. Bunların her biri, E. coli 'lerin bazılarına etkili olmakta ve böylece bir konakçı spektrumu ve spesifitesi meydana gelmektedir. Bakteriyosinler, Gram negatif mikroorganizmaların yanı sıra bazı Gram pozitiflerce de (stafilokok, streptokok, listeria, basiller vs) sentezlenebildikleri görülmektedir
12.4. Virulens Plasmidleri Patojenik mikroorganizmalar, kendilerinde bulunan bazı virulens faktörleri ile konakçıyı hastalandırırlar ve hatta ölümlerine neden olabilirler. Bakteri, ne kadar virulent olursa olsun, eğer konakçı buna direnç gösteriyorsa, mikroorganizma üreyemez, infeksiyon veya hastalık oluşturamaz. Bakterilerin sahip oldukları virulens faktörlerinin bir kısmı da kromozomlarında kodlanmasına karşın bazıları da plasmid orijinlidir. C. tetani (nörotoksin), B. anthracis (pox1 letal toksin), B. thuringiensis(kristal toksin, insekt larvaları için toksik) A. tumefaciens (dikotiledon bitkilerde tümör formasyonu), L. lactis (nisin),s. aureus (eksfoliatif toksin)
12.5. Metabolik Plasmidler Metabolik aktivite bir çok bakteride kromozomlarda bulunan özel genler tarafından yönetilirler. Ancak, bazı bakterilerde de metabolizma ile ilgili reaksiyonlar hem kromozomal ve/veya hem de plasmid orijinli olabilmektedir. 1) Degradatif plasmidler: P. putida ve diğer pseudomonaslarda bir çok kimyasal maddeyi ayrıştırabilecek plasmid kaynaklı enzimlere sahiptirler. Böyle enzimlerin sayısı 10'dan fazlayı bulmaktadır. Örn., SAL, NAH, ASL ve TOL plasmidleri, sıra ile salycylate, naphtalene, alkyl benzen sulphonate ve tolueni ayrıştırarak catechola çevrilir ve sonra da plasmidlerce kodlanan enzimler tarafından acetaldehyde ve piruvatlara dönüştürülür. 2) Diğer metabolik plasmidler: Salmonellalar, genellikle, Lac-'dirler. Bazen Lac+ fenotipe dönüşebilirler (S. typhi). Bunları, Lac+ plasmidler gerçekleştirirler. Lac+ plasmidlere, salmonellalar dışında, serratia, S. lactis ve proteuslarda da tesadüf edilmiştir. Plasmidler, aynı zamanda, salmonellalarda, sukroz fermentasyonuna da neden olabilirler.
12.6. Büyük Plasmidler Genel bir kural olmamakla beraber, molekül ağırlığı 50 Md'den fazla olanlar "büyük plasmidler" olarak dikkate alınmaktadırlar. Gen aktarımlarında önemli fonksiyonları olan plasmidlere, kirli ve organik materyaller açısından zengin sularda yaşayan bakterilerde rastlanılmaktadır.
13. Antimikrobiyallere ve Metallere Dirençlilikte Plasmidlerin Rolü 1) Antibiyotiklerin etkilediği hedef bölgelerin modifikasyonu, 2) Antibiyotikler modifiye edilerek etkinliğinin inaktivasyonu, 3) Antibiyotiklerin hücreye girişinin önlenmesi 4) Enzim substitusyonu
13.1 Hedef Bölgenin Modifikasyonu Stafilokok ve streptokok türlerinde bulunan plasmidlerin kodladığı enzimler, bakteriyel ribosomlardaki 23S rrna da bulunan iki adenin molekülünü metile ederek, lincomycin ve erythromycinin bunlara bağlanmasını önlerler. 13.2 Antibiyotiklerin Modifikasyonu Aminoglikozidlere (streptomycin, spectinomycin, kanamycin, gentamycin, amikacin) karşı dirençliliklere karşı antibiyotikleri modifiye eden özel enzimlerin rolü fazladır. Modifiye olan antibiyotikler ribosomlara bağlanamazlar. 13.3. Antibiyotiklerin Girişinin Önlenmesi Enterobakterilerde rastlanan Tn10 (Transposon 10) tetrasiklinlere dirençlilikte önemli fonksiyona sahiptir. Plasmidlerin sağladığı rezistenslikte tetrasiklinlerin hücreye girişi önlenir ve dışarı atılır. 13.4. Enzim Substitusyonu Sulfonamidler, dihidroptoreate sentezinde fonksiyonu olan enzimin kompetatif inhibitörleridirler. Bu enzim (dihidroptoreate sentase), dihidrofolatın sentezi için gereklidir. 13.5. Metallere Dirençlilik Enterobakterilerde ve stafilokoklarda Arsenik, gümüş, bakır, cıva ve tellurium iyonlarına, stafilokoklardaki plasmidler, arsenik, bizmut, kadmium, bakır, kurşun, civa ve çinko bileşiklerine, Pseudomonaslardaki plasmidler de krom, civa ve tellurium iyonlarına karşı dirençlilik mekanizması oluştururlar.
PBR322 PLAZMİTİ pbr322-1977 de Herbert Boyer, California Ünv. lab p, plazmit BR, Post-doc "Bolivar" ve "Rodriguez
PBR322 PLAZMİTİ Ampisilin ve tetrasiklin direnç genleri Birçok restriksiyon enzim bölgesi
PUC PLAZMİTİ pbr322 nin yarısı büyüklüğünde (daha büyük DNA ların klonlar) pbr322 den geliştirildi Messing et al. p, plazmit UC, University of California puc18, puc19 a benzer, MCS ters