i TÜRKĠYE CUMHURĠYETĠ ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ KĠLĠS TEKESĠ SPERMASININ DONDURULMASINDA SUKROZUN ETKĠSĠ Vet. Hek. Elif BAYRAKTAR DÖLERME VE SUNĠ TOHUMLAMA ANABĠLĠM DALI YÜKSEK LĠSANS TEZĠ DANIġMAN Prof. Dr. Ongun UYSAL 2011 - ANKARA
ii
iii ĠÇĠNDEKĠLER Ġçindekiler... iii Önsöz... vi Simgeler ve Kısaltmalar... vii ġekiller... viii Çizelgeler... ix Resimler...x 1. GĠRĠġ... 1 1.1 Kilis Keçisinin Irk Özellikleri...1 1.1.1 Morfolojik Özellikleri...1 1.1.2 Verim Özellikleri...1 1.2 Tekelerde Reprodüksiyon...2 1.2.1 Genital Organların Embriyolojik GeliĢimi...2 1.2.2 Teke Reprodüktif Organ ve Fonksiyonları...3 1.2.2.1 Primer Üreme Organları...3 1.2.2.2 Eklenti Bezleri ve Görevleri...4 1.2.2.3 DıĢ Genital Organlar...5 1.2.3 Tekelerde Ergenlik( Pubertas)...6 1.2.4 Tekelerde EĢeysel DavranıĢlar...6 1.2.5 Üreme Mevsimi...8 1.2.6 Spermatozoa Üretimi( Spermatogenezis)...9 1.2.7 Sperma Verimi ve Spermatolojik Özellikler...11 1.2.8 Tekelerde Dölermenin Hormonal Mekanizması...11 1.2.9 Teke Spermasının Kısa Süre ve Dondurularak Uzun Süre Saklanması...12
iv 1.2.9.1 Teke Spermasını Dondurma Yöntemleri...14 1.2.9.2 Teke Spermasının Dondurulmasında BaĢarıyı Etkileyen Faktörler...14 1.2.9.3 Teke Spermasının Sulandırılması ve Sulandırma Oranı...19 1.2.9.4Teke Spermasının Dondurulmasında Kullanılan Sulandırıcılar ve Kriyoprotektanlar 20 1.2.9.5 Teke Spermasının Çözdürülmesi...22 2. GEREÇ VE YÖNTEM... 24 2.1 Hayvan Materyali...24 2.2 Hayvanların Bakım ve Beslenmesi...24 2.3 Spermanın Alınması ve Değerlendirilmesi...24 2.3.1 Makroskobik Muayene...25 2.3.1.1 Spermanın Rengi ve Kıvamı...25 2.3.1.2 Spermanın Miktarı...25 2.3.1.3 Spermanın ph Değeri...26 2.3.2 Mikroskobik Muayene...26 2.3.2.1 Spermatozoa Motilitesi...26 2.3.2.2 Spermatozoa Yoğunluğu...26 2.3.2.3 Anormal Spermatozoa ve Akrozoma Bağlı Bozukluk Oranı...27 2.3.2.4 Ölü Spermatozoa Oranı...28 2.4 Spermanın Sulandırılması ve Sulandırıcı Grupları...28 2.5 Spermanın Dondurulması...30 2.6 Spermanın Çözdürülmesi ve Ġn Vitro Değerlendirilmesi...30 2.7 Ġstatiksel Analiz...31 3. BULGULAR... 32 3.1 Nativ Spermalarda Spermatolojik Parametreler...32 3.2 Çözüm Sonu Spermatolojik Parametreler...32
v 3.2.1 Spermatozoa Motilitesi...33 3.2.2 Anormal Spermatozoa Oranı...34 3.2.3 Akrozom Bozukluğu Oranı...35 3.2.4 Ölü Spermatozoa Oranı...36 4. TARTIġMA... 38 5. SONUÇ VE ÖNERĠLER... 48 ÖZET... 50 SUMMARY... 51 KAYNAKLAR... 52 ÖZGEÇMĠġ... 62
vi ÖNSÖZ Günümüzde gerek besleyicilik gerekse sağlık açısından kıymeti kavranmıģ olan keçi eti ve sütüne karģı artan talep oranıyla beraber keçi yetiģtiriciliğine olan ilgi de artıģ göstermiģtir. Öyle ki geçtiğimiz zamanlarda beslenme tarzı dolayısıyla orman düģmanı olarak görülen keçi günümüzde aklanmıģ ve birçok evcil hayvan türüne göre daha çeģitli bitkisel besinleri tüketip hayvansal ürüne dönüģtürebilme özelliğiyle tercih edilir hale gelmiģtir. Bunun yanında uygun bakım ve besleme koģullarında verimlilik oranları yükselebilecek olan yerel ırklarımızı kaybediyor olmamız üzüntü vericidir. Keçi süt ve süt ürünlerine karģı oluģan talep artıģı özellikle süt verimi yüksek ırklarımızın ıslahı konusunda yetiģtiricileri ve araģtırmacıları harekete geçmeye sevketmiģtir fakat yerel ırklarımıza ait uygun damızlıkların bulunmasında sıkıntılar vardır. Ġyi damızlıkları bulunmayan bir sürüden yüksek performans beklenemeyeceği bilinen bir gerçektir. Damızlık yetersizliğinden kaynaklanan problemlerin çözümlenebilmesi ancak genetik materyalin en etkili Ģekilde naklinin sağlanabilmesi ile aģılabilir. Bu amaçla hücre biyoteknolojisine iliģkin çalıģmalara yoğunluk verilmesi gerekmektedir ve suni tohumlama bu anlamda etkili bir yer tutmaktadır. Verim oranları yüksek yerli ırk sürülerimizin oluģturulabilinmesi donmuģ spermayla yapılan suni tohumlamadan elde edilen baģarının artırılmasıyla mümkündür. Ancak keçilerde uygulanan suni tohumlamayla elde edilen fertilite oranı büyükbaģ hayvanlardaki oranlara göre düģüktür. Keçilerde suni tohumlama baģarısını artırabilmek için teke spermasının dondurulmasına iliģkin çeģitli çalıģmalar yaparak çözümsonu parametrelerin iyileģtirilmesini sağlayacak sulandırıcı kompozisyonlarının araģtırılması gerekmektedir. Spermanın dondurulması esnasında hücre bazında hasara neden olan en büyük sıkıntılardan birinin soğuk Ģoku olduğunu düģündüğümüzde bu hasarı en aza indirebilmek için sulandırıcılara farklı oranlarda farklı kryoprotektanların eklenmesi suretiyle çıkan sonuçlar değerlendirilmelidir. Yerli ırklarımızdan olan Kilis süt üretim kapasitesi bakımından iyi ırklarımızdan birisidir ve bu ırkın artarak devamlılığının sağlanabilmesi ülke ekonomisi ve keçi sürülerimizdeki genetik çeģitlilik bakımından önem taģımaktadır. Yapılan bu tez çalıģmasının amacı, teke spermasının dondurulması aģamasında kullanılan farklı oranlardaki sükrozun çözümsonu parametrelere etkisinin karģılaģtırılmasına yönelik olmuģtur. Yüksek lisans öğrenimim ve tez çalıģmam süresince yardım ve desteklerini esirgemeyen danıģman hocam Sayın Prof. Dr. Ongun UYSAL a, Anabilim Dalı BaĢkanımız Sayın Prof. Dr. Necmettin TEKĠN e ayrıca Anabilim Dalının tüm akademik ve teknik personeline, çalıģmamın istatistik değerlendirilmesinde katkıda bulunan
vii Sayın Doç. Dr. Sefa GÜRCAN a, hayatımın her aģamasında olduğu gibi bu dönemde de bana her zaman destek olan aileme Ģükranlarımı sunarım.
viii SĠMGELER VE KISALTMALAR ABP: Androjen Bağlayıcı Protein BSA: Bovine Seum Albumine BHT: Butilated Hydroxytoluene BUS: Bulbouretral sekresyon BUSgp60: Bulbouretral Salgı Glycoprotein 60 CASA: Computer Aided Semen Analizer CUE: Cornell University Extender DNA: Deoksiribonükleik Asit EYCE: Yumurta Sarısı Koagüle Edici Enzim FSH: Follikül Stimülan Hormon GnRH: Gonadotropin Salgılatıcı Hormon ICSH: Ġntersitisyel Hücre Stimülan Hormon Insl3: Ġnsülin benzeri hormon-3 K: Potasyum LDF: DüĢük Yoğunluklu Lipoprotein Fraksiyonu LH: LuteinleĢtirici Hormon ml :Mililitre mm: Milimolar μg: Mikrogram MIF: Müller inhibe edici faktör μlt: Mikrolitre SBUIII: Bulbouretral salgı SRY: Sex Determining Region on Chromosome Y
ix ġekġller ġekil 1. 1: EĢeysel davranıģlarda hormonal mekanizma ġekil 3. 1: Çözüm sonu spermatozoa motilitesi ġekil 3. 2: Çözüm sonu anormal spermatozoa oranı ġekil 3. 3: Çözüm sonu akrozom bozukluğu ġekil 3. 4: Çözüm sonu ölü spermatozoa oranı
x ÇĠZELGELER Çizelge 3. 1. Nativ teke spermalarında belirlenen ortalama spermatolojik parametreler Çizelge3. 2. Çözüm sonrası ortalama spermatolojik parametreler
xi RESĠMLER DĠZĠNĠ Resim 2. 1: ÇalıĢmada kullanılan Kilis tekeleri
1 1.GĠRĠġ 1.1 Kilis Keçisinin Irk Özellikleri Kilis keçisi, Kıl keçisi ile Suriye kökenli Halep keçisinin melezlenmesinde elde edilmiģ ve uzun yıllar kendi aralarında yetiģtirilerek saf hale gelmiģtir. Kilis keçisi Güneydoğu Anadolu bölgesinde ve özellikle Kilis, ġanlıurfa, Gaziantep ve Hatay illerinde yaygın olarak yetiģtirilmektedir. Bugün sayısının 60-70 bin dolayında olduğu tahmin edilmektedir(aktepe, 2009; Alızadehasl, 2011 ). 1.1.1 Morfolojik Özellikleri Kilis keçisinde vücut genellikle siyah kıllarla örtülüdür. Kahverengi, kızıl kahve, gri ve alaca olanlara da rastlamak mümkündür. Genellikle küçük gruplar halinde bağ, bahçe ve aile iģletmelerinde yetiģtirilmektedir. Kilis keçisi farklı iklim koģullarına uyabilmekte; entansif veya ekstansif koģullarda, aile tipi iģletmelerde 2-10 baģ halinde; bazen sürü halinde 200 baģa kadar yetiģtirilebilmektedir. BaĢ rengi genellikle siyah olurken kılçıl veya kahverengi akıtmalı olabilmektedir. DiĢi ve erkekleri çoğunlukla boynuzlu olmakla birlikte boynuzsuz bireylere de rastlanır. Kilis keçilerinde ortalama kulak uzunluğu 28 cm olmakla birlikte bazı bireylerde bu uzunluk 38-39 cm ye kadar çıkabilmektedir( Anonim, 2009; Alızadehasl, 2011). Kilis keçileri, orta, iri ve uzun vücut yapılıdır. BaĢ profili düz olup koç baģlılara da rastlanır. Çene altında bir çift küpeye rastlanır. Meme yapısı geliģmiģ olup sütçü tip görünüme sahiptir(aktepe, 2009; Alızadehasl, 2011). 1.1.2 Verim Özellikleri Kilis ırkı keçilerin laktasyon süreleri ortalama 227 gündür ve süt verimleri ise laktasyon süresi içinde ortalama 217 kg dır. Erkeklerde doğum ağırlığı 3 kg ve ergin
2 ağırlığı ise ortalama 60 kg dır. DiĢilerde ise doğum ağırlığı 2,8 kg ve ergin ağırlığı 40 kg dır. Kilis ırkı keçilerde damızlık yaģı ortalama 16 ayken oğlak verimi de 1,4 olarak belirtilmiģtir( Anonim, 2009). 1.2 Tekelerde Reprodüksiyon 1.2.1 Genital Organların Embriyolojik GeliĢimi Memelilerde cinsiyet geliģimi birbirini takip eden pek çok aģamadan oluģur. Bu süreç iki mekanizmanın kontrolü altındadır. Bunlardan ilki Y kromozomu üzerinde bulunan bir gen olan SRY ( Sex determining Region on chromosome Y) tarafından yönetilen ve canlıda geliģecek gonadın türüne karar veren genetik kontrol mekanizmasıdır. Ġkincisi ise bu aģamadan sonra devreye giren ve genital kanal ile beynin cinsel baģkalaģımından sorumlu olan hormonal kontrol mekanizmasıdır. Erkek genital kanalının geliģimi, erkeklik hormonlarının etkisi altında Ģekillenen aktif bir süreçken diģi genital kanalının geliģimi, erkeklik hormonlarının yokluğunda kendiliğinden Ģekillenen pasif bir süreçtir(demirtaģ ve PiĢkin, 2009). Deoksiribonükleik asiti( DNA) dıģtan saran SRY geninin gevģemesi sonucu ilgili gen kısmının transkripsiyonunun uyarılmasıyla XY canlılarda, gonadlardaki destek hücreleri Sertoli hücrelerine dönüģür. Fötal sertoli hücreleri tarafından üretilen Müller inhibe edici faktör( MIF), Müller kanalının gerilemesine neden olur. Glikoprotein yapıdaki bu hormon fötal testiste seminifer tübüllerin farklılaģmasından itibaren pubertal olgunluğa kadar sertoli hücrelerinde üretilir. Yine sertoli hücreleri, mezenģim hücrelerinin aktif olarak testosteron salgılayan Leydig hücrelerine dönü- Ģümünü sağlar. Leydig hücreleri tarafından üretilen testosteron, Wolf kanalından türeyecek yapıların ve dıģ genital organların maskulinizasyonunun geliģimini destekler. Son olarak da Ġnsülin benzeri hormon-3( Insl3) testislerin abdomenden skrotuma iniģine aracılık eder( Nef ve Parada, 2000; Al-Attar ve ark., 2007; DemirtaĢ ve PiĢkin, 2009)
3 Fötal gonadlardan salınan testosteronun beynin cinsel yönden farklılaģması üzerine de etkileri vardır. Erkeklere özgü davranıģların ortaya çıkmasından sorumlu beyin bölgelerindeki nöronların geliģimini tetikler. Dolayısıyla bu beyin bölgeleri erkeklerde diģilere oranla daha büyük Ģekillenir. Testosteronun erkeklik yönündeki bu geliģtirici etkisine maskülinizasyon (erkekleģtirme) denir(demirtaģ ve PiĢkin, 2009). 1.2.2. Teke Reprodüktif Organ ve Fonksiyonları Reprodüktif organlar 3 grup halinde değerlendirilmektedir. Bunlar primer üreme organları, erkek eklenti bezleri ve dıģ genital organlarıdır. 1.2.2.1. Primer Üreme Organları Testisler: Testisler, endokrin ( testesteron ) ve ekzokrin (spermatozoa) faliyet gösteren bir çift organdır. Testisler sperma üreten parenģimli organlardır. Funiculus spermaticusla asılı olarak deriden torba olan skrotum içinde bulunurlar. Deri altında gevģek bağdoku bulunur, bağdoku iskelet kası yapısında olan ve funiculus spermaticus içinde seyreden M. cremaster'i örter. Testisler fonksiyonlarını normal vücut sıcklığından birkaç derece daha düģük ısıda gerçekleģtirirler. M. cremaster ve scrotum testislerin sperma üretimi için gerekli ısı ayarlamasında görev alır. Spermatazoa üretimi seminifer tubüllerde gerçekleģir. Ġnterstisyel dokuda bulanan Leydig hücrelerinden de androjen üretilir. Tubulus seminiferus epitelyumunda bulanan sertoli hücreleri, spermatozoa geliģimi esnasında bu hücrelerin beslenmesini ve geliģimini desteklemektedir( Deveci, 1994; AktaĢ, 2007; YavaĢ, 2008; Kulaksız, 2009). Erkek gonadları olan testislerin sperma üretme kapasitesi kalıtım yoluyla önceden belirlenip, yaģam boyu yaģ, hormonlar, beslenme, iklim ve mevsim gibi diğer faktörler tarafından kontrol edilmektedir. Bu değiģkenler etkilerini ya hipofiz bezi yoluyla ya da direkt testisi etkileyerek göstermektedirler (YavaĢ,2008).
4 Epididimis: Epididimis testislerin posterior ve süperior kısmında yer alır. BaĢ (caput), gövde (corpus) ve kuyruk (cauda) olmak üzere üç ana bölüme sahiptir (Kulaksız, 2009). Epididimis testis üzerinde bulunan ve spermatozoanın maturasyonunun gerçekleģtiği kanallardan meydana gelir. Epididimiste maturasyona uğramayan spermatozoa fertilizasyon yeteneğine sahip değildir (YavaĢ, 2008). Spermatozoa hücreleri epididimiste fertilizasyon yeteneği kazandıkları gibi sperma plazma membranlarında da epididimal geçiģte değiģiklikler olur( Hammersted ve ark., 1982). Epididimisin sekretorik salgılarının etkisi ile spermatozoa membranının kompleks protein ve lipid modelinde değiģiklik olur. Membran yapısındaki değiģimle gerçekleģen bu olgunlaģma süreci, spermatozoanın epididimisten ejakülasyona kadar ilerlemesi, diģi genital kanalında fertilizasyonun Ģekilleneceği bölgeye kadar yaģamını sürdürmesi, kapasitasyon ve akrozom reaksiyonu gibi fonksiyonların zamanından önce oluģumunun engellenmesini sağlar( Çevik ve Tuncer, 2005). Deferent Kanallar: Kanallar testislerden sonra epididimis, deferent kanallar ve üretra ile devam etmektedir(yavaģ, 2008). Ductus deferens, epididimisin caudalinden çıktıktan sonra üretraya kadar devam eder ve spermatozoonların üretraya taģınmasında görev alır. Ductus deferensin kademeli olarak kalınlaģmasıyla Ģekillenen ampulla ductus deferens üretraya açılmadan önce veziküler bezin sekretorik kanalıyla birle- Ģerek ductus ejaculatorius'u meydana getirir. Üretra ise ejakülat ve idrar için ortak taģıyıcı kanaldır, orificium üretra externa ile dıģarı açılır. ( Deveci, 1994; Alaçam, 1994; YavaĢ, 2008; Kulaksız, 2009). 1.2.2.2. Eklenti Bezleri ve Görevleri Tekelerde eklenti bezleri olarak vesikula seminalis, prostat ve bulboüretral bezler bulunmaktadır. Tüm bezlerden salgılanan sıvılar (seminal plazma) spermatozoa ile birleģerek ejeküle edilen spermayı oluģturmaktadır(yavaģ, 2008; Kulaksız, 2009). Vesikula Seminalis: Pelvis tabanında, ampulla ductus deferenslerin yan tarafında ve idrar kesesinin boyun kısmında "V" Ģeklinde yer alan tubuloalveolar bir çift bezdir ( Alaçam, 1994). Sekresyon içeriğinde bulunan pek çok min-
5 ralle birlikte prostaglandinler diģi eģey organlarının kasılmasını sağlayarak spermatozoonların dölleme yoluna ulaģmasını kolaylaģtırır. Prostat: Pelvis tabanında, idrar kesesinin arka tarafında yer alan, tubuloalveoler bir bezdir. Tekelerde prostat küçük ve yayılmıģ durumdadır. Üretranın etrafını saran prostat bezi iki bölümden oluģmaktadır. Bu iki bölüm corpus prostatae ve parsdisseminate prostat olarak isimlendirilir( Kulaksız, 2009). Kendisine has, kokulu bir salgı yapar. Bu salgı içinde spermiumlar kamçılarıyla aktif hareket yeteneği kazanırlar ( Alaçam, 1994). Spermayı sulandırır ayrıca alkali içerikli salgısıyla üretranın ve vaginanın asidik ph'sını nötralize eder. Glandula Bulboüretralis: Pelvik üretranın her iki tarafında arcus ischiadicus yakınlarında yerleģen bir çift bezdir. Muköz özellikte salgı yapar ve bu salgı ejekülasyondan önce, üretrayı idrardan temizleyerek spermatozoonlar için uygun bir hale getirir( Alaçam, 1994). Ön hazırlık yapmaksızın (kızıģtırma/teasing) suni vajenle alınan spermada bol miktarda bulunur( Kulaksız, 2009). 1.2.2.3. DıĢ Genital Organlar Eksternal üreme organları penis, skrotum ve prepisyumdan oluģmaktadır. Erkek çiftleģme organı olan penisin, idrarı boģaltma ve sperma sıvısını diģi genital sistemine iletme gibi iki görevi vardır. Ġkinci görevini yapabilmesi için organın ereksiyon haline geçmesi lazımdır. Ereksiyonu sağlayan erektil doku, corpus cavernosum penis türlere göre vasküler ve fibroelastik tip olmak üzere ikiye ayrılır. GeviĢ getirenlerde fibroelastik tipte olduğu gibi cavernler sadece penisin kök kısmında bulunmaktadır. Preputium, deri invaginasyonundan oluģan ve penisi dıģtan sararak koruyucu görev üstlenen bir yapıdır. Skrotum ise içinde testislerin bulunduğu bir yapı olup, en önemli görevi; testisin ısısını regüle ederek spermatogenezisin düzenli olarak sabit ve vücut ısısından düģük bir ısıda yapılmasını sağlamaktadır ( Deveci, 1994; Alaçam, 1994; Kulaksız, 2009).
6 1.2.3. Tekelerde Ergenlik( Pubertas) EĢeysel olgunluk fertilizasyon yeteneğine sahip sperma üretebilme ve cinsel istek( libido) gösterme durumudur. Genellikle erkek kuzularda pubertaya giriģ yaģtan çok beden ağırlığıyla iliģkilidir. Dyrmundsson (1973) tek baģına değerlendirildiğinde beden ağırlığının kronolojik yaģa göre, pubertaya ulaģmada daha önemli bir kriter olduğunu belirtmiģtir(koyuncu ve ark.,2005). Pubertaya giriģ yaģında ırklar arasında 4-8 aylık yaģtan 1-4 yıllık yaģa kadar, ırkların erken ya da geç olgunlaģan ırk olmasına bağlı, dikkate değer bir faklılık gözlenmektedir(leboeuf ve ark., 2000). Reprodüktif sistemdeki en büyük geliģme doğum ile puberta arasındaki zaman diliminde gözlenir (Foote, 1978). Pubertada sperma kalitesi, yüksek anormal spermatozoa oranı ve düģük motiliteye bağlı olarak düģüktür fakat pubertayı izleyen birkaç ay içinde beslenmenin de etkisiyle dikkate değer bir düzelme gözlenmektedir( Kridli ve ark.,2006). DiĢi keçilerde olduğu gibi, erkeklerde de ergenlik yaģı ırk, ısı, ıģık ve beslenme gibi çevresel etkilere bağlı olarak farklılık göstermektedir. Erkekte ergenlik yaģı, spermatogenesis in baģlaması olarak kabul edilirse de, pratikte ergenlik yaģının saptanması, ejakulatta spermatozoaların ilk kez görülmesiyle yapılır( Kulaksız, 2009). 1.2.4. Tekelerde EĢeysel DavranıĢlar EĢeysel davranıģlar iki aģamada gerçekleģmektedir. Bunlardan birincisi eģeysel olgunluk öncesi dönem, ikincisi ise eģeysel olgunluk sonrası dönemdir. EĢeysel olgunluk döneminde feromonlardaki artıģla birlikte eģeysel davranıģlar gerçekleģir. Feromonların, memelilerde üreme ve eģeysel davranıģlar üzerine önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Feromon salınımı, bilindiği gibi androgen hormonlar tarafından denetlenmektedir. Feromonlar, yapağı ve yağıltıda sıvı ve uçucu yağ ekstraktları olarak bulunurlar. Feromonların kimyasal bir iletiģim mekanizması olduğu da söylenebilir. Görme ve koklama etkisi ile özel kimi bilgilerin hipotalamusa taģınması söz konusudur. Feromonlar, vücudun belirli bölümlerindeki bazı salgı bezlerinden salgı-
7 lanmanın yanı sıra, idrar ve dıģkı yolu ile doğrudan dıģarı salınımla da etkisini gösterirler(yılmaz ve ark;2009). YetiĢkin erkeklerde seksüel motivasyon ve etkinlik doğrudan hormonal sekresyon ve çevresel etkilere bağlıdır. Seksüel dönemin baģlaması testikular androjenlerin salgılanması sonucu plazma testosteron düzeyinin önemli ölçüde yükselmesiyle olur(leboeuf ve ark., 2000). Spermatogenesis oluģumunda rol oynayan hormonlar, aynı zamanda eģeysel davranıģların ortaya çıkmasında da etkili olmaktadırlar. Bu hormonlar hipotalamusdan salgılanan GnRH, hipofiz bezinden salgılanan gonadotropik hormonlar ve testislerden salgılanan androgen hormonlarıdır ( Ġnce, 2007 ; Yılmaz ve ark., 2009). ġekil 1.1:EĢeysel davranıģların hormonal mekanizması.(ġnce, 2007) Keçilerde seksüel motivasyon ve etkinlik sürü içindeki rekabet ve dominant hiyerarģi ile ayarlanabilir. Sosyal çevrenin, erkek hayvanların seksüel davranıģlarının Ģekillenmesinde ve sperma üretiminin tetiklenmesinde kolaylaģtırıcı bir etkisi vardır.
8 Ayrıca östurusta olan bir diģi varlığı da erkek hayvanlar üzerinde seksüel davranıģların Ģekillenmesinde kolaylaģtırıcı bir rol alır(leboeuf ve ark., 2000). EĢeysel davranıģları, kur yapma davranıģları ve aģım davranıģları olarak ikiye ayırabiliriz. Kur yapma davranıģlarına diģinin idrarını koklama, flehmen hareketi ve ön ayağını yere vurma gibi davranıģlar örnek olarak verilebilir. Tekin( 1990) aģım davranıģlarını yaklaģma, atlama, kavrama, arama, yüklenme, ejekülasyon, inme, penisin ereksiyonunu kaybetmesi Ģeklinde vermektedir. Erkek hayvanları çiftlemeye seksüel uyarımlarla hazırlamak onların seksüel performanslarını geliģtirmekte, seksüel davranıģlar sergileyebilmesinin sıklığını arttırmak aģım için ihtiyaç duyacağı sürenin kısalmasına olanak sağlamaktadır. Bu hangi tür uyarımların seksüel performansı geliģtireceğini belirlemek açısından da yararlı olmaktadır. Stevens ve ark. (1982) flehmen hareketinin diģinin östrus durumunu belirlemeye yönelik bir davranıģ olmadığını, genel koku duyusuna dair bilgi kazanma teģebbüsü olduğunu belirtmiģtir. Erkek hayvanların östrustaki diģiyi tesbit iģlemi esnasında flehmen hareketi yapmadığı gözlemlenmiģtir ve bu da flehmen hareketinin kendi kendini uyarmada ya da hayvanlar arası iletiģimde etkili olan, sonradan kazanılmıģ bir davranıģ olduğunu düģündürmektedir(maina ve Katz,1997). 1.2.5. Üreme Mevsimi Teke, yılın her mevsiminde dölerimsel aktivite göstermekle birlikte, sperma veriminde ve kalitesinde fotoperiyoda bağlı olarak değiģimler gözlenir. Gün ıģığının azalmaya baģladığı normal sıfat sezonunda, testesteron ve Lütenizing hormon (LH) un kandaki düzeylerinde, testis ağırlığında ve dolayısıyla spermatolojik aktivite de artıģlar görülür. Sezonal ırkların çiftleģme mevsimi sonbahar ve erken kıģ dönemidir. Tersi olarak, tropik ve subtropik ırklarda tüm yıl boyunca görülür veya fotoperiyot dıģındaki diğer faktörlerce etkilenir( Kulaksız,2009). Ayrı ırklar için ya da aynı ırka mensup ayrı bireyler için sperma kalitesine ve scrotum çevresine dair aylık değiģimler rapor edilmesine rağmen erkek hayvanlar
9 diģilere göre mevsimsel farklılıklardan daha az etkilenirler. Sperma kalitesinde ve miktarında meydana gelen farklılıklar yıl boyunca değiģen gün ıģığı sürelerine bağlıdır. Scrotum çevresi ve sperm kalitesinde meydana gelen değiģikliklerde en büyük faktörün hayvanın yaģı olmasıyla birlikte scrotum çevresindeki değiģiklikler, üretilen sperma miktarıyla yakından iliģkilidir. Ilıman kuģakta gün uzunluğu üreme mevsimini belirleyen en önemli faktördür(tabbaa ve ark., 2006). Koç ve tekelerde testis ağırlığı bakımından görülen farklılıklar, sperm üretimi bakımından görülen mevsimsel değiģim ile iliģkilidir. Örneğin, ilkbaharda testis parankimasının gramı baģına ortalama 8.5x10⁶ spermatozoa üretilirken, sonbaharda 12,2x10⁶ spermatozoa üretilmektedir( Dellal ve Cedden, 2002). 1.2.6. Spermatozoa Üretimi( Spermatogenezis) Epididimal geçiģ sırasında plazma membranı ve akrozomla ilgili moleküler yapılar iģlevsel olarak olgunlaģır ve akrozom reaksiyonu geçirme yeteneği kazanır. Olgun hücreler epididimisten ayrıldıktan sonra aktif olarak hareket edebilirler( Uçar, 2004) Spermatogeneziste testis hormonu olan testosteron ile hipofiz hormonları olan Follikül stimülan hormon (FSH), Ġnterstitisyel hücre stimülan hormon (ICSH) ve Androjen bağlayıcı protein (ABP) nin rolü vardır. Hipofiz ön lobundan salgılanan FSH tubulus seminiferus contortus lardaki Sertoli hücrelerini etkileyerek bu hücrelerden ABP salgılanmasını sağlar. Pubertasa ulaģıldığında hipofiz ön lobundan salgılanan ICSH testisin intersitisyel dokusunda bulunan Leydig hücrelerini etkileyerek testosteronun salgılanmasına neden olur. DolaĢım ile tubulus seminiferus contortuslara gelen testosteronun ABP ile oluģturduğu kompleks spermatogoniumları etkileyerek çoğalma sürecini baģlatır. Testosteron düzeyindeki yükselme, ICSH ın salgılanmasını inhibe eder. Böylece testosteron miktarı belli bir seviyede tutulur. Testosteronun androjenik etkisiyle seksüel istek belirir, ses kalınlaģır, boynuz, yele, ibik ve sakallar büyür, genital yollara açılan bezler geliģir ve salgı yapar. Sertoli hücreleri ABP yanında inhibin ve az miktarda da olsa östrojen de salgılarlar. Ġnhibin hipofiz ön lobundan FSH hormonunun salgılamasını önler. Östrojen hormonu da
10 Leydig hücrelerinden salgılanan testosteronun Sertoli hücrelerinden östrojene çevrilmesiyle elde edilir. Erkek eģey hücresinin oluģumu anlamına gelen spermatogenezis testisin tubulus seminiferus contortus adı verilen kıvrımlı kanallarında meydana gelir. Spermatogonyumdan spermatozoa oluģuncaya kadar Çoğalma Büyüme OlgunlaĢma BaĢkalaĢma evrelerinden geçer. Goniyogenezis denen çoğalma evresinde spermatogonyumlar mitoz bölünme geçirerek sayıca artar. Spermatogonyumların A ve B tiplerinden spermatogonyum A ların bir kısmı kaynak hücresi olarak kalırken bir kısmı da spermatogonyum B lere dönüģür. Spermatogonyum B ler daha iridir ve bazal membrandan tubulusun lumenine doğru hareket ederler. Spermatogonyum B ler mitotik bölünme ile sayılarını arttırarak luminal yüze doğru yönelirler ve daha da büyüyüp primer spermatositlere dönüģmeleriyle büyüme evresini geçirmiģ olurlar. Bu evreden sonra birbirini takip eden iki mitotik bölünmeden oluģan mayoz bölünmelerden ibaret olan olgunlaģma evresi baģlar. Primer spermatositlerde birinci mitoz bölünme sonucunda sekonder spermatositler, sekonder spermatositlerden de ikinci mitoz bölünme sonucu haploid kromozom içeren spermatidler Ģekillenir. Böylece spermatositogenezis dönemi tamamlanmıģ olur. Mayoz bölünmenin tamamlanmasından sonra spermiyogenezis baģlar ve spermatidler baģkalaģma evresine girer. Spermatidler çekirdek ve stoplazmalarında görülen birseri değiģiklikler sonucu o türe özgü biçimlerini kazanarak, spermatozoaya dönüģürler, bu süreç de yaklaģık 22 gün sürer( Evans ve Maxwell, 1987, Gökçen,1990; Hassa ve AĢtı, 2003)
11 1.2.7. Sperma Verimi ve Spermatolojik Özellikler Tekelerde sperma üretimini değerlendirmek için pek çok çalıģma yapılmıģtır. Bu çalıģmalar sonucu elde edilen verilere göre testis baģına günlük spermatozoa üretimi 2,76x 10⁹ ile 7,23x 10⁹ arasında çeģitlilik göstermektedir. Üreme mevsimi içinde alınan spermalar sezon dıģı alınan spermalara oranla daha fazla seminal plazma içermektedir ve çözüm sonu değerleri açısından seminal plazma miktarı ile içerdeği motil hücre sayısı arasında negatif korelasyon vardır. Bu da bize, ancak üreme sezonu içinde alınan spermalarda bulunan vesikular sekresyonun, teke spermasının dondurulması için negatif etkisi olan bulboüretral sekresyonun etkisini kısmen azalttığını göstermektedir( Leboeuf ve ark., 2000). Genel olarak yaģ, mevsim, sperm alan kiģinin teknik becerisi, yönetim, sperm alma yöntemi, sperm alma sıklığı, tekenin mizacı ve ve kondüsyonuna göre sperm miktarı değiģebilir( Aral ve Aral, 2004; Ġnce ve Karaca, 2009). Tekelerde ejakülat miktarı az olurken spermatozoa yoğunluğu yüksektir. Sperma kıvamı diğer etkiler yanında daha çok spermatozoa sayısına bağlı olarak sulu kıvamdan koyu kıvama kadar değiģir. Teke sperması beyaz, krem, ya da açık sarı renktedir. Teke sperması kimi araģtırıcılarca (Eaton ve Sımmons., 1952) 0,7-2,0 ml olarak belirtilirken, kimi araģtırıcılara (Ewans ve Maxwell, 1987) göre de tekelerde sperma miktarı 0,5-1,5 ml arasındadır. Khalili ve ark.(2009) Markhoz tekeleriyle yaptıkları çalıģmada sperma miktarını 1,11 ml olarak bildirmiģtir. Spermatozoa yoğunluğu 1,5x 10⁹- 5x 10⁹/ ml arasındadır. Spermatozoa motilitesi genelde % 75 den yüksektir. Teke sperması koç spermasına göre donmaya karģı daha dayanıklıdır (Kulaksız, 2009). 1.2.8. Tekelerde Dölermenin Hormonal Mekanizması Reprodüksiyonun hormonal mekanizmasında görev alan en önemli hormon melatonindir (Hafez, 1987).
12 Tekelerde spermatogenezis yıl boyu devam etmesine rağmen, gün ıģığının azalmaya baģlamasıyla birlikte seksüel aktivite önemli ölçüde artar. Hayvanlarda melotonin sekresyonu karanlığın baģlaması ile aktive olmakta, ıģık veya aydınlık karģısında aktivasyon sona ermektedir (Emre, 1993). Gün ıģığının azalması, epifizden (pineal bez) melatonin salgılanmasını arttırır. Melatonin direkt olarak hipotalamusa etki ederek buradan gonodotropinlerin salgılanmasını tetiklemektedir. GnRH da adenohipofiz bezini etkileyerek FSH ve ICSH salınımını uyarmaktadır. ICSH testisteki Leydig hücrelerinden testesteron salgılanmasını sağlarken, FSH ise Sertoli hücreleri ve germinal epitel üzerine etki ederek ABP ve inhibin hormonlarının salgılanmasını sağlamaktadır. ABP, testesteronun tubulus seminiferuslar içine alınması ve buradaki konsantrasyonunun yükseltilmesi için görev yapar. Böylece spermatogenezis için gerekli olan testesteron tubuller içinde ve germinatif hücrelere alınmıģ olur. Hormon sekresyonu ve reprodüktif faliyetlerin kontrolü hipotalamohipofizeal-testiküler aksis adı verilen bir mekanizma ile sağlanmaktadır (Hafez, 1987; Ak, 1996, YavaĢ, 2008). Üreme mevsimi dıģında gün uzunluğuna bağlı gonadotropin salınımında bir azalma olmasına rağmen, spermatozoa ve androjen üretimi için yeterli düzeyde gonadotropin üretimi gerçekleģmektedir. Yine de bu dönemde testis büyüklüğünde, spermatozoa üretiminde ve fertilitede düģmeler olmaktadır (Evans ve Maxwell, 1987; Kulaksız, 2009). 1.2.9. Teke Spermasının Kısa Süreli ve Dondurularak Uzun Süre Saklanması Spermanın +5 C de kısa süreli saklanması iģlemi, spermanın dondurulması esnasında geliģen kristalleģmenin yarattığı ozmotik ve mekanik stresin etkilerini gidermekte, donma iģlemine nazaran membran fosfolipitleriyle tepkime veren serbest radikallerin oluģum oranını belirgin oranda düģürerek serbest radikal kaynaklı yıkımı hafifletmekte, fakat önleyememektedir( Bucak ve Tekin., 2007) Teke sperması 2 ile 15 C lerdeki sıcaklıklar arasında kısa süreli saklanabilir. 4-5 C (buzdolabı sıcaklığı) ise tercih edilen ve kısa süreli saklama için en uygun sıcaklıktır. Teke spermasının kısa
13 süreli saklaması amacıyla, ihtiyaç duyulan sulandırıcılarla ilgili olarak sistematik herhangi bir araģtırma yürütülmemiģ olsa bile, bir çok sulandırıcı fertilite ve laboratuar testlerinden geçirilmiģtir. Bu güne kadar teke spermasının kısa süreli saklanmasında kullanılan sulandırıcılar: fizyolojik tuzlu su, sodyum sitrat yumurta sarısı, sodyum sitrat fruktoz yumurta sarısı, yumurta sarılı veya yumurta sarısız yağlı, yağsız veya bileģenleri ayarlanmıģ süt yanında, ticari olarak Cornell University Extender (CUE), Spermasol, Dilopten, Neoseminan, Illini Variable Temperature (IVT) gibi sulandırıcılarda kullanılmaktadır ( Leboeuf ve ark., 2000; Kulaksız ve DaĢkın, 2007) Kısa süreli saklamada, seminal plazma ile yumurta sarısı arasındaki olumsuz etkileģimin azaltılması için sulandırıcıdaki yumurta sarısı oranının azaltılması da uygun bir çözüm olabilir. Roca ve ark. (1997) teke spermasının kısa süreli saklanmasında, yıkanmamıģ spermanın kullanıldığı grupta sulandırıcıdaki yumurta sarısının oranını %12 den %2 ye çektiklerinde, yıkanmıģ sperma ile yıkanmamıģ sperma arasında gebelik oranları bakımından önemli fark saptayamamıģlardır (%70,3, %73,5). Eppleston ve ark. (1994) yapmıģ oldukları çalıģmada, 5 C tris -fruktoz -yumurta sarısı (%2) içeren sulandırıcıda, en az 8 gün boyunca spermatozoonların fertilizasyon yeteneklerini koruduklarını bildirmiģlerdir( Kulaksız ve DaĢkın, 2007). Spermanın dondurulması için kullanılan sulandırıcılar buffer, karbonhidrat(glukoz, laktoz, rafinoz, sükroz ve trehaloz), tuz( sodyum sitrat, sitrik asit) yumurta sarısı ve antibiyotik içerir (Evans ve Maxwell, 1987; Tonieto ve ark. 2010). Teke spermasının ilk kez Smith ve Polge (1950) tarafından dondurulmasından ve dondurulmuģ çözdürülmüģ teke spermasının pratik uygulamalar için yetersiz olduğunun Barker (1957) tarafından belirtmesinden bu yana, birçok araģtırmacı teke spermasının dondurulmasına iliģkin araģtırmalar yapmıģtır. Ġlk zamanlarda, teke spermasını dondurmak amacıyla çoğunlukla boğalar için geliģtirilen sulandırıcılar denenmiģtir. Belirtilen fertilizasyon sonuçları ise yetersiz (% 3-15), orta (% 20-48) ve güvenilir (%70) düzeylerde olmuģtur. (Leboeuf ve ark., 2000; Kulaksız ve DaĢkın, 2007).
14 Teke spermanın saklanması, özellikle de dondurulması, spermatozoada, yapısal, biyokimyasal ve fonksiyonel hasara neden olur. Bunun sonucu olarak, motilite ve canlılıkta kayıp görülür. Motilite ve canlılıktaki kayıplar fertilite oranını etkiler. Bu nedenle dondurulmuģ spermanın fertilitesi, taze spermanınkinden daha düģüktür. (Purdy, 2006; Kulaksız, 2009). 1.2.9.1. Teke Spermasını Dondurma Yöntemleri Spermanın baģlıca dondurulma yöntemleri Ģunlardır (Ak, 1996): 1) Ampul yöntemi: Kuru buz ve etil alkol kullanılarak cam veya plastik ampullerde dondurma yöntemidir. 2) Pellet Yöntemi : -79 C deki kuru buz diskleri üzerine ufak oyuklar açılarak yapılır. Bu çukurlara 0,1 ml kadar sperma damlatılarak dondurulur. 3) Mini-Tüp Tekniği: Mini-Tüpler içinde sıvı azot buharında dondurulan spermalar sıvı azotta saklanmaktadır. 4) Payet yöntemi: Günümüzde kullanılan en yaygın ve pratik dondurma yöntemidir. Sperma 0,25 veya 0,5 ml hacimli payet denilen plastik çubuklara çekilip ağzı kapatılarak sıvı azot buharında dondurulup sıvı azotta saklanmaktadır. Payet yöntemi Mini- Tüp e göre günümüzde daha yaygın bir kullanım alanı bulmuģtur. Çözdürme sonrası canlılık ve fertilite oranlarına bakıldığında pelet yönteminin payete göre daha iyi sonuçlar vermesine( Ritar ve ark.,1990; Ritar ve Ball, 1991) ve payet yönteminin daha fazla zaman almasına rağmen( Corteel, 1981) tercih edilen yöntem payet Ģeklinde dondurmadır. Çünkü bu yöntem sperma miktarının en doğru Ģekilde belirlenmesini sağlamaktadır( Leboeuf ve ark., 2000; Kulaksız ve DaĢkın, 2007). 1.2.9.2. Teke Spermasının Dondurulmasında BaĢarıyı Etkileyen Faktörler Spermatozoadaki membransel yapılar( plazma membranı, dıģ akrozomal membran, mitokondri memranı) donma/çözünme iģlemine karģı son derece duyarlıdır. Membran yapıları akıcı mozaik tarzında düzenlenmiģ protein, glikoprotein ve
15 glikolipidlerle bezeli iki sıralı fosfolipid katmanından oluģmuģtur. Bu yapıların termodinamik özellikte ve yüzeyde 65-70 oranında doymamıģ fosfolipitlerden( yağ asidi) oluģması, membranların soğutulmalarının sonucu olarak geri dönüģümsüz faz değiģimine, sıvı fazdan jel fazına geçmesine neden olmaktadır (Watson, 2000; Uysal ve Bucak, 2009). Spermanın dondurularak saklanması iģlemi dondurma tekniği, sulandırıcı kompozisyonu, sulandırma ve dondurma oranı ayrıca çözdürme metodu gibi birbiriyle doğrudan iliģkili olan pek çok faktör içeren karıģık bir iģlemdir. Dondurma iģlemi sırasında pek çok hücrenin zarar gördüğü bilinen bir gerçektir. OluĢan bu zarar suni tohumlama sonrasında hücrelerin canlılıklarını, yaģayabilirliklerini, fertilizasyon yeteneklerini azaltmaktadır (Zhang XG ve ark, 2007). Dondurarak saklama iģleminde zarara neden olan faktörler soğuk Ģoku, buz kristal formları, oksidatif stres, membran değiģiklikleri, kriyoprotektan toksikasyonu ve osmotik değiģikliklerdir. Bu nedenle sulandırıcının kompozisyonu, uygun kriyoprotektanlar ve optimum dondurma ve çözdürme oranları spermanın dondurularak saklanmasında önemli faktörlerdir( Farshad ve ark., 2009). Spermanın dondurulması iģleminde sıcaklığın 15 C den 4 C ye düģmesi esnasında meydana gelen soğuk Ģoku ve sonucunda oluģan dondurma zararı sebebiyle spermanın kalitesinde azalma olur. Diğer etkilerle birlikte bu sonuçlar ileri doğru hareket eden motil hücre sayısının azalmasından ve membran bütünlüğünün kaybolmasından kaynaklanmaktadır. Dondurulup çözdürülen spermanın kapasitasyonunu tamamlayabilmesi için diģi genital kanalında geçirebileceği zaman, fertilizasyon yeteneği azalmıģ embriyonik kayıplar artmıģ olur( Maxwell and Salamon, 1993; Bucak and Tekin, 2007; Pesch ve Hoffman, 2007; Çoyan ve ark., 2010). DeğiĢik memeli ırklarına göre, tüm hücrelerin donma stresine karģı dayanabilme gücü benzerlikler gösterse de; spermatozoanın donmaya karģı direnci farklılık göstermektedir. Her tür, spermatolojik özelliklere bakıldığında, donma kabiliyetinde de etkili olan spermatozoa büyüklüğü, Ģekli ve yağ kompozisyonu bakımından büyük farklılıklar taģır ve bu da spermayı dondurmak için seçilecek olan sulandırıcının
16 kompozisyonunun ırk özelliklerine uyumlu olması gerekliliğini doğurur(purdy, 2006; Tuncer, 2010). Spermanın kryopreservasyonunda spermatozoon sulandırıcının değiģik komponentlerinden de önemli ölçüde etkilenirler. Yumurta sarısının etkileri sulandırıcı bufferının kompozisyonuna bağlı olarak değiģir( Santiago ve Moreno, 2006). Örneğin boğa ve teke sperması için kullanılacak sulandırıcılar benzerlik gösterir fakat teke sperması için seminal plazmada bulunan bulboüretral sıvı ile yumurta sarısının etkileģimi spermatozoa üzerinde toksik etki yaratırken böyle bir etki boğa, domuz ya da koç sperması için sözkonusu değildir ( Purdy, 2006; Tuncer ve ark., 2010). Keçi spermasının saklanmasındaki en önemli problem, spermatozoanın canlılığı üzerine seminal plazmanın zararlı etki göstermesidir. Yumurta sarısı spermanın dondurulması ve çözdürülmesi sırasında spermatozoayı soğuk Ģokunun zararlı etkisinden korur. DüĢük konsantrasyonda yumurta sarısı teke spermasının dondurulmasında önerilmektedir( Peterson ve ark., 2007). Ancak yüksek konsantrasyonda yumurta sarısı teke spermasında akrozom bütünlüğünün önemli ölçüde bozulmasına ve çözdürme sonrası spermatozoa motilitesinin düģmesine yol açar( Santiago ve Moreno, 2006). Yumurta sarısı içeren sulandırıcılarla iliģkilendirilen keçi spermasının dondurulmasındaki probleme bulbouretral bez tarafından salgılanan bir fosfolipazın neden olduğu bildirilmektedir. Fosfolipaz aktivitesinin spermatozoaya zararlı etkisi ya spermatozoa membran fosfolipidlerinin hidrolizine neden olmasından ya da yumurta sarısı fosfolipidlerinin toksik derivativ üretiminden kaynaklanmaktadır (Coloma ve ark, 2010). Seminal plazmada yer alan, yumurta sarısı koagule edici özellik taģıyan enzim olan yumurta sarısı koagüle edici enzim (EYCE), yumurta sarısı fosfatidilkolinini (veya lesitini) yağ asiti ve lisofosfatidilkoline (veya spermisidal lisolesitine) hidrolize eden (Alvarez ve Storey, 1983) fosfolipaz A olarak identifiye edilmiģtir( Leboeuf ve ark., 2000; Kulaksız ve DaĢkın, 2007; Xu ve ark., 2009). Lisofosfatidilkoline biyomembranlar üzerine deterjan etkilidir ve teke spermatozoonu için toksiktir ( Peterson ve ark., 2007). Ayrıca tekede bulbouretral bez (SBUIII) kaynaklı glikoprotein 60 (BUSgp60), teke spermatozoasında hasara yol açan triasilgliserol hidrolaz aktivitesine sahiptir ve teke spermasının hareket kalitesinin bozulmasına, akrozom hasarına,
17 spermatozoanın ölümüne, spermatozoa motilitesinin düģmesine neden olur. Glikoprotein 60, spermatozoanın plazma membran trigliseridleri ve süt bazlı sulandırıcı içeriğindeki trigliseridlerle interaksiyona girerek spermatozoanın in vitro canlılığını baskılar Vesiküler bez sekresyonları spermatozoaya koruyucu etki gösterirken, Bulbouretral salgılar (BUS) % 26.7 oranında prematüre akrozom reaksiyonuna neden olmaktadır. Bir monomeric 55 60 kda N-glycosyl-protein olarak identifiye edilen BUSgp60 heparin affinitesi gösterir. Ayrıca triasilglyserol hyrolaz aktivitesi ve aminoasit sıralaması ile pankreatif lipaza benzer. Süt proteinleri (kazein, laktoglobulin) BUS lipazının enzimatik aktivitesini artırır. Süt sulandırıcısındaki süt trigliseridleri hidrolize olarak oleik asit ve palmitik asit oluģur. Böylece spermatozoon için toksik yağ asitleri salınır ( Leboeuf ve ark, 2000; Dorado ve ark., 2007). Teke spermasının dondurulmasında özellikle seminal plazmanın uzaklaģtırılması durumunda reaktif oksijen türlerinin neden olduğu lipid peroksidasyonun önlenebilmesi için antioksidan maddelerin katılması önerilmektedir. Reaktif oksijen türlerinin fizyolojik konsantrasyonları spermatozoanın akrozom reaksiyonu ve fertilizasyon yeteneğinin korumasında önemli rol oynamaktadır. Ancak yüksek konsantrasyonları spermatozoon için zararlı etki oluģturduğundan antioksidan maddelerin spermanın sulandırılmasında kullanılmaktadır. Seminal plazmada doğal olarak bulunan bu antioksidanlar spermanın in vitro maniplasyonları sırasında ya da spermanın yıkanması sonucu yeterli gelmemekte ve trehaloz, butilated hydroxytoluene (BHT) ya da β-cyclodextrin, sisteamin, hipotaurin, taurin gibi antioksidan özellikte maddeler sperma sulandırıcılarına katılmaktadır( Khalifa ve El-Saidy, 2006; Bucak ve ark. (a), 2009). Kolesterol, kapasitasyona yol açan kolesterol çıkıģı ve membran stabilzasyonuna yardım ettiği için plazma membran geçirgenliğini düzenleyen önemli bir faktördür. Kolesterol fosfolipid oranı daha düģük olan koç ve boğa spermatozoasına göre soğuk Ģokunun zararlı etkilerine daha dirençlidir. Kryopreservasyon plazma membranından kolesterol tüketimine yol açar. Plazma membranından kolesterolün kaybı süresince diģi dölerme organlarında kapasitasyon gerçekleģir. Dolayısıyla dondurma-çözdürme iģlemleri sırasında kolesterol kaybının
18 baģlaması erken kapasitasyon ve premature akrozom reaksiyonuna neden olur. Sperma sulandırıcılarına kolesterol yüklenmiģ siklodekstrinin ilavesi plazma membranının stabilitesini ve direncini artımaktadır. ( Fardin ve ark, 2010). Bovine serum albumin (BSA) de geniģ bir protein molekülüdür ve reprodüktif sistem sekresyonlarında bulunur. Koç spermasında çözdürme sonrası spermatozoa motilitesini artırmaktadır. Kolesterol ve BSA en iyi membran koruyucular olarak teke spermasının kryopreservasyonunda sperma sulandırıcılarına katılmaktadır( Fardin ve ark, 2010). Keçilerde suni tohumlama üzerine yapılan araģtırma ve çalıģmalar diğer çiftlik hayvanlarına göre daha azdır. 1950 li yıllardan sonra gerek ülkemizde gerekse dünyada çeģitli bilimsel araģtırmalar yapılmıģ ve halen de yapılmaya devam etmektedir. Ancak keçilerde yapılan suni tohumlama çalıģmalarından istenilen düzeyde bir baģarı elde edilememiģtir. Özelikle de dondurulmuģ spermayla yapılan suni tohumlamalardan elde edilen baģarı oranı düģüktür( Kulaksız ve DaĢkın, 2007). Keçilerde dondurulmuģ sperma ile yapılan suni tohumlamalarda dölverimi % 3-70 arasında değiģirken, Ankara keçilerinde tek tohumlamada % 43.3, çift tohumlamada % 40.6 (60 ve 120 10 6 /tohumlama dozu) bulunmuģtur. KaĢmir keçilerinde servikal tohumlamadan sonra % 33.3-39.1 gebelik oranı elde edilmiģtir. Taze spermayla karģılaģtırıldığında dondurulmuģ spermayla yapılan servikal tohumlamalardan elde edilen fertilite daha düģüktür. Spermatolojik parametreler fotoperiyoddan etkilenerek sezonal varyasyonlar gösterir. Sperma kalitesi üreme mevsimi süresince gün uzunluğu azaldıkça artar. Üreme mevsiminde alınan spermanın dondurulup çözdürülmesi sezon dıģındakinden daha iyi sonuç vermektedir. Üreme mevsiminde dondurulmuģ spermalarla sütçü keçilerden elde edilen kuzulama oranı % 53.0 olurken, mevsim dıģı dondurulmuģ spermalardan alınan oran % 61.0 kaydedilmiģtir. Gebelik oranlarındaki bu geniģ varyasyon ve spermanın bireysel olarak dondurulabilirliğindeki farklılık bazı tekelerin spermatozoa membran biyokimyasal ve biyofiziksel yapılarının soğuk Ģokundan diğerlerine göre daha fazla etkilenmesinden kaynaklanmaktadır ( Gacitua ve Arav, 2005).
19 Teke spermasının dondurulm masını etkileyen faktörler, 1- Spermasının dondurulmasında infertil ya da damızlık değeri olmayan erkeklerin kullanılması, 2- Seminal plazmanın ayrılmıģ olup olmadığı, yıkama yöntemi, yıkamada kullanılan yıkama solüsyonunun içeriği, yıkamanın yoğunluğu (sulandırma oranı ve santrifüj sayısı), 3- Dondurmada kullanılan sulandırıcının içeriği ve yumurta sarısının olup olmaması 4- Sulandırmanın yöntemi, gliserolün eklenmesi ve konsantrasyonu, 5- Dondurmadan önce, ekilibrasyonun uygulanıp uygulanmaması ve süresi, 6- Mini (0.25ml) veya orta boy (0.50ml) payet veya pelet yöntemi ile dondurma teknikleri, 7- DondurulmuĢ spermanın çözdürülmesi, Ģeklinde sıralanabilir( Leboeuf ve ark., 2000; Kulaksız ve DaĢkın, 2007). 1.2.9.3 Teke Spermasının Sulandırılması ve Sulandırma Oranı Spermanın dondurulup çözdürülmesi sonrası intraservikal suni tohumlamada baģarıya ulaģmak için yeterli sayıda ve özellikte spermatozoanın servikal bariyeri geçmesini sağlayacak sulandırıcılara ve sulandırma yöntemlerine ihtiyaç vardır. DüĢük sulandırma oranlarında soğuk Ģokunun olumsuz etkileri, sulandırıcıdaki kriyoprotektif maddelere, oranlarına, sulandırma ve soğutma tekniklerine göre değiģmektedir( Bacınoğlu ve ark., 2007). Teke spermasının sulandırılması bir ya da iki aģamada yapılabilmektedir. Ġki aģamalı sulandırmada, spermanın tekeden alımından sonra kriyoprotektan içermeyen sulandırıcıyla, final sulandırma oranının yarısıyla sulandırılmakta ve daha sonra 5 C ta üzerine kriyoprotektan içeren sulandırıcı ile ilk sulandırıcı miktarı kadar eklenerek final sulandırma iģlemi gerçekleģmektedir. Ġki aģamalı sulandırmanın diğerine bir üstünlüğü olmadığı bildirilmiģtir. Tek aģamalı sulandırma, sulandırıcı hazırlama ve
20 spermanın sulandırılması iģlemini kolaylaģtırması bakımından tercih edilmektedir (Evans ve Maxwell, 1987; Kulaksız, 2009 ). Spermanın sulandırma oranı, optimum tohumlama dozunun eldesinde önemli olmaktadır. Sulandırma iģlemi 1:1-1:23 (sperma: sulandırıcı) oranlarıyla yapılabilmektedir (Purdy, 2006). Bazı araģtırıcılar da baģarılı dondurma ve fertilite oranının ml de 80-500 x 10⁶ oranında spermatozoaya sahip numunelerden elde edildiğini bildirmiģlerdir (Ritar ve Salomon, 1983; Ritar ve ark., 1990). Servikal tohumlamada kullanılacak dondurulmuģ çözdürülmüģ spermanın bir tohumlama dozunda yaklaģık 200 x 10⁶milyon, serviks aracılığıyla intrauterin tohumlamada 60 x 10⁶ milyon, laporoskop tohumlamada ise 20 x 10⁶ milyon motil spermatozoa olması gerektiği belirtilmektedir( Leboeuf ve ark., 2000; Kulaksız ve DaĢkın, 2007). 1.2.9.4. Teke Spermasının Dondurulmasında Kullanılan Sulandırıcılar ve Kriyoprotektanlar Spermatozoa natif spermada uzun süre canlı kalamadığından kullanılan sulandırıcıların bazı temel özellikleri taģıması gereklidir. Buna göre sulandırıcılar; Laktik asit oluģumuna bağlı ph değiģikliklerini telafi etmek için buffer rolü oynamalı, Ortamdaki elektolit dengesini ve optimum ozmotik basıncı devam ettirebilmeli, Spermatozoalar için besin ve enerji temin etmeli, Patolojik olanlar dahil mikroorganizmaların üremesini durdurabilmeli, Hızlı soğutma ve ısı Ģokuna karģı koruyucu olmalıdır( Kulaksız, 2009). Dondurulma iģlemi esnasında sperma sıcaklık düģüģünden kaynaklı pek çok strese maruz kalmaktadır( Watson, 2000). Fakat türler arasında, spermatozoa plazma membranındaki farklılıklardan dolayı dondurma iģleminin neden olduğu stresle baģaçıkabilme yeteneği bakımından farklılıklar vardır( Holt, 2000). Bu nedenle de
21 dondurma iģlemi esnasında kullanılacak sulandırıcının kompozisyonu, seçilen krioprotektan, krioprotektan oranı ve izlenecek olan protokol bakımından türlere özgü farklılıklar olmalıdır ve tüm türleri kapsayan hiçbir uluslararası protokol bulunmamaktadır( Bucak ve Tekin, 2007; Uysal ve Bucak, 2009; Moce ve Vicente, 2009). Çoğunlukla sperma sulandırılırken iso-osmotik sulandırıcıların kullanılmasına karģın son çalıģmalar göstermektedir ki hipertonik sulandırıcılar memeli spermaları için canlı spermatozoa oranı ve akrozom bütünlüğü açısından daha iyi sonuçlar vermektedir( Yildiz ve ark., 2000; Farshad and Akhondzadeh, 2008; Khalili ve ark., 2009). Sulandırıcılarda ozmotik basınç ve hidrojen iyon konsantrasyonunu ayarlamak için sitrat (2,9-trisodyum sitrat dihidrat), tris (hidroksimetil aminometan), sitrik asit ve fosfat gibi tampon maddeleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Trisin etkin tamponlama yönünün belirlenmesi ile birlikte bu madde hem 0-5 C de sıvı formda, hem çevre sıcaklığında, hem de dondurarak saklama yöntemleri için hazırlanan sulandırıcılarda geniģ bir kullanım alanı bulmuģtur ( Salamon ve Maxwell 2000; Foote, 2002; Valente ve ark., 2010). Ayrıca trisin hücre içine nüfus ederek potasyum (K) alımını düģürdüğü ve bu sayede yüksek oranda K un soğutma esnasında spermatozoa üzerindeki olumsuz etkilerini azalttığı kabul edilmektedir. Yağsız süt ürünleri de sulandırıcılar için buffer özelliğine sahiptir. Süte dayalı sulandırıcılarda bulunan laktoz fark edilebilir oranda spermatozoa tarafından metabolize edilemez. Ancak sulandırıcılarda laktoz kullanıldığında tampon madde gerekli değildir (Kulaksız, 2009). Sulandırıcıya eklenen Ģeker spermatozoa tarafından, hücrenin motilitesini ve hareket edebilirliğini sağlayan glikolizis ve mitokondrial oksidatif fosforilasyon için enerji kaynağı olarak kullanılır( Kazhal ve ark., 2010; Malo ve ark., 2010) Ayrıca Ģekerler, sulandırıcıda ozmotik basınç oluģturarak hücre içinde dehidrasyona ve buz kristal formunun daha düģük oranda oluģmasına sebep olurlar( Purdy, 2006). Spermanın dondurulmasında kullanılan sulandırıcıda kriyoprotektif özellikli maddelerin bulunması gereklidir( Bucak ve Tekin, 2008). Kriyoprotektanlar (soğuk Ģokuna karģı koruyucu maddeler) hücrenin soğutulması, dondurulması ve çözdürülmesi esnasında geliģen fiziksel, kimyasal ve oksidatif stresi ve bunlardan doğan ısı
22 Ģokunu, ozmotik değiģimi ve intaselüler kristal oluģumunu azaltmak amacıyla kullanılmakta, direkt olarak çözdürme sonrası spermatolojik parametreleri ve fertiliteyi etkilemektedir (Kulaksız, 2009). Kryoprotektanlar iģlevsel olarak iki gruba ayrılmaktadır. 1- Ġnternal kryoprotektanlar 2- External kryoprotektanlar Ġnternal özellikli kriyoprotektanların yanısıra, bazı eksternal kriyoprotektanların (sakkaritler, antioksidanlar, EDTA) hücre dıģında kriyoprotektif etki gösterdikleri son zamanlarda anlaģılmıģ, sperma sulandırıcılarında kullanılmaya baģlanmıģtır( Bucak ve Tekin, 2008). Eksternal kriyoprotektanların (hücreye penetrasyon özelliğine sahip olmayanlar) ekstrasellüler etkilerinden dolayı, hücre membranındaki esneklik kaybını önledikleri, membran proteinlerinde stabilizasyon sağladıkları, ekstrasellüler ortamda geliģen kristalizasyonu azalttıkları ve geliģen lipit peroksidasyonunu minimize ettikleri bilinmektedir( Bucak ve Tekin, 2008; McClean ve ark, 2008). Yumurta sarısı da günümüzde sperma sulandırıcılarının sık kullanılan bileģenlerinden biridir. Yapılan çalıģmalarda diğer bileģenlerle de iliģkili olarak plazma membranını ve akrozom bütünlüğünü, sıcaklık değiģiminin neden olduğu zararlara karģı koruduğu gözlenmiģtir. Yumurta sarısında bulunan fosfolipidlerin, kolestrolün ve düģük yoğunluklu yağların spermatozoaları dondurma ve çözdürme iģlemi esnasında soğuk Ģokuna karģı koruduğu düģünülmektedir( Kulaksız ve ark., 2010). 1.2.9.5. Teke Spermasının Çözdürülmesi Çözdürme sonrası en iyi motilite ve fertiliteyi elde etmek amacıyla, çeģitli çözdürme sıcaklıkları ve süreleri önerilmektedir. Payet veya pelet Ģeklinde dondurulmuģ spermanın 37 C de çözdürülmesi kabul edilebilir fertilite sonuçları vermiģtir. Deka ve Rao (1987) da, yaptıkları çalıģmada, en iyi sonucu 37 C de almıģlardır. Andersen ise (1969) 75 C de 10 saniyede çözmenin 37 C de 30 saniyede çözmekten daha iyi
23 sonuç verdiğini belirtmiģtir. Tuli ve ark., (1991) Boer keçilerinin kullanıldığı çalıģmada, payetlerin 70 C de 7 saniyede çözülmesinin hem 37 C de 2 dakikada hem de 40 C de 20 saniyede çözmekten üstün olduğunu bulmuģlardır. Fakat saha koģullarında yapılan suni tohumlamada 37 C de 30 saniyede çözmenin daha uygun olduğuna dikkat edilmelidir. Böylece çözülmüģ spermanın aģırı ısınmasının önüne geçilmiģ olur. Pelet Ģeklinde dondurulmuģ sperma, çözdürme solüsyonu içeren deney tüplerinde 37 C de 30 saniyede çözdürülür. (Leboeuf ve ark., 2000, Kulaksız ve DaĢkın, 2007). Bu çalıģma ile, Kilis tekesi spermasının spermatolojik özelliklerini saptamak ve glukoz içeren Tris sulandırıcısına glukoz yerine farklı konsantrasyonlarda sukroz ilave edġlerek, Kilis tekesi spermasının, çözdürme sonrası spermatolojik parametrelerin in vitro muayenesiyle dondurulabilirliğinin ortaya konması amaçlandı.
24 2.GEREÇ ve YÖNTEM 2.1. Hayvan Materyali Bu çalıģmada, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Eğitim, AraĢtırma ve Uygulama Çiftliği nde bulunan 4 yaģ ve üzerindeki 3 adet Kilis tekesi kullanıldı. 2.2. Hayvanların Bakım ve Beslenmesi ÇalıĢmada kullanılan Kilis Tekeleri, çalıģma boyunca Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Eğitim, AraĢtırma ve Uygulama Çiftliği nde küçük baģ hayvan ünitesinde barındırıldı. Tekelerin bakım ve beslenmeleri bağlı bulunduğu kuruluģ tarafından gerçekleģtirilmiģ olup tekeler çalıģma öncesinde sağlık kontrolünden geçirildi ve sağlıklı olan tekelerden yararlanıldı. 2.3. Spermanın Alınması ve Değerlendirilmesi Spermalar suni vajene sperma vermeye alıģkın 3 adet Kilis tekesinden, üreme mevsimi sonuna doğru, diģi varlığında suni vajen ile alındı. Sperma alma iģleminde fantom olarak arama tekesi ile kızgınlığı tespit edilmiģ keçiler kullanıldı. ÇalıĢmada, her bir tekeden 2 olmak üzere toplam 6 ejakülat alındı ve spermaların makroskobik ve mikroskobik muayeneleri yapıldı. Makroskobik muayenelerden spermanın rengi ve kıvamı, ejakülat miktarı ve spermanın ph değerine bakıldı. Spermanın mikroskobik muayenelerinde spermatozoa motilitesi, spermatozoa yoğunluğu, anormal spermatozoa oranı, akrozom bozukluğu, ölü spermatozoa oranı, belirlendi ve kaydedildi.
25 Resim 2.1. ÇalıĢmada Kullanılan Kilis Tekeleri 2.3.1. Makroskobik Muayene 2.3.1.1. Spermanın Rengi ve Kıvamı ÇalıĢmada kullanılacak spermalar toplama kadehinden rengine ve kıvamına bakılarak koyu krem ve kıvamlı (sulu olmayan) ejakülatlar seçildi. 2.3.1.2. Sperma Miktarı Tekelerden alınan ejakülatlar sperma miktarının belirlenmesi için derecelendirilmiģ toplama kadehi üzerinden okunarak mililitre (ml) olarak saptandı.
26 2.3.1.3. Spermanın ph Değeri Sperma numunelerinin ph değerleri 5,5 9,0 (Merck) arasında renk skalası bulunduran ph indikatör kağıdı ile belirlendi. 2.3.2. Mikroskobik Muayene 2.3.2.1. Spermatozoa Motilitesi Ġleri doğru, güçlü hareket eden spermatozoaların, hareketsiz veya diğer hareket biçimi gösteren spermatozoalara oranı olarak ifade edilen spermatozoa motilitesi; spermanın lam üzerindeki küçük bir damlası üzerine lamel kapatılarak, faz-kontrast ısıtma tablalı mikroskopta x200 büyütmede en az 3 değiģik mikroskop sahasında muayene edildi ve yüzde (%) olarak kaydedildi. Spermatozoa motilitesi, bir yönde ve güçlü hareket eden spermatozoaların, hareketsiz veya diğer hareket çeģidi gösterenlere oranı olarak tanımlanmakta ve motil spermatozoaların dölleme güçleri olduğu bilinmektedir (Tekin, 1990). Bunun için özellikle sun i tohumlama çalıģmalarında ve yetiģtiricilikte erkek damızlıklardaki spermatozoa motilitesinin saptanmasının önemi büyüktür (DaĢkın, 1991). Motil spermatozoonların spermadaki sayıları, toplam spermatozoa içindeki yüzde oranlarıyla hesaplanabilir (Tekin, 1990). Spermatozoaların hareket biçimleri ve hızlarının hayvan türlerine göre değerlendirilmesi gerektiğini bildiren Tekin (1990), koç ve teke ejakülatlarında spermatozoa motilitesinin % 90 olduğunu belirtmektedir (YavaĢ, 2008). 2.3.2.2. Spermatozoa Yoğunluğu Bir mililitre spermadaki spermatozoa sayısını ifade eden spermatozoa yoğunluğunun hesaplanmasında, hemositometrik yöntem kullanıldı (Tekin, 1994).
27 Nativ spermalardan alınan numunelerin sulandırılması için 5 ml Hayem solüsyonu içeren tüplerden 10 μlt solüsyon otomatik pipetle atılarak, 10 μlt sperma numunesi konuldu ve sperma 1/500 oranında sulandırılmıģ oldu. Thoma lamında sayılan sperma numunesinin aģağıda verilen formüle göre spermatozoa yoğunluğu hesaplandı. Spermatozoa Yoğunluğu = (10⁹/ml) Sayılan Hücre (Spermatozoa Sayısı) x1000 Sulandırma x Büyük Kare x Sayılan Oranı Hacmi (1/250) Kare Sayısı (10) Spermanın kullanılmasında ve değerlendirilmesinde ejakülat miktarı ve motilite yanında çok önemli bir spermatolojik özelliği oluģturan spermatozoa yoğunluğu, tohumlama dozunun ayarlanmasında ve spermanın sulandırılmasında çok büyük önem taģımaktadır (Gökçen, 1990; Özkoca, 1984; Sevinç, 1984; Tekin, 1990, YavaĢ, 2008). Özkoca (1984), yoğunluğu yüksek olan spermaların hafif asit, düģük olanların ise alkali reaksiyon verdiğini ve alkali özellikte olan spermaların genellikle kalite bakımından yetersiz oldukları gibi, döllenme yeteneklerinin de zayıf olduğunu bildirmiģtir. 2.3.2.3. Anormal Spermatozoa ve Akrozom Bozuklukları Sperma numunelerindeki anormal spermatozoa oranı sıvı fikzasyon yöntemi ile belirlendi. Anormal spermatozoa oranının belirlenmesinde; 0,5 ml Hancock solüsyonunda tespit edilen 1 damla sperma solusyonundan alınan 1 damla numune lam üzerine konularak üzerine lamel kapatıldı. Daha sonra sedir yağı damlatılarak immersiyon objektif (x1000 büyütme) altında 400 spermatozoa sayılarak anormal yapı gösterenlerin oranı yüzde (%) olarak belirlendi. Anormal spermatozoa içerisinde bulunan akrozom bozuklukları da ayrıca kaydedildi. Evans ve Maxwell (1987), spermatozoanın morfolojik muayenesinin sperma kalitesi yönünden ayrıntılı bir test olduğunu ve anormal spermatozoa oranının yüksek
28 olması durumunda, fertilite düģüklüğüne yol açabileceği, bu nedenle %15 ten fazla anormal spermatozoa ve % 5 ten fazla akrozom bozukluğu içeren spermaların suni tohumlamada kullanılmaması gerektiğini bildirmektedirler. 2.3.2.4. Ölü Spermatozoa Oranı Spermalardaki ölü spermatozoa oranını belirlemek için % 3 lük sodyum sitrat ile hazırlanmıģ, % 2 lik eosin boyası kullanıldı. Lam üzerine konulan bir damla spermanın yanına birkaç kat büyüklükte eosin boyası damlatıldı, lamel aracılığı ile karıģtırılarak froti çekildi ve hızla kurutuldu. Hazırlanan preparatlar mikroskopta x400 büyütmede 400 spermatozoa sayılarak değerlendirildi ve ölü spermatozoa oranı yüzde (%) olarak ifade edildi. Preparatların değerlendirilmesinde baģ kısmı kırmızı boya alan spermatozoalar ölü, baģ kısmı boya almamıģ spermatozoonlar canlı olarak değerlendirildi. Ölü spermatozoa oranınnı saptanması spermatolojik özellikler bakımından ancak tamamlayıcı bilgi vermektedir. Eğer, ölü spermatozoa oranı düģükse bu çok Ģey ifade etmez. Çünkü yerinde sallanan, çember hareket gösteren spermatozoalar da canlı spermatozoa özelliği gösterebilirler. Ayrıca boyama sonrası froti çekme sırasında ve frotinin kurutulması esnasında dikkatli olunmaması halinde ölü spermatozoa oranının artabiliceği göz önünde bulundurulmalıdır. Spermada genellikle % 25 in üzerinde ölü spermatozoa bulunması istenmeyen bir özelliktir (Tekin, 1990). 2.4. Spermanın Sulandırılması ve Sulandırıcı Grupları Tekelerden alınan ejakülatlardan makroskobik olarak normal ve motilitesi % 80 in üzerinde olanlar sperma toplama kadehlerinden otomatik pipet ile eģit miktarlarda alınarak önceden 37ºC lik su banyosunda bekletilerek ısıtılmıģ 4 deney tüpüne eģit olarak bölündü.
29 Spermaların sulandırılmasında Tris bazlı sulandırıcının Ģeker komponenti değiģtirilerek kullanıldı. ÇalıĢmada kullanılan sulandırıcının kompozisyonu ve oluģturduğumuz sulandırıcı grupları Ģu Ģekildedir: Kontrol: Grup 1: 3.63gr TRĠS 1.82gr Sitrik Asit 3.63 gr TRĠS 1.82 gr Sitrik Asit 0.5 gr Glukoz 60mM Sukroz %5 Yumurta Sarısı %5 Yumurta Sarısı %5 Gliserol %5 Gliserol Grup 2: Grup 3: 3.63 gr TRĠS 3.63 gr TRĠS 1.82 gr Sitrik Asit 1.82gr Sitrik Asit 80mM Sukroz 100mM Sukroz %5 Yumurta Sarısı %5 Yumurta Sarısı %5 Gliserol %5 Gliserol Önceden 37 C de bekletilerek ısıtılmıģ 4 deney tüpüne eģit oranda bölünen sperma uygun tohumlama dozunun elde edilebilmesi için 1:7 oranında dört farklı sulandırıcı ile sulandırıldı.
30 Alınan spermalar kademeli ve yavaģ Ģekilde otomatik pipet ile sulandırıldıktan sonra sulandırma iģleminin baģarılı olup olmadığını kontrol etmek amacı ile motilitelerine bakıldı. SulandırılmıĢ sperma numuneleri sulandırıcı gruplarına göre önceden belirlenmiģ farklı renklerde 0,25 ml lik payetlere çekildi ve payetlerin açık uçları payet kapatma makinesi ile kapatıldı. 2.5. Spermanın Dondurulması Kasetlere yerleģtirilen payetler +4 C de 2 saat ekilibrasyona bırakıldı ve ekilibrasyondan sonra payetler sıvı azot seviyesinin 4 cm üzerinde (-120 C ) sıvı azot buharında 15 dakikada donduruldu ve sıvı azota daldırılarak saklandı. Spermanın dondurması iģlemine dair dondurma oranlarıyla ilgili pek çok çalıģma yapılmıģtır. Hızlı dondurma protokolü ( 15-60 C/ dk) dondurma çözdürme iģlemi sonrasında en iyi spermatolojik özellikleri vermiģtir fakat hayvan türlerine göre en iyi ya da optimum dondurma protokolünün belirlenebilmesi için pek çok çalıģmaya ihtiyaç vardır ( Barbas ve Macarenhas, 2009). 2.6. Spermanın Çözdürülmesi ve Ġn Vitro Değerlendirilmesi DondurulmuĢ spermalar sıvı azot tankında 1 hafta muhafaza edildikten sonra su banyosunda 37 C de ve 30 saniye içinde her sulandırıcı grubundan 4 adet olmak üzere toplam 16 payet çözdürüldü ve çözüm sonu spermatolojik parametrelerden spermatozoa motilitesi, anormal spermatozoa oranı, akrozom bozukluğu ve ölü spermatozoa oranı yönüyle değerlendirildi. Koç ve teke spermaları genellikle 38-42 C/ 30 sn protokolüne göre çözdürülmektedir. Fakat yüksek derecelerde çözdürme protokolünün de( 60-75 C/ sn) çözüm sonu motilite, akrozom bütünlüğü ve spermatozoanın fertilite yeteneği bakımından sonuçları, uzun sürede çözdürme protokolü sonuçlarıyla benzerlik göstermektedir( Evans and Maxwell 1987).
31 2.7. Ġstatistiksel Analiz AraĢtırmada elde edilen verilerin ortalama değerleri ve standart hataları hesaplandı. Ġstatiksel analizler SPSS 14.0 (Lisans No: 9869264) paket proğramı ile yapıldı. Gruplar arasında farklılık olup olmadığını anlamak için tek yönlü varyans analizi (Anova) uygulandı. Analiz sonucunda farklılık bulunduğunda, farklılığı yaratan grupların tespitinde Duncan testi kullanıldı (Daniel, 1991).
32 3. BULGULAR 3.1. Nativ Spermalarda Spermatolojik Parametreler Kilis tekesinden alınan ejakülatlardan elde edilen spermatolojik parametrelerin ortalama ve genel ortalama değerleri Çizelge 1 de verildi. Üç tekeden alınan sperma numunelerinin baģlıca spermatolojik özelliklerinin değerlendirilmesi sonunda ortalama ejakülat miktarı 0,95± 0,1, 0,9±0,01, 1,05± 0,01 ml; spermatozoa motilitesi sırasıyla %87,50± 2,50, %80,00± 0,01 ve %85,00± 0,01; spermatozoa yoğunluğu 3,91x10⁹± 0,18, 4,16x10⁹±0,10, 3,73x10⁹±0,11; anormal spermatozoa oranı %26± 5,00, %29,5±2,50, %28,5± 0,50; akrozom bozukluğu %9,00±1,00, %10,00±0,01, %9,50± 0,50 ölü spermatozoa oranı %12,00± 1,00, %16,50±0,50, %16,00± 2,00; sperma ph sı 6,75±0,25, 6,50± 0,01, 6,50± 0,01 olarak bulundu. Genel ortalama ejakülat miktarı, spermatozoa motilitesi, spermatozoa yoğunluğu, anormal spermatozoa oranı, akrozom bozukluğu, ölü spermatozoa oranı ve spermanın ph değeri 0,96± 0,04; % 84,16± 0,84; 3,93x 10⁹± 0,13; % 28,00±2,66; % 9,5± 0,5; % 14,83± 1,16; 6,58± 0,09 olarak belirlendi. 3.2. Çözüm Sonu Spermatolojik Parametreler Sıvı azot tankında bir hafta muhafaza edilen payetler, ayarlanabilir dijital su banyosunda +37 C de ve 30 saniye içinde çözdürüldü ve spermatolojik parametreler de ğerlendirildi. Çözüm sonu spermatolojik parametrelerin ortalama değerleri Çizelge 2 de verildi.
33 3.2.1. Spermatozoa Motilitesi Çözüm sonu spermatozoa motilitesi kontrol (0,5 gr Glukoz), grup I (60 mm sukroz), grup II (80 mm sukroz) ve grup III de (100 mm sukroz) sırasıyla % 52,91 ± 1,81; % 49,58 ± 1,90; % 55,20± 1,65 ve % 58,75± 1,54 olarak bulundu. Yapılan istatiksel analiz sonucunda, grup ortalamaları arası fark önemli bulunmadı (P>0,05). ġekil 3.1: Çözüm sonu spermatozoa motilitesi. Spermatozoa motilitesi motilite % 58,75 52,91 55,2 49,58 Kontrol grubu Grup 1 Grup 2 Grup 3
34 3.2.2. Anormal Spermatozoa Oranı Anormal spermatozoa oranı; Kontrol, I, II ve III gruplarında sırasıyla; % 34,29 ± 0,88; % 29,70± 1,28; % 27,50± 1,33 ve % 24,75± 0,76 olarak kaydedildi. Anormal spermatozoa oranı yönüyle gruplararasında gözlenen farklılıklar önemli bulundu (P< 0,001). ġekil 3.2 :Çözüm sonu anormal spermatozoa oranı. Anormal Spermatozoa Oranı Anormal Spermatozoa Oranı(%) 34,29 29,7 27,5 24,75 Kontrol grubu Grup 1 Grup 2 Grup 3
35 3.2.3. Akrozom Bozukluğu Akrozom bozuklukları kontrol, I, II ve III gruplarında sırasıyla; %17,37± 0,19; %16,58± 0,27; %16,12± 0,15 ve %13,25 ± 0,29 olarak saptandı. Akrozom bozukluğu yönüyle grup ortalamaları arası fark önemli bulundu (P< 0,001). ġekil 3.3: Çözüm sonu akrozom bozukluğu. Akrozom Bozukluğu Akrozom Bozukluğu Oranı( %) 17,37 16,58 16,12 13,25 Kontrol grubu Grup 1 Grup 2 Grup 3
36 3.2.4. Ölü Spermatozoa Oranı Ölü spermatozoa oranı, kontrol, I, II ve III gruplarında sırasıyla; % 36,41± 0,52; % 37,91± 1,40; % 33,7 ± 0,78 ve % 32,62± 0,92 olarak bulundu. Ġstatiksel analiz sonucunda, grup ortalamaları arası fark önemli bulundu (P< 0,01). ġekil 3.4: Çözüm sonu ölü spermatozoa oranı. Ölü Spermatozoa Oranı Ölü Spermatozoa Oranı( %) 36,41 37,91 33,7 32,62 Kontrol grubu Grup 1 Grup 2 Grup 3