AĞIR METALLERİN SEBZELER ÜZERİNDE YARATTIĞI LİPİD PEROKSİDASYON DÜZEYİNİN BELİRLENMESİ HAZIRLAYAN ÖĞRENCİ:Umutcan YAĞAN 9-B DANIŞMAN ÖĞRETMEN:Rüçhan ÖZDAMAR 2005 İZMİR
İÇİNDEKİLER Serbest Radikal-Hidroksil Radikali...2 Hidroksil Radikali Reaksiyonları...2 Serbest Radikal Hasarları........... 3 Çalışmamız..........4 Malondialdehid Tayini........4 Sonuçlar ve Tartışma...5 Kaynakça...8 1
AĞIR METALLERİN SEBZELER ÜZERİNDE YARATTIĞI LİPİD PEROKSİDASYON DÜZEYİNİN BELİRLENMESİ Yüzyılımızda endüstri ve teknoloji alanında meydana gelen gelişmeler, doğal dengelerin bozulmasına, hava, su ve toprak kirliliğini de beraberinde getirmiştir.çevre kirliliği açısından güncel bir sorun da ağır metal kirliliğidir. Ağır metallerin havayı, yüzey, göl ve deniz sularını ve toprağı kirletmeleri doğrudan veya gıda zinciri yoluyla insan sağlığının etkilenmesi sonucunu doğurmaktadır. Bu çalışmada marul bitkisi farklı konsantrasyonda krom metaline maruz bırakılarak sebzede yarattığı lipit peroksidasyon düzeyinin saptanması amaçlanmıştır. Çalışmamızda, yardım ve desteğini göz ardı edemeyeceğimiz Ege Üniversitesi öğretim üyelerinden Yrd.Doç.Dr.Şenay BAYSAL a teşekkür ederiz. Cr(VI) deri endüstrisi, boya sanayi, kağıt sanayi gibi endüstrilerin sanayi atıklarında geniş miktarda varolan toksik bir metaldir ve maruz kalan kişilerde deri yaralarına, akciğer kanserine, adale ve kas rahatsızlıklarına yol açar. Cr(V) ve Cr(IV) gibi reaktif ara ürünler askorbat, glutatyon, NADPH bağımlı flavoenzimler gibi intraselüler redüktantlar tarafından daha kararlı olan Cr(III) e indirgenirler. Bu indirgenme prosesi aynı zamanda Fenton veya Haber-Weiss tipi reaksiyonlar yoluyla reaktif oksijen türlerinin oluşumuna neden olur. Ağır metallerin çoğunun su, gıda zinciri yoluyla vücuda girerek ciddi problemlere yol açtığı bilinmektedir. Vücuda alınan bazı metaller hidrojen peroksit varlığında hidroksil radikali oluşumuna neden olmaktadırlar. SERBEST RADİKAL-HİDROKSİL RADİKALİ Serbest radikaller dış yörüngelerinde bir veya daha fazla ortaklanmamış elektron taşıyan yüklü veya yüksüz olabilen atom veya moleküllerdir.hidroksil radikalleri en reaktif serbest radikallerdir ve vücuttaki serbest radikal hasarının en önemli sorumlularındandırlar. Hidroksil radikalleri özellikle hücresel moleküllerle etkileşerek ikincil bir radikal oluştururlar. Hidroksil Radikali Reaksiyonları: 1-Hidrojen abstraksiyonu H3 C CH2 OH + HO H3C C H OH + H2O 2-Çift bağlara çapraz katılım R C = CR + HO R (OH)C C 2 2 2 R2 3-Halojen iyonlarıyla reaksiyon - Cl + OH Cl + HO Serbest Radikal Hasarları: İkincil radikaller diğer moleküllerle reaksiyona girerler ve radikalik reaksiyonlar zincirleşerek devam eder. Zincirleme peroksidasyon sonucu son ürün olarak aldehitler oluşur ve reaksiyon sona erer. Oluşan aldehit yapılarından biri de malondialdehittir. Oluşan malondialdehit 2
proteinlere, DNA ya saldırarak yapıları bozar. Malondialdehit düzeyinin belirlenmesi oluşan lipid peroksidasyonunun belirlenmesini sağlar. Serbest Radikallerin DNA Üzerine Etkileri: DNA onarım enzimlerinde bozulma DNA denaturasyonu Serbest Radikallerin Protein Üzerine Etkileri: Yeniden düzenlenme *Özellikle histidin, tirozin, fenilalanin gibi amino asitlerle karbonil grubu oluşumu *Proteinlerde fragmantasyon ve çapraz bağ oluşumu *Protein fonksiyonunda bozulma *Bağışıklık sistemini uyarabilecek antijenik değişiklikler Hücre dışında oluşan serbest radikaller, hücre bileşenleri ile etkileşebilmek için hücre membranını geçmek zorundadırlar. Bu durumda hücre membranı kritik bir hedef oluşturur. Serbest Radikallerin Lipidler Üzerine Etkileri Baz çifti mutasyonları Enerji açığa çıkmazsızın lipidler okside olunca doymamış lipidler moleküler oksijenle doğrudan reaksiyona girdiklerinden oksidatif bozulmaya uğrarlar. Bu proses lipid peroksidasyonu olarak adlandırılır. Lipid peroksidasyonunun mekanizması 1940 yılında aydınlatılmıştır. Lipid peroksidasyonu zincirleme bir şekilde devam ettikten sonra sitotoksik son ürünler olan aldehitlerin oluşumu ile sonlanmaktadır. 3
ÇALIŞMAMIZ Bu çalışmada marul bitkisi farklı konsantrasyonda krom metaline maruz bırakılarak sebzede yarattığı lipit peroksidasyon düzeyinin saptanması amaçlanmıştır. Materyal ve Yöntem Çalışmamızda kullanılan tiyobarbütirik asit Merck firmasından temin edildi. Kullanılan diğer kimyasallar analitik saflıktadır. Temin edilen marul fideleri eşit büyüklükteki saksılara ekilerek iki hafta sonra 100 mg/l, 250 mg/l ve 500 mg/l derişiminde krom metali ile sabit hacimde uygulamanın ardından belirli zaman aralıklarında marul yaprakları toplandı. Kontrol grubu da dahil her bir örnek ph 7,0 50 mm fosfat tamponunda homojenize edilerek santrifüjlendi. Santrifüjlemenin ardından üst fazları malondialdehit düzeyinin saptanması amacıyla 20 0 C de depolandı. Her bir örnekte malondialdehit düzeyi tiyobarbütirik asit reaktifi kullanılarak spektrofotometrik olarak belirlendi. MDA miktarının hesaplanmasında 0-15 µm konsantrasyon aralığında 1,1,3,3-tetrametoksipropan ile çizilen standart grafik kullanıldı. Malondialdehid (MDA) Tayini Marul örneklerinde lipid peroksidasyon düzeylerinin belirlenmesi, oluşan MDA nın TBA reaktifi kullanılarak spektrofotometrik tayinine dayanmaktadır. Oluşan MDA, TBA ile kompleks oluşturur. Oluşan renkli kompleksin absorbans şiddeti 532 nm de belirlendi. MDA miktarının hesaplanmasında 0-15 µm konsantrasyon aralığında 1,1,3,3-tetrametoksi propan ile çizilen standart grafiği kullanıldı. Reaktifler: TCA: %20 lik trikloroasetik asit TBA: %20 lik (w/v) TCA içinde %0.8 lik(w/v) tiyobarbütirik asit Yöntem: Deney tüpüne 1 ml örnek 1 ml distile su konulup üzerine 2 ml TBA reaktifi eklendi, vortexlemenin ardından 95 o C de 30 dakika inkübe edildi. İnkübasyonun ardından tüpler soğutularak 532 nm de suya karşı absorbans değerleri kaydedildi. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Eşit kaplara 4 er adet olmak üzere dikilen marul fideleri belirli periyod ve miktarlarda sulanarak iki hafta boyunca hiçbir uygulama yapılmadı. Resim 1 de uygulama öncesi marul içeren saksılar görülmektedir. Belirli büyüklüğe ulaşan marul fideleri süre sonunda 100 mg/l, 250 mg/l ve 500 mg/l derişiminde krom metali içeren sulu çözeltiyle muamele edilerek haftada bir olmak üzere marul yaprağı örnekleri toplandı (Resim 2). Toplanan marul yaprakları(resim 3) tartılarak malondialdehid tayini yapılmadan önce -20 o C de depolandı. Ağır metale maruz bırakılmamış kontrol grubu da dahil her bir örnekte malondialdehit düzeyinin belirlenmesi amacıyla ayırılan marul yaprakları tartılarak ph 7,0 50 mm fosfat tamponunda homojenizasyonun ardından 5000 rpmx30 dak santrifüjün ardından üst fazlar MDA tayini için stoklandı. MDA düzeyi çizilen standart grafik yardımıyla belirlendi. 4
Resim 1: Uygulama Öncesi Örnek Resim 2: Farklı Konsantrasyonlarda Metal Uygulama Resim 3: Marul Yapraklarının Toplanması 5
Çizilen standart grafik, denklemi y=0,106x olarak hesaplandı. grafikte 0-15 µm konsantrasyon aralığında 1,1,3,3-tetrametoksipropan kullanılarak ile çizilen standart grafik verildi(grafik 1). Bilinmeyen örnekler de 532 nm de okunan absorbans değerleri denklemde yerine konularak her bir örnekte MDA düzeyi saptandı. A (532nm) 2 1,5 1 0,5 0 0 5 10 15 20 Grafik 1: MDA Standart Grafiği C (µm) Farklı dozlarda ağır metale maruz bırakılmış marul örneklerinde 3 haftalık uygulama sonrası marul kütleleri de dikkate alınarak saptanan MDA düzeyleri grafik 2 de görülmektedir. Krom uygulamanın 3 haftalık periyod boyunca marul yapraklarında çok fazla bozulma yaratmadığı saptanmış olup 3. uygulama sonrası MDA düzeyleri her bir doz için sırasıyla 2.158 µm/mgmarul, 2.321 µm/mg-marul, 3.071 µm/mg-marul gibi düşük değerdedir. Resim 4:Metal Uygulama Sonrasında Marul Fideleri 6
4 MDA(µM/mg-marul) 3 2 1 0 1 2 3 4 Hafta 100 mg 250 mg 500 mg Grafik 2: Krom uygulanmış Marullarda MDA Düzeyleri 7
KAYNAKÇA 1-Touati D., in: Scandalios J.G. (Ed.), Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defenses,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1997, 447 493. 2-Özdemir, G., Hamarat Baysal, Ş., Chromium and alımınum biosorption on Chrysomonas luteola, Applied Microbiology and Biotechnology, 64, 599-603, 2004. 8