Q-Fever Şüphesi Olan Hasta Serum ve Kan Örneklerinde Nested-PCR Yöntemiyle Coxiella burnetii nin Saptanması

Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Q-Fever Şüphesi Olan Hasta Serum ve Kan Örneklerinde Nested-PCR Yöntemiyle Coxiella burnetii nin Saptanması Detection of Coxiella burnetti by Nested-PCR in Blood and Serum Samples of Q-Fever Suspected Patients Egemen AKGÜN *, Meral YILMAZ**, Ergün PINARBAŞI*** ÖZET 2003 yılının Nisan-Ağustos ayları arasında C.Ü. Araştırma Hastanesi nde Q-Fever şüphesi ile gözlem altına alınmış hastaların kan ve serum örneklerinde Coxiella burnetii nin saptanması için Nested-PCR yöntemi kullanıldı. Bunun için C. burnetii genomuna ait 27 kda büyüklüğünde bir dış membran proteinini kodlayan com-1 genini amplifiye etmek için dizayn edilmiş iki çift nükleotid primerinden yararlanıldı. 15 hastanın kan ve serum örneklerinde com-1 gen fragmenti amplifiye edildi. Nested-PCR yöntemi, son yıllarda bölgemizde sıkça gözlenmeye başlayan C. burnetii nin direkt olarak tanımlanması için kullanışlı bir yöntem olabilir. Anahtar kelimeler : Com-1 geni, Coxiella burnetii, Nested-PCR, Q-fever. SUMMARY A Nested-PCR method was used for the detection of Coxiella burnetii in blood and serum samples of the patients who were observed for Q fever suspicion at the Hospital of Cumhuriyet University between April and August 2003. Two pairs of nucleotide primers were used to amplify a 438 bp fragment of the com1 gene encoding a 27-kDa outer membrane protein of C. burnetii. The com-1 gene fragment was amplified from the blood and serum samples of 15 patients. The Nested-PCR can be a useful method for the detection of C. burnetii which has often appeared in our region recently. Key words Com-1 gene, Coxiella burnetii, Nested- PCR, Q-fever. C. Ü. Tıp Fakültesi Dergisi 28 (2): 50 54, 2006 GİRİŞ Q fever, zoonoz bir hastalık olup, etkeni çevre etkilerine karşı oldukça dayanıklıdır. C. burnetii hücre içine yerleşen ve Q fever hastalığına neden olan gram negatif bir bakteridir (1-3). Etken rezervuar olarak başta keneler olmak üzere arthropodları, çiftlik hayvanlarını, kedi ve köpekleri kullanmaktadır (1, 2, 4, 5). C. burnetii enfeksiyonları akut ve kronik Q fever olmak üzere iki farklı klinik seyir izler. Akut Q fever genellikle ani ve yüksek ateş, bitkinlik, ürperme ve baş ağrısı gibi semptomlarla seyreden grip benzeri bir hastalıktır (1, 6, 7). Kronik Q fever da ise en sık rastlanılan bulgular endokarditis ve hepatitis olup bunların yanında vasküler enfeksiyonlar, osteomyelitis ve uzun süreli ateş de gözlenebilmektedir (1, 2, 7-9). * Vet. Hek., Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji AD 58140- Sivas ** Biyolog, Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji AD 58140- Sivas *** Doç. Dr., Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji AD 58140- Sivas 50

Akgün ve ark. Q fever in rutin tanısı genellikle, çok zaman alan ve uygulaması zor olan serolojik testlerle yapılmaktadır. Bu testler arasında en sık kullanılan metot indirect immunofluorescence (IFA) testidir. Ancak serolojiktestler retrospektif teşhise imkan verdiklerinden şimdiki veya daha önce gerçekleşen bir enfeksiyonun ayrımı kesin olarak yapılamaz. Bunun yanında enfeksiyonun erken dönemlerinde antikorların kanda bulunmayışı bu testlere bazı sınırlamalar getirmektedir (10). Son dönemlerde PCR (Polimerase Chain Reaction) yöntemi, klinik örneklerde hastalık etkenlerinin saptanması için oldukça kullanışlı bir araç haline gelmiştir (11-14). PCR yöntemi, çok az miktardaki örneklerde dahi hedef DNA sekansının ortaya çıkartılabilmesini sağladığından Q-fever enfeksiyonlarının laboratuar teşhisinde oldukça duyarlı bir metot olarak karşımıza çıkmaktadır. Biz bu çalışmamızda OMP1, OMP2, OMP3 ve OMP4 primerlerini kullanarak hastalık şüphesi ile gözlem altına alınmış bireylerin kan ve serum örnekleri üzerinde yaptığımız Nested-PCR analizi sonucunda C. burnetii genomuna ait 27 kda büyüklüğünde, bir dış membran proteinini kodlayan com-1 genini amplifiye ettik. GEREÇ VE YÖNTEM Çalışma Grubu ve Örneklerin Alınması 19 Nisan - 10 Ağustos 2003 tarihleri arasında, gribal enfeksiyon ve gastro-intestinal sistem bozuklukları (bulantı, kusma, ishal, vb.) şikayetleri ile C.Ü. Tıp Fakültesi Uygulama ve Araştırma Hastanesi İntaniye Kliniğine başvuran toplam 80 hasta, Q-fever şüphesi ile gözlem altına alınmıştır. Hastalardan, EDTA lı steril tüpler içinde 5 ml venöz kan ve 1 ml serum toplandı. Örnekler çalışma anına kadar 85 C de saklandı. DNA İzolasyonu Hastalığın lökopeniyle birlikte seyretmesi ve buna bağlı olarak DNA izolasyonunda yaşanılabilecek olumsuzluklardan dolayı venöz kan yanında hasta serumlarından da yararlanıldı. Kandan genomik DNA izolasyonu için yüksek tuz konsantrasyonu ile DNA izolasyon yöntemi kullanıldı. Klinik bulgular arasında yer alan lökopeniye ve hastaların ilaç kullanımına bağlı olarak 80 hastanın sadece 58 inde genomik DNA elde edilebildi (Şekil 1). Şekil 1. Hasta kanlarından yüksek tuz konsantrasyonu ile DNA izolasyon yöntemi ile elde edilen DNA örneklerinin agaroz jel görüntüsü (1,2,3 15 nolu hasta kanlarından elde edilen genomik DNA örnekleri). Serum örneklerinden genomik DNA izolasyonu için her bir serum örneğinden 10 μl alınıp 40 μl çalışma tamponu (%1 lik Nonidet P-40, %1 lik Tween 20, 10 mm Tris-HCl) ile karıştırıldı. Karışım 10 dakika kaynatıldı ve ardından 12.000 X g de 5 dakika santrifüj edildi. Süpernatant direkt olarak PCR analizi için kullanıldı. Her çalışma için yeniden DNA izolasyonu yapıldı (15). DNA Amplifikasyonu Hastalık tanısı için Nested-PCR yöntemi kullanılarak genotipleme yapıldı. Nested-PCR, iki aşamalı amplifikasyon yöntemidir (16). Bu iki aşamalı yöntemdeki amaç, kan ve serum örneklerinden elde edilen bakteri DNA konsantrasyonunun düşük olmasına bağlı olarak PCR ürünlerinin saptanabilirliğini artırmaktır. 51

Q-Fever Şüphesi Olan Hasta Serum ve Kan Örneklerinde Nested-PCR Yöntemiyle Coxiella burnetii nin Saptanması Bunun için de ilk PCR sonucunda elde edilen ürünler ikinci PCR için kalıp DNA olarak kullanılır. Bu çalışmada Nested-PCR yöntemi için ilk amplifikasyonda OMP1, OMP2 ve ikinci amplifikasyonda ise OMP3 ve OMP4 primerleri kullanıldı. Tüm nükleotid primerleri ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (IONTEK). OMP1 (5 -AGT AGA AGC ATC CCA AGC ATT G-3 ), OMP2 (5 -TGC CTG CTA GCT GTA ACG ATT G-3 ),OMP3 (5 -GAA GCG CAA CAA GAA GAA CAC-3 ) ve OMP4 (5 -TTG GAA GTT ATC ACG CAG TTG-3 ) primerleri Nested-PCR analizi için kullanıldı. Bu primerler, 21 C.burnetii soyunda da korunmuş nükleotid sekansına sahip com-1 geni için dizayn edilmiştir. Kullanılan primerlerin sekans özgüllüğünü kontrol etmek için GeneBank veri bankası taranmış, diğer viral ve bakteriyel organizmaların gen sekanslarıyla herhangi bir homoloji göstermedikleri saptanmıştır (10). İlk amplifikasyon 25μl lik reaksiyon hacminde gerçekleştirilmiş olup reaksiyon karışım içeriği; 50 ng genomik DNA, 10 pmol OMP1 ve OMP2 primerleri, her bir dntp den (deoksiribonüklotidtrifosfat) 5nmol (fermentase), 1 ünite Taq DNA polimeraz (fermentase), 10 mm Tris-HCl (ph 8,3), 50 mm KCl ve 1,5 mm MgCl 2 olacak şekilde dizayn edildi. Birinci tur PCR reaksiyonu için program, 94 C de 1 dk, 58 C de 1 dk, 72 C de 1 dk olarak uygulandı ve 36 döngüde istenilen ürün amplifiye edildi. İkinci tur PCR reaksiyonu için ilk PCR reaksiyonundan elde edilen üründen 5 μl alınarak reksiyon karışımı hazırlandı ve 94 C de 30 sn, 58 C de 30 sn ve 72 C de 1 dk olacak şekilde PCR programı uygulanarak com-1 gen fragmenti amplifiye edildi. Amplifiye edilmiş PCR ürünlerinin her birinden 10 μl alınıp, ethidium bromide (0.5 μg/ml) ile boyanmış %1 lik agaroz jele yüklenmiştir. Daha sonra agaroz jel elektroforezi gerçekleştirilmiş ve jel, UV ışığı altında incelenip fotoğraflanmıştır. BULGULAR Hasta serum ve kanlarından elde edilen DNA örneklerinde OMP-1 ve OMP-2 primerleri kullanılarak yapılan birinci tur PCR analizi sonucunda 501 bç (baz çifti), OMP-3 ve OMP-4 primerleri kullanılarak yapılan ikinci tur PCR (Nested-PCR ) analizi sonucunda ise 438 bç uzunluğunda bir fragment elde edilmiştir. Kan ve serum örneklerinden PCR ürünü elde edilen hastalar Q- fever (+) olarak değerlendirilmiştir. Biz çalışmamızda Q-fever şüphesi ile müşahede altına alınan 80 hastanın 15 inde (%18,75) Q-fever (+) sonucuna ulaştık (Şekil 2) Şekil 2. Q-fever (+) hastalarının OMP-3 ve OMP-4 primerleri kullanılarak elde edilmiş Nested-PCR ürünleri: M:Gene RulerTM DNA Ladder Mix (100 bp), 1: kan örneği, 2: serum örneği, N: negatif kontrol. Amplifikasyon ürünlerinin her birinden 10 μl alınıp, ethidium bromide (0.5 μg/ml) ile boyanmış %1 lik agaroz jele yüklenmiştir. Soldaki numaralar baz çifti sayısını göstermektedir. Not: 1. tur PCR sonucu OMP-1 ve OMP-2 primerlerine ait PCR ürünleri jelde gözlenemediğinden jele yüklenmemiştir. Çalışmada, Japonya Gifu Üniversitesi, veteriner fakültesi, mikrobiyoloji bölümünden sağlanan C. burnetii Nine Mile soyuna ait bakteri genomu pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. TARIŞMA Coxiella burnetii hücre içine yerleşen gram (-) bir bakteridir. Yüksek enfeksiyon yeteneği ve çevre şartlarına direnci nedeniyle, C. burnetii nin biyolojik silah olarak kullanılabileceği düşünülmektedir (10). Dünya genelinde birçok salgın rapor edilmiştir. Endemilerin çoğu direkt veya indirekt olarak çiftlikler ve çiftlik hayvanları ile ilişkilendirilmiştir ancak şehir endemileri de tanımlanmıştır (17 23). Bununla birlikte son iki yıl içinde ülkemizde bu hastalığın semptomlarına benzer semptomlar taşıyan vakalarda gözlenen ani artış 52

Akgün ve ark. oldukça kaygı vericidir. Bakterinin insana transferinde özellikle enfekte olmuş çiftlik hayvanları dikkati çekmektedir. Hastalıkla ilgili olarak hayvanlarda, nadir oranlarda görülen düşükler ve üreme ile ilgili diğer problemlerin dışında herhangi bir klinik bulgu rapor edilmemiştir (24). Buna karşın hastalık, insanlarda endokarditis ve hepatitis gibi çok ciddi bulgularla karşımıza çıkmaktadır. Bununla birlikte akut ve kronik Q- fever antibiyotik tedavisine cevap veren hastalıklardır. C. burnetii nin klinik örneklerden hızla tanımlanması, antibiyotik tedavisine hızla başlanmasına olanak vereceğinden hastalığa yakalanan bireylerde tedavinin daha sağlıklı olmasına olanak verecektir (10, 25). C. burnetii nin hastalardan izolasyonu zaman alıcı, oldukça zor ve tehlikelidir. Bunun yanında kültür ortamında farklı C. burnetii soyları farklı büyüme koşulları göstermektedir (26). C. burnetii nin rutin teşhisi, indirect immunofluorescence testi (IF) (27-29), komplemen fiksasyon testi (30-32), ELISA (33-35) testlerini de içeren serolojik testlerle gerçekleştirilmektedir. Ancak hastalık etkeninin kandan çekilmesinden yıllar sonra dahi kanda bulunabilen antikorların varlığı nedeniyle şimdiki veya daha önce geçirilen bir hastalığın ayrımının yapılamaması ve bazen de hastalığın erken dönemlerinde antikorların belirlenememesi gibi nedenler bu testlere bazı sınırlamalar getirmektedir. Bu durum PCR yönteminin avantajlarını açıkça göstermektedir. KAYNAKLAR 1. Maurin M, Raoult D: Q fever. Clin Microbiol Rev, 1999; 12: 518 53 2. Marrie TJ: Coxiella burnetii (Q fever). In: Mandell GL, Douglas RG, Bennett JE eds: Principles and practice of infectious diseases. New York, Churchill Livingstone, 2000; 2043-48 3. Raoult D, Marrie TJ: Q fever. Clin Infect Dis, 1995; 20: 489 96 4. Fournier PE, Marrie TJ, Raoult D: Diagnosis of Q fever. J Clin Microbiol, 1998; 36: 1823 24 5. Welsh HH, Lennette EH, Abinanti FR, Winn JF: Air-borne transmission of Q fever: the role of parturifi cation in the generation of infective aerosols. Ann NY Acad Sci, 1958; 70: 528 40 6. Tissot-Dupont H, Raoult D, Brouqui P et al: Epidemiologic features and clinical presentation of acute Q fever in hospitalized cases: 323 French cases. Am J Med, 1992; 93: 427 34 7. Raoult D, Tissot-Dupont H, Foucault C et al: Q fever 1985-1998. Clinical and epidemiologic features of 1,383 infections. Medicine, 2000; 79: 109 23 8. Brouqui P, Tissot-Dupont H, Drancourt M et al: Chronic Q fever: ninety- two cases from France, including 27 cases without endocarditis. Arch Intern Med, 1993; 153: 642 48 9. Weir, W. R. C., B. Bannister, S. Chambres, K. D. Coke, and H. Mistry. Chronic Q fever associated with granulomatous hepatitis. J. Infect. 1984;8:56 60 10. Zhang, G. Q., S. V. Nguyen, T. Ho, M. Ogawa, A. Hotta, T. Yamaguchi, H. J. Kim, H. Fukushi, And K. Hirai. Clinical evaluation of a new PCR assay for detection of Coxiella burnetii in human serum samples. J. Clin. Microbiol. 1998;36:77-80 11. Stein, A., and D. Raoult. Detection of Coxiella burnetii by DNA amplification using polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 1992;30:2462 66. 12. Willems, H., D. Thiele, R. Frolich-Ritter, and H. Krauss. Detection of Coxiella burnetii in cow s milk using the polymerase chain reaction (PCR). Zentralbl. Veterinaermed. B 1994;41:580 87. 13. Willems, H., D. Thiele, and H. Krauss. Plasmid based differentiation and detection of Coxiella burnetii in clinical samples. Eur. J. Epidemiol.1993; 9:411 18. 14. Yuasa, Y., K. Yoshiie, T. Takasaki, H. Yoshida, and H. Oda. Retrospective survey of chronic Q fever in Japan by using PCR to detect Coxiella burnetii DNA in paraffinembedded clinical samples. J. Clin. Microbiol. 1996;34:824 87. 15. Ho, T., N. Kako, G. Q. Zhang, H. Otsuka, M. Ogawa, O. Ochiai, Sa V. Nguyen, T. Yamaguchi, H. Fukushi, N. Nagaoka, M. Akiyama, K. Amano, and K. Hirai. Q fever pneumonia in children in Japan. J. Clin. Microbiol. 1996;34:647 51. 16. Persing D. H. In vitro nucleic acid amplification techniques. In: Persing D. H., Smith T. F., Tenover F. C., White T. J. Diagnostic Molecular Microbiology, Washington DC. 1993;51-87, 53

Q-Fever Şüphesi Olan Hasta Serum ve Kan Örneklerinde Nested-PCR Yöntemiyle Coxiella burnetii nin Saptanması 17. Salmon M, Howells B, Glencross E, Evans A, Palmer S. Q fever in an urban area. Lancet. 1982;1:1002 4. 18. Hawker JI, Ayres JG, Blair I, Evans MR, Smith DL, Smith EG, et al. A large outbreak of Q fever in the West Midlands: windborne spread into a metropolitan area? Commun Dis Public Health. 1998;1:180 7. 19. Suputtamongkol Y, Rolain JM, Losuwanaruk K, Niwatayakul K, Suttinont C, Chierakul W, Pimda K, Raoult D. Q fever in Thailand. Emerg Infect Dis. 2003 Sep;9(9):1186-7 20. http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/00000362.htm 21. http://wonder.cdc.gov/wonder/prevguid/m0045670/m004 5670.asp 22. Tissot-Dupont H, Amadei MA, Nezri M, Raoult D. Wind in November, Q fever in December. Emerg Infect Dis 2004; 10(7):1264 9 23. Hugo C. van Woerden, Brendan W. Mason, Lika K. Nehaul, Robert Smith, Roland L. Salmon, Brendan Healy, Manoj Valappil, Diana Westmoreland, Sarah de Martin, Meirion R. Evans, Graham Lloyd, Marysia Hamilton- Kirkwood, and Nina S. Williams. Q Fever Outbreak in Industrial Setting. Emerg Infect Dis 2004; 10(7):1282 9 24. Lorenz H., Jager C., Willems H. and Baljer G. PCR detection of Coxiella burnetii from different clinical specimens, especially bovine milk, on the basis of DNA preparation with a slica matrix. Applied and Environmental Microbiology.1988; 64(11):4234 7. 25. Zhang G.Q., Hotta A., Mizutani M., Ho T., Yamaguchi T., Fukushi HPer. and Hirai K. Direct identification of Coxiella burnetii plasmids in human sera by nested PCR. J. Clin. Microbiology. 1998;36(8):2210-3, 26. Stein,A., and D. Raoult. Phenotypic and genotypic heterogeneity of 8 new human Coxiella bumetii isolates. ActaVirol. (Prague)1992;36:7-12. 27. Dupuis, G., O. Peter, M. Peacock, W. Burgdorfer, and E. Haller. Immunoglobulin responses in acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 22:484 7. 28. Guigno, D., B. Coupland, E. G. Smith, I. D. Farrell, U. Desselberger, and E. O. Caul. 1992. Primary humoral antibody response to Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever. J. Clin. Microbiol. 1985;30:1958 67. 29. Nagaoka, H., M. Akiyama, M. Sugieda, T. Nishio, S. Akahane, H. Hattori, T. Ho, H. Fukushi, and K. Hirai. Isolation of Coxiella burnetii from children with influenzalike symptoms in Japan. Microbiol. Immunol. 1996;40:147 51. 30. Field, P. R., J. G. Hunt, and A. M. Murphy. Detection and persistence of specific IgM antibody to Coxiella burnetii by enzyme-linked immunosorbent assay: a comparison with immunofluorescence and complement fixation tests. J. Infect. Dis. 1983;148:477 87. 31. Peter, O., G. Dupuis, W. Burgdorfer, and M. Peacock. Evaluation of the complement fixation and indirect immunofluorescence tests in the early diagnosis of primary Q fever. Eur. J. Clin. Microbiol. 1985;4:394 6. 32. Peter, O., G. Dupuis, M. G. Peacock, and W. Burgdorfer. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and complement fixation and indirect fluorescent-antibody tests for detection of Coxiella burnetii antibody. J. Clin. Microbiol. 1987;25:1063 7. 33. Peter, O., G. Dupuis, D. Bee, R. Luthy, J. Nicolet, and W. Burgdorfer. Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of chronic Q fever. J. Clin. Microbiol. 1988;26:1978 82. 34. Schmeer, N. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the demonstration of IgG1, IgG2, and IgM antibodies in bovine Q fever infection. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infectionskr. Hyg. Abt. 1. Orig. 1985;259: 20 34. 35. Schmeer, N., H. P. Muller, W. Baumgartner, J. Wieda, and H. Krauss. Enzyme-linked immunosorbent fluorescence assay and high-pressure liquid chromatography for analysis of humoral immune responses to Coxiella burnetii proteins. J. Clin. Microbiol. 1988;26:2520 5. Yazışma Adresi : Doç. Dr. Ergün PINARBAŞI Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji AD 58140- Sivas epinar@cumhuriyet.edu.tr 0-346-2191010/1028 54